JP2005504829A - 構造的心疾患における心筋機能不全を処置するためのカルモジュリンキナーゼｉｉインヒビターの使用 - Google Patents

構造的心疾患における心筋機能不全を処置するためのカルモジュリンキナーゼｉｉインヒビターの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、被験体における構造的心臓疾患を処置する方法を提供し、この方法は有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターをこの被験体に投与する工程を包含し、このインヒビターの投与により、被験体における構造的心臓疾患が処置される。構造的心臓疾患を処置するためのトランスジェニック動物モデルもまた提供される。構造的心臓疾患を処置し得る化合物についてスクリーニングする手段がさらに提供される。本発明は、拡張型心筋症または他の構造的心疾患（例えば、末期の弁疾患）と診断された被験体において、拡張型心筋症または他の構造的心疾患を発症する心筋機能不全を処置または予防する方法を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願番号６０／３２６，５７６（２００１年１０月１日出願）および米国仮特許出願番号６０／３２８，０１０（２００１年１０月８日出願）の優先権を主張する。これらの６０／３２６，５７６および６０／３２８，０１０の仮特許出願は、その全体において参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されたＨＬ０３７２７およびＨＬ６２４９４の下で、合衆国政府の支持によってなされた。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
（背景）
（発明の分野）
本発明は、カルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）の阻害に関する。より詳細には、このＣａＭＫＩＩ阻害は、構造的心疾患（例えば、心筋梗塞後の収縮不全または拡張型心筋症）を処置または予防し得る。
【背景技術】
【０００４】
心筋梗塞は、アメリカ合衆国および世界中の他の多くの国々において、重大な障害および死の主な原因であり、心疾患全体の約２／３を占める７。
【０００５】
いくつかの疾患開始事象（例えば、心筋梗塞、未処置の高血圧、収縮性タンパク質の先天性変異）は、心腔（ｃａｒｄｉａｃ ｃｈａｍｂｅｒ）の拡張からなる共通の心疾患表現型を生じ得、その結果、心疾患の臨床症状を導く収縮機能の減少（すなわち、収縮期の間に各腔から駆出される全血液の率の減少）をもたらす７。拡張型心筋症は、２つの異なる疾病を含む。本明細書中で使用される場合、拡張型心筋症は、左心室拡張および減少した収縮機能によって特徴付けられる疾病である、虚血性心筋症を含む。生存する非梗塞の心筋の通常の代償性肥大が不十分である場合、この状態は心筋梗塞後に生じ得る７。「拡張型心筋症」はまた、心筋梗塞の非存在下での心筋タンパク質の遺伝的異常に起因して、増大した心筋質量および減少した収縮機能を含み得る７。拡張型心筋症を有する被験体は、心室の拡張に起因する減少した心収縮性を有する被験体である。従って、拡張型心筋症および収縮性機能不全を有する被験体は、生存する非梗塞の心筋肥大が梗塞した心筋を代償する被験体とは異なり、かつそのような被験体よりも重篤な機能不全を有する。さらに、拡張型心筋症および収縮性機能不全を有する被験体は、異常な弛緩を含む他の心臓状態（すなわち、拡張機能不全および心不整脈）とは異なる疾患を有する。
【０００６】
心不全にとって利用可能な治療は不十分であり、そして新規の処置方法が必要とされる。心臓は、正常な収縮を維持する試みにおいて、生存する心筋の肥大により梗塞に応答する。しかし、肥大が代償に不十分である場合、拡張型心筋症および減少した収縮機能は、心不全および死を導く結果となる１９。心筋梗塞後に、心機能不全（ｃａｒｄｉａｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）および心不全（ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）を予防するための医療における重要な進歩にも関わらず１５、これらの問題は、重大な未解決の一般的健康問題のままである。
【０００７】
拡張型心筋症のための薬理学的治療は、治癒的でも十分なものでもなく、多くの患者は亡くなるか、または選択された場合には心臓移植を受ける。心機能不全を減少させ、かつ心不全を有する患者の死亡率を減少させるための、現在利用し得る薬理学的治療は、以下の３つの主要なカテゴリーに分類される：アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、βアドレナリン作動性レセプター（βＡＲ）アンタゴニスト、およびアルドステロンアンタゴニスト。死亡率が減少するにも関わらず、これらの医薬で処置した患者は、年齢の一致する、心不全を有さないコントロール患者と比べて、死に対する有意に増加した危険性を有するままである。ＡＣＥインヒビター１１、βＡＲアンタゴニスト４および（少なくとも１つの型の）アルドステロンレセプターアンタゴニスト１２は、心筋梗塞後の心機能不全および心不全の発症率および程度を有意に減少させ得る。他の利用可能な薬理学的治療剤としては、ニトログリセリン、利尿剤、ポジティブ強心薬（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）（心刺激剤）、および脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）が挙げられる。これらの後者の薬剤は、症状の軽減をもたらし得るが、心不全患者の減少した死亡率とは関連しない。
【０００８】
ＡＣＥインヒビターは、患者の１０％において咳と関連し、そして両側性の腎動脈狭窄または他の重篤な腎臓疾患の設定において腎不全をもたらし得る７。βＡＲアンタゴニストは、インポテンスおよびうつ病と関連し、そして喘息を有する患者には禁忌である；さらに、患者は、悪化した心不全、低血圧、徐脈、心ブロック、およびβＡＲアンタゴニストをイニシエーション（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）を伴う疲労を発症し得る７。アルドステロンレセプター拮抗作用は、男性患者の１０％において重大な、高カリウム血症および女性化乳房痛を引き起こす７、１２。実証された死亡率の有用性を有さない薬剤はまた、問題に関連する；多くの心刺激剤が症状を改善するが、おそらく致死性の心不整脈を誘発することによって、実際には死亡率は増加する７という知見と一致することはその代表である。対照的に、ＣａＭＫＩＩ阻害は、動物モデルにおいて心不整脈を減少させることが現在知られており２０、２１、不整脈を増加させることなく心機能を促進するための新規のアプローチを提示する。現在利用可能な薬理学的治療は、不十分であり、そして重大な所望でない副作用によって制限されるので、改善された効果を有しかつ重篤な副作用を伴わない新規の治療剤の開発は、重要な一般的な健康上の目標である。
【０００９】
カルモジュリンキナーゼＩＩは、心臓に存在する酵素であり、心臓の細胞内でＣａ２＋が増加する場合に活性化され、Ｃａ２＋結合タンパク質カルモジュリンに結合する３。ＣａＭＫＩＩ活性は、重篤な心筋症を有する患者において増加し得るが、ＣａＭＫＩＩは、拡張型心筋症または心不全における収縮の低下には関連していない。
【００１０】
本発明は、拡張型心筋症および心不全を、ＣａＭＫＩＩを阻害することによって処置するための、心筋の収縮機能を改善（増加）させる方法を提供する。本発明はさらに、選択的ＣａＭＫＩＩ阻害ペプチドであるＡＣ３−Ｉの発現に関するトランスジェニックによって、心臓標的化ＣａＭＫＩＩ阻害のマウスモデルを提供する。従って、本発明のＡＣ３−Ｉトランスジェニックマウスは、心疾患における慢性的なＣａＭＫＩＩ阻害の効果について試験するための新規の重要なツールである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、被験体において心筋梗塞後の心筋機能不全を処置または予防する方法を提供し、この方法は、有効量のカルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）のインヒビターを被験体に投与する工程を包含し、インヒビターの投与により、被験体において心筋梗塞後の心筋収縮を改善する。
【００１２】
本発明は、拡張型心筋症または他の構造的心疾患（例えば、末期の弁疾患）と診断された被験体において、拡張型心筋症または他の構造的心疾患を発症する心筋機能不全を処置または予防する方法を提供し、この方法は、有効量のカルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）のインヒビターを被験体に投与する工程を包含し、このインヒビターの投与により、被験体において拡張型心筋症または他の構造的心疾患を処置または予防する。
【００１３】
本発明は、拡張型心筋症と診断された被験体において、拡張型心筋症を発症する心筋機能不全を処置または予防する方法を提供し、この方法は、有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターを被験体に投与する工程を包含し、このインヒビターの投与により、被験体において拡張型心筋症または他の構造的心疾患を処置または予防する。
【００１４】
本発明は、拡張型心筋症と診断された被験体において心筋収縮性を増加させる方法を提供し、この方法は、有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターを被験体に投与する工程を包含し、このインヒビターの投与により、被験体において心筋収縮性を増加させる。
【００１５】
さらに、本発明は、心筋梗塞後の心機能不全および／または低下した収縮性と診断された被験体において心筋収縮性を増加する方法を提供し、この方法は、有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターを被験体に投与する工程を包含し、このインヒビターの投与により、被験体において心筋収縮性を増加する。
【００１６】
本発明はさらに、心筋梗塞後の低下した心筋収縮性と診断された被験体において心筋収縮性を増加させる方法を提供し、この方法は、有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターを被験体に投与する工程を包含し、このインヒビターの投与により、被験体において心筋収縮性を増加する。
