JP4088694B2 - 造血器腫瘍の検査方法およびキット - Google Patents
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Description
の感受性の癌細胞の性質、(iii)癌発症前の診断および発症リスク推定などに大別され
る。
瘍の診断のためのデータ、あるいは造血器腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、または発症する可能性を評価するためのデータを提供する、造血器腫瘍の検査方法およびキットに関する本発明を完成した。
、p73遺伝子、hMLH遺伝子、MGMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD(CDH13またはHカドヘリンともいう)遺伝子よりなる遺伝子群から2種以上の遺伝子を選択し、その選択した遺伝子の発現制御レベルを検出することにより、造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは該腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、または発症する可能性、または造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性を高感度・高精度に早期に評価するためのデータを提供する検査方法であってもよい。
前記造血器腫瘍が好ましくは成人T細胞白血病・リンパ腫である。
本発明の検査方法は、成人T細胞白血病・リンパ腫の病型を高感度に早期検出し、診断するためのデータを提供することを特徴としている。
選択した遺伝子の発現制御レベルをmRNAで検出するか、あるいは
選択した遺伝子の発現制御レベルを、その遺伝子がコードするタンパクで検出することを特徴としている。
GMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群から、少なくとも2種以上の遺伝子を選択し、その選択した遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島の
メチル化頻度を測定することにより、造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは造血器腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、または発症する可能性を評価するためのデータを提供することを特徴とする造血器腫瘍の検査方法であってもよい。
前記造血器腫瘍が好ましくは成人T細胞白血病・リンパ腫である。
特に、成人T細胞白血病・リンパ腫の病型を検出し、診断するためのデータを提供することを特徴としている。
前記メチル化頻度の検出にメチル化感受性制限酵素を用いてもよい。
前記メチル化頻度の検出を、検体を溶解して得た細胞溶解液を直接に重亜硫酸塩で処理し、検体から遺伝子を抽出せずに行なうことを特徴としている。
遺伝子、MGMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群から、少なくとも2種以上の遺伝子を選択し、その選択した遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することにより、成人T細胞白血病・リンパ腫の診断のためのデータ、あるいは前臨床期の状態にある可能性、発症する可能性または造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性を評価するためのデータを提供することを特徴とする造血器腫瘍の検査方法である。
前記の診断のためのデータ、あるいは前臨床期の状態にある可能性、発症する可能性、または造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性を評価するためのデータには、成人T細胞白血病・リンパ腫の病型を検出するためのデータが含まれる。
測することができる。あるいは発症を早期に高精度・高感度に特定することができ、さらに次の病型に進展する可能性についても推測することができる。
[発明の具体的な説明]
本明細書において「癌」とは、悪性腫瘍を指し、単に「腫瘍」ということもある。また「遺伝子(gene)」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担うゲノムDNAをいうが、単に化学的実体であるDNAの形でいうこともある。「癌抑制遺伝子」とは、癌の発症を抑制する遺伝子を意味し、「癌関連遺伝子」は、癌の発症に関与する遺伝子を意味する。なお本明細書において「発症」とは、疾患特異的臨床症状、検査データなどをもとに総合的判断により特定疾患と診断された時点をもって発症とよぶ。「前臨床期」とは、疾患特異的な臨床症状がでてくる前の発症前状態であって、既に微量の悪性腫瘍細胞が存在している早期の状態を指す。DNAのメチル化とは、DNA塩基配列におけるCpG島での5−メチルシトシンを指す。
