JP2963986B2 - カルモジュリン依存性リン酸化酵素ｉｉの特異的阻害剤 - Google Patents
カルモジュリン依存性リン酸化酵素ｉｉの特異的阻害剤Info
- Publication number
- JP2963986B2 JP2963986B2 JP33635197A JP33635197A JP2963986B2 JP 2963986 B2 JP2963986 B2 JP 2963986B2 JP 33635197 A JP33635197 A JP 33635197A JP 33635197 A JP33635197 A JP 33635197A JP 2963986 B2 JP2963986 B2 JP 2963986B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- calmodulin
- peptide
- dependent kinase
- aip
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、カルモジュリン依
存性リン酸化酵素IIに対して選択的かつ強力な阻害活性
を示すペプチドに関する。更に本発明はカルモジュリン
依存性リン酸化酵素IIに対する優れた特異的阻害剤に関
する。本発明の阻害剤によれば、該カルモジュリン依存
性リン酸化酵素IIを介する各種の生理機能の解明に大い
に役立つものと期待される。
存性リン酸化酵素IIに対して選択的かつ強力な阻害活性
を示すペプチドに関する。更に本発明はカルモジュリン
依存性リン酸化酵素IIに対する優れた特異的阻害剤に関
する。本発明の阻害剤によれば、該カルモジュリン依存
性リン酸化酵素IIを介する各種の生理機能の解明に大い
に役立つものと期待される。
【０００２】
【従来の技術】カルモジュリン依存性リン酸化酵素II
（ＣａＭキナーゼII：ＣａＭＫII）は、１９８０年にラ
ット脳において神経伝達物質の一つであるセロトニン生
合成の律速酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼ
を活性化する、新しいタイプのカルモジュリン依存性リ
ン酸化酵素として発見された酵素である。最近の研究の
進展に伴い、本酵素が記憶などの高次神経機能の制御や
種々の細胞機能の調節に重要な役割を果たしていること
が明らかにされてきている。本酵素は、１）脳に多量に
存在する、２）可溶型と顆粒結合型がある、３）基質特
異性が広い、４）臓器特異性アイソフォ−ムが存在す
る、５）自己リン酸化によって活性を制御する、などの
際だった特徴を備えている。特に当該酵素は、脳神経系
において、神経伝達物質の生合成、神経伝達物質の放
出、記憶の基本原理と考えられている長期増強作用、記
憶、特に空間記憶などに関与していることが示唆されて
いる。
（ＣａＭキナーゼII：ＣａＭＫII）は、１９８０年にラ
ット脳において神経伝達物質の一つであるセロトニン生
合成の律速酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼ
を活性化する、新しいタイプのカルモジュリン依存性リ
ン酸化酵素として発見された酵素である。最近の研究の
進展に伴い、本酵素が記憶などの高次神経機能の制御や
種々の細胞機能の調節に重要な役割を果たしていること
が明らかにされてきている。本酵素は、１）脳に多量に
存在する、２）可溶型と顆粒結合型がある、３）基質特
異性が広い、４）臓器特異性アイソフォ−ムが存在す
る、５）自己リン酸化によって活性を制御する、などの
際だった特徴を備えている。特に当該酵素は、脳神経系
において、神経伝達物質の生合成、神経伝達物質の放
出、記憶の基本原理と考えられている長期増強作用、記
憶、特に空間記憶などに関与していることが示唆されて
いる。
【０００３】このため、かかるカルモジュリン依存性リ
ン酸化酵素IIの生体内での機能をさらに解明するために
はこれに対する選択的かつ強力な阻害剤が極めて有用で
あり、かかる阻害剤は該酵素の生理機能の解明に強力な
ツ−ルとなるものと考えられる。
ン酸化酵素IIの生体内での機能をさらに解明するために
はこれに対する選択的かつ強力な阻害剤が極めて有用で
あり、かかる阻害剤は該酵素の生理機能の解明に強力な
ツ−ルとなるものと考えられる。
【０００４】このような観点から現在開発されているカ
ルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの代表的な阻害剤と
しては、非ペプチド性のＫＮ６２、ＫＮ９３や、カルモ
ジュリン依存性リン酸化酵素IIのＮ−領域にある自己阻
害ドメインに由来する数々の合成ペプチド〔たとえば、
ＣａＭＫ(281-302Ala286)（アミノ酸配列：ＭＨＲＱＥ
ＡＶＤＣＬＫＫＦＮＡＲＲＫＬＫＧＡ）〕などがある。
しかし、ＫＮ６２、ＫＮ９３はカルモジュリン結合部位
を阻害することにより阻害活性を発揮するため、他のカ
ルモジュリン依存性リン酸化酵素をも阻害する結果、特
異性を有しないという問題があり、更にアッセイ系のカ
ルモジュリンの濃度いかんによって阻害活性が低くなる
という短所がある。また、ＣａＭＫ(281-302Ala286)等
の自己阻害ドメイン由来の合成ペプチドについては、従
来からさまざまな生理学的実験に用いられてきてはいる
ものの、最近、阻害力が低く特異性に問題があるという
指摘がなされている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA vo
1.91 (1994) 4761-4765）。
ルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの代表的な阻害剤と
しては、非ペプチド性のＫＮ６２、ＫＮ９３や、カルモ
ジュリン依存性リン酸化酵素IIのＮ−領域にある自己阻
害ドメインに由来する数々の合成ペプチド〔たとえば、
ＣａＭＫ(281-302Ala286)（アミノ酸配列：ＭＨＲＱＥ
ＡＶＤＣＬＫＫＦＮＡＲＲＫＬＫＧＡ）〕などがある。
しかし、ＫＮ６２、ＫＮ９３はカルモジュリン結合部位
を阻害することにより阻害活性を発揮するため、他のカ
ルモジュリン依存性リン酸化酵素をも阻害する結果、特
異性を有しないという問題があり、更にアッセイ系のカ
ルモジュリンの濃度いかんによって阻害活性が低くなる
という短所がある。また、ＣａＭＫ(281-302Ala286)等