【００１７】
本発明は、構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する方法を提供し、この方法は、以下：ａ）構造的心臓疾患を有する動物において心臓収縮性を測定する工程；ｂ）工程（ａ）の動物に化合物を投与する工程；ｃ）工程（ｂ）の動物において心臓収縮性を測定する工程；および工程（ａ）の動物における心臓収縮性と比較して、工程（ｂ）の動物における心臓収縮性の増加を検出する工程、を包含し、心臓収縮性の増加の検出により、構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する。
【００１８】
本発明は、被験体において構造的心疾患を処置する方法を提供し、この方法は、本発明の方法によって同定された化合物の有効量を被験体に投与する工程を包含する。
【００１９】
本発明は、トランスジェニック動物を提供し、この動物は、ＣａＭＫＩＩのインヒビターをコードする核酸を発現する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号８のペプチド（ＡＣ３−Ｃとも称される）を含むペプチドをコードする核酸を発現するトランスジェニック動物を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、ＣａＭＫＩＩのインヒビターをコードする核酸およびカルシニューリンを発現する核酸を発現する二重トランスジェニック動物を提供する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の言及を含むことに留意すべきである。従って、例えば、「インヒビター（ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、複数コピーのインヒビターを含み、そしてまた、特定の種のインヒビターの１つより多くを含み得る。
【００２３】
本発明は、心筋梗塞後の心筋収縮不全を有すると診断された被験体において、心筋梗塞後の心筋収縮不全を処置または予防する方法を提供し、この方法は、有効量のカルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）インヒビターをこの被験体に投与する工程を包含し、それによってインヒビターの投与が、被験体において心筋梗塞後の心筋収縮不全を処置または予防する。一般に、「有効量」のインヒビターは、所望の結果を達成するのに必要な量である。「心筋梗塞」は、心臓に対する虚血損傷を意味し、ここで、心筋（心臓の筋肉）の一部が壊死またはアポトーシス（すなわち、プログラム細胞死）を受ける。「虚血損傷」は、器官または組織への血流の遮断（すなわち、虚血事象）から生じる、器官または組織に対する損傷または潜在的な損傷を意味する。全体を通じて使用される場合、「被験体」は、個体を意味する。従って、「被験体」は、飼い動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および鳥類を含み得る。好ましくは、被験体は、霊長類のような哺乳動物であり、そしてより好ましくはヒトである。
【００２４】
被験体は、心筋梗塞を有すると診断された患者であり得る。被験体は、梗塞後の心機能不全を有すると診断された患者であり得る。被験体は、心筋梗塞を有したと診断された患者、従って、梗塞後の心機能不全を発症する危険性が増大した患者であり得る。さらに、被験体は、心室拡張および減少した心筋収縮機能の表現型に関連する任意の原因由来の拡張型心筋症または心機能不全の症状を有すると診断された患者であり得る。被験体は、減少した心筋収縮性を有すると診断された患者であり得る。心筋梗塞、梗塞後の心機能不全、減少した心筋収縮性および拡張型心筋症を診断する方法は、当該分野で周知である。梗塞後の収縮機能不全または拡張型心筋症を有する被験体を、心筋梗塞を有する被験体または心肥大を有する被験体から識別する方法は、当該分野で周知である。心筋梗塞を有すると診断された被験体、または不整脈を有すると診断された被験体、または心肥大を有すると診断された被験体は、拡張型心筋症または低減した心筋収縮性を必ずしも有さないことが認識される。
【００２５】
ＣａＭＫＩＩのインヒビターは、ＣａＭＫＩＩの活性または発現（例えば、量または疾患誘発効果）を阻害する任意の化合物、組成物または因子であり得る。この化合物は、ペプチド因子または非ペプチド因子であり得、例えば、ペプチドインヒビターをコードする核酸が挙げられる。さらに、この因子は、心臓におけるＣａＭＫＩＩの発現を阻害するアンチセンス核酸であり得る（本願の図９中の、Ｈｏｃｈら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １９９９由来のアイソフォームδ３およびδ２について、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１３４０７を参照のこと）５。「阻害する」とは、制限すること、抑止すること、または低減することを意味する。従って、インヒビターは、例えば、酵素活性または酵素の発現量、あるいはその両方を低減し得る因子である。この阻害は、可逆的または不可逆的であり得る。被験体におけるＣａＭＫＩＩ活性または被験体におけるＣａＭＫＩＩの量は、例えば、心エコー検査または他の臨床的パラメータによって決定されるように、機能的応答の検出または測定に基づいて容易に決定され得る。非ヒト動物モデルにおいてＣａＭＫＩＩ活性を測定する特定の方法が、本明細書中で提供される。従って、ＣａＭＫＩＩを阻害する化合物を同定することは、慣用的である。
【００２６】
ＣａＭＫＩＩのインヒビターの例は、配列番号２のペプチドを含むペプチドであり、これはまた、本明細書中でＡＣ３−Ｉとも称される。本発明のインヒビターは、配列番号２のペプチドからなり得る。
【００２７】
ＣａＭＫＩＩインヒビターの別の例は、ＣａＭ−ＫＩＩＮである配列番号４のペプチドを含むペプチドである。このインヒビターは、全長ＣａＭ−ＫＩＩＮ（配列番号４）および／または全長ペプチドのフラグメントであり得る；このフラグメントは、ＣａＭ−ＫＩＩＮｔｉｄｅ（配列番号６）と呼ばれる。ＣａＭＫＩＩＮおよびＣａＭ−ＫＩＩＮｔｉｄｅは、Ｃｈａｎｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）１９９８ ９５：１０８９０〜１０８９５に記載されており、これは、その全体において本明細書で参考として援用される。
【００２８】
これらの各々は、ＣａＭＫＩＩを阻害することが示されるので、それを含むが、非必須アミノ酸を含む他のペプチドおよびポリペプチドは、類似の活性を有すると予想される。非必須アミノ酸は、ペプチドの機能またはペプチドがその機能（例えば、その２次構造またはペプチドの活性の最大の結果）を達成する経路に影響しないアミノ酸である。本発明における非必須アミノ酸の例としては、ＧＦＰを含むアミノ酸、精製のためにタンパク質またはペプチドをタグ化し、そして同定するペプチド標識が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明によって意図されるＣａＭＫＩＩの多数の他のインヒビターが存在し、そのうちの１つはＫＮ−９３である。ＣａＭＫＩＩの非ペプチドインヒビターであるＫＮ−９３は、ＷＯ９８／３３４９１に記載されており、これは、ＫＮ−９３およびＣａＭＫＩＩインヒビターに関するその教示について、その全体において本明細書で参考として援用される。
【００３０】
本発明は、被験体における心筋梗塞後の心機能不全を処置または予防するための方法をさらに提供し、この方法は、被験体に有効量のＣａＭＫＩＩインヒビターを投与する工程を包含し、この方法によって、インヒビターの投与が、被験体において心機能不全を処置または予防する。「心機能不全」とは、心臓障害の臨床的状態を生じる血液を送る心腔の低下した収縮機能を意味する。被験体において心筋梗塞後の心機能不全を診断する方法は、当該分野において周知である。
【００３１】
被験体において心筋梗塞後の心機能不全を処置または予防する方法において、ＣａＭＫＩＩインヒビターは、ペプチド、例えば、配列番号２のペプチドを含むペプチド、または、配列番号２のペプチドからなるペプチドであり得る。ＣａＭＫＩＩインヒビターは、配列番号４のペプチドを含むペプチド、または、配列番号４のペプチドからなるペプチドであり得る。さらに、インヒビターは、配列番号６のペプチドを含むペプチド、または、配列番号６のペプチドからなるペプチドであり得る。インヒビターは、非ペプチドインヒビター、例えば、ＫＮ−９３の活性領域を含むインヒビターであり得るか、またはＫＮ−９３であり得る。
【００３２】
本発明はまた、被験体における任意の原因からの心室拡張の表現型をともなう拡張型心筋症または任意の心臓疾患を処置または予防する方法を提供し、この方法は、被験体に有効量のＣａＭＫＩＩインヒビターを投与する工程を包含し、この方法によって、インヒビターの投与が、被験体において、拡張型心筋症を処置するか、または心室拡張を低下させる。被験体における拡張型心筋症の診断の方法は、当該分野において周知である。
【００３３】
拡張型心筋症を処置または予防する方法において、ＣａＭＫＩＩインヒビターは、ペプチド、例えば、配列番号２のペプチドを含むペプチド、または、配列番号２のペプチドからなるペプチドであり得る。ＣａＭＫＩＩインヒビターは、配列番号４のペプチドを含むペプチド、または、配列番号４のペプチドからなるペプチドであり得る。さらに、インヒビターは、配列番号６のペプチドを含むペプチド、または、配列番号６のペプチドからなるペプチドであり得る。インヒビターは、非ペプチドインヒビター、例えば、ＫＮ−９３の活性領域を含むインヒビターであり得るか、またはＫＮ−９３であり得る。
【００３４】
本発明は、任意の原因からの心室拡張または低下した収縮機能の表現型をともなう拡張型心筋症または任意の心臓疾患と診断された被験体における心筋収縮性を増加させる方法を提供し、この方法は、被験体に有効量のＣａＭＫＩＩインヒビターを投与する工程を包含し、この方法によって、インヒビターの投与が、被験体において、心筋収縮性を改善する。心収縮性を測定する技術、例えば、心エコー検査、核種血管造影、および磁気共鳴画像化が、当該分野において周知である。本明細書で使用される場合、「心筋収縮性」とは、心筋の収縮の尺度であり、より具体的には、左心室の収縮の尺度である。図７に示されるように、ＡＣ３−ＩおよびＫＮ−９３は、心肥大に影響することなしに、心筋収縮性（正の変力作用）を増大させる。
【００３５】