癌抑制遺伝子または癌関連遺伝子の発現変化を調べる検査方法
本発明の方法は、
検体中の2種以上の癌抑制遺伝子または癌関連遺伝子を選択してその発現制御レベルを調べることにより、造血器腫瘍の診断のためのデータ、または該腫瘍に前臨床期の状態にある可能性を発症以前に高感度・高精度に評価するためのデータを提供する、造血器腫瘍の検査方法である。
ていると考えられる。そうした癌抑制遺伝子は、特に限定されないが、例えば、プロテインチロシンホスファターゼSHP1遺伝子・p16Ink4a遺伝子・p15Ink4b遺伝子・CDH1遺伝子・HDAC遺伝子、p14ARF,DAPK、p73,APC,GSTP1、アントロゲン受容体、エストロゲン受容体、TGF−β1、TGF−β2、p130、BRCA、NF1、NF2、TSG101、MDG1、GST−pi、カルト
ニン、HIC−1、エンドセリンB受容体、TIMP−2、TIMP−3、O6−MGMT、hMLH、MSH2およびGFAPなどの遺伝子が挙げられる。
tt細胞白血病)等のB細胞性腫瘍;前駆体T細胞性腫瘍(前駆体T−リンパ芽球性白血病/リンパ腫(前駆体T細胞急性リンパ芽球性白血病)、成熟(末梢)T細胞性腫瘍(T細胞前リンパ球性白血病、T細胞顆粒リンパ球白血病、侵攻型NK細胞白血病、成人T細胞リンパ腫・白血病(HTLV1+)、鼻型節外性NK/T細胞リンパ腫、腸管症型T細胞リンパ腫、肝脾型γ−δT細胞リンパ腫、皮下蜂窩織炎様T細胞リンパ腫、菌状息肉腫/Sezary症候群、退形成性大型細胞リンパ腫(T/ヌル細胞、原発性皮膚未分化型)、他に部門に属さない末梢T細胞リンパ腫、血管免疫芽球T細胞リンパ腫)等のT細胞およびNK細胞性腫瘍;節性リンパ球優勢ホジキンリンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫(結節硬化ホジキンリンパ腫(等級1および2)、リンパ球リッチ古典的ホジキンリンパ腫、混合細胞型ホジキンリンパ腫、リンパ球枯渇ホジキンリンパ腫)等のホジキンリンパ腫(ホジキン病);
などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。
ョンなどが例示される。
・8種の遺伝子
本発明の造血器腫瘍の検査方法として、好ましい検査方法は、
検体中のSHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、M
GMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群から2種以上の遺
伝子を選択し、その選択した遺伝子の発現制御レベルを検出することにより、造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは該腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、または発症する可能性を評価するためのデータを提供する検査方法である。
、造血器腫瘍の前臨床期の状態、発症に対する関与が遺伝子発現の制御を通じて相互に相関しており、しかも造血器腫瘍、とりわけ成人T細胞白血病・リンパ腫の病型の進展に対して特異性が高いことを本発明者は見出した。その関与の程度、様式は様々であるが、造血器腫瘍の診断のためのデータ、該腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、あるいは発症する可能性を評価するための包括的なデータを得るためには、極めて有用な遺伝子群である。すなわち遺伝子スクリーニングにより選び出された、特異的な遺伝子セットともいうべき組み合わせである。これら8種の遺伝子群から2種以上の遺伝子を選択し、その選択した遺伝子の発現制御レベルを検出することが望ましい。すなわち8種の遺伝子すべてについて調べてもよく、あるいは病型などに応じて8種の遺伝子の中から2種以上を任意の組み合せで適宜選択してもよい。上記8種の遺伝子群を「コア標的遺伝子」として、これらから2種以上の遺伝子を選択し、さらにコア遺伝子群以外の別に選択された遺伝子をも含めてそれらの選択した遺伝子の発現制御レベルを検出する態様であってもよい。その場合、コア標的遺伝子群以外の候補遺伝子の選択は、コア標的遺伝子についての測定に、補強的または補充的なデータを与える遺伝子が望ましい。
択された遺伝子の一つに、悪性リンパ腫や白血病の発症に深く関与しているSHP1遺伝子が含まれることが望ましい。
hMLH,MGMTは、DNA修復酵素関連遺伝子である。
HCADは、細胞接着(カドヘリン)関連遺伝子である。カドヘリンは、分子量120kDaの細胞間接着に関連した糖タンパク質であり、胎性期の組織構築、器官形成に重要な役割を演じている。癌細胞においてもEカドヘリン(上皮由来)(CDH1)が癌細胞間の接着を司っていることが知られており、脈管内に浸潤した癌細胞が解離し標的臓器に漂着する癌転移の過程に関与していると考えられている。Eカドヘリンは、急性骨髄性白血病あるいはHodgkinリンパ腫の腫瘍細胞において発現が消失することが知られており、
