WO2005012570A1 - Slc25a10による肥満治療に有効な化合物の評価方法 - Google Patents

Slc25a10による肥満治療に有効な化合物の評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005012570A1
WO2005012570A1 PCT/JP2004/010664 JP2004010664W WO2005012570A1 WO 2005012570 A1 WO2005012570 A1 WO 2005012570A1 JP 2004010664 W JP2004010664 W JP 2004010664W WO 2005012570 A1 WO2005012570 A1 WO 2005012570A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
nos
sirna
gene
slc25al0
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/010664
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hidehito Kotani
Hiraku Itadani
Shinji Mizuarai
Hiromitsu Araki
Satomi Miki
Original Assignee
Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to EP04747977A priority Critical patent/EP1666607A4/en
Priority to JP2005512495A priority patent/JPWO2005012570A1/ja
Priority to CA002534309A priority patent/CA2534309A1/en
Priority to US10/566,822 priority patent/US20060198788A1/en
Publication of WO2005012570A1 publication Critical patent/WO2005012570A1/ja
Priority to US12/607,326 priority patent/US20100076059A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity using the Sk25al0 gene or protein.
  • the present invention also relates to a method for examining obesity using the Slc25al0 gene or protein.
  • Obesity is a risk factor for various adult diseases represented by hypertension, diabetes, hyperlipidemia, ischemic heart disease and the like. In addition, many of these are chronic diseases, which are thought to cause medical expenses to rise in the future, and have become a major social problem.
  • Anti-obesity drugs are being developed to prevent such obesity, and at present, appetite suppressants and lipid absorption inhibitors are clinically used.
  • leptin, PPAR o /, neuropeptide Y, etc. are known as target molecules for research on anti-obesity drugs.Because the causes of force obesity are extremely diverse, the mechanism of action as a drug discovery target There is a long-awaited need for different target molecules.
  • Slc25al0 is known to be a six-transmembrane protein belonging to the group of transport proteins present in the inner membrane of mitochondria, and it has been known that rat and mouse genes (GenBank Accession No. NM— 013770: Kogarutan regarding closing of SEQ ID NO: 1). Biol. Chem. 273 (38), 24754-24759 (1998): Non-patent document 1) and human gene (GenBank Accession No. 1). NM— 012140: Report of cloning of Rokki column number 2) (Biochem. J. 344, 953—960 (1999): Non-patent document 2).
  • Non-Patent Document 2 expression of Slc25al0 in mast cells is reduced when mice are exposed to cold, and Slc25a is expressed when mouse 3T3-L1 cells are treated with insulin.
  • Non-patent document 1 Giuseppe Fiermonte, et al., J. Biol. Chem. 273 (38)
  • Non-Patent Document 2 Kallol Das, et al., Biochem. J. 344, 953-960 (199 9)
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the related art, and has as its object to provide a method for evaluating a compound, such as screening for a therapeutic drug for obesity. Another object of the present invention is to provide a method for obesity testing that can be determined at the molecular level.
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that there is a certain correlation between the expression level of the Slc25al0 gene and the body weight, and at the same time, the expression level of the Slc25al0 gene.
  • the present inventors have found that there is a correlation between a change in the expression of a molecule involved in fatty acid synthesis and a change in the expression level of a molecule involved in fatty acid synthesis, and completed the present invention.
  • the present invention provides the following method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity (1
  • a method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity comprising: (2) administering or contacting the test compound with a test animal or a test cell having a fusion gene of the expression control region of the Slc25al0 gene and a reporter gene, and a test animal or a test cell of the reporter gene. Detecting a change in the expression level of the compound in a subject.
  • the change in the expression level is preferably a decrease in the expression level.
  • the method may further include a step of detecting a change in at least one of the expression level of ACC1 (acetyl-CoA carboxylase 1), malonyl-CoA abundance, and fatty acid abundance.
  • the present invention also provides the following methods (3) and (4) for evaluating compounds effective for treating or preventing obesity.
  • a method for evaluating a compound effective for treating or preventing obesity characterized by comprising:
  • the present invention also provides a therapeutic or prophylactic agent for obesity, comprising a compound obtained by any of the above-mentioned evaluation methods as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for inhibiting fatty acid synthesis, which comprises reducing the expression level of the Slc25al0 gene.
  • means for decreasing the expression level of the Slc25al0 gene is not particularly limited, but it is preferable to use RNAi (RNA interference).
  • RNAi RNA interference
  • the RNA of Slc25al0 can be achieved, for example, by using the following siRNA (small interfering RNA).
  • siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOS: 3 and 4 siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOS: 5 and 6, siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOs: 7 and 8, and nucleic acid consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOs: 9 and 10 siRNA, an siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOS: 11 and 12, the nucleic acid of SEQ ID NOs: 17 and 18, an siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOs: 21 and 22, and an siRNA consisting of the nucleic acids of SEQ ID NOs: 21 and 22 SiRNA consisting of various nucleic acids Consisting of the nucleic acids described in SEQ ID NOS: 25 and 26, the nucleic acids described in SEQ ID NOs: 27 and 28, the nucleic acids described in SEQ ID NOs: 29 and 30, and the nucleic acids described in SEQ ID NOs: 31 and 32 siRNA, an siRNA consisting of the
  • the present invention also provides a method for treating or preventing obesity, which comprises a step of reducing the expression level of the Slc25al0 gene.
  • means for reducing the expression level of the Slc25al0 gene is not particularly limited, but is preferably suppressed by RNAi.
  • RNAi it is preferable to use the siRNA that is achieved by using the above-described siRNA, particularly the nucleic acid having the nucleic acid ability described in SEQ ID NOS: 9 and 10, and the siRNA having the nucleic acid ability described in SEQ ID NOS: 41 and 42.
  • the present invention also provides the following obesity test methods (1)-(5).
  • a method for examining obesity which comprises measuring the expression level or a change in the expression level of the Slc25al0 gene in a test tissue or test cell.
  • a method for detecting obesity which comprises measuring the expression level or a change in the expression level of Slc25al0 protein in a test tissue or test cell.
  • An obesity test method characterized by detecting a polymorphism present in the Slc25al0 gene in a test tissue or test cell.
  • the present invention further provides a siRN comprising the nucleic acid set forth in SEQ ID NOS: 9 and 10.
  • A and an Slc25al0 expression inhibitor, a fat synthesis inhibitor, and a therapeutic or preventive agent for obesity, comprising the siRNA.
  • the present invention further provides a siR comprising the nucleic acid set forth in SEQ ID NOS: 41 and 42.
  • Slc25al0 expression inhibitor a fat synthesis inhibitor, and a therapeutic or preventive agent for obesity, which provide NA and contain the siRNA.
  • the compound evaluation method or test method of the present invention it is possible to provide a compound evaluation method such as screening for a therapeutic agent for obesity.
  • a compound evaluation method such as screening for a therapeutic agent for obesity.
  • an obesity test method that can be determined at the molecular level.
  • FIG. 1 is a micrograph of HEK293 cells.
  • A represents HEK293 cells treated with CCCP
  • (b) represents HEK293 cells not treated with CCCP.
  • Fig. 2 is a view showing the result of analyzing the relationship between Slc25al0 and mitochondrial proton gradient by flow cytometry.
  • (a) shows HEK293 cells treated with CCCP
  • (b) shows untreated HEK293 cells
  • (c) shows HEK293 cells transfected with Slc25al0.
  • FIG. 3 is a graph showing the result of analyzing the relationship between Slc25al0 and mitochondrial proton gradient with a fluorimeter.
  • FIG. 4 is a view showing the expression level of the Slc25al0 gene in each tissue.
  • FIG. 5 shows (a) mouse Slc25al0 gene and (b) before and after differentiation into adipocytes.
  • FIG. 6 is a graph showing the relative expression levels of the Slc25alO gene in cells transfected with various siRNAs.
  • A shows the results with mouse cells, and
  • B shows the results with human cells.
  • SCR refers to cells transfected with scrambled siRNA that do not produce RNAi in mammals.
  • FIG. 7 shows (a) Slc25 in cells transfected with siRNA (H4 or HI0). It is a graph showing the expression level of alO gene and (b) ACCl gene.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression level of the ACC1 gene in cells overexpressing the Slc25alO gene.
  • FIG. 9 is a graph showing the level of malonyl-CoA in cells transfected with siRNA (M8).
  • FIG. 10 is a micrograph of 3T3-L1 cells differentiated into adipocytes.
  • A shows cells before differentiation
  • b shows cells after differentiation
  • c shows cells treated with scr-siRNA
  • d shows cells after differentiation with siRNA (M8 ) Represents cells treated.
  • FIG. 11 is a graph showing the amount of accumulated fat in each cell.
  • the "expression level” in the present invention refers to the absolute amount or relative amount of a transcript of the Slc25al0 gene.
  • the gene includes either DNA or mRNA.
  • the “expression level” refers to the absolute or relative amount of the translation product of the Slc25alO gene.
  • test animal in the present invention is not particularly limited in its species, and includes, for example, mice, rats, puppies, dogs, and monkeys.
  • test tissue in the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue capable of extracting biopower at the time of performing an obesity test.
  • liver tissue adipose tissue, muscle tissue, and blood tissue are preferable.
  • blood tissue is preferable among the above-mentioned tissues.
  • animal species from which these tissues are derived are not particularly limited, but humans are preferred because the main use of the present invention is clinical use in humans.
  • test cell in the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can be extracted from a living body when an obesity test is performed. From the viewpoint of, for example, hepatocytes, fat cells (white fat cells, brown fat cells, etc.) And muscle cells (myoblasts, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, etc.), knee cells (knee islet cells, etc.), and blood cells.
  • the species of the animal from which the tissue is derived is not particularly limited, but human is preferred because the main use of the present invention is clinical use in humans.
  • the term "obesity” in the present invention is defined as a state in which adipose tissue is excessively accumulated, and is accompanied by complications such as diabetes and hypertension or visceral fat in addition to general obesity. Also includes “obesity”. Further, “obesity” in the present invention also means a state in which the body weight has increased relatively as compared to the original body weight when the body weight was controlled by drug administration or the like.
  • test in the present invention includes not only the determination of obesity but also the prediction of future obesity.
  • Slc25al0 that is useful in the present invention will be described.
  • Slc25al0 is present in the mitochondria of brown adipocytes and has about 36-38% homology with the UCP family involved in thermogenesis.
  • UCP is a protein that causes the production of heat in mitochondria. Specifically, proton force S generated by oxidation of glucose and fatty acids, and mitochondrial inner membrane force are released outside the membrane by respiratory chain enzymes, resulting in a proton gradient. UCP acts as a channel to transport protons into the inner membrane, eliminating strong proton gradients. As a result, oxidation of fatty acids and the like is accelerated by protons in the inner membrane, and heat production is promoted. That is, UCP has a function of promoting energy consumption in a living body.
  • Slc25al0 has an activity opposite to that of UCP in heat production in mitochondria. That is, Slc25al0 is present in the inner mitochondrial membrane and has an activity to increase the proton gradient between the inner and outer membranes. As a result, it has a function of storing energy without producing heat. Therefore, the present inventors believe that inhibiting the function of Slc25alO enhances energy consumption and contributes to the elimination of obesity.
  • the present inventors have also found that there is a correlation between a change in the expression level of the Slc25al0 gene and a change in the expression level of a molecule involved in fatty acid synthesis. That is, Slc25al When the expression level of gene 0 is suppressed, the expression level of ACC1 (acetyl CoA carboxylase 1), which is a gene involved in fatty acid synthesis, and the amount of malonyl CoA, a precursor of fatty acid, decrease, while the Slc25al0 gene Increases when the expression level of is increased. This proves that Slc25alO is a molecule that exists in or is deeply involved in the fatty acid synthesis pathway.
  • ACC1 acetyl CoA carboxylase 1
  • Fatty acids are constituents of lipids, and free fatty acids in adipose tissue are converted into triacylglycerol and stored in fat cells in the body. That is, if the synthesis of fatty acids can be inhibited, the storage of triacylglycerol in adipocytes can be inhibited.
  • Slc25al0 and the genes or molecules involved in the synthetic pathway can reduce fatty acid synthesis ability by reducing the expression level, and therefore the behavior (expression level, activity, etc.) of the gene or molecule is used as an index. Furthermore, it is possible to evaluate and select a compound effective for obesity.
  • test compound is administered to a test animal or test cell and the Slc25al0 gene expression level, which fluctuates when the test compound is contacted, is measured, or the test compound is brought into contact with the Slc25al0 protein to determine the effect on the activity of the protein. By examining the test compound, the test compound can be evaluated.
  • a test compound is administered to or contacted with a test animal or test cell, and the test compound is added to the test animal or test cell.
  • a method for confirming whether or not to regulate the expression level of the Slc25al0 gene or a gene functionally equivalent to the gene is described. This method makes it possible to evaluate a compound that is effective for treating or preventing obesity. Specifically, the test compound is evaluated in the following procedure. First, a test compound is administered or brought into contact with a test animal or a test cell.
  • test compound is not limited as long as it is a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent for obesity, regardless of its structure or properties, and the compound species is not limited.
  • the method of administering the test compound to the test animal is not particularly limited. Specifically, for example, oral administration, parenteral administration (for example, transdermal administration, intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection), and the like. No.
  • the method of bringing the test compound into contact with the test cells is not particularly limited.Specifically, for example, they are mixed in a solution such as a culture solution or a buffer solution (a phosphate buffer solution or the like) and brought into contact with each other. Method.
  • test compound regulates the expression level of the Slc25al0 gene or a gene functionally equivalent to the gene in the test animal or test cell.
  • a change in the expression level of the gene is determined by a gene amplification method such as RT-PCR using the control before the administration or the contact as described above as a control.
  • the detection and comparison can be performed by a method using a DNA microarray, a Northern hybridization method, or the like.
  • an animal or a cell into which a fusion gene of the expression control region of the gene and a reporter gene has been artificially introduced may be used.
  • specific examples of the reporter gene include a ⁇ -galactosidase gene, a luciferase gene and a green fluorescens protein gene.
