KR20210042263A

KR20210042263A - 유방암의 조기 예측, 치료 반응, 재발 및 예후 모니터링 방법

Info

Publication number: KR20210042263A
Application number: KR1020207035311A
Authority: KR
Inventors: 루오-카이 린; 친-셍 헝; 셍-차오 왕; 위-메이 청; 치-밍 수
Original assignee: 타이페이 메디컬 유니이버시티
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2019-05-08
Publication date: 2021-04-19
Also published as: PL3790984T3; JP2021522814A; TW202006142A; JP2024061799A; WO2019217537A1; EP3790984A4; CN112534069A; TWI721414B; SG11202011007UA; US20210189500A1; AU2019265619A1; EP3790984A1; ES2968487T3; EP3790984B1; CN112534069B; EP3790984C0

Abstract

본 발명은 유방암의 조기 예측, 치료 반응, 재발 및 예후 모니터링을 위한 신규한 후생유전 바이오마커의 세트를 개시한다. 유전자의 비정상적인 메틸화는 유방암 환자로부터의 종양 조직 및 혈장 샘플에서 검출될 수 있지만, 정상의 건강한 개체에서는 검출되지 않는다. 본 개시는 또한, 본원에서 사용되는 프라이머 및 프로브를 개시한다.

Description

유방암의 조기 예측, 치료 반응, 재발 및 예후 모니터링 방법

본 발명은 유방암의 위험성 또는 감수성 및/또는 유방암의 예후 및 악성의 예측을 위한 유전자 바이오마커에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자 바이오마커의 메틸화를 기초로 하여 유방암을 검출하고, 유방암의 위험성 또는 유방암에 대한 감수성 및/또는 유방암의 악성을 예측한다.

암은 신체의 다른 부위에 침입하거나 퍼질 가능성을 갖는 비정상적인 세포 성장을 수반하는 질환의 그룹이고, 전세계적으로 사망의 주요 원인이다.

메틸화된 DNA는 대부분의 종양 타입의 조직에서 잠재적인 부류의 바이오마커로서 연구되었다. 여러 경우에, DNA 메틸트랜스퍼라아제는 유전자 발현의 후생유전 조절로서 시토신-포스페이트-구아닌(CpG) 섬 부위에서 DNA에 메틸 기를 첨가한다.

US 20080311570A1A호에는 하기 단계를 포함하는 암을 스크리닝하는 방법을 제공한다: (1) 시험 시편을 제공하는 단계; (2) 시험 시편의 게놈 DNA 내에서 적어도 하나의 표적 유전자의 CpG 서열의 메틸화 상태를 검출하는 단계로서, 표적 유전자는 SOX1, PAX1, LMX1A, NKX6-1, WT1 및 ONECUT1로 이루어진 단계; 및 (3) 표적 유전자의 존재 또는 부재를 기초로 하여 시편에 암 또는 암성 병리학적 변화가 존재하는 지의 여부를 결정하는 단계. WO 2016071477A1호는 shox2 유전자에서 CpG 메틸화를 분석함으로써 치료에 대한 암 환자의 반응을 평가하는 것에 관한 것이다. EP2828405B1호는 혈액 또는 혈장 및 대변에서 다수의 유전자 마커를 평가함으로써 대장 신생물을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 개요

본 개시는 유방암의 조기 예측, 치료 반응, 재발 및 예후 모니터링을 위한 한 세트의 신규한 후생유전 바이오마커를 개시한다. 유전자의 비정상적인 메틸화는 종양 조직 및 암 환자로부터의 혈장 샘플에서 검출될 수 있지만, 정상적인 건강한 개체에서는 검출되지 않는다. 본 개시는 또한, 본원에서 사용되는 프라이머 및 프로브를 개시한다.

일 구현예에서, 본 개시는 (a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계를 포함하며, 대조군의 메틸화 상태에 비해 인간 대상체의 DNA 서열에서 과메틸화의 존재가 유방암을 가리키는 것인, 유방암의 검출을 필요로 하는 인간 대상체에서 메틸화 상태를 검출하는 방법을 개시한다.

일 구현예에서, 본 개시는 인간 대상체에서 유방암에 대한 소인, 또는 이의 발병률을 검출하거나 유방암의 치료 반응, 예후 또는 재발을 예측하는 방법으로서, (a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계를 포함하며, 대조군의 메틸화 상태에 비해 인간 대상체의 DNA 서열에서 과메틸화의 존재는 유방암에 대한 소인, 유방암의 발병률, 불량한 치료 반응, 불량한 예후 또는 재발을 가리키는 것인 방법을 개시한다.

일부 구현예에서, 샘플에서 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편 및 대조군 DNA 서열의 메틸화 수준을 검정하기 위해 GCM2 메틸화 특이적 프로브 및 ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브가 사용된다.

일 구현예에서, 본 개시는 (a) GCM2 및 ITPRIPL1 표적 DNA 서열 또는 이의 단편을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) GCM2 메틸화 특이적 프로브 및 ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브를 사용하여 샘플에서 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편 및 대조군 DNA 서열의 메틸화 수준을 검정하는 단계, (c) 과메틸화된 GCM2 및 ITPRIPL1의 존재를 검출하기 위해 대조군 DNA 서열과 비교하여 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편의 상대적 메틸화 상태를 측정하는 단계, (d) 인간 대상체의 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편이 상기 대상체의 대조군 DNA 서열의 메틸화에 비해 과메틸화될 때 대상체를 유방암 치료를 필요로 하는 것으로서 식별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 유방암의 검출을 필요로 하는 인간 대상체에서 메틸화 상태를 검출할 수 있다.