の自己阻害ドメイン由来の合成ペプチドについては、従
来からさまざまな生理学的実験に用いられてきてはいる
ものの、最近、阻害力が低く特異性に問題があるという
指摘がなされている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA vo
1.91 (1994) 4761-4765）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、カルモジュ
リン依存性リン酸化酵素IIが関与する生理機能の解明に
有用なツールとなる、該酵素に対する強力でしかも特異
性の高い阻害剤を提供することを目的とする。
リン依存性リン酸化酵素IIが関与する生理機能の解明に
有用なツールとなる、該酵素に対する強力でしかも特異
性の高い阻害剤を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の実
情を踏まえて、公知阻害剤よりも一層カルモジュリン依
存性リン酸化酵素IIに対する阻害活性が強く、しかも特
異性に優れた阻害剤を開発すべく日夜研究を重ねていた
ところ、autocamtide-2 の特定部位の３乃至４個のアミ
ノ酸を他のアミノ酸で置換してなるペプチドが、上記目
的に適う阻害剤であることを見出して、本発明を開発す
るに至った。
情を踏まえて、公知阻害剤よりも一層カルモジュリン依
存性リン酸化酵素IIに対する阻害活性が強く、しかも特
異性に優れた阻害剤を開発すべく日夜研究を重ねていた
ところ、autocamtide-2 の特定部位の３乃至４個のアミ
ノ酸を他のアミノ酸で置換してなるペプチドが、上記目
的に適う阻害剤であることを見出して、本発明を開発す
るに至った。
【０００７】なお、本発明者らは、既にautocamtide-2
の９番目のアミノ酸（スレオニン）をアラニンで置換す
ることによって調製される autocamtide-2 related inh
ibitory peptide（以下、ＡＩＰという。アミノ酸配
列：ＫＫＡＬＲＲＱＥＡＶＤＡＬ）が、カルモジュリン
依存性リン酸化酵素IIに対して強力でかつ特異性の高い
阻害活性を有することを見出しているが (Biochemical
and Biophysical Research Communication vo1.212, N
o.3 (1995) 806-812)、本発明の阻害剤は、該ＡＩＰに
も増して一層阻害活性に優れるものである。
の９番目のアミノ酸（スレオニン）をアラニンで置換す
ることによって調製される autocamtide-2 related inh
ibitory peptide（以下、ＡＩＰという。アミノ酸配
列：ＫＫＡＬＲＲＱＥＡＶＤＡＬ）が、カルモジュリン
依存性リン酸化酵素IIに対して強力でかつ特異性の高い
阻害活性を有することを見出しているが (Biochemical
and Biophysical Research Communication vo1.212, N
o.3 (1995) 806-812)、本発明の阻害剤は、該ＡＩＰに
も増して一層阻害活性に優れるものである。
【０００８】すなわち、本発明は、下式 Lys-Lys-Ｘ-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr （１） （式中、ＸはAlaまたはLysである。）で示されるアミノ
酸配列を有するペプチドである。
酸配列を有するペプチドである。
【０００９】また、本発明は、上記式（１）で示される
アミノ酸配列を有するペプチドを含有するカルモジュリ
ン依存性リン酸化酵素IIに対する阻害剤である。
アミノ酸配列を有するペプチドを含有するカルモジュリ
ン依存性リン酸化酵素IIに対する阻害剤である。
【００１０】なお、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、
「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のた
めのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における
慣用記号に従うものとする。
ド等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、
「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のた
めのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における
慣用記号に従うものとする。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のペプチドは、式 Lys-Lys-Ｘ-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr （１） で示される特定のアミノ酸配列を有することを特徴とす
る。ここで、ＸはAlaまたはLysのいずれでもよく、本発
明においてAlaを有するペプチドをＶ10Ｆ−ＡＩＰと、
またLysを有するペプチドをＡ3Ｋ／Ｖ10Ｆ−ＡＩＰと称
する。カルモジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫ
II）に対する阻害活性の高さから、好ましくは、Ｘとし
てLysを有するＡ3Ｋ／Ｖ10Ｆ−ＡＩＰである。なお、本
発明のペプチドは、上記特定のアミノ酸配列を有する限
度において、そのＣ末端又はＮ末端のいずれか少なくと
も一方に１乃至数個のアミノ酸を有していてもよい。
る。ここで、ＸはAlaまたはLysのいずれでもよく、本発
明においてAlaを有するペプチドをＶ10Ｆ−ＡＩＰと、
またLysを有するペプチドをＡ3Ｋ／Ｖ10Ｆ−ＡＩＰと称
する。カルモジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫ
II）に対する阻害活性の高さから、好ましくは、Ｘとし
てLysを有するＡ3Ｋ／Ｖ10Ｆ−ＡＩＰである。なお、本
発明のペプチドは、上記特定のアミノ酸配列を有する限
度において、そのＣ末端又はＮ末端のいずれか少なくと
も一方に１乃至数個のアミノ酸を有していてもよい。
【００１２】本発明のペプチドは、Ｃａ2+／ＣａＭ依存
性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）と呼ばれる一