  • the term “gene functionally equivalent to the Slc25alO gene” refers to a gene having a different base sequence from the Slc25al0 gene, but showing relatively high homology and having the same or similar activity as Slc25al0. Is shown.
  • the homology is not particularly limited as long as it is functionally equivalent, but the homology of the base sequence is preferably 70 to 100%, more preferably 80 to 100%. 90-100. Particularly preferred is / o. When the homology is lower than the lower limit, there is a high possibility that Sk25al0 does not exhibit the same or similar function.
  • the homology between the domain having a function specific to Slc25alO and the base sequence corresponding to the domain is high, and in this case, the Slc25alO gene May have the same or similar function as.
  • Such a gene can be suitably used even if the homology of the nucleotide sequence is out of the above range.
  • the ratio The gene having relatively high homology may be a gene in which one or more bases in the Slc25alO gene are naturally or artificially substituted, deleted, disabled, or Z or inserted.
  • the expression level of the Slc25al0 gene or a gene functionally equivalent to the Slc25al0 gene when the test compound is administered or contacted is 30 % or more, Preferably, when it is reduced by 50% or more, the test compound can be evaluated as a compound effective for treating or preventing fertility.
  • a test compound is administered or contacted with a test animal or test cell, and the test animal or test cell is administered.
  • a test compound is administered or contacted with a test animal or test cell, and the test animal or test cell is administered.
  • the second evaluation method is used to evaluate the decrease in the expression level of the Slc25al0 gene or a gene functionally equivalent to the gene as an index. Is preferably performed.
  • a method for detecting a change in the expression level of the gene there is no particular limitation, and the change before the administration or contact is used as a control, and the change in the expression level of the gene is determined by a gene amplification method such as RT-PCR, It can be carried out by detection and quantification by a method using a DNA microarray or a Northern hybridization method. Alternatively, an animal or a cell into which a fusion gene of the expression control region of the gene and a reporter gene has been artificially introduced may be used. In this case, specific examples of the reporter gene include a / 3_galactosidase gene, a luciferase gene and a green fluorescens protein gene.
  • the expression level of the Slc25al0 gene or the gene functionally equivalent to the Slc25al0 gene when the test compound is administered or contacted is 30% or more, Preferably, when the concentration is reduced by 50% or more, the test compound is fertilized. It can be evaluated as a compound that is effective in treating or preventing a disease.
  • a step of detecting at least one change among the expression level of ACC1, malonyl-CoA level, and fatty acid level, which occurs with a change in the expression level of the Slc25al0 gene You may include it.
  • the ACC1 may be an ACC1 protein and a gene, or may be a deviation.
  • the method for detecting a change in the expression level of the ACC1 protein or gene is not particularly limited, and examples thereof include a Western blotting method, a Southern hybridization method, a Northern hybridization method, and a DNA chip.
  • RT PCR.
  • the method for detecting the change in the amount of malonyl-CoA is not particularly limited. For example, malonyl-CoA derived from cells partially purified by reverse phase chromatography or the like may be used to detect fatty acid synthase (fatty a cid synthase). And a method of reacting with radiolabeled acetyl-CoA and measuring the amount of labeled fatty acid produced.
  • the amount of expression of the ACC1 gene or ACC1 protein or the amount of malonyl CoA or fatty acid when the test compound is administered or contacted is 5% or more, If the decrease is preferably 10% or more, the test compound can be evaluated as an effective compound for treating or preventing obesity.
  • test compound is brought into contact with a test animal, a test cell, or the Sk25al0 protein to confirm whether or not the test compound affects the activity of the protein, thereby being effective in treating or preventing obesity.
  • Compounds can be evaluated.
  • test compound is evaluated according to the following procedure. First, a test animal, a test cell, or a test compound is brought into contact with Slc25al0 protein.
  • the test compound is not limited as long as it is a candidate compound for a therapeutic or prophylactic agent for obesity, regardless of its structure or properties, and the species of the compound is not limited.
  • the method of administering the test compound to the test animal is not particularly limited. Specifically, for example, oral administration, parenteral administration (for example, transdermal administration, intramuscular injection, Intravenous injection, subcutaneous injection).
  • the method for bringing the test compound into contact with the test cells is not particularly limited.Specifically, for example, a method in which the two are brought into contact by mixing them in a solution such as a culture solution or a buffer solution (a phosphate buffer solution, etc.) Is mentioned.
  • the method for bringing the test compound into contact with the protein is not particularly limited, and specifically includes, for example, a method of mixing and contacting in a solution such as a buffer (phosphate buffer or the like).
  • the conditions for measuring the activity of the protein may be appropriately set depending on the properties of the protein used. Specifically, for example, in the case of the Slc25al0 protein, a change in the proton gradient between the inside and outside of the inner mitochondrial membrane can be used as an index (for example, Yu XX et al, Biochem. J (2001) 353, 369-375).
  • the test compound is Can be evaluated as a compound effective for treating or preventing obesity.
  • a therapeutic or diagnostic agent for obesity is screened, and the efficacy or safety of these agents is evaluated. Can select an appropriate drug in a bespoke treatment.
  • the organism eg, human
  • the organism eg, human
  • the organism is obese. It is possible to detect and diagnose the power. In addition, it is possible to not only detect the state of obesity at the time of the test, but also to predict whether or not the subject will become obese in the future.
  • a test tissue or a test cell is extracted from a living body to be detected.
  • the extraction can be performed by a known method.
  • RNA total RNA or mRNA
  • RNA can be prepared by a known method. For example, Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 2nd EDITION (1989) (by T. Maniatis: Cold Spring Harbor Laboratory Press) 7.3—7.36 You can do it with reference.
  • the expression level is measured by, for example, a gene amplification method such as RT-PCR, a method using a DNA microarray (for example, a DNA chip manufactured by Affymetrix), or a northern hybridization method. can do. Further, the expression level can also be measured by in situ hybridization, in situ hybridization, or the like using a test tissue or test cell.
  • the above-mentioned measurement of the expression level is performed before and after a period in which the expression level is predicted to change (for example, before and after administration of a therapeutic agent for obesity). Then, the difference in the expression level may be measured. Specifically, in a test tissue or a test cell, if the expression level of the Slc25al0 gene is significantly increased around the period in which the expression level of the Slc25al0 gene is predicted to change, the body weight has increased or It can be diagnosed that it may increase in the future. On the other hand, when the expression level is reduced, it can be diagnosed that the body weight has been reduced or may be reduced in the future.
  • the organism eg, human
  • the organism eg, human
  • the organism is obese. It is possible to detect and diagnose whether or not there is. Further, it is possible to not only detect the obesity state at the time of the test, but also to predict whether the subject may become obese or lean in the future.
  • Methods for measuring the expression level of the protein include a method for quantifying the isolated protein and a method for measuring the blood concentration of the protein, and the specific method is not particularly limited.
  • a specific example of a method for quantifying a protein whose biological strength is also isolated is as follows. First, Slc25al0 protein is prepared from a test tissue or a test cell. Such a protein Can be prepared by a known method. The expression level of the protein thus prepared can be determined by, for example, a method using a protein chip (eg, a protein chip system manufactured by CIPHERGEN) or an immunological method (eg, ELISA, EIA, Western blotting). Can be measured.
  • a protein chip eg, a protein chip system manufactured by CIPHERGEN
  • an immunological method eg, ELISA, EIA, Western blotting
  • the expression level can also be measured by immunostaining using a test tissue or a test cell.
  • a specific example of a method of measuring the blood concentration of a protein includes a method of quantifying the Slc25alO protein by the above-described immunological method using blood collected from a living body.
  • the result can be analyzed to determine whether the subject is obese or lean. That is, since the present invention revealed that the expression level of Slc25al0 protein and body weight have a certain correlation, by comparing the above test results with the expression level of Slc25al0 protein in a control group (healthy person, etc.). And the degree of obesity can be determined. Further, according to the test method of the present invention, it is possible to predict not only the obesity state at the time of the test but also the possibility of obesity or leanness in the future.
  • the expression level is measured before and after a period in which the expression level is predicted to change (for example, before and after administration of a therapeutic agent for obesity). What is necessary is just to measure the difference of expression level. Specifically, in a test tissue or a test cell, before or after the above-mentioned period in which the expression level of the Sk25al0 protein is predicted to change, if the expression level significantly increases, the body weight increases or It can be diagnosed that it may increase in the future.
  • the Slc25alO gene 'protein interacts directly or indirectly with many other molecules to exert a unique function.
  • the present inventors have found that there is a correlation between the expression level of the Slc25a10 gene and changes in various molecules (e.g., ACC1 and malonyl CoA) on the fatty acid synthesis pathway, and that the expression level of the Slc25al0 gene increases. Increased expression of molecules on the fatty acid synthesis pathway, and decreased expression of molecules on the fatty acid synthesis pathway due to decreased expression of the Slc25al0 gene.
  • the This means that the activation state of the fatty acid synthesis pathway can be detected by measuring the expression level of the Slc25al0 gene ′ protein. As a result, it becomes possible to predict and examine fat accumulation due to promotion of fatty acid synthesis.
  • the amount of malonyl-CoA can be calculated using malonyl-CoA as a substrate to cause a fatty acid synthesis reaction and using the amount of radioisotope uptake as an index.
  • the body weight is increased. Can be diagnosed as having increased or may increase in the future. On the other hand, it can be diagnosed that the weight has decreased or may decrease in the future when the amount of change has decreased.
  • the expression level of the S1c25al0 gene or protein may change, or the activity of the protein may be abnormal, depending on the presence and type of the polymorphism. Therefore, by detecting such a genetic polymorphism, it is possible to obtain knowledge on the expression and activity of S Ic25al0, and further to conduct a test for obesity in the test tissue or the test subject from which the test cells were derived. it can.
  • Specific examples of such genetic polymorphisms include minisatellite, microsatellite, and SNP (single nucleotide polymorphism: single nucleotide polymorphism) in column f.
  • Polymorphisms in the Slc25al0 gene can be detected as follows. That is, in the Slc25al0 gene, a nucleotide sequence is determined for an obese subject whose detection level is to be detected, and a polymorphic site is detected. Calculate the allele frequency of the detected polymorphic site and significantly increase or decrease in the subject population Finding alleles identifies polymorphisms that correlate with obesity. Genetic polymorphisms detected in this way include, for example, analysis of the base sequence at the polymorphic site in genomic DNA derived from a subject, and changes in the DNA that vary depending on the type of bases present at the polymorphic site. Clinically detectable by methods that utilize differences in physicochemical properties or differences in restriction enzyme sites, methods that use appropriate detection probes to detect the polymorphic sites, methods that use mass spectrometry, etc. .
  • Slc25al0 In vivo, many proteins exert predetermined physiological functions by interacting with other proteins. Similarly, for Slc25al0, its expression level is controlled by the action of a transcription factor or the like that controls its expression, for example, and it exhibits a predetermined function.
  • the Slc25al0 protein has a certain correlation with the expression level and the activity of the Slc25al0 gene that interacts with the Slc25al0 protein and affects the expression level of the Slc25al0 gene. Therefore, the other behavior can be estimated.
  • interaction means that the Slc25al0 protein and another protein act directly or indirectly.
  • the interaction of the Slc25al0 protein with another protein physically makes Examples include an action that causes modification and the like, and an action that interacts via the third protein and indirectly affects the expression of the Slc25alO protein.
  • proteins include, for example, proteins that exert physiological functions upstream or downstream of Slc25al0 protein in signal transmission via Slc25alO protein.
  • the method for detecting the expression level or activity of such a protein is not particularly limited as long as a suitable means is appropriately selected according to the type of the target protein.
  • the obesity detection method of the present invention as described in the above (A)-(E) enables not only obesity or leanness to be diagnosed at the molecular level, but also obesity or leanness in the future. The possibility can also be predicted, and a more accurate diagnosis can be made as compared with the conventional diagnosis method. (3) An agent for treating or preventing obesity or leanness
  • the Slc25al0 gene shows a correlation between its expression level and body weight.
  • the gene is involved in fatty acid synthesis, and an increase in the expression of the gene promotes fatty acid synthesis. Therefore, a compound that regulates the expression level of the gene to a normal level is not only useful for treating or preventing obesity, but also applicable to, for example, leanness, diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and ischemic heart disease. It is possible.
  • a compound that inhibits the expression of the Slc25al0 gene or decreases the activity of the Slc25al0 protein functions as a fatty acid synthesis inhibitor.
  • the compounds can be administered directly to patients, or can also be administered as pharmaceutical compositions formulated by known pharmaceutical methods.
  • the pharmacologically acceptable carrier or medium includes, for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, binder, and the like. Agents, lubricants, sweeteners, flavors or coloring agents.
  • Methods for administering such a pharmaceutical composition to a patient include, for example, intranasal, transbronchial, muscular or oral administration in addition to intraarterial, intravenous, and subcutaneous injections.
  • Can be The dose of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's body weight, age, administration method, and the like, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the expression level of the Slc25al0 protein has a correlation with a change in body weight based on obesity or leanness. Therefore, obesity or leanness can be easily detected by detecting and measuring the amount of the protein in the test cells and the test tissue using an antibody against the protein.