일 구현예에서, 본 개시는 (a) GCM2 및 ITPRIPL1 표적 DNA 서열 또는 이의 단편을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) GCM2 메틸화 특이적 프로브 및 ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브를 사용하여 샘플의 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편 및 대조군 DNA 서열의 메틸화 수준을 검정하는 단계, (c) 과메틸화된 GCM2 및 ITPRIPL1의 존재를 검출하기 위해 대조군 DNA 서열과 비교하여 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편의 상대적 메틸화 상태를 측정하는 단계, (d) 인간 대상체의 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITRPIPL1이 상기 대상체의 대조군 DNA 서열의 메틸화 상태에 비해 과메틸화될 때 대상체를 유방암에 대한 소인, 또는 이의 발병률, 불량한 치료 반응, 또는 불량한 예후 또는 재발을 갖는 것으로서 식별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직, 세포, 혈액, 소변, 혈청 또는 혈장이다.

일부 구현예에서, 대조군의 메틸화보다 약 64% 더 높은 본원에 기술된 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편의 메틸화는 유방암을 가리킨다. 추가 구현예에서, 대조군의 메틸화보다 약 69% 더 높은 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편의 메틸화는 유방암을 가리킨다. 추가 구현예에서, 대조군의 메틸화보다 각각 약 69% 및 약 80% 더 높은 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 단편의 메틸화는 유방암을 가리킨다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 과메틸화는 인간 대상체의 표적 DNA 서열의 메탈화가 대조군의 메틸화보다 적어도 0.5, 1, 2 또는 3배 더 높을 때 지시된다. 일 구현예에서, 과메틸화는 인간 대상체의 표적 DNA 서열의 메틸화가 대조군의 메틸화보다 적어도 2배 더 높을 때 지시된다.

메틸화 검정에서 사용되는 프로브의 특정 구현예는 서열번호 13 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열(들)과 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 더 높은 퍼센트의 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, GCM2 메틸화 특이적 프로브는 서열번호 15와 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 가지며, ITPR IPL1 메틸화 특이적 프로브는 서열번호 16과 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, GCM2 메틸화 특이적 프로브는 서열번호 15의 서열을 가지며, ITPR IPL1 메틸화 특이적 프로브는 서열번호 16의 서열을 갖는다.

추가 구현예에서, 본 개시의 방법은 하기 하나 이상의 표적 DNA 서열 또는 임의의 이들의 조합물의 메틸화 수준을 검정하는 단계를 추가로 포함한다: C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편 및 C8o rf47 또는 이의 단편. 또한, RKL001의 메틸화 수준이 추가로 검정된다.

일부 구현예에서, C1or f114 메틸화 특이적 프로브, ZNF177 메틸화 특이적 프로브, 또는 C8orf47 메틸화 특이적 프로브 또는 임의의 이들의 조합물은 하기 하나 이상의 표적 DNA 서열 또는 임의의 이들의 조합물의 메틸화 수준을 검정하기 위해 추가로 사용된다: C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편 및 C8o rf47 또는 이의 단편. 또한, 표적 C1orf114, ZNF177 및 C8orf47 또는 이의 단편의 메틸화 특이적 프로브는 각각 서열번호 17, 18 및 14와 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 갖는다. 추가 구현예에서, 표적 C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편 및 C8orf47 또는 이의 단편의 메틸화 특이적 프로브는 각각 서열번호 17, 18 및 14의 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 대조군 DNA 서열과 비교하여 표적 C1orf114, ZNF177, 및/또는 C8orf47 DNA 서열 또는 이의 단편의 상대적 메틸화 상태의 측정은 각각 C1orf114에 대해 약 75%보다 높은 민감도 및 약 76%보다 높은 특이성, 및 ZNF177에 대해 약 62%보다 높은 민감도 및 약 82%보다 높은 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편; 표적 GCM2, ITPRIPL1 및 C1orf114 또는 이의 단편; 및 GCM2, ITPRIPL1, C1orf114 및 ZNF177 또는 이의 단편의 조합물의 상대적 메틸화 상태의 측정은 대조군 DNA 서열과 비교하여, 각각 약 87%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성, 약 95%보다 높은 민감도 및 약 72%보다 높은 특이성, 약 87%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성을 갖는다. 추가 구현예에서, 측정은 가중 합계 스코어 분석에 의해 특이성 및 민감도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 추가의 구현예에서, 표적 GCM2, ITPRIPL1 및 C1orf114 또는 이의 단편의 조합물 또는 표적 GCM2, ITPRIPL1, C1orf114 및 ZNF177 또는 이의 단편의 조합물의 상대적 메틸화 상태의 측정은 각각 약 87%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성, 및 약 91%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성을 갖는다.

추가 구현예에서, RKL001 메틸화 특이적 프로브는 RKL001의 메틸화 수준을 검정하기 위해 추가로 사용된다. 바람직하게는, RKL001 메틸화 특이적 프로브는 서열번호 13과 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 갖는다. 더욱 바람직하게는, RKL001 메틸화 특이적 프로브는 서열번호 13의 상동성을 갖는 서열을 갖는다.

일부 구현예에서, 메틸화 상태는 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱(예를 들어, 바이설파이트 시퀀싱 또는 피로시퀀싱), 바이설파이트 전환, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레아제, 질량-기반 분리, 표적 캡쳐 또는 마이크로어레이에 의해 검출된다. 특정 구현예에서, 메틸화 상태는 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출된다.

중합효소 연쇄 반응에서 사용되는 프라이머의 특정 구현예는 서열번호 1 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택된 서열(들)과 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 보다 높은 퍼센트의 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호 5 내지 8의 서열을 갖는 프라이머 또는 서열번호 15 및 16의 서열을 갖는 프로브는 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편의 메틸화 상태를 검출하거나 측정하기 위해 사용된다.