さらに、本発明は、心筋梗塞と診断された被験体における心筋収縮性を増大させる方法を提供し、この方法は、被験体に有効量のＣａＭＫＩＩインヒビターを投与する工程を包含し、この方法によって、インヒビターの投与が、被験体における心筋収縮性を改善する。
【００３６】
本発明はまた、心筋梗塞後の心機能不全と診断された被験体における心筋収縮性を増大させる方法を提供し、この方法は、被験体に有効量のＣａＭＫＩＩインヒビターを投与する工程を包含し、この方法によって、インヒビターの投与が、被験体における心筋収縮性を改善する。
【００３７】
心筋収縮性を増大させる方法において、ＣａＭＫＩＩインヒビターは、ペプチド、例えば、配列番号２のペプチドを含むペプチド、または、配列番号２のペプチドからなるペプチドであり得る。ＣａＭＫＩＩインヒビターは、配列番号４のペプチドを含むペプチド、または、配列番号４のペプチドからなるペプチドであり得る。さらに、インヒビターは、配列番号６のペプチドを含むペプチド、または、配列番号６のペプチドからなるペプチドであり得る。インヒビターは、非ペプチドインヒビター、例えば、ＫＮ−９３の活性領域を含むインヒビターであり得るか、またはＫＮ−９３であり得る。
【００３８】
ＣａＭＫＩＩインヒビターを使用して、心肥大に影響することなしに、心筋の収縮性を増大させ得、それによって、心筋梗塞、心筋梗塞後の心機能不全および／または拡張型心筋症を診断された被験体を処置し得る。
【００３９】
本発明は、構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：ａ）構造的心臓疾患に罹患する動物における心収縮性を測定する工程；ｂ）化合物を工程（ａ）の動物に投与する工程；ｃ）工程（ｂ）の動物における心収縮性を測定する工程；およびｄ）工程（ａ）の動物における心収縮性と比較して、工程（ｂ）の動物における心収縮性における増大を検出する工程、を包含し、この方法によって、心収縮性における増大の検出は、構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する。本発明の方法において、構造的心臓疾患に罹患する動物は、ＡＣ３−Ｃを発現するトランスジェニック動物であり得る。心収縮性を測定する方法は、当該分野において周知であり、そして、この方法としては、心エコー検査が挙げられるが、これに限定されない。このような方法としては、核種血管造影、磁気共鳴画像化、および左心室血管造影が挙げられる。
【００４０】
本発明は、構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する方法を提供し、この方法は、以下の工程：ａ）構造的心臓疾患に罹患する動物における脳ナトリウム利尿ペプチドを測定する工程；ｂ）化合物を工程（ａ）の動物に投与する工程；ｃ）工程（ｂ）の動物における脳ナトリウム利尿ペプチドを測定する工程；およびｄ）工程（ａ）の動物における脳ナトリウム利尿ペプチドと比較して、工程（ｂ）の動物における脳ナトリウム利尿ペプチドにおける増加を検出する工程、を包含し、この方法によって、血漿脳ナトリウム利尿ペプチドにおける増加の検出は、構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する。本発明の方法において、構造的心臓疾患に罹患する動物は、ＡＣ３−Ｃを発現するトランスジェニック動物であり得る。
【００４１】
心不全は、心収縮性および組織酸素付加における低下に起因する、低下した運動耐性を含む臨床的症候群であり７、トレッドミルまたは自転車エルゴノメトリックスによる運動試験、低組織酸素摂取、または増加した脳ナトリウム利尿ペプチドレベルは、心臓障害の重症度の全ての指標である。心筋梗塞、運動能力、最大酸素消費、および循環脳ナトリウム利尿ペプチドレベルの重度の障害および中程度の障害を示す値は、よく記載されており、心臓障害を処置する当業者に対して周知である７。構造的心臓疾患の例としては、心筋梗塞、心筋梗塞後の心機能不全、低下した心筋収縮性および拡張型心筋症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明は、被験体における心筋梗塞、心筋梗塞後の心機能不全および／または拡張型心筋症を処置する方法を提供し、この方法は、上記の方法によって同定された有効量の化合物を被験体に投与する工程を包含し、この方法によって、この化合物の被験体への投与が、心筋梗塞後の心機能不全および／または拡張型心筋症を処置するか、または心臓障害ならびに拡張した心室および低下した左心室収縮性に罹患する患者を処置する。
【００４３】
本発明は、ＣａＭＫＩＩインヒビターをコードする核酸を発現するトランスジェニック動物を提供する。「トランスジェニック動物」とは、その体内の全ての細胞が、外因性核酸を含む動物を意味する。本発明のトランスジェニック動物の１つの例において、導入遺伝子は、心臓細胞特異的プロモーターによって駆動されて、心筋細胞において、特異的に発現される。このマウスを、心臓特異的αミオシン重鎖プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録Ｕ７１４４１）を用いて操作した。トランスジェニック動物を作製する方法は、当該分野において周知であり、本明細書で具体的に例示される。
【００４４】
本発明のトランスジェニック動物において、発現されるＣａＭＫＩＩインヒビターは、配列番号２のペプチドを含むペプチドであり得る。さらに、本発明のトランスジェニック動物は、配列番号２のペプチドからなるペプチドを発現し得る。近年の報告では、心臓において、イソ型ＣａＭＩＩδの少なくとも４つの多様体が見出されており５、そして、標的とされる調節ドメインの保存性に起因して、ＡＣ３−Ｉ（配列番号２）は、イソ型ＣａＭＫＩＩを阻害する３。ＣａＭＫＩＩ中のＡＣ３−Ｉ標的化ドメインは、他のＣａＭＫ型（すなわち、ＣａＭＫＩおよびＣａＭＫＩＶ、図１）におけるアナログ機能ドメインとは異種であり、そして、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣに対する活性を実質的に欠いている３。
【００４５】
本発明のトランスジェニック動物において、発現されるＣａＭＫＩＩインヒビターは、配列番号４のペプチドを含むペプチドであり得る。さらに、本発明のトランスジェニック動物は、配列番号４のペプチドからなるペプチドを発現し得る。
【００４６】
本発明は、心筋細胞において、配列番号８のペプチド（ＡＣ３−Ｃとしても言及される）を含むペプチドをコードする核酸を発現するトランスジェニック動物をさらに提供する。図４および図５に示されるように、ＡＣ３−ＩマウスおよびＡＣ３−Ｃマウスは、導入遺伝子の類似する発現を有するが、ＡＣ３−Ｃマウスは、心筋症を示し、一方で、ＣａＭＫＩＩ阻害を有するＡＣ３−Ｉマウスは、正常である。図６に示されるように、ＡＣ３−Ｃマウスは、心筋症を有するヒト患者において見出される高い総ＣａＭＩＩ活性を有する。従って、このトランスジェニック動物は、構造的心疾患を処置し得る化合物を同定する本発明の方法において用いられ得る。ＡＣ３−Ｃは、非活性であると考えられているので、これらの結果は、ＡＣ３−Ｃ−ＧＦＰ導入遺伝子の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）部分の効果により説明され得る６。このマウすは、ＡＣ３−Ｉトランスジェニックマウスを作製するための基本的プロトコルに沿って作製される。
【００４７】
本発明はまた、心筋細胞において、ＡＣ３−Ｉをコードする核酸およびカルシニューリンをコードする核酸を発現する二重トランスジェニック動物（ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋）も提供する。カルシニューリン（ＣＡＮ＋）トランスジェニックマウスは、重篤な拡張型心筋症の十分に許容されているモデルである１０。ＣＡＮアンタゴニストは、種々のマウスモデルにおける心筋症表現型を「レスキュー」することが知られているが１６、ＣａＭＫＩＩ阻害は、これらの心筋症モデルまたは任意の他の心筋症モデルの心臓の機能または構造を改善することは企図されていなかった。図８に例示されるように、ＣＡＮに加えてＣａＭＫＩＩのインヒビターを発現する二重トランスジェニック動物は、左心室機能を改善し、そしてＣＡＮ＋動物と比較して軽減された左心室の拡張および肥大を示す。従って、この動物におけるＣａＭＫＩＩの阻害は、拡張型心筋症を処置する。
【００４８】
本発明の方法において、ＣａＭＫＩＩのインヒビターは、公知の方法により投与され得る。特定の実施例において、これらのペプチドインヒビターは、細胞膜透過性となる。細胞「膜透過性」により、膜における開口部または隙間を通って通過し得ることが意味される１６。この方法は、阻害ペプチドに付加されたペプチド配列を使用するが、ミリストイル化は、ペプチドを細胞膜透過性にするための別のアプローチである。
【００４９】
本発明の組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリア中でインビボで投与され得る。「薬学的に受容可能」により、生物学的でも他の点でも望ましくないことはないことを意味する。すなわち、その物質は、それが含まれる薬学的組成物の他の成分のいずれとも有害な様式での任意の所望されない生物学的効果または相互作用を生じることなく組成物と共に被験体に投与され得る。このキャリアは、当業者により周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限にし、そして被験体における任意の有害な副作用を最小限にするような性質により選択される。
【００５０】
局所的経鼻腔投与または吸入剤による投与が代表的に好ましいが、この組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋内、鞘内、動脈内、および腹腔内注射により）、経皮、体外、局所的などで投与され得る。本明細書中で使用される場合、「局所的鼻腔内投与」とは、外鼻孔の一方または両方を通る鼻および鼻の経路への組成物の送達を意味し、そしてスプレー機構または滴下機構によるか、または治療薬のエアロゾル化を介する送達を含み得る。送達はまた、挿管法を介して直接的に下気道（例えば、気管、気管支、および肺）の任意の部分に送達され得る。必要とされる組成物の抽出量は、被験体の種、年齢、体重および一般的な状態、処置される状態の重篤度、用いられる特定の組成物、その投与の様式などに依存して、被験体により変化し得る。従って、全ての組成物についての正確な量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、従来の実験および本明細書における教示のみを用いて、当業者により決定され得る。