  • the “antibody” refers to an entire antibody molecule or a fragment thereof that can bind to the antigen Slc25al0 gene product.
  • Such an antibody can be produced by a known method, and may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a known method may be used, and specific examples thereof include a fluorescent antibody method and an enzyme antibody method.
  • kits containing such an antibody may include, in addition to the antibody, for example, a secondary antibody labeled with a fluorescent label or a radioisotope for detecting the antibody, or a buffer used for performing an antigen-antibody reaction. ,.
  • the present inventors have found that when the expression of the Slc25al0 gene is suppressed, the expression level of ACC1, a gene involved in fatty acid synthesis, and the amount of malonyl-CoA, a precursor of fatty acids, decrease. I found it. Therefore, by reducing the expression level of the Slc25al0 gene, it is possible to inhibit fatty acid synthesis, and thus it is also possible to inhibit fat synthesis.
  • fatty acid synthesis is inhibited by the following procedure.
  • a substance that reduces the expression level of Slc25al0 is selected.
  • Such substances include, for example, compounds that function as Slc25alO inhibitors, Slc25al0 antibodies, antisense nucleotides, and siRNAs used for RNAi.
  • the above substance is introduced into an individual, tissue, or cell in which Slc25alO exists.
  • the method of introduction is not particularly limited, but the compound may be administered intranasally, transbronchially, intraarterially, intravenously, subcutaneously, or the like. Examples of the method include muscular or oral introduction.
  • the method of introduction is not particularly limited, but examples include a method of introducing the compound by injection into a tissue and mixing in a buffer.
  • the method of introduction is not particularly limited, and examples thereof include mixing in a buffer solution, electorifice poration, and the like.
  • RNAi for example, siRNA encapsulated in ribosomes is cultured in cells.
  • the siRNA can be introduced into the cells by bringing the cells into contact with the solution and contacting the cells, and RNAi can be induced (Nature, 411, 494-498 (2001), J. Cell Sci., 114 (Pt 24), 4557-4565 (2001), Biochem. Biophys. Res. Commun., 301 (3), 804-809, 2003).
  • siRNAs can be used S: HI (SEQ ID NOS: 3 and 4), H2 (SEQ ID NOs: 5 and 6), H3 (SEQ ID NOs: 7 and 8), H4 (SEQ ID NO: 7) 9 and 10), H5 (SEQ ID NOS: 11 and 12), H8 (SEQ ID NOs: 17 and 18), H10 (SEQ ID NOs: 21 and 22), HI 1 (SEQ ID NOs: 23 and 24), HI 2 (SEQ ID NOs: 25 and 26) ), Ml (SEQ ID NOS: 27 and 28), M2 (SEQ ID NOs: 29 and 30), M3 (SEQ ID NOs: 31 and 32), M5 (SEQ ID NOs: 35 and 36), M6 (SEQ ID NOs: 37 and 38), M7 (SEQ ID NO: 37) Nos.
  • RNAi may be generated by using a plurality of these siRNAs in combination.
  • H4 and M8 are particularly suitable for Slc25al0 RNAi because they have a particularly strong inhibitory effect on Slc25al0 expression.
  • a substance that reduces the expression level of Slc25alO is selected.
  • Such substances include, for example, compounds that function as Slc25al0 inhibitors, Slc25al0 antibodies, antisense nucleotides, and siRNAs used for RNAi.
  • RNAi RNAi
  • siRNAs having the nucleic acid sequences of SEQ ID NOS: 9 and 10, and expression of Slc25al0 containing the siRNAs Agent, fatty acid synthesis inhibitor, treatment or prevention agent for obesity
  • siRNA comprising the nucleic acids of SEQ ID NOS: 9 and 10 strongly suppresses the expression of Slc25al0. Therefore, this siRNA can be used as a Slc25al0 expression inhibitor, can be used as a fatty acid synthesis inhibitor, and can be used as a therapeutic or preventive agent for obesity.
  • siRNA comprising the nucleic acids of SEQ ID NOs: 41 and 42 strongly suppresses the expression of Slc25al0. Therefore, this siRNA can be used as a Slc25al0 expression inhibitor, can also be used as a fatty acid synthesis inhibitor, and can also be used as a therapeutic or prophylactic agent for obesity.
  • a model mouse showing obesity by administering the NPY Y5 agonist was prepared in the following manner. 9 Male mice (C57BLZ6J: Claire) at the age of 12 weeks were incubated at room temperature 23 ⁇ 2. C, one animal was bred in one plastic gauge under the conditions of 55 ⁇ 15% humidity. The light-dark cycle during rearing was 12 hours, with the lights on at 7 am and off at 7 pm. In addition, the mice were allowed to freely feed (CE-2 (protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight): Claire) and water.
  • CE-2 protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight
  • mice were anesthetized with 80 mg / kg sodium pentobarbital (manufactured by Dynabot), and a sterilized 28-gauge brain injection neuron (manufactured by Alzet) was stereotactically implanted into the right cerebral cortex. .
  • the force neuron was fixed with dental cement perpendicular to the skull at 0.4 mm posterior to Bredama, 0.8 mm laterally, and 2 mm deep.
  • BSA serum albumin
  • D_Try 34 NPY prepared to be 5 micrograms / day
  • 10 mM PBS containing 0.05% BSA
  • an antibiotic 50 mg / kg cefamedine: manufactured by Fujisawa Pharmaceutical
  • mice were fed with a vehicle only and injected normally with a vehicle (vehicle group).
  • D-Try 34 NPY NPY Y5 agonist
  • the group was infused with D_Try 34 NPY, but the amount of food was divided into a group (pair-fed group) with the same amount of food as the vehicle group.
  • a model mouse showing obesity by administering MCH (melanin-concentrating hormone) was prepared in the following manner. 13-week-old male mice (C57BL / 6J: Claire) were bred one at a time in a plastic gauge under the conditions of room temperature 23 ⁇ 2 ° C and humidity 55 ⁇ 15%. The light-dark cycle during rearing was 12 hours, with the lights on at 7:00 am and off at 7:00 pm. In addition, mice were allowed to freely feed (CE-2 (protein: 25.4% by weight, carbohydrate: 50.3% by weight, lipid: 4.4% by weight): Claire) and water freely. . Time the mouse is adapted to the environment, MHF as feed (protein: 15. 0 wt%, carbohydrate: 52.4 wt%, the lipid: 32.6 wt 0/0, Oriental Bio Service Co., Ltd.) gave.
  • mice were anesthetized with 80 mg / kg sodium pentobarbital (manufactured by Dynabot), and a sterilized 28-gauge brain injection neuron (manufactured by Alzet) was stereotactically implanted into the right cerebral cortex. .
  • the force neuron was fixed with dental cement perpendicular to the skull at a position of 0.4 mm posterior to Bredama, 0.8 mm laterally, and 2 mm deep.
  • Force Neure, 30. / o Connected to a osmotic pump (Model No. 2002: Alze) filled with propylene recall via a polyvinyl chloride tube. The pump was placed subcutaneously on the back of the mouse, and the antibiotic was injected subcutaneously.
  • mice were divided into three groups (vehicle group injected with solvent only), group injected with MCH (ad lib fed group), and paired feed injected with MCH with the same average body weight. Group (pair—fed group)). Continuation, tehenore Under anesthesia, the pump was replaced with MCH (3 micrograms / day) or solvent (30% propylene glycol).
  • mice An 18-week-old mouse (C57BL / 6J: Claire) was bred to one plastic gauge at room temperature 23 ⁇ 2 ° C and 55 ⁇ 15% humidity. This mouse was fed a high calorie diet MHF (protein: 18.2% by weight, carbohydrate: 55.6% by weight, lipid: 15.5% by weight) for 6 months, and became obese model mouse (DI (Mouse) was prepared.
  • MHF protein: 18.2% by weight, carbohydrate: 55.6% by weight, lipid: 15.5% by weight
  • DI obese model mouse
  • “Established MFD” refers to mice that were fed with MHF until the body weight no longer increased.
  • HFD which is a high calorie diet containing a higher fat than MHF
  • DIO mice were also prepared which received (protein: 20.8% by weight, carbohydrate: 38.59% by weight, lipid: 32.88% by weight).
  • mice C57BL / 6N, 17 weeks old were individually raised in one cage.
  • the food was given a normal diet (CA-1, CLEA).
  • Food restriction was conducted according to the following schedule. In other words, food (CA-1) was given only for 3 hours (10: 00-13: 00) per day, and water was freely available. The food weight was measured before and after the feeding time, and the difference was defined as the amount of food consumed. During the period during which food intake was restricted, observation of body weight, appearance, and the like were monitored. Mice that failed to condition (i.e., mice that showed extreme weight loss (eg, a decrease of about 20%) in a short period of time) were not used in the experiment. After the mice were bred under vigorous conditions for 7 days, white adipocytes were excised.
  • Example 1-5 and Comparative Example 1-2 Expression of Slc25al0 in White Adipocytes
  • the expression level of the Slc25al0 gene in white adipocytes was measured using the model mouse produced in Production Example 1-4.
  • the expression level was measured by treating RNA extracted from white fat cells of each model mouse using a mouse U74A chip (Affymetrix) and a mouse 25K1.8 chip (Rossetta).
  • HEK293 cells were seeded on a 6- well plate at a density of 2 ⁇ 10 6 / well. Twenty-four hours later, the Slc25al0 gene cloned into the pcDNA3.1 vector was introduced into the above cells using Lipofectamine 2000. In addition, as a negative control, cells into which only the vector was introduced, and as positive controls, cells into which mouse UCP1 was introduced and cells into which human UCP3 had been introduced were prepared. [0103] 48 hours after introduction of the gene, staining was performed using DiOC 6 (3-3'-Dihexyloxacarbocyanine iodide), which is a reagent sensitive to mitochondrial gradient.
  • DiOC 6 (3-3'-Dihexyloxacarbocyanine iodide
  • the staining was performed by staining the cells with 0.3 ⁇ ⁇ DiOC6 for 20 minutes and then washing twice with PBS.
  • the proton gradient is high, the amount of DiOC6 that binds to mitochondria increases and emits strong fluorescence.
  • the proton gradient is low, the amount bound to mitochondria decreases, and the fluorescence intensity decreases.
  • Figure 1 (a) is a confocal micrograph of HEK293 cells treated with CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl-hydrazone), which uncoupling mitochondrial proton gradient in cells, after staining with Di ⁇ C6.
  • 1 (b) is a photograph of HEK293 cells not treated with CCCP. In untreated HEK293 cells, intracellular mitochondria are stained with green dots. On the other hand, in the CCCP-treated cells, the fluorescence intensity was significantly reduced. Therefore, it was confirmed that mitochondria were stained in a proton gradient-specific manner.
  • FIG. 2 shows the analysis results of the flow cytometer.
  • A shows HEK293 cells treated with CCCP
  • b shows untreated HEK293 cells
  • c shows HEK293 cells transfected with Slc25alO.
  • FIG. 2 (a)-(c)
  • the histogram showing the fluorescence intensity of HEK293 cells transfected with the Slc25alO gene shifted (increased fluorescence intensity) compared to the control, indicating that the proton gradient increased. was confirmed.
  • Table 2 shows the average fluorescence intensity of each sample.
  • the cells stained with DiOC6 were washed with PBS, lysed, and centrifuged to prepare a cell extract. This cell extract was analyzed using a fluorimeter (Cytofluor Series 4000 Fluorescent Multi Well Plate Reader, manufactured by Perseptive Biosystems) (Excitation: 485 nm, Emission: 520 nm).
  • 3T3-L1 cells capable of differentiating into adipocytes it was confirmed whether there was a correlation between the expression of Slc25al0 gene and ACC1 gene before and after differentiation.
  • 6 L play The cells were seeded with 3T3-L1 cells, and when they became confluent two days later, they were differentiated into adipocytes in a differentiation-inducing medium containing insulin, dexamethasone and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine). Two days and four days after the differentiation, Slc25al0 expression was suppressed for 3 hours with siRNA (M8), respectively. Correlations were examined 8 days after differentiation. As shown in FIGS.
  • siRNA was synthesized using a silencer siRNA construction kit (Ambion).
  • a silencer siRNA construction kit (Ambion).
  • twelve sequences were examined using Slc25al0 expression suppression as an index.
  • the relative expression levels of the Slc25al0 gene in cells transfected with each siRNA are shown in FIGS. 6 (a) and (b). From these results, H4, H10, and M8 were used as siRNA in the subsequent experiments.
  • each siRNA is as follows. “Position” indicates which nucleic acid number position of the siRNA in the human Slc25al0 gene (NM-012140). HI (Position 186)
  • Antisense AACGTCAGGATGCAGAACGACCCTGTCTC (location J'6) H3 (position 513)
  • AAACAGTCTCCTGAGACCCTCCCTGTCTC SEQ ID NO: 9
  • Sense AAAGCTCCCGGCATTTATTGACCTGTCTC (SEQ ID NO: 25)
  • Antisense AATCAATAAATGCCGGGAGCTCCTGTCTC (SEQ ID NO: 26).
  • nucleotide sequence of siRNA for mouse Slc25al0 gene is shown below.
  • siRNA oligofectamine: manufactured by Invitrogen.
  • RNA was prepared using RNeasy (manufactured by Qiagen).
  • CDNA was prepared from the prepared RNA by quantitative RT-PCR (manufactured by Applied Biosystems), and the expression levels of Slc25al0 and ACC1 were quantified.
  • an expression vector for Slc25al0 was prepared by cloning the human Slc25al0 gene into pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen). This expression vector was transfected into HEK293 cells, and cell lines (H19 clone and H41 clone) stably expressing Slc25al0 were established. RNA was prepared from the cell line (10 6 cells), and the expression levels of Slc25al0 and ACC1 were measured from the prepared RNA by quantitative RT-PCR. As shown in FIG. 8, it was confirmed that when the Slc25al0 gene was forcibly expressed, the expression of the ACC1 gene was increased as compared to the control.
  • Example 10 Behavior of malonyl-CoA content by expression of Slc25alO
  • the 10 7 HepG2 cells cultured at a concentration of cells / dish were trypsinized, the cells were collected by a child centrifugation. Add triclomouth acetic acid (10%: 800 ⁇ L) to the obtained cell pellet. In addition, the solubilized fraction was extracted by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. The extract was purified by reverse phase chromatography (Sep-Pak C18) for partial purification of malonyl CoA. After the obtained eluate was dried, it was dissolved in 100 L of water. A sample containing malonyl-CoA (50 ⁇ L) was reacted with fatty acid synthase and radiolabeled acetyl-CoA to synthesize fatty acids. The fatty acids were extracted with petroleum ether, and the radioactivity of the radiolabeled fatty acids was measured with a scintillation counter.
  • Fat accumulation was analyzed using 3T3-L1 cells.
  • 3T3-L1 cells were seeded on a 6-well plate, and when confluent 2 days later, they were differentiated into adipocytes in a differentiation-inducing medium containing insulin, dexamethasone and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine). . Two days and four days after the differentiation, Slc25al0 expression was suppressed for 3 hours with siRNA (M8), respectively. Eight days after the differentiation, the accumulated fat was stained with 0.175% Oil Red II and washed with PBS.
  • FIG. 10 is a microscope of 3T3-L1 cells differentiated into fat cells.
  • FIG. 11 shows the results of quantification of the amount of accumulated fat in each cell. As is clear from the results shown in FIGS. 10 and 11, when the expression of Slc25al0 was suppressed by RNAi, the amount of accumulated fat was reduced.
  • the compound evaluation method or test method of the present invention it is possible to provide a compound evaluation method such as screening for a therapeutic agent for obesity.
  • a therapeutic agent for obesity such as screening for a therapeutic agent for obesity.
  • an obesity test method that can be determined at the molecular level. Therefore, it is possible to provide new medicines and medical treatment forms in the medical field such as lifestyle-related diseases, such as the development of antifertility drugs and the diagnosis of obesity in clinical practice.
  • metabolic diseases cardiovascular diseases, central nervous system diseases using substances having an activity of suppressing long chain fatty chain elongase activity (eg, siRNA, low molecular weight compounds, proteins, antibodies, etc.) It is possible to provide a method for treating and preventing systemic diseases and the like, and it is also possible to provide a treating and preventing agent containing a powerful substance.
  • metabolic diseases include obesity, diabetes, hormonal abnormalities, hyperlipidemia, gout, and fatty liver.
  • the circulatory diseases include, for example, angina, acute 'depressive heart failure, myocardial infarction, coronary arteriosclerosis, hypertension, kidney disease, electrolyte abnormality and the like.
  • Central nervous system diseases include bulimia.