群の酵素に属するカルモジュリン依存性リン酸化酵素II
（ＣａＭキナーゼII：ＣａＭＫII）の活性を強く阻害す
る性質を有し、そのＩＣ50値は、実施例１で詳述する条
件において、Ｖ10Ｆ−ＡＩＰが約８ｎＭであり、Ａ3Ｋ
／Ｖ10Ｆ−ＡＩＰが約４.１ｎＭである。
性プロテインキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）と呼ばれる一
群の酵素に属するカルモジュリン依存性リン酸化酵素II
（ＣａＭキナーゼII：ＣａＭＫII）の活性を強く阻害す
る性質を有し、そのＩＣ50値は、実施例１で詳述する条
件において、Ｖ10Ｆ−ＡＩＰが約８ｎＭであり、Ａ3Ｋ
／Ｖ10Ｆ−ＡＩＰが約４.１ｎＭである。
【００１３】また後述するように、本発明のペプチド
は、ＣａＭＫIIと同様に多機能性ＣａＭキナーゼに属す
るカルモジュリン依存性リン酸化酵素IV（ＣａＫＭI
V）、またcyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵素（触媒サブ
ユニット）（ＰＫＡ）及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫ
Ｃ）の活性に対しては、ＣａＭＫIIの活性をほぼ完全に
阻害する濃度の約１０倍に相当する１μＭ濃度でも全く
影響を及ぼさず、ＣａＭＫIIに対して選択的・特異的な
阻害活性を有している。
は、ＣａＭＫIIと同様に多機能性ＣａＭキナーゼに属す
るカルモジュリン依存性リン酸化酵素IV（ＣａＫＭI
V）、またcyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵素（触媒サブ
ユニット）（ＰＫＡ）及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫ
Ｃ）の活性に対しては、ＣａＭＫIIの活性をほぼ完全に
阻害する濃度の約１０倍に相当する１μＭ濃度でも全く
影響を及ぼさず、ＣａＭＫIIに対して選択的・特異的な
阻害活性を有している。
【００１４】このため、本発明のペプチドは、ＣａＭＫ
II対する優れた阻害剤であり、ＣａＭＫIIの生理機能の
解明に極めて有用なツールとして有用である。すなわ
ち、本発明は、上記ペプチドのＣａＭＫIIに対する強力
かつ高い選択性を有する阻害剤としての用途をも提供す
るものである。
II対する優れた阻害剤であり、ＣａＭＫIIの生理機能の
解明に極めて有用なツールとして有用である。すなわ
ち、本発明は、上記ペプチドのＣａＭＫIIに対する強力
かつ高い選択性を有する阻害剤としての用途をも提供す
るものである。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に
説明する。但し、当該実施例はなんら本発明の技術的範
囲を制限するものではなく、当業者は本明細書の記載に
基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることがで
き、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
説明する。但し、当該実施例はなんら本発明の技術的範
囲を制限するものではなく、当業者は本明細書の記載に
基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることがで
き、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００１６】実施例１ カルモジュリン依存性リン酸
化酵素IIに対する阻害活性 本発明の２種類のペプチド（Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-
Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr：Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ；Lys-Ly
s-Lys-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr：Ａ3
Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ）のそれぞれの存在下でカルモジュリ
ン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の活性を測定す
ることによって、各ペプチドのＣａＭＫIIに対する阻害
活性を調べた。なお、両ペプチドは、ペプチド固相合成
機PSSM8（島津製作所製）を用いてfmocペプチド合成法
により合成し、常法に従って逆相高速液体クロマトグラ
フィーによって精製することにより調製した。
化酵素IIに対する阻害活性 本発明の２種類のペプチド（Lys-Lys-Ala-Leu-Arg-Arg-
Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr：Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ；Lys-Ly
s-Lys-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr：Ａ3
Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ）のそれぞれの存在下でカルモジュリ
ン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の活性を測定す
ることによって、各ペプチドのＣａＭＫIIに対する阻害
活性を調べた。なお、両ペプチドは、ペプチド固相合成
機PSSM8（島津製作所製）を用いてfmocペプチド合成法
により合成し、常法に従って逆相高速液体クロマトグラ
フィーによって精製することにより調製した。
【００１７】ＣａＭＫIIの酵素活性の測定は、［γ−32
Ｐ］ＡＴＰの存在下で該酵素を合成ペプチドsyntide-2
（アメリカンペプチドカンパニー社製）と３０℃で反応
させ、１分間あたりにsyntide-2に取り込まれた
［32Ｐ］リン酸の量を測定することにより行い、かかる
反応系において上記ペプチド（V10F-AIP、A3K/V10F-AI
P）を存在させることによって生じる酵素活性の低下か
ら、該ペプチドの阻害活性を評価した。なお、syntide-