본 개시는 또한, 본원에 기술된 바와 같은 표적 DNA 서열에서 후생유전 바이오마커의 메틸화 프로파일을 검출하고/거나 특징분석하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 전체 표적 유전자 증폭을 위한 나트륨 바이설파이트 및 어댑터, 및 본원에 기술된 바와 같은 표적 DNA 서열에서 후생유전 바이오마커의 DNA 영역으로부터 적어도 하나의 시토신의 전환된 메틸화된 및/또는 전환된 비메틸화된 서열의 존재를 정량화하기 위한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 검출 가능하게 표지된 폴리뉴클레오타이드)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 키트는 전체 표적 서열 또는 유전자 증폭을 위한 메틸화 감지 제한 효소를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 키트는 하나 이상의 표적 DNA 서열 C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편, C8orf47 또는 이의 단편, 및 RKL0014 또는 임의의 이들의 조합물과 함께 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 검정하기 위한 서열번호 9 내지 12 및 1 내지 4의 서열을 갖는 하나 이상의 프라이머, 및/또는 서열번호 17, 18, 12 및 13의 서열을 갖는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 키트는 하나 이상의 표적 DNA 서열 C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편, C8orf47 또는 이의 단편, 및 RKL0014 또는 임의의 이들의 조합물과 함께 표적 DNA 서열 GCM2 또는 이의 단편 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편의 후생유전 바이오마커의 메틸화 프로파일을 검출하고/거나 특징분석하기 위해 사용될 수 있다. 키트는 표적 DNA 서열의 메틸화 상태를 검출하거나 측정하기 위한 서열번호 9 내지 12 및 1 내지 4의 서열을 갖는 하나 이상의 프라이머 및/또는 서열번호 17, 18, 12 및 13의 서열을 갖는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함한다.

추가 구현예에서, 키트는 전체 표적 서열 또는 유전자 증폭을 위한 메틸화 감지 제한 효소를 추가로 포함한다.

도 1a 내지 도 1f는 종양 조직과 인접한 정상 조직 사이에 표적 핵산 및 유전자의 프로모터, 엑손 및 유전자 바디 영역의 메틸화 상태의 차이에 대한 히트맵(heatmap)을 각각 도시한 것이다(A: RKL001; B: C8orf47; C: GCM2; D: C1orf114; E: ITPRIPL1; F: ZNF177).
도 2는 건강한 대상체 및 유방암 환자의 혈장 샘플에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태의 조기 검출의 차이를 도시한 것이다.
도 3은 유방암 환자 및 건강한 대상체에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태의 조기 검출을 나타내는 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristic; ROC) 곡선 분석을 도시한 것이다. GI: GCM2, ITPRIPL1; GIC: GCM2, ITPRIPL1, C1orf114; GICZ: GCM2, ITPRIPL1, C1orf114, ZNF177; G(a^*) I(b^*) C(c^*) Z(d^*): 가중 합계 스코어 분석후 GCM2+ITPRIPL1+C1orf114+ZNF177.
도 4a 내지 도 4c는 수술 전 및 후에 유방암 환자의 표적 유전자 C1orf114 (A), CA-153 (B) 및 CEA (C)의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 통한 치료 반응을 도시한 것이다.
도 5는 ITPRIPL1 유전자의 메틸화 상태의 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curve)을 기초로 한 유방암 환자의 불량한 예후를 도시한 것이다.

본 발명이 본원에 기술되는 특정 물질 및 방법으로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 사용되는 용어가 특정 구현예를 기술하기 위한 것으로서, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되는 것은 아닌 것으로 이해된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 용어("a," "an," 및 "the")가 내용이 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 복수 대상물을 포함하는 것이 주지되어야 한다. 이에 따라, 예를 들어, "바이오마커"에 대한 언급은 둘 이상의 바이오마커의 혼합물, 등을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "AUC"는 곡선 아래의 면적(area under a curve)에 대한 약어이다. 특히, 이는 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 아래의 면적을 지칭한다. ROC 곡선은 진단 시험의 상이한 가능한 컷 포인트(cut point)에 대한 위양성 비율(false positive rate)에 대한 참양성 비율(true positive rate)의 플롯이다. 선택된 컷 포인트에 따라 민감도와 특이성 간에 상호 절충(trade-off)을 보인다(민감도의 임의의 증가는 특이성의 감소로 동반될 것임). ROC 곡선 아래의 면적(AUC)은 진단 시험의 정확성에 대한 척도이다(면적이 클수록 더 양호하며, 최적의 값은 1이며, 랜덤 시험은 0.5의 면적으로 대각선에 놓인 ROC 곡선을 가질 것임; 참조 문헌[J. P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975]).

용어 "생물학적 샘플"은 예를 들어, 혈액, 연막, 혈장, 혈청, 혈액 세포(예를 들어, 말초 혈액 단핵화 세포(PBMCS), 간상핵 세포, 호중구, 후골수구, 단핵구, 또는 T 세포), 대변, 소변, 골수, 담즙, 척수액, 림프액, 피부 샘플, 피부, 호흡기, 장, 및 비뇨 생식기의 외부 분비물, 눈물, 타액, 우유, 장기, 생검 및 또한 배양 배지 중에서 세포 및 조직, 예를 들어, 재조합 세포, 및 세포 성분의 성장으로부터 형성된 컨디셔닝된 배지를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 시험관내 배양 구성성분의 샘플을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 대상체로부터 단리된 조직, 세포, 또는 유체의 샘플을 지칭한다.

용어 "바이오마커"는 대조군 대상체(예를 들어, 음성 진단 또는 검출되지 않는 암을 갖는 사람, 정상 또는 건강한 대상체)로부터 획득된 유사한 샘플과 비교하여 인간 암을 갖는 환자로부터 획득된 샘플에 존재하는 핵산 분자를 지칭한다. 바이오마커는 검출되고/거나 정량화될 수 있는 핵산, 핵산의 단편, 폴리뉴클레오타이드, 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 바이오마커는 유전자로부터의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "CpG 섬"은 게놈의 나너미제에 대해 GC가 풍부한 게놈의 DNA 스트레치(stretch)를 지칭한다. 통상적으로, GC 함량은 이러한 영역에서 50% 이상이며, 이는 수 백개 및 때때로 수 천개의 염기 쌍으로 확장한다.종종 이러한 영역은 유전자의 5' 단부를 표시한다.