Abstract

　肥満の治療薬のスクリーニング等をはじめとする化合物の評価において、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子又はタンパク質の被検組織又は被検細胞における発現レベルや、当該遺伝子又はタンパク質の性質を利用して当該評価をする。肥満の検査において、Ｓｌｃ２５ａ１０遺伝子の発現量や当該遺伝子における多型等に基づいた検査をする。

Description

明 細 書
Slc25al0による肥満治療に有効な化合物の評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、 Sk25al0遺伝子又はタンパク質を用いた肥満の治療又は予防に有効 な化合物の評価方法に関する。また、本発明は、 Slc25al0遺伝子又はタンパク質 を用いた肥満の検査方法に関する。
背景技術
[0002] 肥満は、高血圧症、糖尿病、高脂血症、虚血性心疾患等に代表される種々の成人 病の危険因子である。また、これらの多くは慢性疾患であることから、将来的には医 療費の高騰の原因になると考えられ、社会的にも大きな問題となっている。
[0003] このような肥満を防止するために抗肥満薬の開発が進められており、現在では、食 欲抑制剤や脂質吸収阻害剤が臨床的に利用されている。ここで、抗肥満薬研究の 標的分子としては、これまでにレプチン、 PPAR o/、ニューロペプチド Y等が知られて いる力 肥満の原因は非常に多様であるため、創薬標的として作用機序の異なった 標的分子が待望されている。
[0004] また、このような肥満状態あるいはその原因を適切に診断することは、その後の適 切な治療にとって不可欠であるため、簡便で精度の高い肥満マーカーの出現が望ま れている。また、近年、投与した薬剤の効果が被投与者の遺伝子多型等の遺伝子型 に影響を受ける現象が見出されており、薬剤の開発段階における臨床試験やいわゆ るオーダーメイド医療において、分子レベルでの検查ゃ診断のマーカーが待望され ている。
[0005] 一方、 Slc25al0は、ミトコンドリアの内膜に存在する輸送タンパク質のグループに 属する 6回膜貫通型のタンパク質であることが知られており、これまでに、ラット及びマ ウスの遺伝子（GenBank Accession No. NM— 013770 :配列番号 1)のクロ 一二ングに関する幸艮告 ϋ. Biol. Chem. 273 (38) , 24754—24759 (1998) ：非特許文献 1)及びヒト遺伝子（GenBank Accession No. NM— 012140 :酉己 列番号 2)のクローニングに関する報告がある（Biochem. J. 344, 953— 960 (1999) :非特許文献 2)。
[0006] 非特許文献 2において、マウスを寒冷下に晒した場合に肥満細胞中の Slc25al0 の発現量が低下すること、マウス 3T3—L1細胞をインシュリン処理した場合に Slc25a
10の発現量が低下すること、同細胞を遊離脂肪酸中で培養した場合に Slc25al0の 発現量が上昇することが明らかにされている。
[0007] 非特許文献 1 : Giuseppe Fiermonte, et al. , J. Biol. Chem. 273 (38)
， 24754-24759 (1998)
非特許文献 2 : Kallol Das, et al. , Biochem. J. 344, 953—960 (199 9)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] しかしながら、 Slc25al0と肥満あるいは体重との相関についてはこれまでに何ら知 見がなぐ体重をコントロールする化合物等についての知見も全くないのが現状であ つた。
[0009] 本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、肥満の治療 薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することを目的とする。また、分子レ ベルで判断可能な肥満の検査方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 Slc25al0遺伝子 の発現量と体重との間には一定の相関関係があることを見出すとともに、 Slc25al0 遺伝子の発現量の変化と脂肪酸合成に関与する分子の発現量の変化との間に相関 関係があることを見出し、本発明を完成した。
[0011] すなわち、本発明は、以下の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法（1
)及び (2)を提供する。
(1)被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、該被検 動物又は該被検細胞中で Slc25al0遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に等価な遺 伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、を含むことを特徴とする肥満の治療又 は予防に有効な化合物の評価方法。 (2)被検化合物を、 Slc25al0遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合 遺伝子を有する被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる工程と、該レポータ 一遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルの変化を検出する工程と、を 含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[0012] 上記評価方法（1)及び（2)において、前記発現レベルの変化は、発現レベルの低 下であることが好ましレ、。また、 ACC1 (ァセチル CoAカルボキシラーゼ 1)発現量、 マロニル CoA存在量及び脂肪酸存在量のうち少なくとも一つの変化を検出する工程 をさらに含んでいてもよい。力かる工程を含むことにより、被検対象となった肥満が S1 c25al0を介した脂肪酸合成に起因して生じていると判断できる。
[0013] 本発明は、また、以下の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法（3)及 び (4)を提供する。
(3)被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、該被検 化合物が、 Slc25al0タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を 含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
(4)被検化合物を、 Slc25al0タンパク質に接触させる工程と、該被検化合物が、該 タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、を含むことを特徴とする 肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[0014] 本発明は、また、前述したいずれかの評価方法によって得られた化合物を有効成 分として含有することを特徴とする肥満の治療又は予防剤を提供する。
[0015] 本発明は、また、 Slc25al0遺伝子の発現量を低下させることを特徴とする脂肪酸 合成阻害方法を提供する。ここで、 Slc25al0遺伝子の発現量を低下させる手段は 特に制限されないが、 RNAi (RNA干渉）を利用することが好ましレ、。 Slc25al0の R NAiは、例えば、以下の siRNA (small interfering RNA)を使用することにより達 成される。配列番号 3及び 4に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 5及び 6に記載 の核酸からなる siRNA、配列番号 7及び 8に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 9及び 10に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 11及び 12に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 17及び 18に記載の核酸力、らなる siRNA、配列番号 21及び 22に 記載の核酸からなる siRNA、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる siRNA、配 列番号 25及び 26に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 27及び 28に記載の核酸 力 なる siRNA、配列番号 29及び 30に記載の核酸力 なる siRNA、配列番号 31 及び 32に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 35及び 36に記載の核酸からなる si RNA、配列番号 37及び 38に記載の核酸力、らなる siRNA、配列番号 39及び 40に 記載の核酸からなる siRNA、配列番号 41及び 42に記載の核酸からなる siRNA、配 列番号 43及び 44に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 45及び 46に記載の核酸 力らなる siRNA、配列番号 47及び 48に記載の核酸からなる siRNA及び配列番号 4 9及び 50に記載の核酸からなる siRNA。特に、配列番号 9及び 10に記載の核酸か らなる siRNA並びに配列番号 41及び 42に記載の核酸力 なる siRNAは、 Slc25a 10遺伝子の発現を強く低下させるため、これらの siRNAを使用することが好ましい。
[0016] 本発明は、また、 Slc25al0遺伝子の発現量を低下させる工程を含むことを特徴と する肥満の治療又は予防方法を提供する。ここで、 Slc25al0遺伝子の発現量を低 下させる手段は特に制限されないが、 RNAiにより抑制することが好ましい。 RNAiは 、上述の siRNAを使用することにより達成される力 特に配列番号 9及び 10に記載 の核酸力 なる siRNA並びに配列番号 41及び 42に記載の核酸力 なる siRNAを 使用することが好ましい。
[0017] 本発明は、また、以下の肥満の検査方法（1)一（5)を提供する。
(1)被検組織又は被検細胞における Slc25al0遺伝子の発現レベル又は発現レべ ルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
(2)被検組織又は被検細胞における Slc25al0タンパク質の発現レベル又は発現レ ベルの変化を測定することを特徴とする肥満の検查方法。
(3)被検組織又は被検細胞において、 Slc25alO遺伝子の発現レベル又は Slc25a 10タンパク質の活性を変化させた際に、該変化によって生じる脂肪酸合成に関与す る物質の変化量を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
(4)被検組織又は被検細胞における Slc25al0遺伝子に存在する多型を検出するこ とを特徴とする肥満の検査方法。
(5) Slc25al0タンパク質と相互作用することにより、 Slc25al0遺伝子の発現量に影 響を及ぼすタンパク質の発現量又は該タンパク質の活性を検出することを特徴とする 肥満の検査方法。
[0018] 本発明は、さらに、配列番号 9及び 10に記載の核酸からなることを特徴とする siRN
Aを提供し、当該 siRNAを含むことを特徴とする Slc25al0発現抑制剤、脂肪合成 抑制剤及び肥満の治療又は予防剤を提供する。
[0019] 本発明は、さらに、配列番号 41及び 42に記載の核酸からなることを特徴とする siR
NAを提供し、当該 siRNAを含むことを特徴とする Slc25al0発現抑制剤、脂肪合成 抑制剤及び肥満の治療又は予防剤を提供する。
発明の効果
[0020] 本発明の化合物の評価方法又は検査方法によれば、肥満の治療薬のスクリーニン グ等、化合物の評価方法を提供することが可能となる。また、分子レベルで判断可能 な肥満の検査方法を提供することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1]図 1は、 HEK293細胞の顕微鏡写真である。 （a)は、 CCCPで処理した HEK2 93細胞を表し、（b)は、 CCCP非処理の HEK293細胞を表す。
[図 2]図 2は、 Slc25al0とミトコンドリアプロトン勾配との関係についてフローサイトメ 一ターにより解析した結果を示す図である。 (a)は CCCPで処理した HEK293細胞 を、（b)は非処理の HEK293細胞を、（c)は Slc25al0を導入した HEK293細胞を 表す。
[図 3]図 3は、 Slc25al0とミトコンドリアプロトン勾配との関係についてフルォロメータ 一により解析した結果を示すグラフである。
[図 4]図 4は、各組織における Slc25al0遺伝子の発現量を示す図である。
[図 5]図 5は、脂肪細胞への分化の前後における（a)マウス Slc25al0遺伝子及び (b
) ACC1遺伝子の発現量の変化を示すグラフである。
[図 6]図 6は、様々な siRNAをトランスフエタトした細胞における Slc25alO遺伝子の 相対発現量を表すグラフである。 （a)はマウスの細胞での結果を、 (b)はヒトの細胞で の結果を表す。 SCRは哺乳類では RNAiが生じなレ、スクランブル siRNAをトランスフ ェクトさせた細胞を表す。
[図 7]図 7は、 siRNA (H4又は HI 0)をトランスフエタトさせた細胞における（a) Slc25 alO遺伝子及び (b) ACCl遺伝子の発現量を表すグラフである。
[図 8]図 8は、 Slc25alO遺伝子を過剰発現させた細胞における ACC1遺伝子の発 現量を表すグラフである。
[図 9]図 9は、 siRNA(M8)をトランスフエタトさせた細胞におけるマロニル CoAのレべ ルを表すグラフである。
[図 10]図 10は、脂肪細胞に分化した 3T3— L1細胞の顕微鏡写真である。 （a)は分化 前の細胞を、 （b)は分化後の細胞を、（c)は分化後の細胞を scr~siRNAで処理した 細胞を、 (d)は分化後の細胞を siRNA (M8)で処理した細胞を表す。
[図 11]図 11は、各細胞における脂肪の蓄積量を表すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0022] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0023] 先ず、本発明にかかる用語について説明する。
[0024] 本発明における「発現レベル」とは、 Slc25al0遺伝子の転写産物の絶対量又は相 対量をいう。この場合、当該遺伝子は、 DNA又は mRNAのいずれをも含む。また、 発現の検出対象がタンパク質の場合、その「発現レベル」とは、 Slc25alO遺伝子の 翻訳産物の絶対量又は相対量をいう。
[0025] また、本発明における「被検動物」としては、その種は特に限定されず、例えば、マ ウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、サルが挙げられる。
[0026] また、本発明における「被検組織」とは、肥満検查を行う際に生体力 抽出可能な 組織であればその種類は特に限定されないが、肥満の影響が反映されやすいとの 観点から、例えば、肝臓組織、脂肪組織、筋肉組織、血液組織であることが好ましい 。また、組織の単離が容易であるとの観点から、前記組織の中でも血液組織であるこ とが好ましい。ここで、これらの組織の由来となる動物種については特に制限されな レ、が、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであることが好まし い。
[0027] また、本発明における「被検細胞」についても、肥満の検査を行う際に生体から抽 出可能な細胞であれば、その種類は特に限定されないが、肥満の影響が反映され やすいとの観点から、例えば、肝細胞、脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等） 、筋肉細胞（筋芽細胞、骨格筋細胞平滑筋細胞等）、膝細胞 (膝島細胞等）、血球細 胞であることが好ましい。ここで、力、かる組織の由来となる動物種については特に限 定されないが、本発明の主たる用途がヒトの臨床的使用であることから、ヒトであること が好ましい。
[0028] さらに、本発明における「肥満」とは、脂肪組織が過剰に蓄積した状態と定義される 一般的な肥満に加え、これに糖尿病や高血圧等の合併症又は内臓脂肪が伴う、い わゆる「肥満症」も含む。また、本発明における「肥満」は、薬物投与等による体重の コントロールを受けた場合に、もとの体重と比較して相対的に体重が増加した状態を も意味する。
[0029] また、本発明における「検査」とは、肥満であることを単に判断するのみならず、将 来的な肥満を予測する場合をも含む。
[0030] 次に、本発明に力かる Slc25al0について説明する。 Slc25al0は褐色脂肪細胞 のミトコンドリアに存在し、熱産生に関与する UCPファミリーと 36— 38%程度の相同 性を有する。 UCPは、ミトコンドリアにおいて熱の産生を引き起こすタンパク質である 。具体的には、グルコースや脂肪酸が酸化されることによって生じたプロトン力 S、呼吸 鎖酵素群によってミトコンドリア内膜力 膜外に放出され、その結果、プロトン勾配が 生じる。 UCPは、プロトンを内膜内に運ぶチャネルとして機能し、力かるプロトン勾配 を解消する。その結果、内膜内のプロトンによって脂肪酸等の酸化が亢進し、熱産生 を促す。すなわち、 UCPは、生体内のエネルギーの消費を促進する機能を有してい る。
[0031] 本発明者らは、上述の Slc25al0と UCPとの相同性の高さに反して、 Slc25al0力 S ミトコンドリアにおける熱産生において UCPとは逆の活性を有することを見出した。す なわち、 Slc25al0は、ミトコンドリア内膜に存在し、内膜の内外間のプロトン勾配を 上昇せしめる活性を有し、その結果、熱産生をせずにエネルギーを蓄積する機能を 有する。従って、 Slc25alOの機能を阻害することによりエネルギー消費が亢進され、 肥満の解消に寄与するものと、本発明者らは考えている。
[0032] 一方、本発明者らは、 Slc25al0遺伝子の発現量の変化と脂肪酸合成に関与する 分子の発現量の変化との間に相関関係があることをも見出した。すなわち、 Slc25al 0遺伝子の発現量を抑制した場合に脂肪酸合成に関与する遺伝子である ACC1 (ァ セチル CoAカルボキシラーゼ 1)の発現量や、脂肪酸の前駆物質であるマロニル Co Aの量が減少し、一方、 Slc25al0遺伝子の発現量を増加させた場合に増加する。こ れは、 Slc25alOが脂肪酸の合成経路上に存在する、あるいは、当該合成経路に深 く関与する分子であることを証明するものである。また、脂肪酸は脂質の構成成分で あり、体内では、脂肪組織に入った遊離脂肪酸がトリァシルグリセロールに変化し、 脂肪細胞に貯蔵される。すなわち、脂肪酸の合成を阻害することができればトリァシ ルグリセロールの脂肪細胞への貯蔵を阻害できる。 Slc25al0や当該合成経路に関 与する遺伝子又は分子は、その発現量を低下させることにより脂肪酸の合成能を低 下させることができるため、当該遺伝子又は分子の挙動 (発現量や活性など）を指標 に、肥満に有効な化合物の評価や選択が可能となる。