2への［32Ｐ］リン酸の取り込み量は、ホスホセルロー
スペーパーを用いる Roskoskiの方法（Methods. Enzymo
l. 99, 3-6 (1983)）に従って測定した。
Ｐ］ＡＴＰの存在下で該酵素を合成ペプチドsyntide-2
（アメリカンペプチドカンパニー社製）と３０℃で反応
させ、１分間あたりにsyntide-2に取り込まれた
［32Ｐ］リン酸の量を測定することにより行い、かかる
反応系において上記ペプチド（V10F-AIP、A3K/V10F-AI
P）を存在させることによって生じる酵素活性の低下か
ら、該ペプチドの阻害活性を評価した。なお、syntide-
2への［32Ｐ］リン酸の取り込み量は、ホスホセルロー
スペーパーを用いる Roskoskiの方法（Methods. Enzymo
l. 99, 3-6 (1983)）に従って測定した。
【００１８】用いた酵素活性測定反応液の組成は、４０
ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ
酢酸マグネシウム、４０μＭ syntide-2、５０μＭ
［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ40、０．３
ｍＭ ＣａＣｌ2、１μＭ カルモジュリン、０．１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、各種濃度のペプチド（V10F-AIPまたはA3
K/V10F-AIP）であり、この反応液にＣａＭＫIIを０.３
０５４μｇ／ｍｌ添加して、反応を開始した。なお、Ｃ
ａＭＫIIは、J. Biochem. 115, 1075-1082 (1994)の記
載に従って、ラット大脳皮質から単離精製したものを用
いた。
ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ
酢酸マグネシウム、４０μＭ syntide-2、５０μＭ
［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ40、０．３
ｍＭ ＣａＣｌ2、１μＭ カルモジュリン、０．１ｍ
Ｍ ＥＧＴＡ、各種濃度のペプチド（V10F-AIPまたはA3
K/V10F-AIP）であり、この反応液にＣａＭＫIIを０.３
０５４μｇ／ｍｌ添加して、反応を開始した。なお、Ｃ
ａＭＫIIは、J. Biochem. 115, 1075-1082 (1994)の記
載に従って、ラット大脳皮質から単離精製したものを用
いた。
【００１９】結果を、Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについて図１に、
またはＡ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについて図２に示す。この
結果からわかるように、本発明のペプチド（Ｖ10Ｆ-Ａ
ＩＰ、Ａ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ）は、それぞれＣａＭＫIIを
濃度依存的に阻害した。該酵素の活性を５０％阻害する
のに必要なペプチド濃度（ＩＣ50値）は、Ｖ10Ｆ-ＡＩ
Ｐについては８ｎＭ、Ａ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについては
４.１ｎＭであった。
またはＡ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについて図２に示す。この
結果からわかるように、本発明のペプチド（Ｖ10Ｆ-Ａ
ＩＰ、Ａ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ）は、それぞれＣａＭＫIIを
濃度依存的に阻害した。該酵素の活性を５０％阻害する
のに必要なペプチド濃度（ＩＣ50値）は、Ｖ10Ｆ-ＡＩ
Ｐについては８ｎＭ、Ａ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについては
４.１ｎＭであった。
【００２０】かかるＩＣ50値から、本発明のペプチド
は、従来公知の阻害剤であるＣａＭＫ(281-302Ala286)
（ＩＣ50値＝２μＭ）及びＫＮ９３（ＩＣ50値＝２０μ
Ｍ）に比して、５００〜５０００倍もＣａＭＫIIに対す
る阻害活性が高いことが分かる。
は、従来公知の阻害剤であるＣａＭＫ(281-302Ala286)
（ＩＣ50値＝２μＭ）及びＫＮ９３（ＩＣ50値＝２０μ
Ｍ）に比して、５００〜５０００倍もＣａＭＫIIに対す
る阻害活性が高いことが分かる。
【００２１】また、ＡＩＰ（ＩＣ50値＝４０ｎＭ）に比
べても５〜１０倍も阻害活性が高く、本発明のペプチド
がカルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対して極めて
高い阻害活性を有することが明らかになった。
べても５〜１０倍も阻害活性が高く、本発明のペプチド
がカルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対して極めて
高い阻害活性を有することが明らかになった。
【００２２】実施例２ 反応特異性 実施例１と同様な方法で、本発明のペプチド（Ｖ10Ｆ-
ＡＩＰ、Ａ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ）の存在下で、カルモジュ
リン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の他、カルモ
ジュリン依存性リン酸化酵素IV（ＣａＭＫIV）、cyclic
ＡＭＰ依存性リン酸化酵素（触媒サブユニット）（ＰＫ
Ａ）及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）といった各種
のセカンドメッセンジャーを介する多機能性キナーゼに
ついてのそれぞれ酵素活性を測定することにより、本発
明のペプチドによる活性阻害がＣａＭＫIIに対して選択
的なものかどうかを調べた。
ＡＩＰ、Ａ3Ｋ/Ｖ10Ｆ-ＡＩＰ）の存在下で、カルモジュ
リン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の他、カルモ
ジュリン依存性リン酸化酵素IV（ＣａＭＫIV）、cyclic
ＡＭＰ依存性リン酸化酵素（触媒サブユニット）（ＰＫ