바이오마커의 "대조 양"은 바이오마커의 시험량과 비교되는 임의의 양 또는 양의 범위일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 암의 "조기 검출"은 전이 전의 암의 가능성을 발견하는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 이는 샘플 조직 또는 세포의 형태학적 변화가 관찰되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "검출하다", "검출하는" 또는 "검출"은 발겨나거나 식별하는 일반적인 행위 또는 검출 가능하게 표지된 조성물의 특정 관찰을 기술할 수 있다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드, 전구체, 또는 RNA(예를 들어, 비-코딩 RNA, 예를 들어, 리보솜 RNA, 전달 RNA, 스플리코솜 RNA, 마이크로RNA)의 생산을 위해 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA) 서열을 지칭한다. 폴리펩타이드 또는 비-코딩 RNA는, 전장 또는 단편 폴리펩타이드의 요망되는 활성 또는 기능성 성질(예를 들어, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성, 등)이 유지되는 한, 전장 코딩 서열 또는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 인코딩될 수 있다. 이에 따라, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예를 들어, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인헨서, 사일런서(silencer), 절연인자(insulator), 경계 요소, 복제 기원, 기질 부착 부위 및 유전자좌 조절 영역을 포함하거나 배제할 수 있다. 이러한 용어는 또한, 유전자의 길이가 전장 mRNA에 해당하도록 이의 단부 상에 약 1 kb 이상의 거리에 대해 5' 및 3' 단부 둘 모두 상에서 코딩 영역에 인접하게 위치된 구조 유전자 및 서열의 코딩 영역을 포함한다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 둘 모두를 추가로 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "상동성"은 제2 서열과 소정 정도의 서열 동일성을 공유하지만, 이러한 서열이 제2 서열과 동일하지 않은 제1 서열을 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 돌연변이 유전자의 서열과 상동성이지만 동일하지는 않다. 일부 구현예에서, 2개의 서열 간의 상동성의 정도는 적절한 엄격한 조건 하에서 이들 사이의 상동성 재조합을 허용하기에 충분하다.

핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고/거나 이에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 결정하고, 이러한 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열은 또한, 이러한 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클리오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 유사성(correspondence)을 지칭한다. 둘 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이의 동일성 퍼센트를 결정함으로써 비교될 수 있다. 2개의 서열의 동일성 퍼센트는, 핵산 또는 아미노산 서열이든지 간에, 2개의 정렬된 서열 간의 정확한 매치의 수를 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다.

일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 간의 서열 유사성의 정도는 성동성 영역 사이에 안정한 이중 나선을 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드의 혼성화 이후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로의 소화, 및 소화된 단편의 크기 결정에 의해 결정될 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은 상기 방법을 이용하여 측정한 경우, 서열이 규정된 길이의 분자와 적어도 약 70% 내지 75%, 바람직하게는, 80% 내지 82%, 더욱 바람직하게는, 85% 내지 90%, 더욱더 바람직하게는, 92%, 더욱더 바람직하게는, 95%, 및 가장 바람직하게는, 98% 서열 동일성을 나타낼 때 실질적으로 서로 상동적이다. 본원에서 사용되는 실질적으로 상동성이라는 것은 또한 특정한 DNA 또는 폴리펩타이드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 지칭한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은 예를 들어, 그러한 특정 시스템에 대해 규정된 바와 같이, 엄격한 조건 하에서 남부 혼성화 실험(Southern hydridization experiment)에서 식별될 수 있다[예를 들어, 문헌[Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, D.C.; IRL Press] 참조].

본원에서 사용되는 용어 "예측"은 환자가 약물 또는 약물 세트에 바람직하게 또는 바람직하지 않게 반응할 가능성, 및 또한 그러한 반응의 정도를 지칭한다. 이에 따라, 치료 예측 인자는 예후와 무관하게, 특정 치료에 대한 개별 환자의 반응과 관련된 변수이다.

본원에서 사용되는 용어 "메틸화"는 핵산의 영역에서의 시토신 염기 또는 염기들, 예를 들어, 게놈 DNA에 대한 DNA 메틸 트랜스퍼라아제 효소의 작용에 의해 첨가된 메틸 기의 존재를 지칭한다.

용어 핵산 분자의 "메틸화 상태," "메틸화 프로파일," 또는 "메틸화 상태"는 핵산 분자에 하나 이상의 메틸화된 뉴클레오타이드 염기의 존재 또는 부재를 지칭한다. 예를 들어, 메틸화된 시토신을 함유한 핵산 분자는 메틸화된 것으로 간주된다(즉, 핵산 분자의 메틸화 상태는 메틸화된다). 어떠한 메틸화된 뉴클레오타이드도 함유하지 않는 핵산 분자는 메틸화되지 않은 것으로 간주된다.

용어 "과메틸화"는 정상 대조군 DNA 샘플 내에 상응하는 CpG 디뉴클레오타이드에서 발견되는 핵산 분자에서 메틸화된 뉴클레오타이드 염기의 양에 비해, 시험 DNA 샘플의 DNA 서열 내에 하나 또는 복수의 CpG 디뉴클오타이드에서의 핵산 분자에서 메틸화된 뉴클레오타이드 염기의 존재 증가에 해당하는 평균 메틸화 상태를 지칭한다.

