KR20180007291A

KR20180007291A - 암 리스크를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20180007291A
Application number: KR1020160182708A
Authority: KR
Inventors: 융-시앙 린; 치-잉 리; 핑-후이 바이
Original assignee: 티씨아이 코 엘티디
Priority date: 2016-07-12
Filing date: 2016-12-29
Publication date: 2018-01-22
Also published as: TWI600767B; CN107619863A; TW201802247A; KR101914348B1

Abstract

본 발명은 암 리스크를 검측하는 방법으로서, 상기 방법은 개체 및 암이 아닌 제어군의 혈액 샘플을 제공하고, 또한 그 암 유전 마커의 발현량을 측정하며, 또한 계산한 암이 아닌 제어군의 개별 유전자 기초 발현량을 이용하고, 나아가서 상기 개체 및 암이 아닌 제어군의 개별 유전자 발현량을 각각 상기 개별 유전자 기초 발현량으로 나누어 각 유전자의 발현 배율을 계산하고, 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배수 또는 하강 배수가 동일한 가중을 갖도록 하며, 마지막으로 자연 로그의 배율을 합하여 암 리스크 지수로 하는 것을 포함한다. 상기 암 리스크 지수는 개체의 암 리스크 및 환자의 암 치료를 받은 후의 반응 및 예후 상황의 평가에 이용된다.

Description

암 리스크를 검출하는 방법{METHOD OF DETECTING A RISK OF CANCER}

본 발명은 암 리스크를 검출하는 방법에 관한 것으로, 특히 18개의 암 유전 마커를 이용하여 암 리스크를 검출하는 방법이다.

최근에는, 분자 의학 기술에 있어서 혈액 샘플의 암 리스크 진단 및 예측을 위한 암 유전 마커가 점차 발전하고 있고, 이들의 마커는 조기 검출에 이용할 수 있어 증상이 임상에서 검출되기 전, 치료 시기 및 회복 시기를 포함하여 환자의 생존율을 개선할 수 있다. 이들의 기술은 대부분 암과 관련있는 게놈을 선택하고, 암 환자와 일반인의 해당 게놈에 있어서의 차이를 관찰하며, 일반적으로 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient)를 이용하여 확률 변환 메커니즘 또는 판단 메커니즘을 세우고, 피험자의 유전자 발현을 상기 확률 변환 메커니즘 또는 판단 메커니즘에 도입하여 검증한다.

그러나, 상술한 방법은 피어슨 상관 계수에 의한 것이고, 선형 상관 계수로서, 2개 변수의 선형 상관 정도를 반영하기 위한 통계량이다. 상기 방법은 이하의 몇 가지 결점을 갖는다. (1) 상기 방법은, 이들의 유전자 발현 패턴(pattern)이 유사한지 여부를 고려해야 하며, 유전자 발현에 있어서 모두 정상 파동 범위에 있지만 유전자 발현 패턴이 서로 유사하다는 오판이 나타나기 쉽고, 나아가서 유전자 발현량의 정도가 합리적인지 여부를 고려하지 않았으며, (2) 상기 방법은 단일 유전자가 군체 중에서의 표선 분포 상황을 고려한 것이지만 개체 간 차이를 고려하지 않았고, 또한 (3) 단일 유전자의 효력이 부족하다.

따라서, 현재 혈액 샘플의 암 리스크 진단 및 예측을 위한 암 유전 마커에 있어서, 군체의 유전자 발현량을 기초값으로 하여 개체의 영향을 감소시키고, 또한 유전자에 대하여 가중시키는 방법이 부족하다.