Ａ）及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）といった各種
のセカンドメッセンジャーを介する多機能性キナーゼに
ついてのそれぞれ酵素活性を測定することにより、本発
明のペプチドによる活性阻害がＣａＭＫIIに対して選択
的なものかどうかを調べた。
【００２３】なお、用いた酵素活性測定反応液の組成は
次の通りである。
次の通りである。
【００２４】(1)ＣａＭＫII： 実施例１と同じ (2)ＣａＭＫIV：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐ
Ｈ８．０）、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μＭ
syntide-2、５０μＭ ［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、２ｍＭ Ｄ
ＴＴ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2、０．８４μＭ カルモ
ジュリン、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、各種濃度のペプチド
（V10F-AIPまたはA3K/V10F-AIP）、３．４６μｇ／ｍｌ
のカルモジュリン依存性リン酸化酵素IV（ＣａＭＫIV） (3)ＰＫＡ：４０ｍＭ Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．
０）、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μＭ syntid
e-2、５０μＭ ［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、０．０１％ Ｔｗ
ｅｅｎ20、各種濃度のペプチド（V10F-AIPまたはA3K/V1
0F-AIP）、０．８μｇ／ｍｌのcyclicＡＭＰ依存性リン
酸化酵素（触媒サブユニット）（ＰＫＡ） (4)ＰＫＣ：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ
８．０）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μＭ
syntide-2、５０μＭ ［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、０．３５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ20、２μｇ／
ｍｌ 1,2-dioleoyl-rac-glycerol、２０．２μｇ／ｍ
ｌ ホスファチジルセリン、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、各
種濃度のペプチド（V10F-AIPまたはA3K/V10F-AIP）、
０．３２８μｇ／ｍｌのプロテインキナーゼＣ（ＰＫ
Ｃ） Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについての結果を図３に、またはＡ3Ｋ/
Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについての結果を図４に示す。この結果
からわかるように、カルモジュリン依存性リン酸化酵素
IV、cyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵素（ＰＫＡ）及びプ
ロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、いずれも本発明のペ
プチドの存在（１μＭ）によって殆どその活性に影響を
受けることがなかった。本発明のペプチドは、上記濃度
の1/10に相当する０．１μＭの濃度でほぼ完全にＣａＭ
ＫIIの活性を阻害することから（図３、図４）、該ペプ
チドがＣａＭＫIIに対して極めて選択性の高い阻害剤で
あることが分かる。
Ｈ８．０）、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μＭ
syntide-2、５０μＭ ［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、２ｍＭ Ｄ
ＴＴ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ2、０．８４μＭ カルモ
ジュリン、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、各種濃度のペプチド
（V10F-AIPまたはA3K/V10F-AIP）、３．４６μｇ／ｍｌ
のカルモジュリン依存性リン酸化酵素IV（ＣａＭＫIV） (3)ＰＫＡ：４０ｍＭ Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．
０）、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μＭ syntid
e-2、５０μＭ ［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、０．０１％ Ｔｗ
ｅｅｎ20、各種濃度のペプチド（V10F-AIPまたはA3K/V1
0F-AIP）、０．８μｇ／ｍｌのcyclicＡＭＰ依存性リン
酸化酵素（触媒サブユニット）（ＰＫＡ） (4)ＰＫＣ：４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ
８．０）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１００μＭ
syntide-2、５０μＭ ［γ-32Ｐ]ＡＴＰ、０．３５ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ20、２μｇ／
ｍｌ 1,2-dioleoyl-rac-glycerol、２０．２μｇ／ｍ
ｌ ホスファチジルセリン、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、各
種濃度のペプチド（V10F-AIPまたはA3K/V10F-AIP）、
０．３２８μｇ／ｍｌのプロテインキナーゼＣ（ＰＫ