【００５１】
使用される場合、組成物の非経口投与は、一般的に、注射により特徴付けられる。注射可能物質は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体中の懸濁液または溶液に適する固体形態、または乳濁液のいずれかとして、従来の形態に調製され得る。非経口投与のためのより最近に改められたアプローチは、一定の投与量が維持されるような徐放性または持続放出性の系の使用を含む。例えば、本明細書中に参考として援用される米国特許第３，６１０，７９５号を参照のこと。
【００５２】
これらの物質は、溶液、懸濁液（例えば、微小粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）であり得る。これらは、抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して特定の細胞型に標的化され得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するためのこの技術の使用の例である：Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１２：４４７〜４５１（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１、（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、５８：７００−７０３、（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４：３−９、（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５：４２１−４２５、（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２９：５７−８０、（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４２：２０６２−２０６５、（１９９１））。「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」および他の抗体結合体化リポソーム（結腸癌に標的化する脂質媒介薬物を含む）、細胞特異的リガンドを介してＤＮＡを標的化する媒介レセプター、腫瘍標的化に指向されたリンパ球、およびマウス神経膠腫細胞をインビボで標的化する高度に特異的な治療的レトロウイルスのようなビヒクル。以下の参考文献は、腫瘍組織に対して特異的なタンパク質を標的化するこの技術の使用の例である（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４−６２２０、（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１１０４：１７９−１８７、（１９９２））。一般的に、レセプターは、構成的またはリガンド誘導性のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。クラスリン被覆されたピットにおけるこれらのレセプタークラスターは、クラスリン被覆された小疱を介して細胞に入り、レセプターが選択される酸性化エンドソームを通り、次いで、細胞表面に再循環するか、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソーム内で分解される。内在化経路は、種々の機能（例えば、栄養取込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見進入、リガンドの解離および分解、ならびにレセプターレベルの調節）を果たす。多くのレセプターが、細胞型、レセプター濃度、リガンドの型、リガンドの価、およびリガンドの濃度に依存して、１つより多い細胞内経路に従う。レセプター媒介エンドサイトーシスのこれらの分子機構および細胞性機構が、概説されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６、３９９〜４０９（１９９１））。
【００５３】
本発明の組成物は、インヒビターをコードする核酸を含み得るか、またはＣａＭＫＩＩアンチセンス核酸を含み得る。開示された組成物は、種々の様式で、標的細胞に送達され得る。例えば、この組成物は、エレクトロポレーションを通してか、またはリポフェクションを通してか、またはリン酸カルシウム沈降を通して、送達され得る。選択される送達機構は、標的化される細胞の型、および送達が、例えば、インビボで行われるかまたはインビトロで行われるかに一部依存する。
【００５４】
従って、この組成物は、開示される組成物またはベクターに加えて、例えば、脂質（例えば、リポソーム（例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソーム））を含み得る。リポソームはさらに、所望される場合には、特定細胞の標的化を容易にするためのタンパク質を含み得る。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に対して求心性の血液に投与され得るか、または気道の標的細胞へと気道中に吸入され得る。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。さらに、この化合物は、特定の細胞型（例えば、マクロファージ）に対して標的化され得るマイクロカプセルの成分として投与され得、またはここで、化合物の拡散もしくはマイクロカプセルからの化合物の送達が、特定の速度または投薬量で設計される。
【００５５】
被験体の細胞への外因性ＤＮＡの投与および取り込み（例えば、遺伝子の形質導入またはトランスフェクション）を包含する上記方法において、細胞への組成物の送達は、種々の機構を介し得る。１つの例として、送達は、市販のリポソーム調製物（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ，ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ならびに当該分野で標準的な手順に従って開発される他のリポソームを使用することによって、リポソームを介し得る。さらに、本発明の核酸またはベクターは、インビボでのエレクトロポレーションにより送達され得る。このインビボでのエレクトロポレーションは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から利用可能な技術であり、そしてＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機器（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用する。
【００５６】
細胞に送達され、宿主細胞ゲノムに組み込まれる核酸は、代表的に、組み込み配列を含む。これらの配列はしばしば、ウイルス関連配列である（特に、ウイルスに基づく系が使用される場合）。これらのウイルスの組み込み系はまた、非核酸ベースの送達系（例えば、リポソーム）を使用して送達される核酸に組み込まれ得、その結果、その送達系に含まれる核酸は、宿主ゲノムに組み込まれ得る。本明細書中で使用される場合、「核酸」は、一本鎖分子または二本鎖分子を含み、これらはヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇから構成されるＤＮＡであり得るか、または塩基Ａ、Ｕ（Ｔに対する置換）、ＣおよびＧから構成されるＲＮＡであり得る。核酸は、コード鎖またはその相補鎖を表し得る。核酸は、天然に存在する配列の部分に対して配列同一性であり得るか、または天然に存在する配列において見出されるアミノ酸と同一のアミノ酸をコードする代替コドンを含み得る。さらに、核酸は、当該分野で周知のようなアミノ酸の保存的置換を示すコドンを含み得る。
【００５７】
宿主ゲノムへの組み込みのための他の一般的な技術としては、例えば、宿主ゲノムとの相同組換えを促進するように設計された系が挙げられる。これらの系は代表的に、ベクター核酸と標的核酸との間において組換えが起こることにより、送達される核酸の宿主ゲノム中への組込みを生じさせるに十分な相同性を宿主細胞ゲノム内の標的配列に対して有し、発現されるべき核酸に隣接する配列に依存する。当業者は、相同組換えを促進するために必要とされるこれらの系および方法を理解する。
【００５８】
上記のように、この組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中において投与され得、そして当該分野で周知の種々の機構（例えば、裸のＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃を介したＤＮＡの筋内注射、エンドサイトーシスなど）によって、インビボおよび／またはエキソビボで被験体の細胞に送達され得る。エキソビボ方法が使用される場合、細胞または組織は取り出され得、そして当該分野で周知の標準的なプロトコールに従って体外で維持され得る。この組成物は、任意の遺伝子転移機構（例えば、リン酸カルシウム媒介性遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームなど）を介して、細胞に導入され得る。次いで、形質導入された細胞は、その細胞または組織型についての標準的な方法により、その被験体に注入して戻され得る（例えば、薬学的に受容可能なキャリア中において）か、または同位置に移植し戻され得る。被験体への種々の細胞の移植または注入について、標準的な方法が公知である。
【００５９】
インヒビターは、ＣａＭＫＩＩの活性または量を阻害するに有効な任意の用量で投与され得る。上述のように、ＣａＭＫＩＩの活性または量における減少の検出は、当業者に周知である。より詳細には、インヒビターは、体重１ｋｇあたり約０．０５ｍｇ〜約５．０ｍｇの用量で投与され得る。あるいは、インヒビターは、体重１ｋｇあたり約０．３ｍｇ〜約３．０ｍｇの用量で投与され得る。
【００６０】
以下の実施例は、本明細書において特許請求される組成物および／または方法が如何にして作製および評価されるかに関しての完全な開示および記載を当業者に提供するために示され、そして純粋に本発明の例示であることが意図され、そして本発明者らが、本発明者らによる発明とみなす範囲を限定することは意図されない。数値（例えば、量、温度など）に関しては、正確度を確実にするよう試みてはいるが、いくらかの誤差および偏差については考慮されるべきである。本発明は、以下の実施例においてより詳細に記載されており、これらは単なる例示に過ぎないことが意図される。なぜなら、その実施例における多数の改変およびバリエーションが当業者に明らかであるからである。