용어 "저메틸화"는 정상 대조군 DNA 샘플 내에 상응하는 CpG 디뉴클레오타이드에서 발견되는 핵산 분자에서 메틸화된 뉴클레오타이드 염기의 양에 비해, 시험 DNA 샘플의 DNA 서열 내에 하나 또는 복수의 CpG 디뉴클오타이드에서의 핵산 분자에서 메틸화된 뉴클레오타이드 염기의 존재 감소에 해당하는 평균 메틸화 상태를 지칭한다.

용어 "대상체"는 인간을 지칭한다.

용어 "감수성"은 조직을 특정 외부 자극에 대해 특정 방식으로 반응하게 만들고 이에 따라 개체를 대개 특정 질환에 더 민감하게 되는 경향이 있는 신체의 체질 또는 상태를 지칭한다.

용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 경우, 결합 분자가 결합하는 핵산의 일부를 규정하는 핵산 서열을 지칭한다.

용어 "위험성"은 향후 10년 이내, 또는 대상체의 일생 동안과 같은 특정 기간 동안 질병에 걸릴 것으로 추정되는 기회를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "예후"는 일반적으로, 임상적 병태 또는 질환의 가능한 과정 및 결과의 예측을 지칭한다. 환자의 예후는 대개 질환의 바람직하거나 바람직하지 않은 과정 또는 결과를 나타내는 질환의 인자 또는 증상을 평가함으로써 이루어진다.

용어 "가중 합계 스코어(weight sum score)"는 다른 목적의 중요성을 강조하기 위해 개별적으로 가중치가 부여된, 모든 목적을 포함하는 스코어에 의해 등급이 매겨지는 모든 가능한 대안을 지칭한다.

암은 하나 이상의 돌연변이 또는 유전자의 변형에 의해 야기된 세포의 비정상적인 성장에 의해 세포 증식 및 세포 사멸의 균형이 조절되지 않는 것을 특징으로 한다. 암과 같은 여러 질환 과정에서, 유전자 프로모터 CpG 섬은 비정상적인 과메틸화를 획득하며, 이는 세포 분열 후에 딸 세포에 의해 유전될 수 있는 전사 침묵(transcriptional silencing)을 초래한다. 암에서 침묵을 야기시키는 DNA 메틸화는 통상적으로, 단백질 코딩 유전자의 프로모터에 존재하는 CpG 섬의 다수의 CpG 부위에서 발생한다. DNA 메틸화의 변형은 암 발생의 중요한 구성요소로서 인식되었다. DNA 메틸화 프로파일링은 다른 암 검출에 비해 더 높은 임상 민감도 및 동적 범위를 제공한다. 따라서, 본 개시는 유방암의 조기 예측, 치료 반응 및 예후 또는 재발 모니터링을 위한 방법 및 키트를 제공한다.

본 개시에서, 생물학적 샘플에서 GCM2 및 ITPRIPL1 표적 DNA 서열 또는 이의 단편의 메틸화 상태는 인간 대상체에서 유방암을 검출하거나 유방암에 대한 소인, 또는 이의 발병률을 검출하거나 유방암의 치료 반응, 예후 또는 재발을 예측하기 위해 측정된다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플에서 C1orf114, ZNF177 및/또는 C8orf47 표적 DNA 서열 또는 이의 단편의 메틸화 상태는 인간 대상체에서 유방암을 검출하거나 유방암에 대한 소인 또는 이의 발병률을 검출하거나 유방암의 치료 반응, 예후 또는 재발을 예측하기 위해 측정된다. 추가 구현예에서, 인간 염색체 19에서 핵산 서열, RKL001의 메틸화 상태가 추가로 측정된다.

GCM2 유전자는 아교 세포 누락 동족체 2를 코딩하는데, 이는 신경 세포와 아교 세포 결정 간에 이원 스위치(binary switch)로서 작용하는 것으로 사료된다. GCM 단백질 및 포유류 GCM 동족체는 DNA-결합 활성을 갖는 보존된 N-말단 GCM 모티프를 함유한다. GCM2 서열 및 이의 기능은 웹사이트 https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=GCM2에 기술된 것과 같이 당해 분야에 알려져 있다.

ITPRIPL1 유전자는 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 수용체 상호작용 단백질-유사 1로부터 코딩한다. ITPRIPL1 서열 및 이의 기능은 웹사이트 https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ITPRIPL1에 기술된 것과 같이 당해 분야에 알려져 있다.

ZNF177은 아연 핑거 단백질 177을 코딩한다. ZNF177 서열 및 이의 기능은 웹사이트 https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ZNF177에 기술된 것과 같이 당해 분야에 알려져 있다.

C8orf47은 글루타메이트 풍부 단백질 5를 코딩한다. C8orf47 서열 및 이의 기능은 웹사이트 https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ERICH5에 기술된 것과 같이 당해 분야에 알려져 있다.

RKL001은 하기 서열을 갖는 염색체 19의 핵산 서열이다: CGCAGGCCAGGCCCTCTATTCCTGTCGCTGCGCCCCGCCTTGCCGGCTGCGTGTCACCCCCCCCCCTGCCGCGCTGGCTCCCCGTCCGTCCCACCAGCCTTGCTGTCCTGGGCAGGCCGGGGAATTCCTCCCGGTTCCTGGAAAAAACA (서열번호 19).

일부 구현예에서, 메틸화는 시토신 메틸화 부위를 포함한다. 일부 경우에, 시토신 메틸화는 5-메틸시토신(5-mCyt) 및 5-하이드록시메틸시토신을 포함한다. 일부 경우에, 시토신 메틸화 부위는 CpG 디뉴클레오타이드 모티프에서 발생한다. 다른 경우에, 시토신 메틸화 부위는 CHG 또는 CHH 모티프에서 발생하며, 여기서, 이는 아데닌, 시토신 또는 티민이다. 일부 경우에, 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드 모티프 또는 CpG 부위는 CpG 디뉴클레오타이드에 풍부한 짧은 DNA 서열인 CpG 섬을 형성한다. 일부 경우에, CpG 섬은 항상 그러한 것은 아니지만, 통상적으로, 길이가 약 0.2 내지 약 1 kb이다. 일부 경우에, 메틸화는 CpG 섬 메틸화를 포함한다.