Ｃ） Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについての結果を図３に、またはＡ3Ｋ/
Ｖ10Ｆ-ＡＩＰについての結果を図４に示す。この結果
からわかるように、カルモジュリン依存性リン酸化酵素
IV、cyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵素（ＰＫＡ）及びプ
ロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、いずれも本発明のペ
プチドの存在（１μＭ）によって殆どその活性に影響を
受けることがなかった。本発明のペプチドは、上記濃度
の1/10に相当する０．１μＭの濃度でほぼ完全にＣａＭ
ＫIIの活性を阻害することから（図３、図４）、該ペプ
チドがＣａＭＫIIに対して極めて選択性の高い阻害剤で
あることが分かる。
【００２５】以上実施例１及び実施例２で示されるよう
に、本発明のペプチド（V10F-AIP、A3K/V10F-AIP）は、
カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対して、従来公
知の阻害剤よりも格段に強い阻害活性を有し、選択性に
優れている。特に、本発明のペプチドの高い阻害活性
は、実験系の阻害剤量が軽減できるという経済的利点に
加えて、カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対する
選択性の向上にもまた寄与している。すなわち、有効阻
害剤濃度を低くできるということは、プロテインキナー
ゼＣが関与する系において、他の酵素を阻害する可能
性、つまりプロテインキナーゼＣ関与の経路を抑制して
しまう危険性を回避、軽減できるという点で有用であ
る。
に、本発明のペプチド（V10F-AIP、A3K/V10F-AIP）は、
カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対して、従来公
知の阻害剤よりも格段に強い阻害活性を有し、選択性に
優れている。特に、本発明のペプチドの高い阻害活性
は、実験系の阻害剤量が軽減できるという経済的利点に
加えて、カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対する
選択性の向上にもまた寄与している。すなわち、有効阻
害剤濃度を低くできるということは、プロテインキナー
ゼＣが関与する系において、他の酵素を阻害する可能
性、つまりプロテインキナーゼＣ関与の経路を抑制して
しまう危険性を回避、軽減できるという点で有用であ
る。
【００２６】これらのことから、本発明のペプチドは、
カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対する優れた阻
害剤である。近年、カルモジュリン依存性リン酸化酵素
IIの特異的阻害剤であるＡＩＰを用いて、生体機能及び
そのメカニズムが探索証明されつつあるが（Molecular
Brain Research 46 (1997) 338-342; THE JOURNAL OFBI
OLOGICAL CHEMISTRY Vol.270, No.51, pp.30257-30259
(1995); The Journalof Neuroscience, 1997,17(14) p
p.5357-5365; J. Neurochem. 68, pp169-175(1997))、
本発明によれば、ＡＩＰにも優って該酵素を介する各種
の生理機能の解明に大いに役立つものと期待される。
カルモジュリン依存性リン酸化酵素IIに対する優れた阻
害剤である。近年、カルモジュリン依存性リン酸化酵素
IIの特異的阻害剤であるＡＩＰを用いて、生体機能及び
そのメカニズムが探索証明されつつあるが（Molecular
Brain Research 46 (1997) 338-342; THE JOURNAL OFBI
OLOGICAL CHEMISTRY Vol.270, No.51, pp.30257-30259
(1995); The Journalof Neuroscience, 1997,17(14) p
p.5357-5365; J. Neurochem. 68, pp169-175(1997))、
本発明によれば、ＡＩＰにも優って該酵素を介する各種
の生理機能の解明に大いに役立つものと期待される。
【００２７】
配列番号： 1 配列の長さ： 13 amino acid 配列の型： amino acid トポロジー： linear 配列： Lys Lys Ala Leu Arg Arg Gln Glu Ala Phe Asp Ala Tyr 5 10 配列番号： 2 配列の長さ： 13 amino acid 配列の型： amino acid トポロジー： linear 配列： Lys Lys Lys Leu Arg Arg Gln Glu Ala Phe Asp Ala Tyr 5 10
【図１】実施例１の結果を示す図であり、本発明のペプ
チド（Ｖ１０Ｆ‐ＡＩＰ）が濃度依存的にカルモジュリ
ン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の活性を阻害す
ることを示す。
チド（Ｖ１０Ｆ‐ＡＩＰ）が濃度依存的にカルモジュリ
ン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の活性を阻害す
ることを示す。
【図２】実施例１の結果を示す図であり、本発明のペプ
チド（Ａ３Ｋ/Ｖ１０Ｆ‐ＡＩＰ）が濃度依存的にカル
モジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の活性
を阻害することを示す。
チド（Ａ３Ｋ/Ｖ１０Ｆ‐ＡＩＰ）が濃度依存的にカル
モジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）の活性
を阻害することを示す。
【図３】実施例２の結果を示す図であり、Ｖ１０Ｆ‐Ａ
ＩＰ（０.１μＭ）はカルモジュリン依存性リン酸化酵
素IV（ＣａＭＫIV）（○）、プロテインキナーゼＣ（Ｐ
ＫＣ）（□）、cyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵素（ＰＫ
Ａ）（■）に対してはその活性に影響を及ぼさず、カル
モジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）に対し
てその活性を特異的に阻害することを示す。
ＩＰ（０.１μＭ）はカルモジュリン依存性リン酸化酵
素IV（ＣａＭＫIV）（○）、プロテインキナーゼＣ（Ｐ
ＫＣ）（□）、cyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵素（ＰＫ
Ａ）（■）に対してはその活性に影響を及ぼさず、カル
モジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫII）に対し
てその活性を特異的に阻害することを示す。
【図４】実施例２の結果を示す図であり、Ａ３Ｋ/Ｖ１
０Ｆ‐ＡＩＰ（０.１μＭ）はカルモジュリン依存性リ
ン酸化酵素IV（ＣａＭＫIV）（○）、プロテインキナー
ゼＣ（ＰＫＣ）（□）、cyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵
素（ＰＫＡ）（■）に対してはその活性に影響を及ぼさ
ず、カルモジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫI
I）に対してその活性を特異的に阻害することを示す。
０Ｆ‐ＡＩＰ（０.１μＭ）はカルモジュリン依存性リ
ン酸化酵素IV（ＣａＭＫIV）（○）、プロテインキナー
ゼＣ（ＰＫＣ）（□）、cyclicＡＭＰ依存性リン酸化酵
素（ＰＫＡ）（■）に対してはその活性に影響を及ぼさ
ず、カルモジュリン依存性リン酸化酵素II（ＣａＭＫI
I）に対してその活性を特異的に阻害することを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 湯元 昇 大阪府池田市緑丘１丁目８番31号 工業 技術院大阪工業技術研究所内 (72)発明者 石田 敦彦 北海道旭川市西神楽４線５号 旭川医科 大学内 (72)発明者 亀下 勇 北海道旭川市西神楽４線５号 旭川医科 大学内 (72)発明者 奥野 幸子 北海道旭川市西神楽４線５号 旭川医科 大学内 (72)発明者 木谷 隆子 北海道旭川市西神楽４線５号 旭川医科 大学内 (72)発明者 藤澤 仁 北海道旭川市西神楽４線５号 旭川医科 大学内 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍ．，Ｖｏｌ．212，Ｎｏ. ３（1995）ｐ．806−812 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 下式： Lys-Lys-Ｘ-Leu-Arg-Arg-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp-Ala-Tyr （式中、ＸはAlaまたはLysである。）で示されるペプチ
ド。 - 【請求項２】請求項１記載のペプチドを含有することを
特徴とするカルモジュリン依存性リン酸化酵素IIの阻害
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33635197A JP2963986B2 (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | カルモジュリン依存性リン酸化酵素ｉｉの特異的阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33635197A JP2963986B2 (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | カルモジュリン依存性リン酸化酵素ｉｉの特異的阻害剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11152298A JPH11152298A (ja) | 1999-06-08 |
| JP2963986B2 true JP2963986B2 (ja) | 1999-10-18 |
Family
ID=18298236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33635197A Expired - Lifetime JP2963986B2 (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | カルモジュリン依存性リン酸化酵素ｉｉの特異的阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2963986B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002341938B2 (en) * | 2001-10-01 | 2007-08-30 | Vanderbilt University | Use of calmodulin kinase II inhibitors to treat myocardial dysfunction in structural heart disease |
| JPWO2006049215A1 (ja) * | 2004-11-02 | 2008-05-29 | 大日本住友製薬株式会社 | 自己免疫疾患を治療するための併用薬 |
-
1997
- 1997-11-19 JP JP33635197A patent/JP2963986B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，Ｖｏｌ．２１２，Ｎｏ．３（１９９５）ｐ．８０６−８１２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11152298A (ja) | 1999-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pucéat et al. | Differential regulation of protein kinase C isoforms in isolated neonatal and adult rat cardiomyocytes | |
| Sun et al. | Differential activation of CREB by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases type II and type IV involves phosphorylation of a site that negatively regulates activity. | |