発症との関連が示唆されている。またHCAD(またはCDH13、あるいはHカドヘリンとも呼ばれる)遺伝子については、細胞内ドメインを欠き、細胞間接着のみならず細胞内シグナリングにも関連していることが知られている。また異常なDNAメチル化あるいは遺伝子欠失により、卵巣癌、乳癌、肺癌、大腸癌など様々な癌においてHカドヘリンの発現が消失していることが報告されている。最近、本発明者らのグループの研究を始めとするいくつかの研究により、早期慢性骨髄性白血病またはインターフェロン治療低応答性慢性骨髄性白血病においてHCAD・プロモーターの強いメチル化が観察されること、並びにびまん性大細胞型B細胞リンパ腫においてHCAD遺伝子DNAの異常メチル化および対立遺伝子欠失により、遺伝子発現の低下・消失が観られることが知られている。
種々の病態に伴う生体内アポトーシスとの関連が想定されている。
・成人T細胞白血病・リンパ腫
本発明の検査方法において、対象となる造血器腫瘍は特に限定されない。しかし上記造血器腫瘍の中でも成人T細胞白血病・リンパ腫は好適であり、その病型を検出し、診断するためのデータを提供することが可能である。
る。
場合がしばしばみられる。またそれらの前に前白血病状態(臨床的に特記すべき所見を示さない、すなわちATLLを発症していない状態)としてHTLV−Iキャリアーがある。
遺伝子メチル化の検出による検査方法
本発明である造血器腫瘍の検査方法のもう一つの局面は、
検体中の2種以上の癌抑制遺伝子または癌関連遺伝子を選択してその選択した遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することにより、造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは造血器腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、発症する可能性、または造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性を評価するためのデータを提供することを特徴としている。
・CpG島のメチル化(methylation)
遺伝子のプロモーター領域にCpG配列に富む領域、すなわちCpG島が存在する場合
、そのCpG島におけるシトシンのメチル化は、その遺伝子の転写制御に関連する。したがって、遺伝子のプロモーター領域におけるシトシンのメチル化を検出することにより、当該遺伝子の発現異常(例えば、転写が活性化されているのか抑制されているのか)を検出することができる。さらに上記遺伝子が癌抑制遺伝子である場合、癌抑制遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のシトシンのメチル化を検出することにより、上記細胞検体に含まれる細胞が癌細胞の可能性があるか否かを検出することができる。
細胞検体を溶解液により溶解させて細胞検体溶解液を調製する工程、
この工程により得られる細胞検体溶解液を、直接、重亜硫酸塩含有試薬で処理し、当該細胞検体溶解液に含まれるCpG含有DNAの塩基配列中の非メチル化シトシンをウラシルへと変換する工程、
得られたCpG含有DNAを、所定のメチル化特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよび非メチル化特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる工程、
次いで上記CpG含有DNAが増幅されたか否かを検出する工程
とを含む方法に基づくならば、簡便かつ迅速にDNAのメチル化を検出することができる。これらの処理では、検体DNA内の非メチル化シトシンがウラシルを経由してチミンに変換され、一方、5−メチル化シトシンは最終的にシトシンであることによりメチル化シトシンと非メチル化シトシンの判別を行なうことができる。
D遺伝子よりなる遺伝子群から、少なくとも2種以上の遺伝子を選択し、その選択した遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することにより、造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは造血器腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、発症する可能性、または造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性などを評価するためのデータを提供することを特徴とする検査方法である。
的遺伝子は、SHP1、p15、p16、p73、DAPK、MGMTであることが判明した。こ
れらの遺伝子は、CIMPの面から着目されるべきであることが結論された。また造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは該腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、または発症する可能性を評価するためのデータなどを提供する本発明検査方法において、選択された遺伝子の一つに少なくともSHP1遺伝子が含まれることが望ましい。