일부 구현예에서, 메틸화 상태는 메틸화 특이적 효소 소화; 바이설파이트 시퀀싱; 프로모터 메틸화, CpG 섬 메틸화, MSP, 헤비 메틸, 메티라이트(MethylLight), 및 Ms-SNuPE로부터 선택된 분석; 및 증폭된 DNA의 검출에 의존하는 달른 방법에 의해 분석된다. 용어 "MethylLight™"는 형광-기반 실시간 PCR 기술을 지칭한다. 메티라이트는 문헌[Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

용어 "헤비 메틸" 검정은 증폭 프라이머 사이에 CpG 위치를 포함하거나 증폭 프라이머에 의해 포함된 메틸화 특이적 차단 프로브(또한, 본원에서 블로커(blocker)로서 지칭됨)가 핵산 샘플의 메틸화-특이적 선택적 증폭을 가능하게 하는 검정을 지칭한다.

용어 "Ms-SNuPE"는 메틸화-민감성 단일 뉴클레오타이드 프라이머 확장을 지칭한다. MsSNuPE는 문헌[Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

용어 "MSP"는 메틸화-특이적 PCR을 지칭한다. MSP는 문헌[Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996] 및 미국특허 제5,786,146호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

DNA의 바이설파이트 변형은 CpG 메틸화 상태를 평가하는 방법이다. 5-메틸시토신은 진핵 세포의 DNA에서 가장 빈번한 공유 염기 변형이다. 그러나, 5-메틸시토신 위치는, 5-메틸시토신이 시토신과 동일한 염기 짝짓기 거동을 갖기 때문에, 시퀀싱 또는 혼성화 방법에 의해 직접적으로 식별할 수 없다. 또한, 5-메틸시토신에 의해 전달된 후생유전 정보는 예를 들어, PCR 증폭 동안 완전히 손실된다. 바이설파이트 시퀀싱은 5-메틸시토신의 존재에 대해 DNA를 분석하는 방법으로서, 바이설파이트와 시토신의 특정 반응을 기반으로 한 것이며, 이에 의해, 후속 알칼리 가수분해 시에, 시토신은 이의 염기 짝짓기 거동에서 티민에 해당하는 우라실로 전환된다. 그러나, 5-메틸시토신은 상기 언급된 조건 하에서 변형되지 않게 유지된다. 이에 따라, 본래 DNA는 이의 혼성화 거동에 의해 시토신과 본래 구별할 수 없는 메틸시토신이 예를 들어, 증폭 및 혼성화에 의해, 또는 시퀀싱에 의해, 분자 생물학적 기술을ㄹ 이용하여 오로지 잔류하는 시토신으로서 검출될 수 있는 방식으로 전환된다.

일 구현예에서, 메틸화 상태는 중합효소 연쇄 반응, 핵산 시퀀싱(예를 들어, 바이설파이트 시퀀싱 또는 피로시퀀싱), 바이설파이트 전환, 질량 분석법, 메틸화 특이적 뉴클레아제, 질량-기반 분리, 표적 캡쳐 또는 마이크로어레이에 의해 검출된다. 일 구현예에서, 메틸화 상태는 표적 유전자의 메틸화된 CpG를 증폭하기 위해 프라이머를 사용함으로써 검출된다. 추가 구현예에서, 메틸화의 검출은 PCR, 메틸화 특이적 PCR(MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR, 정량적 메틸화-특이적 PCR(QMSP), 메틸화된 DNA-특이적 결합 단백질을 사용한 PCR 또는 정량적 PCR에 의해 수행된다.

본 개시의 일 구현예에서, 본원에 기술된 유전자의 메틸화된 CpG를 증폭시킬 수 있는 프라이머(들)가 사용될 수 있다. 프라이머(들)는 유전자의 메틸화된 CpG에 혼성화하는 영역에 적어도 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 상세하게는, 유전자의 메틸화된 CpG를 증폭시키기 위한 프라이머(들)는 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열(들)과 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 더 높은 퍼센트의 상동성을 갖는 서열(들)을 포함한다.

본원에 기술된 유전자의 메틸화된 CpG와 혼성화 가능한 프로브(들)가 사용될 수 있다. 유전자의 메틸화된 CpG와 혼성화 가능한 프로브(들)는 유전자의 메틸화된 CpG에 혼성화하는 영역에서 적어도 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드를 포함한다. 상세하게는, 프로브(들)는 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열(들)과 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 더 높은 퍼센트의 상동성을 갖는 서열(들)을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 표적 유전자의 메틸화 상태의 검출은 표적 유전자의 정상 상태에 비해 유전자에 과메틸화의 존재를 포함한다.

일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 유방암을 갖는 것으로 의심되는 환자 또는 검출되는 대상체로부터의 조직, 세포, 혈액, 소변, 혈청 또는 혈장이다.

본원에서 사용되는 용어 "암을 갖는 것으로 의심되는 환자"는 초기 진단(예를 들어, 대량 또는 증가된 바이오마커 수준을 나타내는 CT 스캔)을 받았지만 암의 단계 또는 암을 지시하는 메틸화된 유전자의 존재 또는 부재가 알려지지 않은 개체를 지칭한다. 이러한 용어는 암에 한번 걸린 사람을 추가로 포함한다(예를 들어, 차도가 있는 개체).

일부 구현예에서, 상태를 정확하게 예측하기 위한 검출 시험은 검정의 민감도, 검정의 특이성 또는 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 아래의 면적(AUC)으로서 측정된다. ROC 곡선 아래의 면적이 클수록, 예를 들어, 더욱 정확하고 강력하게 시험 값을 예측할 수 있다.