[0033] (1)肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法
本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法について説明する。被 検化合物を被検動物ゃ被検細胞に投与、接触させることにより変動する Slc25al 0 遺伝子の発現量を測定したり、被検化合物を Slc25al0タンパク質に接触させて当 該タンパク質の活性に及ぼす影響を検討したりすることにより、当該被検化合物の評 価を行うことが可能となる。
[0034] すなわち、このような被検化合物の中には、細胞や組織に作用することにより、 Sic 25al0遺伝子の発現レベルや Slc25alOタンパク質の活性を正常化あるいはコント ロールし、脂肪の蓄積や食欲のコントロール等、肥満の原因となるメカニズムの正常 化を図ることができるものがあると考えられる。従って、以下に説明するような評価方 法により、肥満の治療薬又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
[0035] (A) Slc25al0遺伝子の発現レベル調節能を指標とする評価方法
Slc25al0遺伝子の発現レベル調節能を指標とする第 1の評価方法として、被検化 合物を被検動物又は被検細胞に投与又は接触させ、当該被検化合物が被検動物 又は被検細胞中で Slc25al0遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子 の発現レベルを調節するか否かを確認する方法が挙げられる。本方法により、肥満 の治療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。 [0036] 具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。先ず、被検化合物を被検動 物又は被検細胞に投与又は接触させる。ここで、被検化合物としては、肥満の治療 又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合物種も限定さ れない。被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はなぐ具体的に は、例えば、経口投与、非経口投与 (例えば、経皮投与、筋肉内注射、静脈内注射、 皮下注射）力 S挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる方法としても特 に制限はなぐ具体的には、例えば、培養液や緩衝液 (リン酸緩衝液等)等の溶液中 で混合し両者を接触させる方法が挙げられる。
[0037] 次に、被検化合物が被検動物又は被検細胞中で Slc25al 0遺伝子あるいは当該 遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レベルを調節するか否かを確認する。
[0038] 前記遺伝子の発現レベルの調節の有無の確認法としては、特に制限はなぐ前述 の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化を RT— PCRのような 遺伝子増幅法、 DNAマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダィゼーショ ン法等によって検出 ·比較することにより実施することができる。また、前記遺伝子の 発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細 胞を用いてもよレ、。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、 β— ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルォレツセンスプロテ イン遺伝子が挙げられる。
[0039] ここで、「Slc25al O遺伝子と機能的に等価な遺伝子」とは、 Slc25al0遺伝子と塩 基配列は異なるものの、比較的高い相同性を示し、 Slc25al0と同じ又は類似の活 性を有する遺伝子を示す。ここで、前記相同性は、機能的に等価であれば特に制限 はないが、塩基配列の相同性が 70— 100%であることが好ましぐ 80— 100%であ ることがより好ましぐ 90— 100。/oであることが特に好ましい。相同性が前記下限より 低い場合には、 Sk25al0と同じ又は類似の機能を示さない可能性が高い傾向にあ る。し力、しながら、塩基配列の相同性が前記下限未満であっても、 Slc25alOに特有 の機能を有するドメインと、当該ドメインに対応する塩基配列との相同性が高レ、場合 には Slc25alO遺伝子と同様又は類似の機能を有する場合がある。このような遺伝 子は、塩基配列の相同性が前記範囲外であっても好適に使用可能である。また、比 較的相同性の高い遺伝子とは、 Slc25alO遺伝子における 1又は 2以上の塩基が自 然若しくは人工的に置換、欠失、不可及び Z又は挿入した遺伝子であってもよい。
[0040] 被検化合物を投与又は接触させなレ、場合に比べて、被検化合物を投与又は接触 させた場合の Slc25al0遺伝子又は Slc25al0遺伝子と機能的に等価な遺伝子の 発現レベルが 30%以上、好ましくは 50%以上低下した場合、当該被検化合物は肥 満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
[0041] また、 Sk25al0遺伝子の発現レベル調節能を指標とする第 2の評価方法として、 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させ、当該被検動物又は 被検細胞中で Slc25al0遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発 現レベルの変化を検出する方法が挙げられる。発現レベルの調節の有無のみならず 、発現レベルの変化の程度を検出することにより、被検化合物の活性の強弱をも考 慮した評価が可能となる。また、上述のように、 Slc25al0遺伝子の発現レベルが低 下すると、例えば ACC1やマロニル CoAといった脂肪酸合成経路上の分子の発現 量や存在量が低下し、結果的に脂肪酸の合成量が減少する。従って、脂肪酸合成 能を低下せしめる化合物のスクリーニング等を行う場合には、前記第 2の評価方法に よって、 Slc25al0遺伝子あるいは当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現レべ ルの低下を指標に評価を行うことが好ましい。
[0042] 前記遺伝子の発現レベルの変化を検出する方法としては、特に制限はなぐ前述 の投与又は接触の前を対照とし、当該遺伝子の発現量の変化を RT— PCRのような 遺伝子増幅法、 DNAマイクロアレイを用いる方法又はノーザンハイブリダィゼーショ ン法等によって検出 ·定量することにより実施することができる。また、前記遺伝子の 発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺伝子を人為的に導入した動物又は細 胞を用いてもよレ、。この場合、レポーター遺伝子としては、具体的には、例えば、 /3 _ ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子又はグリーンフルォレツセンスプロテ イン遺伝子が挙げられる。
[0043] 被検化合物を投与又は接触させなレ、場合に比べて、被検化合物を投与又は接触 させた場合の Slc25al0遺伝子又は Slc25al0遺伝子と機能的に等価な遺伝子の 発現レベルが 30%以上、好ましくは 50%以上低下した場合、当該被検化合物は肥 満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
[0044] また、前記第 2の方法に加えて、 Slc25al0遺伝子の発現レベルの変化に伴って 生じる、 ACC1の発現量、マロニル CoA存在量及び脂肪酸存在量のうち少なくとも 一つの変化を検出する工程を含んでいてもよレ、。ここで、前記 ACC1は、 ACC1タン パク質及び遺伝子のレ、ずれであってもよレ、。
[0045] ACC1タンパク質や遺伝子の発現量の変化を検出する方法としては、特に制限は ないが、例えば、ウェスタンブロッテイング、サザンハイブリダィゼーシヨン法、ノーザン ハイブリダィゼーシヨン法、 DNAチップ、 RT— PCRが挙げられる。また、マロニル Co Aの存在量の変化を検出する方法としては、特に制限はないが、例えば、逆相クロマ トグラフィ一等で部分精製した細胞由来のマロニル CoAを脂肪酸合成酵素（fatty a cid synthase)及び放射線標識したァセチル CoAと反応させ、生成された標識脂 肪酸量を測定する方法が挙げられる。
[0046] 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触 させた場合の ACC1遺伝子若しくは ACC1タンパク質の発現量又はマロニル CoA若 しくは脂肪酸の存在量が 5%以上、好ましくは 10%以上低下した場合、当該被検化 合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
[0047] このように、 Slc25al0遺伝子の発現量及び ACC1、マロニル CoA、脂肪酸の発現 量や存在量を指標として化合物の評価を行うことにより、脂肪酸合成経路に直接作 用する被検化合物の評価が可能となる。
[0048] (B) Sic 25a 10タンパク質の活性を指標とする評価方法
被検化合物を被検動物、被検細胞又は Sk25al0タンパク質に接触させ、被検化 合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認することにより、肥満の治 療又は予防に有効な化合物を評価することが可能となる。
[0049] 具体的には、以下の手順で被検化合物の評価を行う。先ず、被検動物、被検細胞 又は被検化合物を Slc25al0タンパク質に接触させる。ここで、被検化合物としては 、肥満の治療又は予防薬の候補化合物であれば、その構造や性質は問わず、化合 物種も限定されない。被検化合物を被検動物に投与する方法としては特に制限はな ぐ具体的には、例えば、経口投与、非経口投与 (例えば、経皮投与、筋肉内注射、 静脈内注射、皮下注射）力 S挙げられる。また、被検化合物を被検細胞に接触させる 方法としても特に制限はなぐ具体的には、例えば、培養液や緩衝液 (リン酸緩衝液 等)等の溶液中で混合し両者を接触させる方法が挙げられる。また、タンパク質と被 検化合物を接触させる方法としては、特に制限はなぐ具体的には、例えば、緩衝液 (リン酸緩衝液等）等の溶液中で混合し接触させる方法が挙げられる。
[0050] 次に、被検化合物が当該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する。タン パク質の活性測定における条件は、使用するタンパク質の性質により適宜設定すれ ばよい。このような条件としては、具体的には、例えば、 Slc25al0タンパク質の場合 には、ミトコンドリア内膜の内外間のプロトン勾配の変化等を指標とすることができる（ 例えば、 Yu XX et al, Biochem. J (2001) 353, 369— 375参照）。
[0051] 被検化合物を投与又は接触させない場合に比べて、被検化合物を投与又は接触 させた場合の Slc25al0タンパク質の活性が 30%以上、好ましくは 50%以上低下し た場合、当該被検化合物は肥満の治療又は予防に有効な化合物と評価できる。
[0052] 以上説明したような本発明の肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法に より、肥満の治療薬や診断薬のスクリーニングや、これらの薬剤の有効性又は安全性 の評価、さらには、オーダーメイド治療における適切な薬剤の選択が可能となる。
[0053] (2)肥満の検査方法
次に本発明の肥満の検查方法について説明する。
[0054] (A) Slc25al0遺伝子の発現レベルを測定することによる肥満の検查方法
被検組織又は被検細胞における Slc25al0遺伝子の発現レベルの変化を検出す ることにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞を 抽出した生体 (例えばヒト）が肥満であるか否力、を検查 ·診断することが可能である。ま た、単に検查時の肥満の状態を検查するのみならず、将来的に肥満になるか否かを 予測することも可能である。
[0055] 以下に、本発明の検査の具体的な方法について説明する。先ず、検查対象となる 生体より被検組織又は被検細胞を抽出する。このような抽出の方法としては特に制限 はなぐ公知の方法により抽出することができる。
[0056] 次に、抽出された被検組織又は被検細胞から発現レベルの測定の対象となる遺伝 子を調製する。 Slc25alO遺伝子の発現レベルを測定するには、先ず、被検組織又 は被検細胞から Slc25al0の RNA (total RNA又は mRNA)を調製する必要があ る。このような RNAの調製は、公知の方法によって行うことができる力 例えば、 Mol ecular cloning A LABORATORY MANUAL 2nd EDITION (1989) ( T. Maniatis著： Cold Spring Harbor Laboratory Press) 7. 3—7. 36を 参照して行うことができる。こうして調製した RNAを用いて、例えば、 RT— PCRのよう な遺伝子増幅法、 DNAマイクロアレイ（例えば、 Affymetrix社製 DNAチップ）を用 いる方法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法により、その発現量を測定することができ る。また、被検組織又は被検細胞を用いたイン サイチュ ノ、イブリダィゼーシヨン (in situ hybridization)等により、その発現量を測定することもできる。
[0057] また、 Slc25al0遺伝子の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の測 定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後 (例えば、肥満治療薬の投与の 前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は被 検細胞において、前述した Slc25al0遺伝子の発現量が変化すると予測される期間 の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に、体重の増加があった又は将来 的に増加する可能性があると診断できる。一方、前記発現レベルが減少した場合に 体重の減少があった又は将来的に減少する可能性があると診断できる。
[0058] (B) Slc25alOタンパク質の発現レベルを測定することによる肥満の検查方法
被検組織又は被検細胞における Slc25al0タンパク質の発現レベルの変化を検出 することにより、又は、発現レベルを測定することにより、当該被検組織又は被検細胞 を抽出した生体 (例えばヒト）が肥満であるか否力、を検查 ·診断することが可能である 。また、単に検查時の肥満状態を検查するのみならず、将来的に肥満又は痩せにな りうるかを予測することも可能である。
[0059] 以下、このような検査の具体的な方法について説明する。タンパク質の発現レベル を測定する方法としては、生体力も単離したタンパク質を定量する方法やタンパク質 の血中濃度を測定する方法があり、具体的な方法としては特に限定されない。生体 力も単離したタンパク質を定量する方法の具体例としては、以下のとおりである。先ず 、被検組織又は被検細胞から Slc25al0タンパク質を調製する。このようなタンパク質 の調製は、公知の方法によって行うことができる。こうして調製したタンパク質から、例 えば、プロテインチップ（例えば、 CIPHERGEN社製プロテインチップシステム）を用 いる方法、免疫学的方法（例えば、 ELISA、 EIA法、ウェスタンブロッテイング法）に より、その発現量を測定することができる。また、被検組織又は被検細胞を用いた免 疫染色等によって、その発現量を測定することもできる。一方、タンパク質の血中濃 度を測定する方法の具体例としては、生体から採取した血液を用いて、上記免疫学 的方法等により、 Slc25alOタンパク質を定量する方法が挙げられる。
[0060] 以上のようにして、 Slc25al0の遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定した後 、その結果を解析することにより、被検体が肥満か又は痩せであるかを検査できる。 すなわち、本発明より、 Slc25al0タンパク質の発現レベルと体重は一定の相関関係 を有することが明らかにしたため、上記検査結果と対照群 (健常人等）における Slc2 5al0タンパク質の発現量とを比較することにより、肥満の程度を判断することが可能 となる。また、本発明の検査方法によれば、単に検査時の肥満の状態を検査するの みならず、将来的な肥満又は痩せの可能性の予測も可能となる。
[0061] また、 Slc25al0タンパク質の発現レベルの変化を検出するには、前記の発現量の 測定を当該発現量が変化すると予測される期間の前後 (例えば、肥満治療薬の投与 の前後）について行い、発現量の差を測定すればよい。具体的には、被検組織又は 被検細胞において、前述した Sk25al0タンパク質の発現量が変化すると予測され る期間の前後で、その発現レベルが有意に上昇した場合に体重の増加があった又 は将来的に増加する可能性があると診断できる。
[0062] (C) Slc25alO及び脂肪酸合成経路に関与する分子の相互作用に基づく肥満の 検查方法
生体内において、 Slc25alO遺伝子'タンパク質は、他の多くの分子と直接的又は 間接的に相互作用して固有の機能を発揮している。例えば、本発明者らは、 Slc25a 10遺伝子の発現量と脂肪酸合成経路上の種々の分子 (例えば、 ACC1やマロニル CoA)の変化量との間に相関があり、 Slc25al0遺伝子の発現が増加することにより 、脂肪酸合成経路上の分子の発現が増加すること、及び、 Slc25al0遺伝子の発現 が低下することにより、脂肪酸合成経路上の分子の発現が低下することを見出してい る。これは、 Slc25al0遺伝子'タンパク質の発現量を測定することにより、脂肪酸合 成経路の活性化状態を検出することができることを意味する。その結果、脂肪酸合成 の促進に起因する脂肪の蓄積を予測 ·検査することが可能となる。
[0063] ここで、脂肪酸合成経路上の種々の分子の発現を検出する方法としては、特に制 限はなぐ遺伝子（例えば、 ACC1)であれば、ノーザンハイブリダィゼーシヨンや RT —PCRにより検出すればよぐマロニル CoAであれば、マロニル CoAを基質として脂 肪酸合成反応をさせ、放射性同位体の取り込み量等を指標にマロニル CoAの量を 算出すること力 Sできる。
[0064] このようにして検出された脂肪酸合成経路上の分子の変化量より、標準体重又は 健常人における当該分子の発現量又は量と比較して、変化量が有意に上昇した場 合に体重の増加があった又は将来的に増加する可能性があると診断できる。一方、 前記変化量が減少した場合に体重の減少があった又は将来的に減少する可能性が あると診断できる。