【実施例】
【００６１】
（実施例）
（ＡＣ３−Ｉトランスジェニックマウス） ＡＣ３−Ｉマウスを、ＡＣ３−Ｉについてのペプチド配列に基づくミニ遺伝子の合成によって作製した（図１）。ＣａＭＫＩＩ阻害性ペプチドであるＡＣ３−Ｉ（ＫＫＡＬＨＲＱＥＡＶＤＣＬ）２をコードする「ミニ遺伝子」を、これらの相補的オリゴヌクレオチドを用いて構築した：
（配列番号１）
ＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＧＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＣＴＧＡＣＧＧＡＡＣＧＣＴＡＧ、
そして以下の相補的オリゴヌクレオチドを使用して、関連の不活性コントロールペプチドＡＣ３−Ｃ（ＫＫＡＬＨＡＱＥＲＶＤＣＬ）について同様にミニ遺伝子を構築した：
（配列番号７）
ＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＧＧＧＡＡＧＴＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＧＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣＧＧＡＡＣＧＣＴＡＧ。
【００６２】
このミニ遺伝子を、ＥＧＦＰとインフレームで、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢｓｐＥＩ部位に挿入した。これにより、ＥＧＦＰは、このペプチドのＮ末端に配置される。ＡＣ３−Ｉミニ遺伝子は、Ｋｏｚａｋコンセンサス翻訳開始部位を含む。次いで、これを配列決定し、そして緑色蛍光を示すようにＨＥＫ２９３細胞において発現させた。以前の研究によりＡＣ３−Ｉ−ＧＳＴ−ＭＴＳ融合ペプチドは、合成ＣａＭＫＩＩ基質に対して完全なＣａＭＫＩＩ阻害性効力を保持したことが示されており（ＡＣ３−Ｉ−ＧＳＴ−ＭＴＳ ＩＣ５０＝０．４μＭ；ＡＣ３−Ｉ ＩＣ５００．５μＭ）、これによりＡＣ３−Ｉ−ＧＦＰタンパク質もまたＣａＭＫＩＩ阻害性活性を保持することが示唆される。次いで、８００ｂｐのＡＣ３−Ｉ−ＧＦＰ配列を、ＰＣＲを使用して増幅し、精製し、そしてα−ＭＨＣプロモーターベクター（ＧｅｎＢａｎｋ登録Ｕ７１４４１）およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡテイルを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｊ．Ｒｏｂｂｉｎｓ博士により開発）のＳａｌＩ部位にサブクローニングした。この構築物を、配列決定により確認し、そしてマウス心房腫瘍細胞株（ＨＬ１）において発現させた。これもまた緑色蛍光を示した。Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅコア施設において、マウス胚性幹細胞に直鎖化ＤＮＡ（２ｎｇ／ｍｌ）を注射し、そしてこれをＢ６Ｄ２偽妊娠雌に移植した。
【００６３】
ＡＣ３−Ｉを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に連結することによって、組織学的切片が顕微鏡下で試験された場合に、心臓全体にわたって均質な発現が示された。これらのＡＣ３−Ｉマウスは、生存可能であり、そして正常な基本的な心臓のサイズ及び機能を有する（図２）。しかし、これらのマウス由来の心臓は、総心臓ＣａＭＫＩＩ活性を有意に減少し（図３（Ａ））、そしてこれらのマウスは、実験的な心筋梗塞後に、野生型の同腹仔コントロールと比べて有意に少ない心臓機能欠損を有する（図３（Ｂ））。これらの知見は、ＣａＭＫＩＩ活性が、心筋梗塞後の心臓機能不全についての新規シグナルであり、そしてＣａＭＫＩＩを阻害する方法によって、心筋梗塞を有する患者を処置する本発明者らの特許請求の範囲の基礎となることを示す。
【００６４】
ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋トランスジェニックマウス：二重トランスジェニックマウスを、図９において図式化したストラテジーを使用して異種交配した。第１世代の遺伝子型決定のために、尾の生検を３週齢で採取し、そしてこれを５５℃にて、０．５Ｍｇ／ｍｌ プロテアーゼＫ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．５％ ＳＤＳ中でインキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出を２回行なった後に、ゲノムＤＮＡを等容量のイソプロパノールを用いて沈殿させた。ＤＮＡを、２．５μｇのＲＮＡａｓｅＡを含む５０μｌの１／１０ ＴＥ（ｐＨ８．０）中に一晩溶解した。１５μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで完全に消化し、そして消化されたＤＮＡを、１×ＴＡＥ中の０．８％アガロースゲルで分離した。電気泳動の後、このゲルを０．２５Ｎ ＨＣＬ中で３０分間インキュベートし、０．５Ｍ ＮａＯＨ−１．５Ｍ ＮａＣｌ中で１５分間２回中和し、そして０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−１．５Ｍ ＮａＣｌ中で１５分間２回平衡化した。このゲルを一晩、ＭＳＩナイロン転写膜（Ｍｉｃｒｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ． Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈｔ， ＭＡ）でブロットし、そしてこのフィルターをＵＶ架橋した。ＧＦＰ−ＡＣ３ＩまたはＧＦＰ−ＡＣ３Ｃ ＤＮＡフラグメントを、プローブとしてランダムオリゴヌクレオチドプライミング（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）により３２Ｐで標識した。ハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト液、０．１％ ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡの存在下で一晩４２℃で行った。このフィルターを、０．５ｘＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳ中で３０分間６５℃にて洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ−０．１％ ＳＤＳで２０分間６５℃にて２回洗浄した。このフィルターを、Ｋｏｄａｋオートラジオグラフィフィルムに曝露して、その後現像した。
【００６５】
第１世代後のトランスジェニックマウスの慣用のスクリーニングをＰＣＲにより行った（図９を参照のこと）。２つのプライマーが、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の３’末端における４４２ｂｐ領域を増幅するように作用した。これらのプライマーの配列は、５’−Ｈｇｈ （５’−（配列番号９）ＧＴＣＴＡＴＴＣＧＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴ−３’）および３’−Ｈｇｈ（５’−（配列番号１０）ＡＣＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＴＧＡＧＴＧＧＡＣＣ−３’）である。１００ｎｇの精製したゲノムＤＮＡを、２００ｐＭの各プライマーと混合し、そして以下のプロトコルに従って増幅した：９５℃で５分間、次いで、９５℃で４５秒、５０℃で４５秒、７２℃で１分そして最後に７２℃で７分の伸長からなるサイクルを３０回。全てのサンプルを、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムの存在下で１．５％アガロースゲルで展開し、そして染色されたＤＮＡバンドを、ＵＶ光の下で可視化した。新しいプライマーセットを異種交配した二重トランスジェニックマウスのために開発した（図９）。これらは、二重トランスジェニック動物と単一トランスジェニック動物との区別を可能にする。
【００６６】
心エコー検査：心エコー検査を、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｏｎｏｓ ５５００（完全にマウス研究専用）および特別に開発した１２ＭＨｚのプローブを使用して実行した。心臓の寸法を、２Ｄ−誘導Ｍモード（２−Ｄ−ｇｕｉｄｅｄ Ｍ ｍｏｄｅ）画像から得、そしてリーディングエッジ法を用いて短軸および胸骨傍の長軸の画像を使用して個々のブラインド（ｂｌｉｎｄｅｄ）リーダーにより線を読み取る。動物は、ペントバルビタール（１５ｍｇ／Ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いて軽く鎮静させ得るが；マウスがこの手順に対して馴化するための短い「トレーニング」期間を受ける場合、麻酔なしで測定され得る。約９０％のマウスが、麻酔の心臓減圧の影響なしに心エコー図研究を受けるためにトレーニングされ得る。測定値は、左心室後壁（ＬＶＰＷ）、心室間中隔（ＩＶＳ）、および左心室内径（ＬＶＩＤ）からの３回の連続した心拍を平均する。駆出率短縮化（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）（ＦＳ）を使用して収縮期関数を見積もり、そして式ＦＳ＝（ＬＶＩＤ拡張期−ＬＶＩＤ収縮期）／ＬＶＩＤ拡張期×１００に従って計算する。
【００６７】
心筋梗塞手術：手術を、Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ ｍｏｕｓｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて慣用的に実施し、この手術は、他の公開された報告１８ ８ １４と本質的に同一である。手短に言うと、マウスを麻酔し（ペントバルビタール３３μｇ／ｇおよびケタミン３３μｇ／ｇ、ｉ．ｐ．）、そしてげっ歯類レスピレータに配置する（１回呼吸量０．５ｍｌ、１分あたり１２０回の呼吸数）。左の胸骨に平行に開胸して胸部を開けて、中央から左の前方下行動脈の領域を８−０縫合糸で結紮した。胸部を閉じて（５−０縫合糸で行う）、そしてこの動物をレスピレーターから離した。野生型マウスは、ウェット／ドライ肺重量の増加により評価された場合、代表的に心不全を発症する。擬似操作は、結紮プロセスを省略する。約７５％の動物が、首尾よく前方壁が収縮して手術に耐える。