이와 같은 사정을 감안하여, 본 발명은 암 리스크를 검출하는 방법을 제공하며, 그 방법은, (a) 피험자로부터 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플을 취득하는 단계, (b) β-글로불린(hemoglobin beta gene, HBB), 당화 헤모글로빈(hemoglobin A1, HBA1), 사이토카인 신호 전달 억제제-3(suppressor of cytokine signalling 3, SOCS3), 부신수질(adrenomedullin, ADM), 분비성 백혈구 프로테아제 억제제(secretory leukocyte protease inhibitor -1, SLP1), 세포 표면 항원 무리 68(cluster of differentiation 68, CD68), S100 칼슘 결합 단백질 P(S100 calcium binding protein P, S100P), DNA 손상 유도 전사물 3(DNA damage inducible transcript 3, DDIT3), 카텝신 Z(cathepsin Z, CTSZ), Bcl-2 관련 X 단백질(Bcl-2-associated protein x, Bax), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), 트랜스케톨라아제(transketolase, TKT), G 단백질 결합 에스트로겐 수용체(G protein-coupled estrogen receptor, GPER), 함토글로빈 및 함토글로빈 관련 단백질(haptoglobin and haptoglobin-related, HPR|HP), FK506 결합 단백질 3(FK506 Binding Protein 3, FKBP3), 산성 포스파타아제 5(acid phosphatase 5, ACP5), 리소좀 관련 단백질 4 트랜스막 알파(lysosomal protein transmembrane 4 alpha, LAPTM4A) 및 케모카인 수용체 4(chemokine receptor, CXCR4)로 이루어지는 암 유전 마커군의 mRNA 발현량을 계측하는 단계, (c) 상기 피험자의 암 리스크 지수를 계산하며, 그 공식은 sum[LN(개별 유전자 발현량/개별 유전자 기초 발현량)]으로, (ⅰ) 개별 유전자 발현량을 개별 유전자 기초 발현량으로 나누어 각 유전자의 발현 배율을 계산하고, (ⅱ) 나아가서 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배수 또는 하강 배수가 동일한 가중을 갖도록 하며, (ⅲ) 유전자 발현량이 상승하면 암 리스크가 확인되고, 유전자 발현량이 하강하면 고려하지 않고, 또한 (ⅳ) 개체 유전자 발현이 상승하는 것이 속하는 가중을 합하여 피험자의 암 리스크 지수로 하는 것을 포함하는 단계, (d) 상기 개별 유전자 기초 발현량은 암이 아닌 제어군으로부터 취한 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플의 암 유전자의 발현량에 대응하는 기하 평균수인 단계, 및 (e) 단계 (c)로 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수를 계산하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 피험자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 중위수보다 낮으면, 상기 피험자는 암 저리스크를 갖는 것을 대표하고, 상기 피험자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 99% 신뢰 구간(C.I)보다 높으면, 상기 피험자는 암 형성의 고리스크를 갖는 것을 대표한다.

본 발명은 또한 환자의 암 치료에 대한 예후 재발 리스크를 평가하는 방법을 제공하며, 그 방법은, (a) 피험자로부터 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플을 취득하는 단계, (b) HBB, HBA1, SOCS3, ADM, SLP1, CD68, S100P, DDIT4, CTSZ, BAX, APP, TKT, GPER, HPR|HP, FKBP3, ACP5, LAPTM4A 및 CXCR4로 이루어지는 암 유전 마커군의 mRNA 발현량을 검출하는 단계, (c) 상기 피험자의 암 리스크 지수를 계산하며, 그 공식은 sum[LN(개별 유전자 발현량/개별 유전자 기초 발현량)]으로, (ⅰ) 개별 유전자 발현량을 개별 유전자 기초 발현량으로 나누어 각 유전자의 발현 배율을 계산하고, (ⅱ) 나아가서 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배수 또는 하강 배수가 동일한 가중을 갖도록 하며, (ⅲ) 유전자 발현량이 상승하면 암 리스크가 확인되고, 유전자 발현량이 하강하면 고려하지 않고, 또한 (ⅳ) 개체 유전자 발현이 상승하는 것이 속하는 가중을 합하여 피험자의 암 리스크 지수로 하는 것을 포함하는 단계, (d) 상기 개별 유전자 기초 발현량은 암이 아닌 제어군으로부터 취한 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플의 암 유전자의 발현량에 대응하는 기하 평균수인 단계, 및 (e) 단계 (c)로 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수를 계산하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 환자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 중위수보다 낮으면, 상기 환자는 암 재발의 저리스크를 갖는 것을 대표하고, 상기 환자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 99% 신뢰 구간(C.I)보다 높으면, 상기 환자는 암 재발의 고리스크를 갖는 것을 대표하며, 또한 상기 암이 아닌 제어군의 인원수는 20명 이상을 필요로 한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 단계 (b)는 마이크로어레이 칩, 실시간 중합 효소 연쇄 반응(real-time PCR), 노던 블롯 또는 가시적 분자 결합화를 통하여 측정한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 위암, 방광암 또는 간암이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검체 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 샘플이다.

따라서, 본 발명은 암 리스크를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체 및 암이 아닌 제어군의 혈액 샘플을 제공하고, HBB, HBA1, SOCS3, ADM, SLP1, CD68, S100P, DDIT4, CTSZ, BAX, APP, TKT, GPER, HPR|HP, FKBP3, ACP5, LAPTM4A 및 CXCR4로 이루어지는 군을 포함하는 18개의 암 유전 마커의 발현량을 측정하며, 먼저 계산한 암이 아닌 제어군의 개별 유전자 기초 발현량을 이용하고, 그 후에 상기 개체 및 암이 아닌 제어군의 개별 유전자 발현량을 각각 상기 개별 유전자 기초 발현량으로 나누어 각 유전자의 발현 배율을 계산하고, 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배수 또는 하강 배수가 동일한 가중을 갖도록 하며, 마지막으로 자연 로그의 배율을 합하여 암 리스크 지수로 하는 것을 포함하고, 상기 암 리스크 지수는 개체의 암 리스크 및 환자의 암 치료를 받은 후의 반응 및 예후 상황을 평가하기 위한 것이다.

이하에 본 발명의 실시 방식을 추가로 설명하며, 이하에 열거한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다. 당업자라면 누구나, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 한, 약간의 변경과 보정을 할 수 있기 때문에, 본 발명이 보호하는 범위는 청구범위에서 한정한 것에 준한다.

도 1은 본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법에 있어서의 단일 개체가 1회 검출한 암 리스크 지수를 나타내는 데이터도이다.
도 2는 본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법에 있어서의 위암 환자의 연속으로 검출한 암 리스크 지수를 나타내는 그래프이다.
도 3은 기타 칩을 이용한 본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법에 있어서의 간암의 암 리스크 지수를 검증하는 데이터도이다.

본 발명은 암 리스크를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체 및 암이 아닌 제어군의 혈액 샘플을 제공하고, 18개의 암 유전 마커의 발현을 측정하며, 군체의 유전자 발현량을 기초값으로 하여 개체의 영향이 감소되도록 하고 또한 유전자에 대하여 가중하는 방법으로 암 리스크 지수를 계산하는 것을 포함하며, 상기 암 리스크 지수는 개체의 암 리스크 및 환자의 암 치료를 받은 후의 반응 및 예후 상황을 평가하기 위한 것이다.

정의

본문에서 사용하는 용어 "유전 마커"는, mRNA 발현량이 변화하여, 특정 질병 또는 이상 리스크의 증가를 지침할 수 있다는 것을 의미한다.

본문에서 사용하는 용어 "유전자 발현량"은, 유전자로부터 산생된 단백질 또는 기능성 RNA 산물을 의미한다.

본문에서 사용하는 용어 "암이 아닌 제어군"은, 상기 개체가 암에 걸리지 않았음을 이미 확인한 것을 의미한다.

본문에서 사용하는 용어 "마이크로어레이 칩"은, 유전자 발현량을 검사할 수 있는 마이크로어레이 칩을 의미하고, 이는 AFFYMETRIX, ILLUMINA, AGILENT 및 PhalanxBio, Inc.의 마이크로어레이 칩이어도 되지만, 이에 한정되지 않는다.

실시예 1 본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법

본 발명은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서의 상이한 유전자의 발현량에 대해 상이하게 가중함으로써, 암이 아닌 제어군 및 암인 군으로 분리하는 목적을 달성한다.

1.1 유전자 군의 수집

먼저, 본 발명에서는 암이 발생할 때 말초 혈액 단핵 세포에 있는 특수 발현(과도 발현 또는 과저 발현) 유전자를 연구하고, 또한 이들의 유전자의 검출 공구(mRNA 마이크로어레이 칩 또는 실시간 중합 효소 연쇄 반응(real-time PCR) 시스템 또는 기타 mRNA 분석 방법)에 의한 발현 구간을 관찰한다. 유전자 발현량이 비선성 검사 범위에 있으면 가중을 낮추고(30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 기타 바람직한 분석 결과를 얻을 수 있는 비례), 50%로 가중을 낮추는 것이 바람직하다.

본 발명의 암과 가장 상관성이 있는 18개의 유전 마커로서, β-글로불린(hemoglobin beta gene, HBB), 당화 헤모글로빈(hemoglobin A1, HBA1), 사이토카인 신호 전달 억제제-3(suppressor of cytokine signalling 3, SOCS3), 부신수질(adrenomedullin, ADM), 분비성 백혈구 프로테아제 억제제(secretory leukocyte protease inhibitor -1, SLP1), 세포 표면 항원 무리 68(cluster of differentiation 68, CD68), S100 칼슘 결합 단백질 P(S100 calcium binding protein P, S100P), DNA 손상 유도 전사물 3(DNA damage inducible transcript 3, DDIT3), 카텝신 Z(cathepsin Z, CTSZ), Bcl-2 관련 X 단백질(Bcl-2-associated protein x, Bax), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), 트랜스케톨라아제(transketolase, TKT), G 단백질 결합 에스트로겐 수용체(G protein-coupled estrogen receptor, GPER), 함토글로빈 및 함토글로빈 관련 단백질(haptoglobin and haptoglobin-related, HPR|HP), FK506 결합 단백질 3(FK506 Binding Protein 3, FKBP3), 산성 포스파타아제 5(acid phosphatase 5, ACP5), 리소좀 관련 단백질 트랜스막 4 알파(lysosomal protein transmembrane 4 alpha, LAPTM4A) 및 케모카인 수용체 4(chemokine receptor, CXCR4)로 조성되는 군을 포함한다.

1.2 개별 유전자 기초 발현량의 계산

본 발명에서는 암이 아닌 제어군 중에서 상이한 개체에 있어서의 단일 유전자의 발현량을 기하 평균수(또는 발현량 분포에 대해 가중 평균함)로 하며, 이를 유전자 기초 발현량으로 한다.

1.3 개체의 암 리스크 지수의 계산

본 발명에서는 모든 샘플 중의 단일 개체의 모든 유전자를 각각 유전자 기초 발현량으로 나누어, 유전자 발현의 배율을 얻을 수 있고, 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배율 또는 하강 배율이 동일한 가중을 갖도록 하며, 상승 배율의 유전자를 검시하고, 마지막으로 개체가 속하는 유전자 발현이 상승한 유전자 가중을 합하여 상기 개체의 암 리스크 지수로 한다.

1.4 군의 분리

본 발명에서는 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수 분포와 암인 군의 암 리스크 지수 분포를 각각 계산한다.

단일 개체의 1회 검출: 상기 개체의 암 리스크 지수가 암이 아닌 제어군의 정규 분포 구역에서 중위수(또는 평균수) 이하이면 암 저리스크에 해당하고, 암이 아닌 제어군의 정규 분포 구역에서 99% 신뢰 구간(C.I.) 이상이면 암 고리스크에 해당하며, 양자 사이는 암 중리크스에 해당한다.

단일 개체의 연속 검출: 상기 개체의 암 리스크 지수가 연속으로(2, 3, 4 또는 그 이상) 암이 아닌 제어군의 정규 분포 구역 또는 암 환자 분포 구역에서 나타난다면, 이는 상응 발현(corresponding performance)이다.

실시예 2 본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법의 검증

본 발명으로부터 알 수 있는 바와 같이 18개의 유전 마커는 암의 검측 진단, 및 암의 치료 효과의 평가 및 예후의 예측에 정확하게 응용할 수 있고, 암 환자 및 암 환자가 아닌 제어군의 혈액 샘플을 이용하여 18개의 유전 마커의 발현량을 측정한 후 개별 샘플의 암 리스크 지수를 계산한다.

2.1 샘플의 연구

제어군 샘플: 본 발명에서 암에 걸리지 않았음을 이미 진단한 26명의 정상 개체의 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 샘플을 수집하였고, 이는 모두 기증자 본인의 동의 하에 진행한 것이다. 각 샘플은 적어도 두 번 검측하였으며, 본 발명에서는 총 55번의 검출 결과를 내었다.

암 샘플: 본 발명에서 1명의 위암 환자, 2명의 방광암 환자, 1명의 유방암 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플을 수집하였고, 상기 환자들은 각각 암 재발 확진 전, 암 재발 확진 시, 치료 기간 또는 치료 후에 검출하였으며, 이는 모두 기증자 본인의 동의하에 진행한 것이다.

2.2 RNA 추출

본 발명에서는 상품 사용 설명서에 따라 TRIzol® 시약(INVITROGEN사, 미국)을 이용하여 RNA를 추출하고, 추출 후에는 초미량 분광 광도계((Nano Drop spectrophotometer)(THERMO FISHER SCIENTIFIC사, 미국)로 RNA의 농도 및 순도를 측정하며, OD206/OD280의 비율 및 OD260/OD230의 비율에 의하여 RNA의 순도를 추산한다. 여기에서 OD260/OD280의 비율은 1.8 내지 2.0의 사이에 있고, OD260/OD230의 비율이 2.0 이상으로 RNA의 순도가 바람직하다는 것을 말하고, 또한 미세유체 전기영동 분석기(상품 번호 2100, AGILENT사, 미국)로 RNA의 단편의 크기, 정성(定性) 및 정량(定量) 분석을 평가한다.

2.3 휴먼 발현 프로필 칩(Human Oligonucleotide DNA microarray, HOA) 분석

본 발명에서 사용하는 휴먼 발현 프로필 칩 v6(PhalanxBio, Inc., 타이완)는 33,679개의 탐침을 포함하고, 각 탐침은 60염기 올리고뉴클레오타이드(sense-strand) 장쇄의 휴먼 발현 프로필 유전자 탐침으로 설계되며, 그 중에서 32,741개의 탐침은 국제 공인의 RefSeq 및 Ensembl의 시퀀스 데이터 베이스의 주석 유전자를 참고하였고, 그 외에 추가로 938개의 제어군 탐침을 포함한다.

2.4 칩 분석

본 발명에서 1μg RNA에 의하여 OneArray® 아미노화 마커 aRNA 증폭 시약(PhalanxBio, Inc., 타이완) 및 Cy5 염색약(GE Healthcare사, 미국)을 사용하여 형광 마커의 안티센스 RNA(aRNA) 표적물을 제조하여 사용한다. 혼성 시스템(PhalanxBio, Inc., 타이완)을 이용하여 혼성 완충액(PhalanxBio, Inc., 타이완)으로 상기 형광 마커의 안티센스 RNA(aRNA) 표적물을 상기 휴먼 발현 프로필 칩에 혼성한다. 16시간 혼성 후, 비특이적으로 결합된 표적물을 씻어내어, DNA 칩 스캐너(상품 번호 G2565CA, AGILENT사, 미국)를 이용하여 칩 스캔하고, 또한 GenePix 4.1 연체 분석(Molecular Device사)을 이용하여 Cy5 형광 신호 강도를 분석한다.

각 단일 샘플은, 중복성(reproducibility)이 0.975를 초과하도록 적어도 2회 검출하고, 중위수의 75백분위에 적용되도록 얻어진 신호 강도를 Rosetta 분석기 시스템(Rosetta Pharmamate사, 미국)에 입력하여 데이터 처리하고 또한 데이터를 표준화시킨다. 동일한 시간에 오차 가중 방법(error-weighted approach)을 이용하여 샘플의 오차를 평가한다. 매칭 샘플의 발현량의 변화와 p값의 양자 간의 비교는 유전자 차이 발현(differentially expressed gene)을 평가함으로써 분석 계산하고, 유전자 차이 발현의 표준이 발현량의 변화가 2 이상 또는 -2 이하 및 p값이 0.05 미만임을 확정하고 그 후의 추가적인 분석을 한다.

2.5 암 리스크 지수 분석

본 발명에서는 암이 아닌 제어군 중 18개의 유전자 발현값을 선택하고, 개별 유전자의 실험족군에 있어서의 기하 평균수를 기초 발현량으로 하고, 표 1 및 표 2에서 나타내는 바와 같이, 모든 샘플 중의(암이 아닌 제어군 및 암인 군을 포함함) 단일 개체의 모든 유전자를 각각 개별 유전자 기초 발현량으로 나누어, 유전자 발현의 배율을 얻을 수 있고, 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배율 또는 하강 배율이 동일한 가중을 갖도록 하며, 마지막에 유전자 개체가 속하는 가중을 합하면 상기 개체의 암 리스크 지수이다.

암이 아닌 제어군의 정규 분포 구역에서 신뢰 구간의 99%(즉 암 리스크 지수 6.25) 이상이면 암 고리스크이거나 암 환자이고, 암 리스크 지수가 3(중위수) 이하이면 암 저리스크이며, 양자(3 및 6.25) 사이에 위치하면 중리스크이다. 암 조직의 암 리스크 지수: a. 1명의 암 환자의 재발 확진 전의 암 리스크 지수는 8.52, 6.08, 8.75, 18.09 및 10.58이고, 약물 치료 전의 암 리스크 지수는 12.77이며, 약물 치료 기간의 암 리스크 지수는 7.90, 6.48, 6.31, 5.27 및 8.45이고, b. 2명의 방광암 환자가 연속으로 검출되는 암 리스크 지수는 각각 11.63 및 13.31, 10.24 및 12.30이고, c. 1명의 유방암 환자의 치료 기간의 암 리스크 지수는 11.88이고, 치료 완료 1개월 후의 암 리스크 지수는 2.40이다. 이상의 샘플의 검증 시간 간격은 2주 내지 8주이다.

본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법에 있어서 단일 개체가 1회 검출하는 결과는, 도 1에서 나타내는 바와 같이, 유방암, 위암, 방광암 환자가 본 발명의 18개의 유전 마커를 이용하여 얻어진 가장 바람직한 검출 발현이고, 유효 지표는, 88.2%의 민감성(sensitivity), 91%의 특이성(specificity), 90.4%의 정확성(accuracy)이다.

본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법에 있어서 위암 환자가 연속으로 검출되는 암 리스크 지수 결과는, 도 2에 나타내는 바와 같이, 위암 환자가 재발 확진 전부터 약물 치료 전까지의 암 리스크 지수는 시간의 경과에 따라 서서히 증가하지만, 약물 치료 기간부터 CT 스캔으로 암 증상이 안정적임을 나타낼 때까지의 암 리스크 지수는 시간의 경과에 따라 서서히 감소되며, 암 환자가 이용한 본 발명의 18개의 유전 마커가 암 존재의 검출 및 암 환자의 암 치료의 예후 반응에 대한 평가에 이용할 수 있음을 실증했다.

실시예 3 기타 칩을 사용한 본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법의 검증

본 발명은 상이한 실험 방식으로 상기 18개의 암 유전 마커군의 mRNA 발현량을 측정함에 있어서 모두 본 발명의 방법을 적용할 수 있음이 검증되었다.

먼저, 본 발명은 Shi M, Chen MS, Sekar K, Tan CK et al. A blood-based three-gene signature for the non-invasive detection of early human hepatocellular carcinoma. Eur J Cancer 2014 Mar;50(5):928-36의 논문 중에 공개된 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 유전자 칩의 모든 유전자 발현량으로부터, 본 발명에 기재된 18개의 암 유전자의 mRNA 발현량을 얻어, 실시예 2에 기재된 방법을 이용하여 본 발명의 암 리스크 지수를 분석한다.

암 리스크 지수 분포는 도 3에서 나타내는 바와 같으며, 10개의 제어군 샘플(표 3에서 나타내는 바와 같음)과, 10개의 간암 샘플(표 4에서 나타내는 바와 같음)을 포함하고, 암이 아닌 군의 정규 분포 구역에서 99% 신뢰 구간(즉 암 리스크 지수 2.9) 이상이면 암 고리스크에 해당하거나 또는 암 환자이고, 암 리스크 지수가 1.0(중위수) 이하이면 암 저리스크에 해당하며, 양자 사이(1 및 2.9)는 중리스크에 해당한다. 유효 지표는 100%의 민감성(sensitivity), 60%의 특이성(specificity), 80%의 정확성(accuracy)이다. 본 발명의 방법은 상이한 실험 방식을 이용하여 얻어진 mRNA 발현량에 따라 각종 암 리스크를 검출할 수 있음을 실증했다.

상술한 내용과 같이, 본 발명의 암 리스크를 검출하는 방법은, 측정된 개체 및 암이 아닌 군의 혈액 샘플 중 18개의 암 유전 마커의 발현량을 이용하고, 또한 군체의 유전자 발현량을 이용하여 기초값으로 하여 개체 영향을 감소시키고 또한 유전자에 대하여 가중함으로써 암 리스크 지수를 계산하는 방법이며, 상기 암 리스크 지수가 개체의 암 리스크 및 환자의 암 치료를 받은 후의 반응 및 예후 상황을 평가한다. 따라서, 본 발명의 방법은 예방 건강 의학에 적용하여 암의 잠재 리스크를 평가할 수 있고, 암 치료 효과의 평가에 적용하여 현재 치료가 유효한지 여부의 평가를 보조할 수 있으며, 암 추적 및 예후에 적용하여 암 재발 리스크를 평가한다.

Claims

암 리스크를 검출하는 방법으로서,
(a) 피험자로부터 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플을 취득하는 단계,
(b) β-글로불린(hemoglobin beta gene, HBB), 당화 헤모글로빈(hemoglobin A1, HBA1), 사이토카인 신호 전달 억제제-3(suppressor of cytokine signalling 3, SOCS3), 부신수질(adrenomedullin, ADM), 분비성 백혈구 프로테아제 억제제(secretory leukocyte protease inhibitor -1, SLP1), 세포 표면 항원 무리 68(cluster of differentiation 68, CD68), S100 칼슘 결합 단백질 P(S100 calcium binding protein P, S100P), DNA 손상 유도 전사물 3(DNA damage inducible transcript 3, DDIT3), 카텝신 Z(cathepsin Z, CTSZ), Bcl-2 관련 X 단백질(Bcl-2-associated protein x, Bax), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), 트랜스케톨라아제(transketolase, TKT), G 단백질 결합 에스트로겐 수용체(G protein-coupled estrogen receptor, GPER), 함토글로빈 및 함토글로빈 관련 단백질(haptoglobin and haptoglobin-related, HPR|HP), FK506 결합 단백질 3(FK506 Binding Protein 3, FKBP3), 산성 포스파타아제 5(acid phosphatase 5, ACP5), 리소좀 관련 단백질 트랜스막 4 알파(lysosomal protein transmembrane 4 alpha, LAPTM4A) 및 케모카인 수용체 4(chemokine receptor, CXCR4)로 이루어지는 암 유전 마커군의 mRNA 발현량을 계측하는 단계,
(c) 상기 피험자의 암 리스크 지수를 계산하며, 그 공식은 sum[LN(개별 유전자 발현량/개별 유전자 기초 발현량)]으로, (ⅰ) 개별 유전자 발현량을 개별 유전자 기초 발현량으로 나누어 각 유전자의 발현 배율을 계산하고, (ⅱ) 나아가서 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배수 또는 하강 배수가 동일한 가중을 갖도록 하며, (ⅲ) 유전자 발현량이 상승하면 암 리스크가 확인되고, 유전자 발현량이 하강하면 고려하지 않고, 또한 (ⅳ) 개체 유전자 발현이 상승하는 것이 속하는 가중을 합하여 피험자의 암 리스크 지수로 하는 것을 포함하는 단계,
(d) 상기 개별 유전자 기초 발현량은 암이 아닌 제어군으로부터 취한 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플의 암 유전자의 발현량에 대응하는 기하 평균수인 단계, 및
(e) 단계 (c)로 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수를 계산하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 피험자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 중위수보다 낮으면, 상기 피험자는 암 형성의 저리스크를 갖는 것을 대표하고, 상기 피험자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 99% 신뢰 구간(C.I)보다 높으면, 상기 피험자가 암 형성의 고리스크를 갖는 것을 대표하는 방법.
청구항 1에 있어서,
단계 (b)는 마이크로어레이 칩, 실시간 중합 효소 연쇄 반응(real-time PCR), 노던 블롯 또는 가시적 분자 결합화를 통하여 측정하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 방광암 또는 간암인 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 검체 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 샘플인 방법.
환자의 암 치료에 대하여 예후 재발 리스크를 평가하는 방법으로서,
(a) 피험자로부터 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플을 취득하는 단계,
(b) HBB, HBA1, SOCS3, ADM, SLP1, CD68, S100P, DDIT4, CTSZ, BAX, APP, TKT, GPER, HPR|HP, FKBP3, ACP5, LAPTM4A 및 CXCR4로 이루어지는 암 유전 마커군의 mRNA 발현량을 검출하는 단계,
(c) 상기 피험자의 암 리스크 지수를 계산하며, 그 공식은 sum[LN(개별 유전자 발현량/개별 유전자 기초 발현량)]으로, (ⅰ) 개별 유전자 발현량을 개별 유전자 기초 발현량으로 나누어 각 유전자의 발현 배율을 계산하고, (ⅱ) 나아가서 배율의 자연 로그를 취하여 상승 배수 또는 하강 배수가 동일한 가중을 갖도록 하며, (ⅲ) 유전자 발현량이 상승하면 암 리스크가 확인되고, 유전자 발현량이 하강하면 고려하지 않고, 또한 (ⅳ) 개체 유전자 발현이 상승하는 것이 속하는 가중을 합하여 피험자의 암 리스크 지수로 하는 것을 포함하는 단계,
(d) 상기 개별 유전자 기초 발현량은 암이 아닌 제어군으로부터 취한 핵산을 포함하는 체액의 검체 샘플의 유전자의 발현량에 대응하는 기하 평균수인 단계, 및 (e) 단계 (c)로 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수를 계산하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 피험자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 중위수보다 낮으면, 상기 피험자는 암 형성의 저리스크를 갖는 것을 대표하고, 상기 피험자에 의한 암 리스크 지수가 상기 암이 아닌 제어군의 암 리스크 지수의 99% 신뢰 구간(C.I)보다 높으면, 상기 피험자가 암 형성의 고리스크를 갖는 것을 대표하는 방법.
청구항 5에 있어서,
단계 (b)는 마이크로어레이 칩, 실시간 중합 효소 연쇄 반응(real-time PCR), 노던 블롯 또는 가시적 분자 결합화를 통하여 측정하는 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 방광암 또는 간암인 방법.
청구항 5에 있어서,
상기 검체 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 샘플인 방법.