[0065] また Slc25al0の発現のみならず、 Slc25al0タンパク質の活性を変化させた際に 、これによつて生じる脂肪酸合成経路上の分子の変化量を検出することにより、肥満 の検査をすることもできる。
[0066] (D) Slc25al0遺伝子の遺伝的多型を検出する肥満の検査方法
Slc25al0遺伝子に遺伝的多型が存在する場合、その多型の有無や種類により S1 c25al0遺伝子又はタンパク質の発現レベルが変化したり、当該タンパク質の活性に 異常が生じたりする場合がある。従って、このような遺伝的多型を検出することにより S Ic25al0の発現や活性に関する知見を得、さらに、被検組織ゃ被検細胞の由来とな つた被検体の肥満の検查を行うことができる。このような遺伝的多型としては、具体的 には、 f列えば、ミニサテライト、マイクロサテライト、 SNP (single nucleotide polym orphism：一塩基多型）が挙げられる。
[0067] Slc25al0遺伝子における多型の検出は以下のようにして行うことができる。すなわ ち、 Slc25al0遺伝子において、その発現量を制御する領域を検查対象となる肥満 の被検体を対象として塩基配列を決定し、多型部位を検出する。検出された多型部 位の対立遺伝子頻度を算出し、被検体集団において有意に増加又は減少している 対立遺伝子を見出すことにより肥満と相関する多型を同定する。このようにして検出 された遺伝的多型は、例えば、被検体由来のゲノム DNAについて、多型部位の塩 基配列の解析、多型部位に存在する塩基の種類に依存して変化する DNAの物理 化学的性質の差や制限酵素部位の相違を利用する方法、当該多型部位の検出に 適当な検出用プローブを利用する方法及び質量分析法を利用した方法等によって 臨床的に検出可能である。
[0068] (E) Slc25al0タンパク質と相互作用することにより Slc25al0遺伝子の発現量に 影響を及ぼすタンパク質の発現量又は活性を検出することによる肥満の検査方法
[0069] 生体内において、多くのタンパク質は他のタンパク質と相互作用することにより、所 定の生理機能を発揮する。 Slc25al0についても同様に、例えば、その発現を制御 する転写因子等の作用を受けることにより発現量が制御され、所定の機能を発揮し ている。 Slc25al0タンパク質と、当該 Slc25al0タンパク質と相互作用することにより Slc25al0遺伝子の発現量に影響を及ぼすタンパク質の発現量やその活性とは一 定の相関関係を有し、いずれか一方の挙動を検出することにより、他方の挙動を推 測できる関係にある。
[0070] ここで、「相互作用」とは、 Slc25al0タンパク質と別のタンパク質が直接的又は間接 的に作用することをいい、例えば、 Slc25al0タンパク質が別のタンパク質と物理的 に接触することによりアミノ酸の修飾等を生じるような作用や、第 3のタンパク質を介し て相互作用し、間接的に Slc25alOタンパク質の発現に影響を及ぼすような作用が 挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、 Slc25alOタンパク質を介するシ グナル伝達において、 Slc25al0タンパク質の上流又は下流で生理的機能を発揮す るタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質の発現量又は活性を検出する 方法としては、対象となるタンパク質の種類に応じて好適な手段を適宜選択すればよ ぐ具体的な手段としては特に限定されない。
[0071] 以上の (A)—（E)で説明したような本発明の肥満の検查方法によって、分子レベル で肥満又は痩せの診断が可能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性 についても予測できることとなり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能 となる。 [0072] (3)肥満又は痩せの治療、予防剤
Slc25al0遺伝子は、その発現量と体重とが相関関係を示す。また、上述したよう に、当該遺伝子は、脂肪酸の合成に関与し、当該遺伝子の発現が増加すると脂肪 酸の合成は促進される関係にある。従って、当該遺伝子の発現レベルを正常レベル へと調節する化合物は肥満の治療又は予防に有用であるのみならず、例えば、痩せ 、糖尿病、高血圧症、高脂血症、虚血性心疾患にも応用可能である。また、 Slc25al 0遺伝子の発現を阻害することにより脂肪酸の合成は阻害されることから、 Slc25al0 遺伝子の発現を阻害するか又は Slc25al0タンパク質の活性を低下させる化合物は 、脂肪酸合成阻害剤として機能する。このような化合物としては、上述したような本発 明の化合物の評価方法によって選択された化合物が挙げられる。これらの化合物を 薬剤として使用するには、当該化合物を直接患者へ投与する以外に、公知の製剤 学的方法により製剤化した医薬組成物として投与することもできる。製剤化するに際 し、薬理学上許容される担体若しくは媒体としては、具体的には、例えば、滅菌水、 生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、 甘味料、香料又は着色剤が挙げられる。また、このような医薬組成物を患者に投与 する方法としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的 、経気管支的、筋肉的又は経口的な投与が挙げられる。医薬組成物の投与量は、患 者の体重、年齢又は投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を 適宜選択することが可能である。
[0073] (4)肥満又は痩せの検查薬、検查キット
Slc25al0タンパク質の発現量は、肥満又は痩せに基づく体重変化と相関関係を 有する。従って、当該タンパク質に対する抗体を使用して被検細胞ゃ被検組織中の タンパク質量を検出、測定することにより、肥満又は痩せの検查を簡便に行うことがで きる。ここで、「抗体」とは、抗原である Slc25al0遺伝子産物に結合しうる抗体分子 全体又はその断片をいう。このような抗体は、公知の方法によって製造することができ 、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよレ、。また、当該抗 体を用いた免疫学的測定法としては、公知の方法を使用すればよぐ具体的には、 例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法が挙げられる。 [0074] また、このような抗体を含んだキットを製造し、本発明を実施することも可能である。 キットの構成としては、当該抗体に加え、例えば、抗体を検出するために蛍光標識や ラジオアイソトープで標識された 2次抗体や抗原抗体反応を行う際に使用する緩衝 液を備えていてもよレ、。
[0075] このような肥満又は痩せの検查薬を使用することにより、分子レベルでの診断が可 能となるばかりか、将来的に肥満又は痩せになる可能性についても予測できることと なり、従来の診断方法と比較して、より的確な診断が可能となる。また、本発明の肥満 又は痩せの検査キットを使用することにより、前述したような的確な診断を非常に簡便 に実施することが可能となる。
[0076] (5)脂肪酸合成阻害方法及び肥満の治療又は予防方法
次に、本発明の脂肪酸合成阻害方法及び肥満の治療又は予防方法について説明 する。既に述べたように、本発明者らは、 Slc25al0遺伝子の発現を抑制した場合に 脂肪酸合成に関与する遺伝子である ACC1の発現量や、脂肪酸の前駆物質である マロニル CoAの量が減少することを見出した。したがって、 Slc25al0遺伝子の発現 量を低下させることにより、脂肪酸合成を阻害することか可能となり、ひいては、脂肪 の合成を阻害することも可能である。
[0077] 具体的には、以下の手順で脂肪酸合成阻害を行う。先ず、 Slc25al0の発現量を 低下させる物質を選択する。かかる物質としては、例えば、 Slc25alO阻害剤として 機能する化合物、 Slc25al0の抗体、アンチセンスヌクレオチド及び RNAiに使用す る siRNAが挙げられる。
[0078] 次に、 Slc25alOが存在する個体、組織、細胞に対して前記の物質を導入する。具 体的には、対象が個体であれば、導入方法としては特に制限はないが、前記化合物 等を、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的 又は経口的に導入する方法が挙げられる。また、対象が組織であれば、導入方法と しては特に制限はないが、組織中への注入、緩衝液中での混合により導入する方法 力 S挙げられる。さらに、対象が細胞であれば、導入方法としては特に制限はないが、 緩衝液中での混合、エレクト口ポレーシヨン等が挙げられる。
[0079] より具体的には、 RNAiの場合、例えば、リボソームに封入した siRNAを細胞培養 液に添カ卩し細胞に接触させることで細胞内に siRNAを導入でき、 RNAiを起こすこと ができる（Nature, 411, 494—498 (2001) , J. Cell Sci.， 114 (Pt 24) ， 4557-4565 (2001)、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 301 (3 )， 804-809, 2003)。 Slc25al0の RNAiには、以下の siRNAを用レヽること力 Sで きる： HI (配列番号 3及び 4)、 H2 (配列番号 5及び 6)、 H3 (配列番号 7及び 8)、 H4 (配列番号 9及び 10)、 H5 (配列番号 11及び 12)、 H8 (配列番号 17及び 18)、 H10 (配列番号 21及び 22)、 HI 1 (配列番号 23及び 24)、 HI 2 (配列番号 25及び 26)、 Ml (配列番号 27及び 28)、 M2 (配列番号 29及び 30)、 M3 (配列番号 31及び 32) 、 M5 (配列番号 35及び 36)、 M6 (配列番号 37及び 38)、 M7 (配列番号 39及び 40 )、 M8 (配列番号 41及び 42)、 M9 (配列番号 43及び 44)、 M10 (配列番号 45及び 46)、 Mi l (配列番号 47及び 48)及び M12 (配列番号 49及び 50)。これらの siRN Aを複数組み合わせて使用することにより RNAiを生じさせてもよい。これらの中でも 、 H4及び M8は Slc25al0の発現抑制作用が特に強いため、 Slc25al0の RNAiに 適している。
[0080] このように Slc25al0の発現量を低下させることにより、脂肪酸の合成が阻害される
[0081] また、力かる脂肪酸合成阻害方法を肥満の治療又は予防に応用することができる。
すなわち、生体内で Slc25al0の発現量を低下させることにより脂肪酸の合成を阻害 し、結果的に脂質の合成を抑制することにより肥満の治療又は予防が可能となる。
[0082] 具体的には、以下の手順で肥満の治療又は予防を行う。先ず、 Slc25alOの発現 量を低下させる物質を選択する。かかる物質としては、例えば、 Slc25al0阻害剤と して機能する化合物、 Slc25al0の抗体、アンチセンスヌクレオチド及び RNAiに使 用する siRNAが挙げられる。
[0083] 次に、このような物質を生体内に投与する。投与方法としては、特に制限はないが、 例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉 的又は経口的な投与方法が挙げられる。 RNAiを用いた具体的な方法については、 脂肪酸合成阻害方法で説明した通りである。
[0084] (6)配列番号 9及び 10の核酸力 なる siRNA及びそれを含む Slc25al0発現抑制 剤、脂肪酸合成抑制剤、肥満の治療又は予防剤
既に述べたように、配列番号 9及び 10の核酸からなる siRNAは、 Slc25al0の発 現を強く抑制する。したがって、この siRNAは Slc25al0発現抑制剤として用いること ができ、また、脂肪酸合成抑制剤として用レ、ることもでき、さらに、肥満の治療又は予 防剤として用いることも可能である。
[0085] (7)配列番号 41及び 42の核酸力 なる siRNA及びそれを含む Slc25al0発現抑 制剤、脂肪酸合成抑制剤、肥満の治療又は予防剤
既に述べたように、配列番号 41及び 42の核酸からなる siRNAは、 Slc25al0の発 現を強く抑制する。したがって、この siRNAは Slc25al0発現抑制剤として用いること ができ、また、脂肪酸合成抑制剤として用いることもでき、さらに、肥満の治療又は予 防剤として用いることも可能である。
実施例
[0086] 以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施 例に限定されるものではない。
[0087] (肥満モデル動物の作製）
製造例 1 :ニューロペプチド Y (Neuropeptide Y: NPY) Y5ァゴニス M. c. v.投 与マウス）
[0088] NPY Y5ァゴニストを投与することにより肥満を呈するモデルマウスを以下の要領 で作製した。 9一 12週齢の雄マウス（C57BLZ6J :クレア社製）を、室温 23 ± 2。C、 湿度 55 ± 15%の条件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼育した。また、飼育時の 明暗のサイクルは 12時間とし、午前 7時に点灯し、午後 7時に消灯した。また、マウス には、飼料（CE— 2 (タンパク質： 25. 4重量％、炭水化物： 50. 3重量％、脂質: 4. 4 重量％)：クレア社製）と水を自由に摂取させた。
[0089] マウスを 80mg/kgペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅 菌された 28ゲージの脳注入力ニューレ（アルゼ (Alzet)社製）を右側脳質へ定位的 に移植した。力ニューレを、ブレダマより後方へ 0· 4mm、側方へ 0· 8mm、深さ 2m mの位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。力ニューレを、 0. 05% ゥシ血清アルブミン（BSA)を含む 10mMのリン酸緩衝液で満たした浸透圧ポンプ（ モデルナンバー 2002 :アルゼ社製）にポリビュルクロライドチューブで接続した。 10 mM PBS(0. 05% BSA含む)に D_Try34NPY (5マイクログラム/日になるように 調製）を溶解した溶液をポンプに満たした後、マウスの背中の皮下に埋め込み連続 注入した。また、抗生物質 (50mg/kgのセファメジン (Cefamedine)：藤沢薬品製） を皮下注射した。
[0090] これらのマウスを、溶媒のみを注入し通常に摂食させたグループ（vehicle group) 、 D-Try34NPY (NPY Y5ァゴニスト）を注入することによって摂食量を増加させ肥 満にさせたグループ（ad lib fed group)、 D_Try34NPYを注入したが摂食量は v ehicle groupと同量に摂食制限をかけたグループ（pair— fed group)に分けた。
[0091] 製造例 2 : MCH投与マウス
MCH (melanin-concentrating hormone)を投与することにより肥満を呈する モデルマウスを以下の要領で作製した。 13週齢の雄マウス（C57BL/6J :クレア社 製）を、室温 23± 2°C、湿度 55 ± 15%の条件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼 育した。また、飼育時の明暗のサイクルは 12時間とし、午前 7時に点灯し、午後 7時 に消灯した。また、マウスには、飼料 (CE— 2 (タンパク質： 25. 4重量％、炭水化物： 5 0. 3重量％、脂質: 4. 4重量％) ：クレア社製）と水は自由に摂取させた。マウスが環 境に適応した頃、飼料として MHF (タンパク質： 15. 0重量％、炭水化物： 52. 4重量 %、脂質： 32. 6重量0 /0、オリエンタルバイオサービス社製）を与えた。
[0092] マウスを 80mg/kgペントバルビタールナトリウム（ダイナボット社製）で麻酔し、滅 菌された 28ゲージの脳注入力ニューレ（アルゼ (Alzet)社製）を右側脳質へ定位的 に移植した。力ニューレはブレダマより後方へ 0. 4mm、側方へ 0. 8mm、深さ 2mm の位置に、頭蓋骨に対し垂直に歯科用セメントで固定した。力ニューレを、 30。/oプロ ピレンダリコールで満たした浸透圧ポンプ（モデルナンバー 2002：アルゼ社製）にポ リビュルクロライドチューブで接続した。ポンプはマウスの背中の皮下に坦め込み、抗 生物質を皮下注射した。
[0093] これらのマウスを、平均体重を一致させた 3つのグループ（溶媒のみを注入したグル ープ（vehicle group)、 MCHを注入したグループ（ad lib fed group)、 MCHを 注入しペアフィードとしたグループ（pair— fed group) )に分けた。続レ、て、エーテノレ 麻酔下で、ポンプを MCH(3マイクログラム/日）又は溶媒（30%プロピレングリコール )に置き換えた。
[0094] 製造例 3 : DIO (Diet induced obesity)マウス
18週齢のマウス（C57BL/6J :クレア社製）を、室温 23± 2°C、湿度 55 ± 15%の 条件下、 1プラスチックゲージに 1匹ずつ飼育した。このマウスに高カロリー食である MHF (タンパク質： 18. 2重量％、炭水化物： 55. 6重量％、脂質： 15. 5重量％)を 6 ヶ月間に渡って与え、肥満を呈するモデルマウス（DI〇マウス）を作製した。なお、実 施例中、 Established MFD」は、これ以上体重が増えないようになるまで MHFを 与えて飼育したマウスを指す。
[0095] また、前記のマウスに MHFよりさらに高い脂肪を含有する高カロリー食である HFD
(タンパク質： 20. 8重量％、炭水化物： 38. 59重量％、脂質： 32. 88重量％)を与え た DIOマウス（HFD)も作製した。
[0096] 製造例 4 :食事制限をしたマウス
マウス（C57BL/6N、 17週齢）を 1ケージに 1匹ずつ個別に飼育した。また、エサ は普通食 (CA— 1、 CLEA)を与えた。摂食制限は、以下のようなスケジュールで行つ た。すなわち、エサ (CA— 1)を 1日につき 3時間（10 : 00— 13 : 00)だけ与え、水は自 由に摂取できるようにした。摂食時間の前後で餌の重量を測定し、その差を摂食量と した。また、摂食制限をしている期間は、体重、外見の観察等をモニターした。なお、 条件付けに失敗したと思われるマウス (短期間に極度な体重減少 (例えば 20%程度 の減少）が見られるマウス）は実験には使用しなかった。力かる条件下でマウスを 7日 間飼育した後、白色脂肪細胞を摘出した。
[0097] 実施例 1一 5及び比較例 1一 2 :白色脂肪細胞における Slc25al0の発現
製造例 1一 4におレ、て製造したモデルマウスを用いて、白色脂肪細胞 (WAT)中の Slc25al0遺伝子の発現量を測定した。発現量の測定は、各モデルマウスの白色脂 肪細胞から抽出した RNAを、 mouse U74Aチップ（Affymetrix社製）及び mouse 25K1. 8チップ（Rossetta社製）を用いて処理することにより行った。
[0098] 非処理の C57BLZ6Nの白色脂肪細胞における Slc25al0の発現量を 1とした場 合の、 DIOマウス（DIO)、 D_Try34NPY投与マウス（NPY (FF) )、 D_Try34NPY pair feeding投与群マウス（NPY (PF) )、 MCH投与マウス（MCH (FF) )、 MCH pair feeding投与群マウス（MCH (PF) )、食事制限をしたマウス（Fasting)及び NPY Y5アンタゴニスト投与マウス（Y5ant)における Slc25al0遺伝子の発現量を 表 1に示す。
[0099] 表 1より明らかなように、肥満モデルマウスでは Sk25al0の発現量が増加し、食事 制限をしたマウス及び NPY Y5アンタゴニストを投与したマウスでは、その発現量が 低下していた。従って、 NPY Y5アンタゴニストの発現量と体重とが相関関係を有し ていることが明らかとなった。
[0100] [表 1]
Figure imgf000024_0001
[0101] 実施例 6： Slc25al0とミトコンドリアプロトン勾配との関連
Slc25al0と高い相同性を有する UCPは、ミトコンドリアの膜電位を変化させること (こより熱産生を行う。そこで、 Slc25al0iこつレヽてもミトコンドリアのプロ卜ン勾酉己 (こつ いて検討した。
[0102] 先ず、 HEK293細胞を 6wellプレートに 2 X 106/wellの密度で播種した。 24時間 後、 pcDNA3. 1ベクターにクローニングした Slc25al0遺伝子を、リポフエクトァミン 2000を用いて、前記の細胞に導入した。また、ネガティブコントロールとしてベクター のみを導入した細胞、並びに、ポジティブコントロールとしてマウス UCP1を導入した 細胞及びヒト UCP3を導入した細胞を準備した。 [0103] 遺伝子を導入して 48時間後にミトコンドリア勾配に感受性を示す試薬である DiOC 6 (3-3 ' -Dihexyloxacarbocyanine iodide)を用いて染色を行った。当該染色は 、細胞を 0. 3 μ Μ DiOC6で 20分間染色した後、 PBSで 2回洗浄することにより行 つた。なお、 DiOC6は、プロトン勾配が高い場合にはミトコンドリアに結合する量が多 くなり、強い蛍光を発する。一方、プロトン勾配が低い場合にはミトコンドリアに結合す る量は減少し、蛍光強度は弱くなる。
[0104] 図 1 (a)は、細胞内ミトコンドリアプロトン勾配を uncouplingさせる CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl-hydrazone)で処理した HEK293細胞を Di〇C6で 染色した後の共焦点顕微鏡写真であり、図 1 (b)は、 CCCP非処理の HEK293細胞 の写真である。非処理の HEK293細胞では、細胞内ミトコンドリアが緑状のドットに染 色されていることがわかる。一方、 CCCP処理細胞では、蛍光強度が大きく低下して レ、ることがわかる。従って、ミトコンドリアがプロトン勾配特異的に染色されていることが 確認できた。
[0105] DiOC6の蛍光強度、すなわち、ミトコンドリアプロトン勾配の定量化は、以下の 2つ の方法により行った。
[0106] (1)フローサイトメーターによる解析
DiOC6で染色した細胞をリン酸緩衝液（PBS)で洗浄した後、フローサイトメーター (Beckman Coulter社製： Epics Elite Flow Cytometer) (ァノレゴンレーザー： 488nm、バンドパスフィルター： 522nm)を用いてその蛍光強度を測定した。
[0107] フローサイトメーターの解析結果を図 2に表す。 （a)は CCCPで処理した HEK293 細胞を、（b)は非処理の HEK293細胞を、（c)は Slc25alOを導入した HEK293細 胞を表す。図 2 (a)—（c)に示すとおり、 Slc25alO遺伝子を導入した HEK293細胞 の蛍光強度を示すヒストグラムは、コントロールと比較してシフト（蛍光強度が増加）し ており、プロトン勾配が上昇したことが確認できた。表 2に、それぞれの試料の蛍光強 度の平均値を示す。
[0108] [表 2] サンプル名 平均蛍光強度 図 2 (a) CCCP処理 5.4
図 2 (b) Slc25a10遺伝子導入せず 16.8
図 2 (c) Slc25a10遺伝子導入 25.9
[0109] (2)フルォロメーターによる解析
DiOC6で染色した細胞を PBSで洗浄した後、溶解し、遠心分離することによって 細胞抽出液を準備した。この細胞抽出液をフルォロメーター（Perseptive Biosyst ems社製： Cytofluor Series 4000 Fluorescent Multi Well Plate Reade r) (Excitation: 485nm、 Emission: 520nm)を用いて解析した。
[0110] ベクターのみを導入したコントロール細胞の蛍光強度を 100として、各試料の相対 値を求めたところ、図 3に示すとおり、マウス UCP1又はヒト UCP3を導入した細胞で は 20%程度のプロトン勾配の低下が観察されたのに対し、マウス又はヒト Slc25al0 遺伝子を導入した細胞では 20%程度のプロトン勾配の上昇が観察された。この結果 より、 Slc25al0のプロトン勾配に対する活性は UCPとは逆の作用を有するものであ り、その活性は UCPと同程度の強度であることが確認できた。
[0111] 実施例 7:Slc25alO遺伝子の発現
脂肪組織、骨格筋、脾臓、肺、腎臓、脳、心臓、精巣、肝臓の mRNAがトランスファ 一されたノーザン解析用のメンブレン (バイオチェーン社製、クロンテック社製）を用い て、 Slc25al0遺伝子の発現部位の解析を行った。ここで、プローブとして32 Pで標識 されたマウス Slc25al0の全長 cDNAを使用し、 QuickHYB (ストラタジーン社製）を 緩衝液としてハイブリダィゼーシヨンを行った。
[0112] 図 4に示すとおり、 Slc25al0遺伝子は脂肪組織に非常に強く発現し、腎臓及び肝 臓にも若干発現していることが確認された。
[0113] 実施例 8:Slc25alOの発現抑制による ACC1の挙動
(1)脂肪酸合成における Slc25al0の役割
脂肪細胞への分化能を有する 3T3— L1細胞を用いて、分化の前後で Slc25al0 遺伝子と ACC1遺伝子の発現の間に相関があるかどうかを確認した。 6ゥエルプレー トに 3T3—L1細胞を播種し、 2日後にコンフルェントになったところで、インスリン、デ キサメタゾン及び IBMX (3—イソブチルー 1—メチルキサンチン）を含む分化誘導培地 にて脂肪細胞へと分化させた。分化から 2日後及び 4日後に、それぞれ siRNA (M8 )で 3時間、 Slc25al0の発現抑制を行った。分化 8日後に相関を調べた。図 5 (a)及 び (b)に示すように、 3T3-L1を脂肪に分化させた場合に、 Slc25alO遺伝子及び A CC1遺伝子のいずれについても、その発現量が増加することが確認できた。 ACC1 の発現の増加は脂肪酸合成が亢進していることの指標となることから、脂肪酸合成の 亢進と Slc25al0の発現との間に密接な関係があることが確認できた。
[0114] (2) siRNAのトランスフエクシヨン及び定量的 RT— PCR
先ず、サイレンサー siRNAコンストラタシヨンキット（アンビオン社製）を用いて siRN Aを合成した。次に、ヒト又はマウスの Slc25al0に最適な配列を決定するため、それ ぞれ 12種の配列を Slc25al0の発現抑制を指標に検討した。各 siRNAをトランスフ ェタトした細胞における、 Slc25al0遺伝子の相対発現量を図 6 (a)及び (b)に示す。 この結果から、以後の実験には siRNAとして H4、 H10及び M8を用いることとした。
[0115] 各 siRNAの配列は以下のとおりである。 「ポジション」は、ヒト Slc25al0遺伝子（N M— 012140)においてその siRNAがどの核酸番号の位置に該当するかを示す。 HI (ポジション 186)
センス： AACTGCGTCTGCAGATGCACCCCTGTCTC (配列番号 3)
アンチセンス： AAGGTGCATCTGCAGACGCAGCCTGTCTC (配歹' J番号 4) H2 (ポジション 465)
センス： AAGTCGTTCTGCATCCTGACGCCTGTCTC (酉己歹 IJ番号 5)
アンチセンス： AACGTCAGGATGCAGAACGACCCTGTCTC (配歹' J番号 6) H3 (ポジション 513)
センス： AAATCCAGCGCATGGGCGTAGCCTGTCTC (配歹 IJ番号 7)
アンチセンス： AACTACGCCCATGCGCTGGATCCTGTCTC (配歹' J番号 8) H4 (ポジション 556)
センス： AAACAGTCTCCTGAGACCCTCCCTGTCTC (配列番号 9)
アンチセンス： AAGAGGGTCTCAGGAGACTGTCCTGTCTC (配列番号 10) H5 (ポジション 651)
センス： AAGGTGCTAAGGACCAGCTGCCCTGTCTC (配列番号 11) アンチセンス： AGCAGCTGGTCCTTAGCACCCCTGTCTC (配歹' J番号 12) H6 (ポジション 780)
センス： AACTGATACTCCCCCTTGGAGCCTGTCTC (配歹' J番号 13) アンチセンス： AACTCCAAGGGGGAGTATCAGCCTGTCTC (配歹 lj番号 14) H7 (ポジション 945)
センス： AAGGCTGGTCAGGATGGCACTCCTGTCTC (；配歹幡号 15) アンチセンス： AAAGTGCCATCCTGACCAGCCCCTGTCTC (配列番号 16) H8 (ポジション 1010)
センス： AAGTGCTGGGCTTGGGACTCTCCTGTCTC (配歹幡号 17) アンチセンス： AAAGAGTCCCAAGCCCAGCACCCTGTCTC (配列番号 18) H9 (ポジション 1315)
センス： AAGTGCTGGAAGATGCTGCTCCTGTCTC (；配歹 lj番号 19)
アンチセンス： AAAGTGCTGGAAGATGCTGCTCCTGTCTC (；配歹 lj番号 20) H10 (ポジション 1426)
センス： AAGAGGACATGGAAGGTCTGGCCTGTCTC (配列番号 21) アンチセンス： AACCAGACCTTCCATGTCCTCCCTGTCTC (配歹 IJ番号 22) HI 1 (ポジション 1634)
センス： AAGCTGGTGAGTGGAGAGGCTCCTGTCTC (配歹' J番号 23) アンチセンス： AAAGCCTCTCCACTCACCAGCCCTGTCTC (配列番号 24) HI 2 (ポジション 1870)
センス： AAAGCTCCCGGCATTTATTGACCTGTCTC (配列番号 25) アンチセンス： AATCAATAAATGCCGGGAGCTCCTGTCTC (配列番号 26)。 同様に、マウス Slc25al0遺伝子（NM_013770)に対する siRNAの塩基配列を 以下に示す。
Ml (ポジション 209)
センス： AATTGGGTCTGCAAATGCACCCCTGTCTC (；配歹幡号 27) アンチセンス： AAGGTGCATTTGCAGACCCAACCTGTCTC (配列番号 28) M2 (ポジション 358)
センス： AATCCCGCATGGTCTCGTAGACCTGTCTC (配歹 lj番号 29) アンチセンス： AATCTACGAGACCATGCGGGACCTGTCTC (；配歹' J番号 30) M3 (ポジション 488)
センス： AAGTCGTTCTGCATCCTGACACCTGTCTC (酉己歹 IJ番号 31) アンチセンス： AATGTCAGGATGCAGAACGACCCTGTCTC (配列番号 32) M4 (ポジション 536)
センス： AAATCCAGGGCATGAGAGTAGCCTGTCTC (配列番号 33) アンチセンス： AACTACTCTCATGCCCTGGATCCTGTCTC (配歹 lj番号 34) M5 (ポジション 674)
センス： AAAGTGCTGAGGACCAGTTGCCCTGTCTC (；配歹 lj番号 35) アンチセンス： AAGCAACTGGTCCTCAGCACTCCTGTCTC (配歹幡号 36) M6 (ポジション 788)
センス： AAGGAGTTCATCAGGCGAGTCCCTGTCTC (；配歹 lj番号 37) アンチセンス： AAGACTCGCCTGATGAACTCCCCTGTCTC (配歹幡号 38) M7 (ポジション 968)
センス： AAATGTCAGGTGGTTGGCACTCCTGTCTC (；配歹' J番号 39) アンチセンス： AAAGTGCCAACCACCTGACATCCTGTCTC (配歹 IJ番号 40) M8 (ポジション 1159)
センス： AAGTGGCACCTCTGCCCTACTCCTGTCTC (；配歹 lj番号 41) アンチセンス： AAAGTAGGGCAGAGGTGCCACCCTGTCTC (配列番号 42) M9 (ポジション 1312)
センス： AAAGCAGGAAACGAACTCGGCCCTGTCTC (配歹' J番号 43) アンチセンス： AAGCCGAGTTCGTTTCCTGCTCCTGTCTC (酉己歹 lj番号 44) M10 (ポジション 1481)
センス： AACTCTCCTGAAGGCACTACCCCTGTCTC (配列番号 45) アンチセンス： AAGGTAGTGCCTTCAGGAGAGCCTGTCTC (配列番号 46) Mi l (ポジション 1661)
センス： AAGTGTGAGGGACACAGACAGCCTGTCTC (配列番号 47) アンチセンス： AACTGTCTGTGTCCCTCACACCCTGTCTC (酉己歹 IJ番号 48) Ml 2 (ポジション 1827)
センス： AATTGAGGGAAAACAGGCTGCCCTGTCTC (配歹' J番号 49) アンチセンス： AAGCAGCCTGTTTTCCCTCAACCTGTCTC (配列番号 50)。
[0117] 次に、 siRNAを導入した細胞を準備した。 siRNAのトランスフエクシヨンに際して、 6 穴プレートに 2 X 104細胞/ wellの濃度で播種した。 24時間後、 siRNA (H4又は H 10)をオリゴフエクタミン（Oligofectamine：インビトロジェン社製）を用いて細胞にトラ ンスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンの 2日後、細胞を回収し、 RNeasy (キアゲン 社製）を用いて RNAを調製した。調製した RNAから定量的 RT— PCR (アプライドバ ィォシステム社製）により cDNAを調製し、 Slc25al0及び ACC1の発現量を定量し た。
[0118] 図 7 (a)及び (b)に示すように、 RNAiにより Slc25al0遺伝子の発現を抑制した場 合に、 ACC1遺伝子の発現もそれに比例して抑制されることが確認できた。
[0119] 実施例 9： Slc25al0の強制発現による ACC1の挙動
次に、 Slc25al0遺伝子を強制発現させ、 HEK293細胞における発現を増加させ た場合に ACC1の発現がどのような挙動を示す力、を検討した。
[0120] 先ず、 Slc25al0の発現ベクターを、ヒト Slc25al0遺伝子を pcDNA3. 1 (インビト ロジェン社製）にクローニングすることにより調製した。この発現ベクターを HEK293 細胞にトランスフエクシヨンし、安定的に Slc25al0を発現する細胞株（H19クローン 及び H41クローン）を樹立した。当該細胞株 (106細胞)から RNAを調製し、調製した RNAから定量的 RT—PCRにより Slc25al0及び ACC1の発現レベルを測定した。 図 8に示すように、 Slc25al0遺伝子を強制発現させた場合、対照と比較して ACC1 遺伝子の発現も増加していることが確認できた。
[0121] 実施例 10 : Slc25alOの発現によるマロニル CoA量の挙動
107細胞/ dishの濃度で培養した HepG2細胞をトリプシン処理し、遠心分離するこ とにより細胞を回収した。得られた細胞のペレットにトリクロ口酢酸（10%： 800 μ L)を 加え、 3000rpmで 10分間遠心分離することにより可溶化画分を抽出した。マロニル CoAの部分精製のために、抽出物を逆相クロマトグラフィー（Sep-Pak C18)で精 製した。得られた溶出液を乾燥させた後、 100〃Lの水に溶解した。マロニル CoA(5 0 x L)を含む試料を脂肪酸シンセース（fatty acid synthase)及び放射線標識し たァセチル CoAと反応させ、脂肪酸を合成した。脂肪酸を石油エーテルで抽出し、 放射線標識された脂肪酸の放射活性をシンチレーシヨンカウンタ一により測定した。
[0122] 図 9に示すように、 Slc25al0遺伝子の発現を抑制した場合に、マロニル CoAの生 成量は低下することが確認できた。また、脂肪酸の生成は、通常、マロニル CoAと比 例的な挙動を示すことから、 Slc25al0遺伝子の発現と脂肪酸の生成量との間にも 同様の関係があるものと考えられた。
[0123] 実施例 11：脂肪蓄積の同定
3T3— L1細胞を用いて、脂肪の蓄積を解析した。
6ゥエルプレートに 3T3—L1細胞を播種し、 2日後にコンフルェントになったところで 、インスリン、デキサメタゾン及び IBMX (3—イソブチルー 1—メチルキサンチン）を含む 分化誘導培地にて脂肪細胞へと分化させた。分化から 2日後及び 4日後に、それぞ れ siRNA (M8)で 3時間、 Slc25al0の発現抑制を行った。分化から 8日後に、蓄積 した脂肪を 0. 175%のオイルレッド〇で染色し、 PBSで洗浄した。図 10は、脂肪細 胞に分化した 3T3—L1細胞の顕微鏡である。
[0124] また、脂肪の蓄積量を定量するため、染色した脂肪細胞を lmLのプロパノールで 処理し、蓄積した脂肪を溶出させた。各細胞における脂肪の蓄積量の定量結果を図 11に示す。図 10及び 11に示した結果から明らかなように、 RNAiで Slc25al0の発 現抑制を行ったところ、脂肪の蓄積量が減少した。
産業上の利用可能性
[0125] 以上説明したように、本発明の化合物の評価方法又は検査方法によれば、肥満の 治療薬のスクリーニング等、化合物の評価方法を提供することが可能となる。また、分 子レベルで判断可能な肥満の検査方法を提供することが可能となる。従って、抗肥 満薬の開発や臨床における肥満の診断など、生活習慣病を一例とする医療の分野 において、新たな医薬や診療形態を提供することが可能となる。 また、本発明によれば、長鎖脂肪鎖伸長酵素活性を抑制する活性を有する物質（ 例えば、 siRNA、低分子化合物、タンパク質、抗体など）を用いた代謝系疾患、循環 器系疾患、中枢神経系疾患などの治療 ·予防方法を提供することが可能となり、また 、力かる物質を含有する治療 ·予防剤を提供することが可能となる。代謝系疾患とし ては、例えば、肥満症、糖尿病、ホルモン分泌異常、高脂血症、通風、脂肪肝などが 挙げられる。循環器疾患としては、例えば、狭心症、急性'うつ血性心不全、心筋梗 塞、冠状動脈硬化症、高血圧、腎臓病、電解質異常などが挙げられる。中枢神経系 疾患としては、過食症などが挙げられる。

Claims

請求の範囲
[1] 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
該被検動物又は該被検細胞中で Slc25al0遺伝子あるいは該遺伝子と機能的に 等価な遺伝子の発現レベルの変化を検出する工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[2] 被検化合物を、 Slc25al0遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子との融合遺 伝子を有する被検動物又は被検細胞に投与又は接触させる工程と、
該レポーター遺伝子の被検動物又は被検細胞中での発現レベルの変化を検出す る工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[3] 前記発現レベルの変化が発現レベルの低下であることを特徴とする請求項 1又は 2 に記載の化合物の評価方法。
[4] ACC1の発現量、マロニル CoA存在量及び脂肪酸存在量のうち少なくとも一つの 変化を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項 1一 3のいずれか一項に記 載の化合物の評価方法。
[5] 被検化合物を、被検動物又は被検細胞に、投与又は接触させる工程と、
該被検化合物が、 Slc25alOタンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する 工程と、
を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[6] 被検化合物を、 Slc25al0タンパク質に接触させる工程と、
該被検化合物が、該タンパク質の活性に影響を与えるか否かを確認する工程と、 を含むことを特徴とする肥満の治療又は予防に有効な化合物の評価方法。
[7] 請求項 1一 6のいずれか一項に記載の評価方法によって得られた化合物を有効成 分として含有することを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
[8] Slc25al0遺伝子の発現量を低下させることを特徴とする脂肪酸合成阻害方法。
[9] Slc25al0遺伝子の発現量を RNAiにより低下させることを特徴とする脂肪酸合成 阻害方法。
[10] 前記 RNAiが、配列番号 3及び 4に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 5及び 6 に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 7及び 8に記載の核酸からなる siRNA、配 列番号 9及び 10に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 11及び 12に記載の核酸 力 なる siRNA、配列番号 17及び 18に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 21 及び 22に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる si RNA、配列番号 25及び 26に記載の核酸力 なる siRNA、配列番号 27及び 28に 記載の核酸からなる siRNA、配列番号 29及び 30に記載の核酸からなる siRNA、配 列番号 31及び 32に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 35及び 36に記載の核酸 力 なる siRNA、配列番号 37及び 38に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 39 及び 40に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 41及び 42に記載の核酸からなる si RNA、配列番号 43及び 44に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 45及び 46に 記載の核酸からなる siRNA、配列番号 47及び 48に記載の核酸からなる siRNA及 び配列番号 49及び 50に記載の核酸からなる siRNAからなる群から選択されるー以 上の siRNAを使用したものであることを特徴とする請求項 9に記載の脂肪酸合成阻 害方法。
前記 RNAiが配列番号 9及び 10に記載の核酸からなる siRNAを使用したものであ ることを特徴とする請求項 9に記載の脂肪酸合成阻害方法。
前記 RNAiが配列番号 41及び 42に記載の核酸からなる siRNAを使用したもので あることを特徴とする請求項 9に記載の脂肪酸合成阻害方法。
Slc25al0遺伝子の発現量を低下させる工程を含むことを特徴とする肥満の治療 又は予防方法。
Slc25al0遺伝子の発現量を RNAiにより低下させることを特徴とする肥満の治療 又は予防方法。
前記 RNAiが、配列番号 3及び 4に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 5及び 6 に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 7及び 8に記載の核酸からなる siRNA、配 列番号 9及び 10に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 11及び 12に記載の核酸 力 なる siRNA、配列番号 17及び 18に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 21 及び 22に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 23及び 24に記載の核酸からなる si RNA、配列番号 25及び 26に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 27及び 28に 記載の核酸からなる siRNA、配列番号 29及び 30に記載の核酸からなる siRNA、配 列番号 31及び 32に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 35及び 36に記載の核酸 力 なる siRNA、配列番号 37及び 38に記載の核酸力 なる siRNA、配列番号 39 及び 40に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 41及び 42に記載の核酸からなる si RNA、配列番号 43及び 44に記載の核酸からなる siRNA、配列番号 45及び 46に 記載の核酸からなる siRNA、配列番号 47及び 48に記載の核酸からなる siRNA及 び配列番号 49及び 50に記載の核酸からなる siRNAからなる群から選択されるー以 上の siRNAを使用したものであることを特徴とする請求項 14に記載の肥満の治療又 は予防方法。
[16] 前記 RNAiが配列番号 9及び 10に記載の核酸からなる siRNAを使用したものであ ることを特徴とする請求項 14に記載の肥満の治療又は予防方法。
[17] 前記 RNAiが配列番号 41及び 42に記載の核酸からなる siRNAを使用したもので あることを特徴とする請求項 14に記載の肥満の治療又は予防方法。
[18] 被検組織又は被検細胞における Slc25al0遺伝子の発現レベル又は発現レベル の変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
[19] 被検組織又は被検細胞における Slc25al0タンパク質の発現レベル又は発現レべ ルの変化を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
[20] 被検組織又は被検細胞において、 Slc25al0遺伝子の発現レベル又は Slc25alO タンパク質の活性を変化させた際に、該変化によって生じる脂肪酸合成に関与する 物質の変化量を測定することを特徴とする肥満の検査方法。
[21] 被検組織又は被検細胞における Slc25al0遺伝子に存在する多型を検出すること を特徴とする肥満の検査方法。
[22] Slc25al0タンパク質と相互作用することにより、 Slc25al0遺伝子の発現量に影 響を及ぼすタンパク質の発現量又は該タンパク質の活性を検出することを特徴とする 肥満の検査方法。
[23] 配列番号 9及び 10に記載の核酸からなることを特徴とする siRNA。
[24] 請求項 23に記載の siRNAを含むことを特徴とする Slc25al0発現抑制剤。
[25] 請求項 23に記載の siRNAを含むことを特徴とする脂肪酸合成抑制剤。
[26] 請求項 23に記載の siRNAを含むことを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
[27] 配列番号 41及び 42に記載の核酸からなることを特徴とする siRNA。
[28] 請求項 27に記載の siRNAを含むことを特徴とする Slc25al0発現抑制剤。
[29] 請求項 27に記載の siRNAを含むことを特徴とする脂肪酸合成抑制剤。
[30] 請求項 27に記載の siRNAを含むことを特徴とする肥満の治療又は予防剤。
PCT/JP2004/010664 2003-07-31 2004-07-27 Slc25a10による肥満治療に有効な化合物の評価方法 WO2005012570A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04747977A EP1666607A4 (en) 2003-07-31 2004-07-27 METHOD OF EVALUATING AN EFFECTIVE COMPOUND FOR TREATING OBESITY USING SLC25A10
JP2005512495A JPWO2005012570A1 (ja) 2003-07-31 2004-07-27 Ｓｌｃ２５ａ１０による肥満治療に有効な化合物の評価方法
CA002534309A CA2534309A1 (en) 2003-07-31 2004-07-27 Method of evaluating compound efficacious in treating obesity by using slc25a10
US10/566,822 US20060198788A1 (en) 2003-07-31 2004-07-27 Method of evaluating compound efficacious in treating obesity by using slc25a10
US12/607,326 US20100076059A1 (en) 2003-07-31 2009-10-28 METHOD OF EVALUATING COMPOUND EFFICACIOUS IN TREATING OBESITY BY USING Slc25a10

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-204249 2003-07-31
JP2003204249 2003-07-31
JP2004057535 2004-03-02
JP2004-057535 2004-03-02

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/607,326 Continuation US20100076059A1 (en) 2003-07-31 2009-10-28 METHOD OF EVALUATING COMPOUND EFFICACIOUS IN TREATING OBESITY BY USING Slc25a10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005012570A1 true WO2005012570A1 (ja) 2005-02-10

Family

ID=34117892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/010664 WO2005012570A1 (ja) 2003-07-31 2004-07-27 Slc25a10による肥満治療に有効な化合物の評価方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20060198788A1 (ja)
EP (1) EP1666607A4 (ja)
JP (1) JPWO2005012570A1 (ja)
CA (1) CA2534309A1 (ja)
WO (1) WO2005012570A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008178363A (ja) * 2007-01-25 2008-08-07 Tohoku Univ レプチンシグナル伝達障害モデル動物
JP2013059332A (ja) * 2012-10-26 2013-04-04 Tohoku Univ マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法
WO2017159592A1 (ja) * 2016-03-15 2017-09-21 綿引 一 肥満リスクの診断キット，及び肥満の発症リスクの分析方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4814774B2 (ja) * 2006-12-06 2011-11-16 花王株式会社 肥満調節剤の評価方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999064458A1 (en) * 1998-06-08 1999-12-16 Trustees Of Boston University Novel methods for identifying modulators of mitochondrial anion carrier activity

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE304552T1 (de) * 2000-02-18 2005-09-15 Leangene Ab Methoden zur identifizierung von zusammensetzungen, die für die behandlung von fettleibigkeit nützlich sind, unter verwendung von foxc2
US20020137063A1 (en) * 2000-08-29 2002-09-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 57242, a novel human G protein-coupled receptor family member and uses therefor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999064458A1 (en) * 1998-06-08 1999-12-16 Trustees Of Boston University Novel methods for identifying modulators of mitochondrial anion carrier activity

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAS K, ET AL: "Predominant expression of the mitochondrial dicarboxylate carrier in white adipose tissue", BIOCHEM. J., vol. 344, 1999, pages 313 - 320, XP008003598 *
FIERMONTE G, ET AL: "Organization and sequence of the gene for the human mitochondrial dicarboxylate carrier: evolution of the carrier family", BIOCHEM. J., vol. 344, 1999, pages 953 - 960, XP002981711 *
FIERMONTE G, ET AL: "The sequence, bacterial expression, and functional reconstritution of the rat mitochondrial dicarboxylate transporter cloned via distant homologs in yeast and caenorhadbitis elegans", J. BIO. CHEM., vol. 273, no. 38, 1998, pages 24754 - 24759, XP002981710 *
See also references of EP1666607A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008178363A (ja) * 2007-01-25 2008-08-07 Tohoku Univ レプチンシグナル伝達障害モデル動物
JP2013059332A (ja) * 2012-10-26 2013-04-04 Tohoku Univ マウスの生育過程において社会的隔離に対する肥満又は糖尿病発症の感受性を解析する方法
WO2017159592A1 (ja) * 2016-03-15 2017-09-21 綿引 一 肥満リスクの診断キット，及び肥満の発症リスクの分析方法
CN108779454A (zh) * 2016-03-15 2018-11-09 绵引 肥胖风险的诊断试剂盒和肥胖发病风险的分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2534309A1 (en) 2005-02-10
EP1666607A4 (en) 2007-11-21
JPWO2005012570A1 (ja) 2007-09-27
US20100076059A1 (en) 2010-03-25
US20060198788A1 (en) 2006-09-07
EP1666607A1 (en) 2006-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Eraly et al. Decreased renal organic anion secretion and plasma accumulation of endogenous organic anions in OAT1 knock-out mice
Louet et al. The coactivator SRC-1 is an essential coordinator of hepatic glucose production
JP5299900B2 (ja) 糖尿病関連肝臓由来分泌タンパク質の２型糖尿病または血管障害の診断または治療への利用
US7491381B2 (en) Method of evaluating compound efficacious in treating obesity
JP4820092B2 (ja) 転移のための新規な因子及びその使用
JPWO2007018309A1 (ja) Ｒｂパスウェイ上の分子を指標とする化合物の評価方法及び分子診断方法
US20100076059A1 (en) METHOD OF EVALUATING COMPOUND EFFICACIOUS IN TREATING OBESITY BY USING Slc25a10
CA2908889C (en) Treatment of insulin resistance through inhibitors of transcription factor tsc22d4
US20130210039A1 (en) Blood insulin resistance and diabetes marker progranulin, method for analyzing concentration of progranulin in blood sample, and method for screening for substance that improves insulin resistance and improves or suppresses diabetes
US7510833B2 (en) Method for examining obesity or leanness
CA2739171A1 (en) Biomarker for microdomain diease
JP2017214337A (ja) 筋ジストロフィー治療剤
JP2018194299A (ja) 解糖系代謝制御物質のスクリーニング方法及び解糖系代謝制御剤
JP4960951B2 (ja) Ｍｇｃ４５０４の使用
KR101885946B1 (ko) 제2형 당뇨병 진단용 마커 및 그 용도
JP5119510B2 (ja) 肥満の予防・治療剤
WO2020146639A2 (en) Compositions and methods for the diagnosis and treatment of diseases of the liver
JP2003230388A (ja) 糖・脂質代謝異常疾患マーカーおよびその利用
CN116179705A (zh) Srebf1在制备治疗急性t淋巴细胞白血病化疗药物中的应用
CN112789356A (zh) 急性肾损伤特异性生物标志物、急性肾损伤的诊断方法、急性肾损伤的检查用试剂盒、动物治疗方法以及急性肾损伤用医药
KR20200112069A (ko) 골 질환의 예방 또는 치료를 위한 Ｊｍｊｄ２ｂ 억제제의 용도
CN111363824A (zh) 一种用于肝癌诊断的lncRNA生物标志物及其应用
JP2006109732A (ja) 糖代謝調節剤、およびそのスクリーニング方法
KR20180047188A (ko) Cry1의 당뇨병 치료제 및 이를 표적으로 하는 당뇨병 치료제 스크리닝 용도
JPWO2005093068A1 (ja) 新規タンパク質及びプロモーター

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005512495

Country of ref document: JP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2534309

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004747977

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10566822

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004747977

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10566822

Country of ref document: US