【００６８】
ＣａＭＫＩＩ活性アッセイ：ＣａＭＫＩＩ活性を、ＡＣ３−Ｉマウスおよび同腹子コントロールにおいて、本発明者らの以前に公開した方法１を使用して、ＣａＭＫＩＶよりもＣａＭＫＩＩに対する選択性が約５０倍である９合成基質のｓｙｎｔｉｄｅ２を用いて、心臓（心室）全体のホモジェネートからアッセイした。
【００６９】
拡張型心筋症：収集データを、ＣａＭＫＩＩ阻害による拡張型心筋症の防止に対して示す。ＡＣ３−Ｃ（ＡＣ３−Ｉの不活性コンジナー）に連結されたＧＦＰを発現するコントロールトランスジェニックマウスを作製した。このマウスは、ＡＣ３−Ｉ−ＧＦＰマウスでは存在しないかなり重篤な拡張型心筋症を発症し、そして非常に高いレベルのＣａＭＫＩＩ活性を有する（図５）。
【００７０】
本出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術水準をより完全に記載するために、その全体が、本明細書中により本出願に参考として援用される。
【００７１】
種々の修飾および改変が、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明においてなされ得ることが当業者に明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書および本明細書中に開示される実施を考慮して当業者に明らかである。明細書および実施例は、例示的のみとみなされ、本発明の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲により示されることが意図される。
【００７２】
（参考文献）
【００７３】
【表１】
Figure 2005504829
【００７４】
【表２】
Figure 2005504829
【００７５】
【表３】
Figure 2005504829

【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩおよびＣａＭＫＩＶのドメイン構造、ならびに本研究のために操作されたＡＣ３−ＩトランスジェニックマウスおよびＡＣ３−Ｃトランスジェニックマウスにおいて発現されるＣａＭＫＩＩ阻害および制御ペプチドの図。ＣａＭＫＩＩおよびＣａＭＫＩＶは共に、ＣａＭ結合領域および自己阻害（ＡＩ）領域からなる調節ドメイン（黒の矩形）を有する。ＣａＭＫＩＩのＣａＭ結合領域（２９６〜３０９（ＣａＭＫＩＩに従って番号付けし、イタリック体で示される））は、ＣａＭＫＩＶと非常に類似し（同一アミノ酸に下線を付している）、そしてＣａＭＫＩＩ中のＣａＭ結合配列に対する阻害ペプチドは、ＣａＭＫＩＶの活性を同様に阻害する１７。ＡＣ３−Ｉは、Ｔｈｒ２８６（矢印を付した）の周りに集中するＣａＭＫＩＩのＡＩ領域上に示され、そしてＣａＭＫＩＩおよびＣａＭＫＩＶとは異なる。ＣａＭＫＩのＣａＭ結合領域もＡＩ領域も、ＣａＭＫＩＩにもＣａＭＫＩＶにも相同ではないが、ＡＩ領域とは対照的に、ＣａＭＫＩＩまたはＣａＭＫＩＶのＣａＭ結合領域に対する阻害ペプチドは、それにもかかわらずＣａＭＫＩを阻害し得る。なぜなら、ＣａＭ結合ドメインは、一般に、ヘリックス構造を共有するが、しばしば、一次配列の相同性を欠くからである１３。
【図２−１】ＡＣ３−Ｉマウスは、正常な心臓サイズおよび心収縮機能を有する。（ＡおよびＢ）心エコー検査による左心室寸法は、拡張期（Ａ）または収縮期（Ｂ）において、ＡＣ３−Ｉマウスと野生型（ＷＴ）同腹子コントロールとの間で有意には異ならない。（ＣおよびＤ）心室中隔の厚さは、拡張期（Ｃ）たは収縮期（Ｄ）において、ＡＣ３−ＩマウスとＷＴ同腹子コントロールとの間で異ならない。（Ｅ）左心室駆出率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）の短縮は、ベースラインにおいて、ＡＣ３−ＩとＷＴ同腹子コントロールとの間で異ならない。全てのパネルにおいて、白抜きの棒はＷＴであり、黒い棒はＡＣ３−Ｉトランスジェニック（ＴＧ）である。各ライン番号（パネルＥに示される）での、研究したマウスの数（ｎ）は、全てのパネルにおいて同じである。
【図２−２】ＡＣ３−Ｉマウスは、正常な心臓サイズおよび心収縮機能を有する。（ＡおよびＢ）心エコー検査による左心室寸法は、拡張期（Ａ）または収縮期（Ｂ）において、ＡＣ３−Ｉマウスと野生型（ＷＴ）同腹子コントロールとの間で有意には異ならない。（ＣおよびＤ）心室中隔の厚さは、拡張期（Ｃ）たは収縮期（Ｄ）において、ＡＣ３−ＩマウスとＷＴ同腹子コントロールとの間で異ならない。（Ｅ）左心室駆出率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）の短縮は、ベースラインにおいて、ＡＣ３−ＩとＷＴ同腹子コントロールとの間で異ならない。全てのパネルにおいて、白抜きの棒はＷＴであり、黒い棒はＡＣ３−Ｉトランスジェニック（ＴＧ）である。各ライン番号（パネルＥに示される）での、研究したマウスの数（ｎ）は、全てのパネルにおいて同じである。
【図２−３】ＡＣ３−Ｉマウスは、正常な心臓サイズおよび心収縮機能を有する。（ＡおよびＢ）心エコー検査による左心室寸法は、拡張期（Ａ）または収縮期（Ｂ）において、ＡＣ３−Ｉマウスと野生型（ＷＴ）同腹子コントロールとの間で有意には異ならない。（ＣおよびＤ）心室中隔の厚さは、拡張期（Ｃ）たは収縮期（Ｄ）において、ＡＣ３−ＩマウスとＷＴ同腹子コントロールとの間で異ならない。（Ｅ）左心室駆出率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ）の短縮は、ベースラインにおいて、ＡＣ３−ＩとＷＴ同腹子コントロールとの間で異ならない。全てのパネルにおいて、白抜きの棒はＷＴであり、黒い棒はＡＣ３−Ｉトランスジェニック（ＴＧ）である。各ライン番号（パネルＥに示される）での、研究したマウスの数（ｎ）は、全てのパネルにおいて同じである。
【図３】ＡＣ３−Ｉマウスは、心筋梗塞手術後に、野生型（ＷＴ）同腹子コントロールよりも、有意に減少した心臓ＣａＭＫＩＩ活性（Ａ）および有意により良い左心室駆出率短縮（Ｂ）を有する。ＣａＭＫＩＩ活性の測定値は、全心臓ホモジェネートからのものである。
【図４】ＧＦＰウェスタンブロットによる、ＡＣ３−ＩマウスおよびＡＣ３−Ｃマウスにおける導入遺伝子発現。ライン番号は、ウェスタンブロットにおける同一性および対応する定量的リン光画像化（データは、ＡＣ３−Ｉのライン５に対して正規化した）を示すために、丸括弧内に示される。全てのトランスジェニックマウスの遺伝的同一性を、サザン分析によって確認したが、ＡＣ３−Ｉのライン３は、この導入遺伝子を発現しなかった。
【図５】ＡＣ３−Ｃトランスジェニックマウス（ライン１由来）は、拡張型心筋症を発症する。左心室内径（ＬＶＩＤ）は、拡張期において、ＡＣ３−ＩマウスよりもＡＣ３−Ｉマウスにおいて有意に高く（Ｂ、＊＊Ｐ＜０．０１、ライン４由来）、拡張した表現型を示す。ＬＶＩＤは、収縮期の間にＡＣ３−ＩマウスにおけるよりもＡＣ３−Ｃ（Ｂ）マウスにおいて有意により小さくなり（Ａ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）、減少した心室駆出率を示す。ＬＶＩＤとは対照的に、心室中隔（ＩＶＳ）および左心室後壁（ＬＶＰＷ）は、拡張期でも収縮期でも、ＡＣ３−ＩとＡＣ３−Ｃとの間で有意には異ならない。（Ｃ）左心室駆出率短縮は、ＡＣ３−Ｉマウスと比較して、ＡＣ３−Ｃにおいて有意に低下される（Ｐ＜０．００１）。（Ｄ）心拍数は、ＡＣ３−ＩマウスとＡＣ３−Ｃマウスとの間で異ならない。
【図６】総ＣａＭＫＩＩ活性は、ＡＣ３−Ｃマウスおよび野生型（ＷＴ）同腹子と比較して、ＡＣ３−Ｉ由来の心室ホモジェネートにおいて、有意に低下する。（Ａ）総ＣａＭＫＩＩ活性。（Ｂ）Ｃａ２＋非依存性の、ＣａＭＫＩＩ活性の割合。
【図７Ａ】ＣａＭＫＩＩ阻害は、心筋梗塞手術後の収縮機能を改善する。心筋梗塞手術の３週間後の非麻酔マウスにおける心エコー測定により、ＣａＭＫＩＩ阻害したマウスにおける、有意に維持された左心室駆出率が明らかとなる。（Ａ）左心室（ＬＶ）駆出率短縮は、ＣａＭＫＩＩ阻害剤であるＫＮ−９３（体重１ｋｇ当たり１μｍｏｌおよび１０μｍｏｌ）で毎日処置したマウスおよびＣａＭＫＩＩ阻害を遺伝子導入により標的化したＡＣ３−Ｉマウスにおいて、野生型同腹子コントロール（ＷＴ）または不活性ＫＮ−９３同種ＫＮ−９２（体重１ｋｇ当たり３０μｍｏｌ）で毎日処置したＷＴマウスよりも、有意により高い。ＡＮＯＶＡによるＰ＜０．００１および星印は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ較正ｔ検定を使用した、ＷＴと比較した有意な差異を示す。
【図７Ｂ】ＣａＭＫＩＩ阻害は、心筋梗塞手術後の収縮機能を改善する。心筋梗塞手術の３週間後の非麻酔マウスにおける心エコー測定により、ＣａＭＫＩＩ阻害したマウスにおける、有意に維持された左心室駆出率が明らかとなる。（Ｂ）拡張期の間のＬＶ内径（ＬＶＩＤ）は、ＬＶ室拡張のマーカーである。群間で、拡張期の間に、ＬＶＩＤにおいて有意な差異は存在しなかった。
【図７Ｃ】ＣａＭＫＩＩ阻害は、心筋梗塞手術後の収縮機能を改善する。心筋梗塞手術の３週間後の非麻酔マウスにおける心エコー測定により、ＣａＭＫＩＩ阻害したマウスにおける、有意に維持された左心室駆出率が明らかとなる。（Ｃ）拡張期のＬＶ後壁（ＬＶＰＷ）の壁厚は、非梗塞壁のＬＶ肥大の測定値である。群間で、拡張期の間に、ＬＶＰＷにおいて有意な差異は存在しなかった。
【図７Ｄ】ＣａＭＫＩＩ阻害は、心筋梗塞手術後の収縮機能を改善する。心筋梗塞手術の３週間後の非麻酔マウスにおける心エコー測定により、ＣａＭＫＩＩ阻害したマウスにおける、有意に維持された左心室駆出率が明らかとなる。（Ｄ）心拍数は、他の全ての群と比較して、遺伝子導入によりＣａＭＫＩＩ阻害を標的化したＡＣ３−Ｉマウスにおいて、有意により減速した。