일 구현예에서, 가중 합계 스코어는 지시 인자로서 핵산 서열 및 유전자에서 메틸화 상태를 결정하기 위해 측정된다. 가중 합계 모델(WSM)은 가장 잘 알려져 있고 가장 단순한 다중-기준 결정 분석(multi-criteria decision analysis; MCDA)/다수의 결정 기준의 측면에서 다수의 대안을 평가하기 위한 다중-기준 결정이다. 본 개시에 따르면, 가중 합계 스코어 분석은 GCM2, ITPRIPL1, C1orf114 및 ZNF177의 조합이 대조군에 비해 약 91%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성을 나타냄을 나타낸다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바이오마커 중 하나 이상은 적어도 p<0.05의 상이한 샘플에서의 통계학적 차이를 나타낸다. 이러한 바이오마커를 사용하는 검출 시험은 적어도 0.9의 AUC를 나타낼 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 DNA 서열에서 후생유전 바이오마커의 과메틸화 상태는 "불량한" 예후 또는 대상체가 약물 또는 약물 세트에 불리하게 반응하여 암의 진행 및/또는 하나 이상의 치료제의 불응성으로 이어질 가능성과 관련이 있다. 일부 경우에, "불량한" 예후는 대상체가 약물 또는 약물 세트에 반응하지 않아서 암으로 진행할 가능성을 지칭한다. 일부 경우에, "불량한" 예후는 5년 미만 내지 1개월 미만의 대상체의 생존을 지칭한다. 일부 경우에, "불량한" 예후는 치료 시에 대상체의 생존이 5년 미만 내지 1개월 미마닌 대상체의 생존을 지칭한다. 일부 경우에, "불량한" 예후는 대상체가 하나 이상의 약물에 대해 불응성 암에 걸릴 가능성을 추가로 지칭한다.

일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 표적 DNA 서열의 메틸화 프로파일을 검출하고/거나 특징화하기 위한 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 DNA 서열은 GCM2 및 ITPRIPL1 ; GCM2 , ITPRIPL1 및 C1orf114 ; GCM2 , ITPRIPL1 , C1orf114 및 ZNF177 ; GCM2 , ITPRIPL1 , C1orf114 , ZNF177 및 RKL1001; 및 GCM2 , ITPRIPL1 , C1orf114 및 ZNF177, RKL1001 및 C8orf47로 이루어진 군으로부터 선택된 조합을 포함한다.

일부 경우에, 키트는 하나 이상의 표적 유전자의 메틸화 상태/수준을 검출하거나 측정하기 위한 복수의 프라이머 또는 프로브를 포함한다. 이러한 키트는 일부 경우에, 본원에 기술된 메틸화 바이오마커 서열 중 적어도 하나를 혼성화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 및 유전자 메틸화의 검출을 위한 적어도 하나의 시약을 포함한다. 메틸화의 검출을 위한 시약은 예를 들어, 나트륨 바이설페이트, (예를 들어, 적어도 하나의 C-U 전환을 함유한) 마커 서열이 메틸화되지 않은 경우 마커 서열의 생성물인 서열에 혼성화하도록 설계된 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 메틸화-민감한 또는 메틸화-의존 제한 효소를 포함한다. 일부 경우에, 키트는 검정에서 사용하기 위해 구성된 검정 장비 형태의 고체 지지체를 제공한다. 일부 경우에, 키트는 키트에서 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 연결된 검출 가능한 라벨, 예를 들어, 프로브를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 바와 같이 가중 합계 스코어를 얻기 위한 공정 유닛을 추가로 포함한다.

선택적으로, 증폭된 부분에 혼성화 가능한 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 폴리펩타이드가 또한 키트에 포함된다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 표적 DNA 서열을 증폭하기 위한 충분한 프라이머를 포함하고, 각 증폭된 DNA 영역 또는 이의 부분에 혼성화 가능한 검출 가능하게 표지된 폴리뉴클레오타이드를 선택적으로 포함한다. 키트는 메틸화-의존 또는 메틸화 민감한 제한 효소 및/또는 나트륨 바이설파이트를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 키트는 나트륨 바이설파이트, 프라이머 및 전체 표적 유전자 증폭을 위한 어댑터, 및 본원에 기술된 후생유전 바이오마커의 DNA 영역으로부터 적어도 하나의 시토신의 전환된 메틸화된 및/또는 전환된 비메틸화된 서열의 존재를 정량화하기 위한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 검출 가능하게 표지된 폴리뉴클레오타이드)를 포함한다.

일부 구현예에서, 키트는 메틸화 감지 제한 효소, 프라이머 및 전체 표적 유전자 증폭을 위한 어댑터, 및 본원에 기술된 후생유전 마커의 DNA 영역의 적어도 일부분의 카피의 수를 정량화하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 메틸화 결합 모이어티, 및 본원에 기술된 DNA 영역의 적어도 일부분의 카피의 수를 정량화하기 위한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

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본원에 기술되고 청구된 본 발명은 본 상세한 개시에 서술되거나 기술되거나 언급된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 여러 속성 및 구현예를 갖는다. 본원에 기술되고 청구된 모든 포괄적인 것 및 본 발명이 이러한 상세한 개시에 기술된 특징 또는 구현예로 또는 이에 의해 제한되지 않는 것으로 의도되지 않으며, 이는 제한되지 않고 단지 예시를 위해 포함되는 것이다. 당업자는 여러 성분 및 파라미터가 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 어느 정도까지 변경되거나 개질되거나 공지된 등가물로 치환될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 이러한 개질 및 등가물이 개별적으로 기술된 것처럼 본원에 포함되는 것으로 인식되어야 한다. 본 발명은 또한, 본 명세서에 개별적으로 또는 총괄적으로 지칭되거나 명시된 단계, 특징, 조성물 및 화합물 모두, 및 상기 특징 단계 중 임의의 둘 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.