・メチル化頻度の測定
本発明の検査方法は、選択された遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル
化頻度を測定する方法であり、前記メチル化頻度の検出を、検体を溶解して得た細胞溶解液を重亜硫酸塩で処理した後に行なうことを特徴としている。
(1)細胞を含む検体を溶解液により溶解させて細胞検体溶解液を調製する細胞溶解工程と、
(2)上記細胞溶解工程により得られる細胞検体溶解液を、重亜硫酸塩含有試薬で直接処理し、当該細胞検体溶解液に含まれるCpG含有DNAの塩基配列中の非メチル化シトシンをウラシルへと変換するDNA変換工程と、
(3)上記DNA変換工程により得られるCpG含有DNAを、所定のメチル化特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよび非メチル化特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅させるDNA増幅工程と、
(4) 上記DNA増幅工程によって、上記CpG含有DNAが増幅されたか否かを検出
するメチル化検出工程と
を含む方法である。
シルに変換される。具体的には、シトシンが重亜硫酸塩によりスルホン化(Sulphonation)され、さらに加水分解により脱アミノ化(Hydrolytic deamination)され、さらに、アルカリ存在下での脱スルホン化(Alkaline desulphonation)により、ウラシルに変換さ
れる。これに対して、メチル化されたシトシンは、重亜硫酸塩処理してもウラシルに変換されない。図4では、同一の塩基配列を有するDNAについて、その塩基配列中のCpGがメチル化されている、またはメチル化されていない場合の重亜硫酸塩処理を表わしている。
り、微量の遺伝子しか含まれない検体は検査できないという事態から本発明の検査方法では免れることができる。
タ重亜硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウムまたはピロ亜硫酸ナトリウムともいう)を好適に用いることができる。さらに、重亜硫酸化合物と尿素とを併用してもよい。
、hMLH遺伝子、MGMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群から、少なくとも2種以上の遺伝子を選択し、その選択した遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することにより、造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは造血器腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、発症する可能性、または造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性を評価するためのデータを得る方法であるが、その造血器腫瘍として、成人T細胞白血病・リンパ腫である場合に好適に用いられる。上記8種の遺伝子群は、特に成人T細胞白血病・リンパ腫においては、コア標的遺伝子としてもよい。成人T細胞白血病・リンパ腫の病型を検出し、診断するためのデータを提供する目的には、特異的な遺伝子セットとして有用であるためである。とりわけ成人T細胞白血病・リンパ腫の病型のうち、くすぶり型、慢性型、リンパ腫型、急性型を特定する場合に有用である。
・データの形態
検体中の2種以上の癌抑制遺伝子または癌関連遺伝子を選択してその発現制御レベルを測定し、得られた結果は、適切に統計解析を行なって、造血器腫瘍の診断のためのデータ、あるいは該腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、発症する可能性、または造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性を評価するためのデータとすることが望ましい。統計解析は、当業界で利用されている各種の統計手法、検定法の中から適する方法を選択しておこなうことができる。
量の腫瘍細胞が既に存在し該腫瘍の前臨床期の状態にある可能性、または発症している可能性を発症以前に高感度・高精度に評価するためのデータ、あるいは造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性を評価するためのデータを提供する。その場合に用いられるデータは、上記のいずれか1つの方法を用いて得たデータであってもよいし、何通りかの方法を併用して得られたデータであってもよい。また、選択された2種以上の癌抑制遺伝子または癌関連遺伝子の示差的発現プロファイルの形態であってもよい。例えば、遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化プロファイルが該当する。そうしたプロファイルから造血器腫瘍に関与する遺伝子群のパターン、その関わりの程度が判る。
キット