【図８Ａ】ＣａＭＫＩＩ阻害は、左心室拡張を低減し、そして拡張型心筋症において左心室収縮機能を改善する。二重トランスジェニック（ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋）は、ＣＡＮ＋トランスジェニックマウスと比較して、左心室（ＬＶ）拡張を低減し、そしてＬＶ駆出率短縮を改善した１０。非麻酔カルシニューリン（ＣＡＮ＋）トランスジェニックおよび交配二重トランスジェニックＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋マウスにおける心エコーによる測定値は、ＬＶ内径（ＬＶＩＤ）が、拡張期において有意に低減し、そして心室中隔（ＩＶＳ）およびＬＶ後壁（ＬＶＰＷ）が、ＣＡＮ＋マウスと比較して、ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮにおいて、拡張期において増大することを示し、このことは、ＣａＭＫＩＩ阻害を遺伝子導入によって標的化することによって、拡張型心筋症表現型の部分的救済を示す。測定パラメータは、上部４つのパネルと同じである：左心室径（ＬＶＩＤ）、心室中隔（ＩＶＳ）および左心室後壁（ＬＶＰＷ）。左心室収縮機能は、ＣＡＮ＋マウスと比較して、二重トランスジェニックＣＡ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋マウスにおいて有意に増大し、このことは、心臓ＣａＭＫＩＩ阻害を遺伝子導入により標的化することによる、収縮機能の改善を示す。対照的に、ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋トランスジェニック動物とＣＡＮ＋トランスジェニック動物との間で、心拍数に差異は存在しない。全てのマウスは、４〜８週齢の間であった。
【図８Ｂ】ＣａＭＫＩＩ阻害は、左心室拡張を低減し、そして拡張型心筋症において左心室収縮機能を改善する。二重トランスジェニック（ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋）は、ＣＡＮ＋トランスジェニックマウスと比較して、左心室（ＬＶ）拡張を低減し、そしてＬＶ駆出率短縮を改善した１０。非麻酔カルシニューリン（ＣＡＮ＋）トランスジェニックおよび交配二重トランスジェニックＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋マウスにおける心エコーによる測定値は、ＬＶ内径（ＬＶＩＤ）が、拡張期において有意に低減し、そして心室中隔（ＩＶＳ）およびＬＶ後壁（ＬＶＰＷ）が、ＣＡＮ＋マウスと比較して、ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮにおいて、拡張期において増大することを示し、このことは、ＣａＭＫＩＩ阻害を遺伝子導入によって標的化することによって、拡張型心筋症表現型の部分的救済を示す。測定パラメータは、上部４つのパネルと同じである：左心室径（ＬＶＩＤ）、心室中隔（ＩＶＳ）および左心室後壁（ＬＶＰＷ）。左心室収縮機能は、ＣＡＮ＋マウスと比較して、二重トランスジェニックＣＡ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋マウスにおいて有意に増大し、このことは、心臓ＣａＭＫＩＩ阻害を遺伝子導入により標的化することによる、収縮機能の改善を示す。対照的に、ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋トランスジェニック動物とＣＡＮ＋トランスジェニック動物との間で、心拍数に差異は存在しない。全てのマウスは、４〜８週齢の間であった。
【図８Ｃ】ＣａＭＫＩＩ阻害は、左心室拡張を低減し、そして拡張型心筋症において左心室収縮機能を改善する。二重トランスジェニック（ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋）は、ＣＡＮ＋トランスジェニックマウスと比較して、左心室（ＬＶ）拡張を低減し、そしてＬＶ駆出率短縮を改善した１０。非麻酔カルシニューリン（ＣＡＮ＋）トランスジェニックおよび交配二重トランスジェニックＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋マウスにおける心エコーによる測定値は、ＬＶ内径（ＬＶＩＤ）が、拡張期において有意に低減し、そして心室中隔（ＩＶＳ）およびＬＶ後壁（ＬＶＰＷ）が、ＣＡＮ＋マウスと比較して、ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮにおいて、拡張期において増大することを示し、このことは、ＣａＭＫＩＩ阻害を遺伝子導入によって標的化することによって、拡張型心筋症表現型の部分的救済を示す。測定パラメータは、上部４つのパネルと同じである：左心室径（ＬＶＩＤ）、心室中隔（ＩＶＳ）および左心室後壁（ＬＶＰＷ）。左心室収縮機能は、ＣＡＮ＋マウスと比較して、二重トランスジェニックＣＡ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋マウスにおいて有意に増大し、このことは、心臓ＣａＭＫＩＩ阻害を遺伝子導入により標的化することによる、収縮機能の改善を示す。対照的に、ＡＣ３−Ｉ＋／ＣＡＮ＋トランスジェニック動物とＣＡＮ＋トランスジェニック動物との間で、心拍数に差異は存在しない。全てのマウスは、４〜８週齢の間であった。
【図９Ａ】ＡＣ３−ＩまたはＡＣ３−Ｃと、カルシニューリン（ＣＡＮ）トランスジェニックマウスとの交配についてのストラテジー。（Ａ）四角は、交配対を示す。第一の比較は、ＣＡＮポジティブマウス間であるが、代替的比較（これは、図８に示されるデータを提供する）もまた示される。
【図９Ｂ】ＡＣ３−ＩまたはＡＣ３−Ｃと、カルシニューリン（ＣＡＮ）トランスジェニックマウスとの交配についてのストラテジー。（Ｂ）ＰＣＲの結果は、ＡＣ３−ＩマウスとＣＡＮマウスとの間の交配が首尾よいものであり、そして二重トランスジェニックマウスが、標準的なＰＣＲ方法を用いて同定され得ることを明らかにする。

Claims (74)

  1. 被験体において心筋梗塞後の心筋収縮不全を処置または予防する方法であって、該方法は、有効量のカルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）のインヒビターを該被験体に投与する工程を包含し、該インヒビターの投与により、該被験体において心筋梗塞後心筋収縮不全が処置または予防される、方法。
  2. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号２のペプチドを含むペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記インヒビターが、配列番号２のペプチドである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号４のペプチドを含むペプチドである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記インヒビターが、配列番号４のペプチドである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号６のペプチドを含むペプチドである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記インヒビターが、配列番号６のペプチドである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記インヒビターが、ＫＮ−９３である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．０５ｍｇ〜約５．０ｍｇの用量で投与される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．３ｍｇ〜約３．０ｍｇの用量で投与される、請求項１に記載の方法。
  11. 拡張型心筋症と診断された被験体において拡張型心筋症を処置または予防する方法であって、該方法は、有効量のカルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）のインヒビターを該被験体に投与する工程を包含し、該インヒビターの投与により、該被験体において拡張型心筋症が処置または予防される、方法。
  12. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号２のペプチドを含むペプチドである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記インヒビターが、配列番号２のペプチドである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号４のペプチドを含むペプチドである、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記インヒビターが、配列番号４のペプチドである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号６のペプチドを含むペプチドである、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記インヒビターが、配列番号６のペプチドである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記インヒビターが、ＫＮ−９３である、請求項１１に記載の方法。
  19. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．０５ｍｇ〜約５．０ｍｇの用量で投与される、請求項１１に記載の方法。
  20. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．３ｍｇ〜約３．０ｍｇの用量で投与される、請求項１１に記載の方法。
  21. 拡張型心筋症と診断された被験体において心筋収縮性を増加させる方法であって、該方法は、有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターを該被験体に投与する工程を包含し、該インヒビターの投与により、該被験体において心筋収縮性が増加される、方法。
  22. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号２のペプチドを含むペプチドである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記インヒビターが、配列番号２のペプチドである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号４のペプチドを含むペプチドである、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記インヒビターが、配列番号４のペプチドである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号６のペプチドを含むペプチドである、請求項２１に記載の方法。