| Chen et al. | Beta-adrenergic receptor kinase. Agonist-dependent receptor binding promotes kinase activation. | |
| Alessi et al. | Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF‐1. | |
| Otero | NM23/nucleoside diphosphate kinase and signal transduction | |
| Berg et al. | Regulation of collagen production by the β-adrenergic system | |
| Roth et al. | Phosphorylation of purified insulin receptor by cAMP kinase | |
| Fujisawa et al. | Regulatory mechanism of tyrosine hydroxylase activity | |
| US9896668B2 (en) | Substrate-mimetic AKT inhibitor | |
| Hashimoto et al. | Potent and preferential inhibition of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II by K252a and its derivative, KT5926 | |
| Lerosey et al. | The cAMP-dependent protein kinase phosphorylates the rap1 protein in vitro as well as in intact fibroblasts, but not the closely related rap2 protein | |
| Ando et al. | Enhanced insulin-induced mitogenesis and mitogen-activated protein kinase activities in mutant insulin receptors with substitution of two COOH-terminal tyrosine autophosphorylation sites by phenylalanine. | |
| Zhu et al. | Regulation of tetrahydrobiopterin biosynthesis in cultured dopamine neurons by depolarization and cAMP. | |
| JP2963986B2 (ja) | カルモジュリン依存性リン酸化酵素ｉｉの特異的阻害剤 | |
| Tanaka et al. | Poly (ADP-ribose) synthetase is phosphorylated by protein kinase C invitro | |
| Raju et al. | Purification and properties of bovine spleen N-myristoyl-CoA protein: N-myristoyltransferase. | |
| EP0793721B1 (fr) | Peptides capables de se lier au domaine sh3 de la proteine gap, sequences nucleotidiques codant pour ces peptides, leur preparation et utilisation | |
| GOPPELT-STRUEBE et al. | Independent regulation of cyclo-oxygenase 2 expression by p42/44 mitogen-activated protein kinases and Ca2+/calmodulin-dependent kinase | |
| Johnson et al. | Regulation of muscle phosphorylase activity by carnosine and anserine | |
| Kodaira et al. | Functional muscarinic m3 receptor expressed in gastric cancer cells stimulates tyrosine phosphorylation and MAP kinase | |
| Chang et al. | The regulation of thymidine kinase in HL-60 human promyeloleukemia cells. | |
| Francis et al. | Phosphodiesterase 5: molecular characteristics relating to structure, function, and regulation | |
| Tetta et al. | Inhibition of the synthesis of platelet-activating factor by anti-inflammatory peptides (antiflammins) without methionine. | |
| Dasarathy et al. | Elevation of angiotensin converting enzyme by 3‐isobutyl‐1‐methylxanthine in cultured endothelial cells: A possible role for calmodulin | |
| Fernandes et al. | Effect of the DEF motif on phosphorylation of peptide substrates by ERK |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |