WO2017159592A1 - 肥満リスクの診断キット，及び肥満の発症リスクの分析方法 - Google Patents

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中島　利博
聡子 荒谷
英俊 藤田
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中島　利博
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    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic kit for obesity risk and a method for analyzing the risk of developing obesity.
  • Japanese Patent No. 5279492 discloses a probe for use in polymorphism analysis of obesity genes. By analyzing the obesity gene in this way, a technique for analyzing a genetic risk that a subject develops obesity has been developed.
  • the present invention provides a diagnostic kit for obesity risk and a method for analyzing the risk of developing obesity.
  • the present invention is basically based on the knowledge obtained by the Examples that the genetic information of those who are obese and those who are not obese is analyzed, and those who are obese express a large amount of synoviolin gene.
  • the expression level of the Synoviolin gene in those who are obese is statistically significant and higher than the expression level of the Synoviolin gene in those who are not.
  • the Synoviolin gene is considered to be an obesity marker for judging the risk (possibility of morbidity) of whether or not there is a high tendency to genetically become obese.
  • the first aspect of the present invention relates to a diagnostic kit for obesity risk.
  • This diagnostic kit for obesity risk includes a probe for identifying the Synoviolin gene, which is an obesity marker.
  • the second aspect of the present invention relates to a method for analyzing the risk of developing obesity.
  • This method includes a step of measuring the expression level of a synoviolin gene in a sample collected from a target organism, and a step of determining the risk of developing obesity using the expression level of the synoviolin gene.
  • the present invention can provide a diagnostic kit for obesity risk and a method for analyzing the risk of developing obesity.
  • FIG. 1 is a box and whisker plot showing the expression levels of Synoviolin gene and ATF6 gene.
  • FIG. 2 is a box plot showing the expression levels of the XBP1 gene and the EIF2 gene.
  • FIG. 3 is a box plot showing the expression levels of the GRP78 gene and the IREI1 gene.
  • the first aspect of the present invention relates to a diagnostic kit for obesity risk.
  • This diagnostic kit collects a sample (for example, blood, saliva, nails, hair) from a target organism (for example, a human) and measures the expression level of the synoviolin gene contained in the collected sample.
  • a target organism for example, a human
  • this diagnostic kit for risk of obesity includes a probe for identifying the Synoviolin gene that is an obesity marker. By using this probe, the expression level of the synoviolin gene can be determined.
  • This diagnostic kit can be used for genetic diagnosis, for example, to determine whether or not it has a gene prone to obesity.
  • the diagnostic kit may contain a known element for measuring the expression level of the target synoviolin gene in addition to the probe. Examples of such elements are primers used in PCR and may include a PCR measurement device.
  • a known method may be appropriately employed.
  • An example of a method for determining the expression level of the synoviolin gene is PCR.
  • the expression level of the synoviolin gene for example, the expression level at the mRNA level may be measured, or the expression level at the protein level may be measured.
  • methods for determining the expression level of the Synoviolin gene are Northern blotting, quantitative RT-PCR, Western blotting, ELISA, and immunostaining. Since these methods are known and kits for realizing these methods are sold, the expression level of the synoviolin gene can be determined in consideration of the instruction manual for the kits.
  • Probes for identifying the Synoviolin gene are known.
  • An example of a probe for identifying the Synoviolin gene is No. 16 in the Roche universal probe library.
  • the region amplified by this probe is that of SEQ ID NO: 1.
  • the obesity risk diagnostic kit of the present invention may appropriately include known elements for genetic diagnosis in addition to the above-described probes.
  • the second aspect of the present invention relates to a method for analyzing the risk of developing obesity.
  • This method includes a step of measuring the expression level of a synoviolin gene in a sample collected from a target organism, and a step of determining the risk of developing obesity using the expression level of the synoviolin gene.
  • the step of measuring the expression level of the synoviolin gene is as described above.
  • it may be compared with the expression level of the synoviolin gene in a sample collected from a healthy subject.
  • a threshold value regarding the expression level of the synoviolin gene may be obtained in advance using a sample of a plurality of obese or non-obese subjects and compared with the threshold.
  • This method for analyzing the risk of developing obesity may be automatically obtained using a computer.
  • the computer has an input / output unit, a calculation unit, a control unit, and a storage unit, which can exchange information using a bus or the like.
  • storage part has memorize
  • a control part reads the calculation program memorize
  • the obtained analysis result is appropriately sent to and stored in the storage unit by the control unit and is output from the input / output unit. In this way, the risk of developing obesity in the subject is required.
  • RNA recovery and real-time (RT) -PCR Blood was collected from 33 healthy individuals, and lymphocytes were collected using Ficoll separation method. Using the collected lymphocytes, total RNA was generated using ISOGEN (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.). Table 1 shows information on the age, sex, height, and BMI value of healthy persons (healthy donors) in the examples.
  • SYVN1 (Synoviolin gene) Forward primer: 5'- ccagtacctcaccgtgctg-3 (SEQ ID NO: 2) Reverse primer: 5'-tctgagctagggatgctggt-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • the probe used was No. 16 from the Roche universal probe library.
  • ATF6 Forward primer: 5′-gcagaaggggagacacattt-3 ′ (SEQ ID NO: 4)
  • Reverse primer 5'-tgtggtcttgttatgggtggt-3 ', (SEQ ID NO: 5)
  • the probe used was No. 62 from the Roche universal probe library.
  • XBP1 Forward primer: 5'-ggagttaagacagcgcttgg-3 '(SEQ ID NO: 6) Reverse primer: 5'-cactggcctcacttcattcc-3 ', (SEQ ID NO: 7)
  • SEQ ID NO: 7 As a probe, No. 37 of the universal probe library of Roche was used.
  • IRE1 Forward primer: 5'-gaagcatgtgctcaaacacc-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Reverse primer 5'-tctgtcgctcacgtcctg-3 ', (SEQ ID NO: 9)
  • SEQ ID NO: 9 As a probe, No. 502 of the universal probe library of Roche Corporation was used.
  • eIF2a Forward primer: 5'-gaagctaagaaagctgcaaagc-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • Reverse primer 5'- cagtgtttcgtggtgtgctc-3 ', (SEQ ID NO: 11)
  • the probe used was No. 43 from the Roche universal probe library.
  • GRP78 Forward primer: 5'-catcaagttcttgccgttca-3 '(SEQ ID NO: 12) Reverse primer: 5'-ttcaggagcaaatgtctttgttt-3 ', (SEQ ID NO: 13)
  • the probe used was No. 10 from the Roche universal probe library.
  • RPLPO Forward primer: 5′-gcagaaggggagacacattt-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
  • Reverse primer 5′-tgtggtcttgttatgggtggt-3 ′, (SEQ ID NO: 15)
  • the probe used was No. 62 from the Roche universal probe library.
  • RT-PCR For RT-PCR, ReverseTra Ace (registered trademark), which is a highly efficient reverse transcriptase manufactured by Toyobo Co., Ltd., was used.
  • the conditions for RT-PCR were as follows. RT-PCR determined conditions such as temperature setting based on the instruction manual of the kit used. 1 ⁇ g of total RNA and RNase-free water were combined to make 10 ⁇ L, incubated at 65 ° C. for 5 minutes, and then cooled on ice for 5 minutes.
  • the obtained expression level was subjected to statistical analysis using Excel statistical software 2012 (the Excel Statistical software 2012) manufactured by SSRI Japan.
  • the RNA expression level of each gene was divided into a body BMI (body mass index) of 25 kg / m 2 or more and the following, and statistically significant differences were verified by unpaired Student's t-test. . At that time, if the p-value was 0.05 or less, it was judged that there was a statistically significant difference.
  • FIG. 1 to 3 are box and whisker plots showing the expression level of each RNA.
  • FIG. 1 is a box and whisker plot showing the expression levels of Synoviolin gene and ATF6 gene.
  • FIG. 2 is a box plot showing the expression levels of the XBP1 gene and the EIF2 gene.
  • FIG. 3 is a box plot showing the expression levels of the GRP78 gene and the IREI1 gene.
  • the present invention can be used in the field of genetic diagnostic equipment and in the diagnostic business.