  27. 前記インヒビターが、配列番号６のペプチドである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記インヒビターが、ＫＮ−９３である、請求項２１に記載の方法。
  29. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．０５ｍｇ〜約５．０ｍｇの用量で投与される、請求項２１に記載の方法。
  30. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．３ｍｇ〜約３．０ｍｇの用量で投与される、請求項２１に記載の方法。
  31. 低下した心筋収縮性と診断された被験体において心筋収縮性を増加する方法であって、該方法は、有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターを該被験体に投与する工程を包含し、該インヒビターの投与により、該被験体において心筋収縮性が増加される、方法。
  32. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号２のペプチドを含むペプチドである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記インヒビターが、配列番号２のペプチドである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号４のペプチドを含むペプチドである、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記インヒビターが、配列番号４のペプチドである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号６のペプチドを含むペプチドである、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記インヒビターが、配列番号６のペプチドである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記インヒビターが、ＫＮ−９３である、請求項３１に記載の方法。
  39. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．０５ｍｇ〜約５．０ｍｇの用量で投与される、請求項３１に記載の方法。
  40. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．３ｍｇ〜約３．０ｍｇの用量で投与される、請求項３１に記載の方法。
  41. 心筋梗塞後の心臓の構造的機能不全と診断された被験体において心筋収縮性を増加させる方法であって、該方法は、有効量のＣａＭＫＩＩのインヒビターを該被験体に投与する工程を包含し、該インヒビターの投与により、該被験体において心筋収縮性が増加される、方法。
  42. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号２のペプチドを含むペプチドである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記インヒビターが、配列番号２のペプチドである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号４のペプチドを含むペプチドである、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記インヒビターが、配列番号４のペプチドである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号６のペプチドを含むペプチドである、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記インヒビターが、配列番号６のペプチドである、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記インヒビターが、ＫＮ−９３である、請求項４１に記載の方法。
  49. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．０５ｍｇ〜約５．０ｍｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  50. 前記インヒビターが、体重１キログラムあたり約０．３ｍｇ〜約３．０ｍｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
  51. ＣａＭＫＩＩのインヒビターをコードする核酸を発現する、トランスジェニック動物。
  52. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号２のペプチドを含むペプチドである、請求項５１に記載のトランスジェニック動物。
  53. 前記インヒビターが、配列番号２のペプチドである、請求項５２に記載のトランスジェニック動物。
  54. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号４のペプチドを含むペプチドである、請求項５１に記載のトランスジェニック動物。
  55. 前記インヒビターが、配列番号４のペプチドである、請求項５４に記載のトランスジェニック動物。
  56. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号６のペプチドを含むペプチドである、請求項５１に記載のトランスジェニック動物。
  57. 前記インヒビターが、配列番号６のペプチドである、請求項５６に記載のトランスジェニック動物。
  58. ＣａＭＫＩＩのインヒビターをコードする核酸およびカルシニューリンをコードする核酸を発現する、二重トランスジェニック動物。
  59. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号２のペプチドを含むペプチドである、請求項５８に記載の二重トランスジェニック動物。
  60. 前記インヒビターが、配列番号２のペプチドである、請求項５９に記載の二重トランスジェニック動物。
  61. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号４のペプチドを含むペプチドである、請求項５８に記載の二重トランスジェニック動物。
  62. 前記インヒビターが、配列番号４のペプチドである、請求項６１に記載の二重トランスジェニック動物。
  63. 前記ＣａＭＫＩＩのインヒビターが、配列番号６のペプチドを含むペプチドである、請求項５８に記載の二重トランスジェニック動物。
  64. 前記インヒビターが、配列番号６のペプチドである、請求項６３に記載の二重トランスジェニック動物。
  65. 配列番号８のペプチドを含むペプチドをコードする核酸を発現する、トランスジェニック動物。
  66. 前記トランスジェニック動物が、配列番号８のペプチドをコードする核酸を発現する、請求項６５に記載のトランスジェニック動物。
  67. 構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
    ａ）請求項５１に記載の動物において心臓収縮性を測定する工程；
    ｂ）請求項５１に記載の該動物に化合物を投与する工程；
    ｃ）工程（ｂ）の該動物において心臓収縮性を測定する工程；および
    ｄ）工程（ａ）の該動物における心臓収縮性と比較して、工程（ｂ）の該動物における心臓収縮性の増加を検出する工程、
    を包含し、心臓収縮性の増加の検出により、構造的心臓疾患を処置し得る化合物が同定される、方法。
  68. 前記構造的心臓疾患が、拡張型心筋症または心筋収縮不全の少なくとも１つであり得る、請求項６７に記載の方法。
  69. 構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
    ａ）請求項５８に記載の動物において心臓収縮性を測定する工程；
    ｂ）請求項５８に記載の該動物に化合物を投与する工程；
    ｃ）工程（ｂ）の該動物において心臓収縮性を測定する工程；および
    ｄ）工程（ａ）の該動物における心臓収縮性と比較して、工程（ｂ）の該動物における心臓収縮性の増加を検出する工程、
    を包含し、心臓収縮性の増加の検出により、構造的心臓疾患を処置し得る化合物が同定される、方法。
  70. 前記構造的心臓疾患が、拡張型心筋症または心筋収縮不全の少なくとも１つであり得る、請求項６９に記載の方法。
  71. 構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
    ａ）請求項５１に記載の動物における脳ナトリウム利尿ペプチドを測定する工程；
    ｂ）請求項５１に記載の該動物に化合物を投与する工程；
    ｃ）工程（ｂ）の該動物における脳ナトリウム利尿ペプチドを測定する工程；および
    ｄ）工程（ａ）該動物における脳ナトリウム利尿ペプチドと比較して、工程（ｂ）の該動物における脳ナトリウム利尿ペプチドの増加を検出する工程、
    を包含し、脳ナトリウム利尿ペプチドの増加の検出により、構造的心臓疾患を処置し得る化合物が同定される、方法。
  72. 前記構造的心臓疾患が、拡張型心筋症または心筋収縮不全の少なくとも１つであり得る、請求項７１に記載の方法。
  73. 構造的心臓疾患を処置し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下：
    ａ）請求項５８に記載の動物における脳ナトリウム利尿ペプチドを測定する工程；
    ｂ）請求項５８に記載の該動物に化合物を投与する工程；
    ｃ）工程（ｂ）の該動物における脳ナトリウム利尿ペプチドを測定する工程；および
    ｄ）工程（ａ）該動物における脳ナトリウム利尿ペプチドと比較して、工程（ｂ）の該動物における脳ナトリウム利尿ペプチドの増加を検出する工程、
    を包含し、脳ナトリウム利尿ペプチドの増加の検出により、構造的心臓疾患を処置し得る化合物が同定される、方法。
  74. 前記構造的心臓疾患が、拡張型心筋症または心筋収縮不全の少なくとも１つであり得る、請求項７３に記載の方法。
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