本発明のキットは、上記検査方法を実施するためのキットである。具体的には、検体を溶解するための溶解液、重亜硫酸塩含有試薬、メチル化検出増幅試薬を少なくとも含み、2種以上の選択された癌抑制遺伝子または癌関連遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化プロファイルを作製するためのキットである。
方式、手順を利用して行うことができる。
以下の実施例中で用いる装置名、使用材料の濃度、使用量、処理時間、処理温度などの数値的条件、処理方法などはこの発明の範囲内の好適例にすぎない。また、以下の説明をいくつかの図を参照して行なうが、これらの図はこの発明を理解できる程度に概略的に示してあることもある。
造血器腫瘍疾患の一つである成人T細胞白血病・リンパ腫(ATLL)において、8種の遺伝子群から選択された2種以上の遺伝子プロモーター領域におけるメチル化の有無、メチル化頻度をメチル化特異的PCR法(methylation specific PCR(MSP))を用いて確認し、その臨床的意義を調べた。
・対象および検体
総数78人から測定のための臨床検体を採取した。内訳は、ボランティアの健常者13名、HTLV-Iウイルス感染者(キャリアー)の10名、成人T細胞白血病・リンパ腫の慢性型
の患者5名、くすぶり型の患者15名、リンパ腫型の患者20名、急性型の患者15名について
、末梢血単核細胞(PBMC)もしくはリンパ節組織細胞を採取した。検体としての末梢血は、耳朶、上腕静脈などより採血し、単核細胞(PBMC)を常法により調製した。
・検索した遺伝子(造血器腫瘍用遺伝子セット)
造血器腫瘍用遺伝子セットとして次の8種類の癌抑制遺伝子または癌関連遺伝子を対象とし、そのプロモーター領域のメチル化を調べた:
SHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、MGMT遺伝
子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子。
・メチル化の検出
続いて検体からゲノムDNAを得るために、検体と細胞溶解液とを混合した後、一定時間、混合溶液を加熱した。この処理により検体中の細胞を溶解液によって破壊し、その細胞中のゲノムDNAを抽出した。なお、細胞溶解工程での溶解液の組成、濃度、反応温度、および反応時間等の反応条件は、特許文献3に記載された条件によった。
上記DNA変換工程後の修飾DNA溶液を用いて、遺伝子群(SHP1、p16,p15,p73,hMLH,MGMH,DAPK,HCAD)のプロモーター領域に存在するCpG島のメチル化の有無、メチル化の程度について、MSP(methylation specific PCR)法を用いるCpG島アッセイ(メチル化アッセイ)を実施した。この方法によれば、メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーを用いて、DNA変換工程後におけるCpG含有DNAをPCR増幅するために、より高精度でメチル化されたDNAを検出することができる。
control)を同時に処理を行った。ポジティブコントロールには、健常者の末梢血単核球細胞から得たDNAをSssIメチラーゼ(New England BioLabs Inc.,Beverly,MA)で処理したもの(PBMC (SssI))を用いた。またネガティブコントロールは、健常者のDNA試料を用いてMSPを行なった。
反応溶液:(10pmolプライマー:2μl重亜硫酸塩修飾DNA:10×PCR緩衝液:2mMdNTP:25mM塩化マグネシウム:AmpliTaqGold DNAポ
リメラーゼ0.25単位;最終反応容量20μl中)
反応条件:(95℃で10分間):[(94℃で15秒間):(AT(アニーリング温度
)で1分間):(72℃で1分間)]35から40サイクル:(72℃で7分間)
増幅後のPCR産物の検出を3%アガロースゲルで電気泳動してメチル化の有無を検出した。またPCR産物のサイズに相当するバンドの有無およびその産物サイズ(product size)をマーカー(50塩基対ladder)で検出した。
・各病型における遺伝子のメチル化
電気泳動の結果を図5〜図9に示すとともに、図10-1、-2および-3には各病型に
おける遺伝子メチル化の結果がまとめられている。
のサイズを示す。
ないことが判った。
遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、MGMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子のプロモーター領域におけるメチル化の状況も示す。
急性型(acute ATLL)DNAを増幅させた場合は、p15、hMLHにおいて、いずれも20%(3/15)とメチル化が少数確認された。ここで高いメチル化率を示したのはSHP1,DAPKおよびHCADであり、その値はそれぞれSHP1が80%(12/15)、DAPKが53%(8/15)、HCADが87%(13/15)で
あった。
16,MGMT,DAPK,HCADにおいて高いメチル化率を示し、その値はそれぞれSHP1が90%(18/20)、p15が20%(4/20)、p16が40%(8/20)、MGMTが45%(9/20)、DAPKが80%(16/20)、HCADが90%(18/20)であった。
パ腫型ATLLとの判別において、たとえば標的遺伝子をSHP1、p16、DAPK、MGMT、HCADを用いると健常者とリンパ腫型の間に有意な差があるため、健常者からリンパ腫型ATLLへの発症マーカーとして有用である。さらに健常者と慢性型ATLLとの間では、SHP1、DAPK、HCADが良好な判別マーカーとなり得る。
図10-1〜3に示される測定結果から、上記8個の遺伝子で、明らかにATLL病型で
メチル化の様相が異なることが明らかとなった。このことから測定した8個の遺伝子のメチル化を調べることが、ATLLの病型を特定することが可能であり、病型の進展と関係があることが示唆された。
(遺伝子メチル化の同時性)
造血器腫瘍用遺伝子セットである8種の遺伝子間において、ATLLで同時にメチル化される遺伝子間の相関関係を表2にまとめた。同時にメチル化される遺伝子間の相関性は、フィッシャーの直接確率検定(Fisher's exact test)(片側)により調べた。特にDAP
K遺伝子とMGMT遺伝子の間、SHP1遺伝子とDAPK遺伝子の間及びHCAD遺伝子とDAPK遺伝子の間に関連性が示された。なお、表2では、HTLV-Iキャリアー10名、成人T細胞白血病・リンパ腫の例数として、くすぶり型の患者15名(図10-2の“smoldering type”で、1〜15の患者)、慢性型の患者5名(図10-2の“chronic type”で、1〜5の患者)、リンパ腫型の患者20名、急性型の患者15名(図10-3の“acute type”
で、1〜15の患者)である場合の結果である。
また、これら相関関係を、8種の遺伝子の細胞内機能とメチル化を基準とした関連性を図3にまとめた。このようにATLLにおいて癌抑制遺伝子、アポトーシス、DNA修復酵素、細胞接着、情報伝達調節因子などの細胞活動局面で機能する遺伝子が同時的にメチル化されて発現が抑制されていることはATLLの発症と進展に関係していることを示す。また同一の生理的意義に括られる遺伝子群であっても、メチル化されにくいものもあり、遺伝子の示差的発現に対応するものである。
(ATLL病型の進展とメチル化の相関性)
図12に、「平均MSP(+)遺伝子数」について健常者、ATLLの各病型の間における有意差があるか調べた結果を示す。「平均MSP(+)遺伝子数」とは、MSPでポジティブの結果を与えた、すなわちMSPでメチル化が認められた平均遺伝子数である。これらの結果から以下のことが導き出せた。
(両側確率)(SPSS: SPSS Japan Inc. 社)により行なった。p=0.05を有意水準と
した。健常者の平均MSP(+)遺伝子数とHTLV−Iキャリアー、くすぶり型、慢性型、急性型、リンパ腫型ATLLの各病型の平均MSP(+)遺伝子数との間に有意な差が認められ、健常者からHTLV−Iキャリアー、健常者から各病型のATLLを判別するマーカーとして「平均MSP(+)遺伝子数」は有用である。さらにHTLV−I キャリアーの「平均MSP(+)遺伝子数」と慢性型、急性型またはリンパ腫型ATLLの「平均MSP(+)遺伝子数」の間、またはくすぶり型ATLLの「平均MSP(+)遺伝子数」と慢性型またはリンパ腫型ATLLの「平均MSP(+)遺伝子数」との間にも有意な差が認められ、「平均MSP(+)遺伝子数」は」HTLV−Iキャリアーから慢性型、急性型またはリンパ腫型のATLLの発症、あるいはくすぶり型ATLLから慢性型またはリンパ腫型ATLLへの病型の進展のマーカーとして有用である。また「平均MSP(+)遺伝子数」は、急性型ATLLとリンパ腫型ATLLとの判別にも適用可能である。HTLV−Iキャリアーと慢性型間でも「平均MSP(+)遺伝子数」は、有意差がある。
〜15の患者)である場合の結果である。
別において、たとえば標的遺伝子をSHP1,DAPK,HCADを用いると健常者と急性型の間に有意な差があるため、健常者から急性型ATLLへ発症のマーカーとして有用である。健常者とリンパ腫型ATLLとの判別において、たとえば標的遺伝子をSHP1,p16,DAPK,MGMT,HCADを用いると健常者とリンパ腫型の間に有意な差があるため、健常者からリンパ腫型ATLLへ発症のマーカーとして有用である。
ともに高いメチル化頻度を示した場合は病型がくすぶり型からリンパ腫型へ進展した可能性が高く、さらに、標的遺伝子をくすぶり型ではメチル化されていないp73、hMLH、SHP1を加えた3種以上に増やすことで検出精度あるいは信頼度が向上する。
(指標CIMP(+)に基づく解析)
ここでは、ATLLの各病型とDNAメチル化とを対応させる指標として、CIMPをもとに統計解析を行なった。一般的に、CIMP(CpG Island Methylator Phenotype)とは、いろいろな特異的標的遺伝子群のプロモーター領域のCpG島が高頻度にメチル化され、それにより、当該標的遺伝子群の発現が次々に消失する表現型のことを指す。ここでは8種の遺伝子群(SHP1、p15、p16、p73、hMLH、MGMH、DAPK、HCAD)のうち、4つ以上の遺伝子がCIMPにある場合をCIMP(+):Positiveと表することとした。 図10−1,図10−2,図10−3,図13のデータをもとに、病型の進展とCIMPとの相関性をフィッシャーの直接確率検定(片側)で評価し、結果を表4に示した。 p=0.05を有意
水準とした。
の“acute type”で、1〜15の患者)である場合の結果である。hMLH及びp73以外の遺伝子において、CIMPの有無と関連性が認められた。
キャリアーから慢性型、急性型およびリンパ腫型との間で標的遺伝子のメチル化が起こっている遺伝子数が有意に異なっている(図12)。さらに病型の進展にともなってその数が増加し、CIMP(+)の症例が増加することから(表4)、ATLLの病型の進展についても、標的遺伝子のメチル化遺伝子数及びCIMPをモニタリング・マーカーとして採用することが可能である。
ここでは、急性型ATLLとリンパ腫型ATLLを対象に上記遺伝子セットのメチル化の有無を評価した。急性型では血液中に異型リンパ球が確認されるが、リンパ腫型では血液中の異型リンパ球は見られないなどの違いはあるものの、LDHが上昇するものがほとんどで、細胞性免疫低下や高Ca血症などの症状を呈する。このほか高尿酸血症、高ビリルビン血症(肝浸潤)、アルカリフォスファターゼ上昇(骨破壊)、PTHrP上昇(骨破壊)がみられる。リンパ腫型は他の悪性リンパ腫と比べ特に治療抵抗性で、経過中に全身のリンパ節、臓器への浸潤が起こりリンパ腫を形成する。急性型は通常異型を示すATLL腫瘍細胞が末梢血に多数認められ典型的な白血病の症状を呈する。さらにリンパ節腫脹、肝機能障害、および浮腫がみられATLL細胞は骨髄や中枢神経系など多くの臓器に浸潤する(図2)。
かったのに対して、リンパ腫型のDNAではp16が40%(8/20)、p73が15%(3/20)、MGMTが45%(9/20)のメチル化率を示した。また、hMLHは急性型では20%(3/15)のメチル化率であるのに、リンパ腫型では5%(1/20)と、メチル化の頻度が小さいという特徴的な結果も得られた。そうしたメチル化のパターンの相違は、両病型の間で、病態の発生機序の違いを反映していると考えられる。
これらの結果より、8種の遺伝子群のメチル化の有無を検出することによって、急性型ATLLとリンパ腫型との間に差が認められることが判明した。
臨床因子として遺伝子メチル化の利用
実際はATLL病型の進展の検出を、次のように行なうことができる。まず、一次スクリーニングとして、上記の実施例1に示したように8種遺伝子のセットのうち、どの遺伝子がメチル化され、メチル化されていないかという視点からデータを分析して、HTLV-Iキャリアー、くすぶり型、慢性型、急性型およびリンパ腫型などの病型の判別を行なう。その後、HTLV−Iキャリアー、くすぶり型または慢性型と判定された患者については定期的な検査を行なう中で、CIMP及び8種の遺伝子群の指標に基づき経過観察を続ける。CIMPがポジティブであり、かつ8種の遺伝子群のうちメチル化された遺伝子の個数が増加傾向を示した場合には、病型の進展を疑い、精密な検査をさらに行なうことが肝要である。また病型判別において、急性型およびリンパ腫型と判定された患者は、さらに詳細な判別を行ない、一刻も早く適切な治療をすることが必要である。
れ同一人である。12は、治療前のデータ、13は、再発し増悪した際のデータを表し、いずれの病態においてもメチル化している遺伝子の種類および数(3個)は同一であった。このことは治療により減少した白血病細胞と同一のクローンが再び増加し再発したものと考えられ、本方法が治療後の病態を高感度・高精度にモニターし経過観察するためにきわめて有用であることを示している。6は、完全寛解(CR)してメチル化がまったくないことを示し、7では、移植治療後に再発したが、部分寛解(PR)中はSHP1のみがメチル化していた。このことからPRとCRとの境界にSHP1のメチル化が関与している可能性も考えられ、特定遺伝子のメチル化を探る意義を示している。以上より本発明が提供するデータに基づいて造血器腫瘍の別の病型へと進展しつつある可能性をも予見できる。
ATLLの進展に伴い、
(1)メチル化を示す遺伝子数の増加、
(2)特定の遺伝子のメチル化、
(3)CIMPの頻度の増加を認める。
を捉えることを可能とし、さらには検出した徴候から病型の進展を予見可能とした本発明は、患者に対し個別に適切な治療・投薬計画を立てる上で極めて有用な技術である。
Claims (13)
- 検体中のSHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、M
GMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群の遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することにより、SHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、MGMT遺伝子、DAPK遺伝子
およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子セットのメチル化状態を成人T細胞白血病・リンパ腫の発症または進展を示すマーカーとして、成人T細胞白血病・リンパ腫の病型もしくは前臨床期状態を検出する検査方法。 - 検体中のSHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、M
GMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群について、それらの遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することによりCIMPを算出し、指標であるCIMPがポジティブであるか否かにより成人T細胞白血病・リンパ腫の病型もしくは前臨床期状態を検出する、請求項1に記載の検査方法。 - 検体中のSHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、M
GMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群について、それらの遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することにより平均MSP(+)遺伝子数を算出し、指標である平均MSP(+)遺伝子数が0.5を超える場
合の数値に基づいて成人T細胞白血病・リンパ腫の病型もしくは前臨床期状態を検出する、請求項1に記載の検査方法。 - 前記成人T細胞白血病・リンパ腫の病型もしくは前臨床期状態は、HTLV−Iキャリアー、くすぶり型、慢性型、リンパ腫型または急性型のいずれかである、請求項1〜3のいずれかに記載の検査方法。
- 成人T細胞白血病・リンパ腫の診断のためのデータ、あるいは前臨床期の状態にある可能性、または発症する可能性を評価するためのCIMPまたは平均MSP(+)遺伝子数を提供することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の検査方法。
- 前記遺伝子セットにおいて、HTLV−Iキャリアーまたは前臨床期状態を検出するデータを提供するために、SHP1遺伝子、p73遺伝子およびHCAD遺伝子を判別マーカ
ーとすることを特徴とする請求項1に記載の検査方法。 - 検体中のSHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、M
GMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子群について、それらの遺伝子のプロモーター領域におけるCpG島のメチル化頻度を測定することによりCIMPを算出し、指標であるCIMPの変化により、造血器腫瘍(成人T細胞白血病・リンパ腫を除く)の病型もしくは前臨床期状態の検出に適用される検査方法。 - 前記メチル化頻度の測定にメチル化感受性制限酵素を用いることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の検査方法。
- 前記メチル化頻度の測定を、検体を溶解して得た細胞溶解液を重亜硫酸塩で処理した後に行なうことを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載の検査方法。
- 前記メチル化頻度の測定を、検体を溶解して得た細胞溶解液を直接に重亜硫酸塩で処理し、検体から遺伝子を抽出せずに行なうことを特徴とする、請求項9に記載の検査方法。
- 前記検体が、扁桃、骨髄、リンパ節、消化器、呼吸器、脾臓、肝臓、感覚器、中枢神経系、運動器、皮膚および末梢血よりなる群から選択された器官、組織から採取された細胞含有検体であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれかに記載の検査方法。
- SHP1遺伝子、p15遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、MGMT遺
伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子のメチル化検出用の増幅試薬、検体を溶解するための溶解液、重亜硫酸塩含有試薬を少なくとも含み、検体中のSHP1遺伝子、p15
遺伝子、p16遺伝子、p73遺伝子、hMLH遺伝子、MGMT遺伝子、DAPK遺伝子およびHCAD遺伝子よりなる遺伝子セットのプロモーター領域におけるCpG島のメチル化プロファイルを作製し、成人T細胞白血病・リンパ腫のHTLV−Iキャリアー、くすぶり型、慢性型、リンパ腫型または急性型のいずれであるかを検出するためのキット。 - 前記検体が、扁桃、骨髄、リンパ節、消化器、呼吸器、脾臓、肝臓、感覚器、中枢神経系、運動器、皮膚および末梢血よりなる群から選択された器官、組織から採取された細胞含有検体であることを特徴とする、請求項12に記載のキット。
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