  • Sequence number 2 Primer Sequence number 3: Primer Sequence number 4: Primer Sequence number 5: Primer Sequence number 6: Primer Sequence number 7: Primer Sequence number 8: Primer Sequence number 9: Primer Sequence number 10: Primer Sequence number 11: Primer Sequence number 12: Primer Sequence number 13: Primer Sequence number 14: Primer Sequence number 15: Primer

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Abstract

【解決課題】　肥満リスクの診断キット及び肥満の発症リスクの分析方法を提供する。 【解決手段】　肥満である者とそうでない者の遺伝情報を分析し，肥満である者には，シノビオリン遺伝子が多く発現していることを利用した，肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む肥満リスクの診断キット。対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む肥満の発症リスクの分析方法。

Description

肥満リスクの診断キット，及び肥満の発症リスクの分析方法
　本発明は肥満リスクの診断キット，及び肥満の発症リスクの分析方法に関する。
　特許第５２７９４９２号公報には，肥満遺伝子の多型解析に使用するためのプローブが開示されている。このように肥満遺伝子を分析することで，対象が肥満を発症する遺伝的なリスクを解析する技術が開発されている。
　一方，国際公開２０１４－１０３８６３号パンフレットには，シノビオリンの発現を抑制することで肥満を防止できることが記載されている。
特許第５２７９４９２号公報 国際公開２０１４－１０３８６３号パンフレット
　本発明は，肥満リスクの診断キット及び肥満の発症リスクの分析方法を提供する。
　本発明は，基本的には，肥満である者とそうでない者の遺伝情報を分析し，肥満である者には，シノビオリン遺伝子が多く発現しているという実施例による知見に基づくものである。すなわち，肥満である者のシノビオリン遺伝子の発現量は，統計上有意差をもって，そうでない者のシノビオリン遺伝子の発現量よりも多い。このため，シノビオリン遺伝子は，遺伝的に肥満となる傾向が高いか否かのリスク（罹患可能性）を判断するための肥満マーカーとなりうると考えられる。また，対象のこのシノビオリン遺伝子の発現量を求めて所定の値（あらかじめ測定し，求めておいたシノビオリン遺伝子の発現量に関する閾値）と比較することで，対象が遺伝的に肥満を発症するリスクがあるか否か分析することができる。
　本発明の第１の側面は，肥満リスクの診断キットに関する。この肥満リスクの診断キットは，肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む。
　本発明の第２の側面は，肥満の発症リスクの分析方法に関する。この方法は，対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む。
　本発明は，肥満リスクの診断キット及び肥満の発症リスクの分析方法を提供できる。
図１は，シノビオリン遺伝子及びＡＴＦ６遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。 図２は，ＸＢＰ１遺伝子及びえｌＦ２遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。 図３は，ＧＲＰ７８遺伝子及びＩＲＥＩ１遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。
　以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
　本発明の第１の側面は，肥満リスクの診断キットに関する。この診断キットは，対象となる生物（たとえばヒト）から試料（たとえば，血液，唾液，爪，毛髪）を採取し，採取した試料に含まれるシノビオリン遺伝子の発現量を測定することで，対象が遺伝的に肥満となる可能性があるか（肥満リスク）を分析し，評価するものに関する。そのため，この肥満リスクの診断キットは，肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む。このプローブを用いることで，シノビオリン遺伝子の発現量を求めることができる。この診断キットは，たとえば，肥満になりやすい遺伝子を有しているか否かを判別するといった遺伝子診断に用いることができる。この診断キットは，プローブのほか，対象のシノビオリン遺伝子の発現量を測定するための公知の要素を含んでいてもよい。そのような要素の例は，ＰＣＲに用いられるプライマーであり，ＰＣＲ測定装置を含んでもよい。
　シノビオリン遺伝子の発現量を求める方法は，公知の方法を適宜採用すればよい。シノビオリン遺伝子の発現量を求める方法の例は，ＰＣＲである。シノビオリン遺伝子の発現量は，例えば，ｍＲＮＡレベルの発現量を測定してもよいし，タンパク質レベルの発現量を測定してもよい。シノビオリン遺伝子の発現量を求める方法の例は，ノーザンブロット法，定量的ＲＴ－ＰＣＲ法，ウエスタンブロット法，ＥＬＩＳＡ法及び免疫染色法である。これらの方法は，公知であり，これらの方法を実現するためのキットが販売されているので，そのキットの取扱説明書を参酌し，シノビオリン遺伝子の発現量を求めることができる。
　シノビオリン遺伝子を同定するためのプローブは，公知である。シノビオリン遺伝子を同定するためのプローブの例は，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの１６番である。このプローブで増幅される領域は，配列番号１のものである。
　配列番号１：
ccagtacctcaccgtgctggcctccttggggcccccccggcctgccacttcagtcaactccactgaggagactgccactacagttgttgctgctgcctcctccaccagcatccctagctcaga
　本発明の肥満リスクの診断キットは，上記のプローブ以外に遺伝子診断を行うための公知の要素を適宜含んでもよい。
　本発明の第２の側面は，肥満の発症リスクの分析方法に関する。この方法は，対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む。シノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程は，先に説明したとおりである。シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求めるためには，対象となる健常人から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量と比較してもよい。また，あらかじめ複数の肥満者又は非肥満者の試料を用いて，シノビオリン遺伝子の発現量に関する閾値を求めておき，その閾値と比較するようにしてもよい。
　この肥満の発症リスクの分析方法は，コンピュータを用いて自動的に求められるようにされていてもよい。コンピュータは，入出力部，演算部，制御部及び記憶部を有しており，これらはバスなどを用いて，情報の授受を行うことができるようにされている。そして記憶部は，試料（たとえば，血液，唾液，爪，毛髪）に応じた，シノビオリンの遺伝子の発現量に関する閾値を記憶している。入出力部から，対象に関する情報（ＩＤなど）と，試料に関する情報と，シノビオリン遺伝子の発現量に関する情報がコンピュータ内に入力される。すると，制御部は，記憶部に記憶される演算プログラムを読み出し，記憶部から試料に応じた閾値を読み出し，演算部にシノビオリン遺伝子の発現量と閾値とを比較させる。そして，演算部は，比較した結果に基づいて，肥満の発症リスクに関する分析結果を求める。求めた分析結果は，制御部により適宜記憶部へ送られて記憶されるとともに，入出力部から出力される。このようにして，対象の肥満の発症リスクが求められる。
　以下，実施例を用いて本発明を具体的に説明する。本発明は，以下の実施例に限定されるものではない。
　ＲＮＡの回収とリアルタイム（ＲＴ）－ＰＣＲ
　３３人の健常人から採血し，フィコール分離法を用いて，リンパ球を回収した。回収したリンパ球を用い，ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン製）を用いて，トータルＲＮＡを生成した。表１に実施例における健常人（ヘルシードナー）の年齢や性別，身長，ＢＭＩ値に関する情報を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１μｇのトータルＲＮＡを，ランダムプライマーを用いたＲｅｖｅｒＴｒａ（東洋紡製）を用いて逆転写した後，ライトサイクラー４８０プローブズマスター（ロッシュ社製）を用いたリアルタイムＰＣＲを用いて，シノビオリン遺伝子や，商標体ストレス関連遺伝子の発現量を検証した。内在のコントロールとして，リボソーマルプロテイン，ラージ，ＰＯ（ＲＰＬＰＯ）を用いた。
　実施例において用いたプライマーとプローブは以下の通りであった。
　ＳＹＶＮ１:（ シノビオリン遺伝子）
　フォワードプライマー：５′－ ccagtacctcaccgtgctg －３（配列番号２）　
　リバースプライマー：５′－ tctgagctagggatgctggt －３′（配列番号３）　
　プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの１６番を用いた。
　ＡＴＦ６: 
　フォワードプライマー：５′－ gcagaaggggagacacattt －３′（配列番号４）　
　リバースプライマー：５′－ tgtggtcttgttatgggtggt －３′, （配列番号５）　
　プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの６２番を用いた。
　ＸＢＰ１: 
　フォワードプライマー：５′－ ggagttaagacagcgcttgg －３′（配列番号６）　
　リバースプライマー：５′－ cactggcctcacttcattcc －３′, （配列番号７）　
　プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの３７番を用いた。
　ＩＲＥ１: 
　フォワードプライマー：５′－ gaagcatgtgctcaaacacc －３′（配列番号８）　
　リバースプライマー：５′－ tctgtcgctcacgtcctg －３′, （配列番号９）　
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの５０２番を用いた。
　ｅＩＦ２ａ:
　フォワードプライマー：５′－ gaagctaagaaagctgcaaagc －３′（配列番号１０）　
　リバースプライマー：５′－ cagtgtttcgtggtgtgctc －３′, （配列番号１１）　
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの４３番を用いた。
　ＧＲＰ７８: 
　フォワードプライマー：５′－ catcaagttcttgccgttca －３′（配列番号１２）　
　リバースプライマー：５′－ ttcaggagcaaatgtctttgttt －３′, （配列番号１３）　
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの１０番を用いた。
　ＲＰＬＰＯ:
　フォワードプライマー：５′－ gcagaaggggagacacattt －３′（配列番号１４）　
　リバースプライマー：５′－ tgtggtcttgttatgggtggt －３′, （配列番号１５）　
プローブとして，ロッシュ社のユニバーサルブローブライブラリーの６２番を用いた。
　ＲＴ－ＰＣＲには，東洋紡社製の高効率逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）を使用した。
　　ＲＴ－ＰＣＲの条件は以下の通りであった。ＲＴ－ＰＣＲは，用いたキットの使用説明書に基づいて温度設定等の条件を定めた。
　全ＲＮＡ　１μｇと，ＲＮａｓｅフリー水を合わせて１０μＬとし，６５℃で５分インキュベートした後，氷上で５分冷却した。
　その後以下の原料を添加した。
　５×バッファ　　　　　　　　　　　　　　　　４μＬ
　１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　ミクスチャ　　　　　　２μＬ
　ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（Ｒ）　　　　　　　１μＬ
　ＲＮａｓｅ　阻害剤　　　　　　　　　　　　　０．５μＬ
　ランダムプライマー　（２５ピコモル／μＬ）　１μＬ
　ＲＮａｓｅフリー水　　　　　　　　　　　　　１．５μＬ
　ＲＮＡ溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μＬ
　合計　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０μＬ
　３０℃で１０分間インキュベートした後，４２℃で３０分インキュベートし，その後，９９℃で５分間インキュベートした。
　得られた発現量を，ＳＳＲＩジャパン社製エクセル統計ソフト２０１２（ｔｈｅ Ｅｘｃｅｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１２）を用いて，統計解析を行った。各遺伝子のＲＮＡ発現量を，対象者のＢＭＩ（ボディマス指数）が２５ｋｇ／ｍ２以上と以下とで分けて，対応のない（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ステューデントのｔ検定により，統計学的な有意差を検証した。その際に，ｐ値が０．０５以下であれば，統計学上有意差があると判断した。
　図１～図３は，各ＲＮＡ発現量を示す箱ひげ図である。図１は，シノビオリン遺伝子及びＡＴＦ６遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。図２は，ＸＢＰ１遺伝子及びえｌＦ２遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。図３は，ＧＲＰ７８遺伝子及びＩＲＥＩ１遺伝子の発現量を示す箱ひげ図である。
　図１に示される通り，ＢＭＩ（ボディマス指数）が２５ｋｇ／ｍ２以上と以下において，シノビオリン遺伝子及びＡＴＦ６遺伝子の発現量に統計学上の有意差がみられた。すなわち，ＢＭＩが２５ｋｇ／ｍ２以上の者は，統計学的な有意差をもって，シノビオリン遺伝子の発現量が２５ｋｇ／ｍ２以下の者に比べて多いことがわかる。すなわち，このため，シノビオリン遺伝子の発現量を求めることで，遺伝的に肥満となるリスクを評価できることが示された。
　本発明は，遺伝子診断機器の分野や診断業において利用されうる。
　配列番号２：プライマー
　配列番号３：プライマー
　配列番号４：プライマー
　配列番号５：プライマー
　配列番号６：プライマー
　配列番号７：プライマー
　配列番号８：プライマー
　配列番号９：プライマー
　配列番号１０：プライマー
　配列番号１１：プライマー
　配列番号１２：プライマー
　配列番号１３：プライマー
　配列番号１４：プライマー
　配列番号１５：プライマー

Claims (2)

  1. 肥満マーカーであるシノビオリン遺伝子を同定するためのプローブを含む，肥満リスクの診断キット。
  2. 対象となる生物から採取された試料におけるシノビオリン遺伝子の発現量を測定する工程と，
    　前記シノビオリン遺伝子の発現量を用いて，肥満の発症リスクを求める工程を含む，
    　肥満の発症リスクの分析方法。
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