본원에서 참조되거나 언급된 모든 특허, 출판물, 과학 문헌, 웹 사이트, 및 다른 문헌 및 자료는 본 발명이 속하는 당업자의 기술 수준을 나타내며, 이러한 각각의 참조된 문헌 및 자료는 전문이 개별적으로 포함되거나 전문이 본원에 기술된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 본 출원인은 본 명세서 내에, 임의의 이러한 특허, 출판물, 과학 문헌, 웹 사이트, 전자적으로 사용 가능한 정보, 및 다른 참고 자료 또는 문헌으로부터 임의의 및 모든 자료 및 정보를 물리적으로 도입할 권리를 보유한다. 본 명세서에서 임의의 출원, 특허, 및 출판물에 대한 언급은 유효한 종래 기술을 구성하거나 세계 어느 국가에서 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 인정 또는 제안의 형태가 아니고, 이러한 것으로서 받아들여서는 안된다.

본원에 기술된 특정 방법 및 조성물은 바람직한 구현예의 대표예이고, 예시적이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 다른 목적, 양태, 및 구현예는 본 명세서를 고려할 때 당업자에게 발생할 것이고, 청구범위에 의해 규정된 바와 같이 본 발명의 사상 내에 포함된다. 본 발명의 범위 및 사상을 벋어나지 않으면서, 본원에 개시된 본 발명에 대해 다양한 치환 및 개질이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 자명하게 될 것이다. 본원에서 예시적으로 기술된 본 발명은 임의의 구성요소 또는 구성요소들의 부재, 또는 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있으며, 이는 본원에서 필수적인 것으로서 상세하게 개시되지 않는다. 이에 따라, 예를 들어, 본원의 각 경우에, 본 발명의 구현예 및 실시예에서, 임의의 용어 "포함하는," "...를 본질적으로 포함하는," 및 "...로 이루어진"은 본 명세서에서 다른 2개의 용어로 대체될 수 있다. 또한, 용어 "포함하는(comprising, including)," "함유하는" 등은 제한 없이 광범위하게 판독되어야 한다. 본원에 예시적으로 기술된 방법 및 공정은 적합하게, 단계의 다른 순서로 실행될 수 있으며, 반드시 본원에 또는 청구범위에 명시된 단계의 순서로 제한되지 않는다. 또한, 본원에 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a," "an," 및 "the")가 문맥이 달리 명확하게 명시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 어떠한 상황에서도, 특허는 본원에서 상세하게 개시된 특정 실시예 또는 구현예 또는 방법으로 제한되는 것으로 해석될 수 없다. 어떠한 상황에서도, 특허는 이러한 기술이 상세하게 본 출원에 의해 응답하는 서면에서 명시적으로 채택된 자격이나 유보가 없이 기술되는 경우에 임의의 심사관 또는 특허청의 임의의 다른 공무원 또는 직원의 임의의 진술에 의해 제한되는 것으로 해석될 수 있다. 또한, 명칭, 표제, 등은 이러한 문헌의 독자의 이해도를 향상시키기 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 판독되지 않아야 한다. 본원에 지칭된 본 발명의 양태, 구현예 또는 성분들의 임의의 예는 비제한적인 것으로 간주된다.

사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되며, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 도시되고 기술된 특징 또는 이의 일부의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 다양한 개질이 청구된 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 이에 따라, 본 발명이 바람직한 구현예 및 선택적 특징에 의해 상세하게 개시되지만, 본원에 개시된 개념의 개질 및 변경이 당업자에 의해 재분류될 수 있으며, 그러한 개질 및 변경이 첨부된 청구범위에 의해 규정된 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주되는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 본원에 광범위하게 및 일반적으로 설명되었다. 일반적인 개시 내에 속하는 각각의 더 좁은 종 및 아속 그룹핑은 또한 본 발명의 부분을 형성한다. 절제된 물질이 본원에 상세하게 인용되는지의 여부에 관계없이, 이는 속으로부터 임의의 대상을 제거하는 단서 또는 부정적 제한과 함께 본 발명의 일반적인 설명을 포함한다.

다른 구현예는 하기 청구범위 내에 속한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠쉬 그룹의 형태로 기술되는 경우에, 당업자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 서브그룹의 관점에서 기술된다는 것을 인식할 것이다.

추가 설명 없이, 당업자가 전술한 설명을 기초로 하여 본 발명을 최대한 사용할 수 있을 것으로 여겨진다. 이에 따라, 하기 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 단지 예시적인 것으로서 해석되어야 한다.

본 개시가 예시적인 구현예로 기술되었지만, 다양한 변경 및 개질은 당업자에게 제안될 수 있다. 본 개시가 첨부된 청구범위 내에 속하는 것으로서 이러한 변경 및 개질을 포함하는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1: 유방암 조직에서 표적 핵산 및 유전자의 메틸화 상태

Illumina 메틸화 450K 어레이-기반 데이터에 대한 β 값을 The Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network로부터 발생하였다. 정상 조직으로부터의 β 값이 0.15 미만이고 △β 값(종양 조직의 값에서 정상 조직의 값이 차감된 값)이 0.3보다 높을 때 표적 핵산 및 유전자를 선택하였다. GCM2, ITPRIPL1, C1orf114 및 ZNF177, RKL1001 및 C8orf47의 △β 값은 0.3보다 훨씬 더 높다.

β 값(T), 종양 조직의 메틸화 수준;

β 값(T)>0.3, 표지된 청색은 다른 암에 대한 바이오마커로서 계산될 것임.

도 1은 종양 조직과 인접한 정상 조직(n=97) 사이에 표적 핵산 및 유전자의 메틸화 상태(β 값)의 차이를 도시한 것이다. 더 진한 칼라는 Illumina 메틸화 450K 어레이-기반 데이터에 따라 더 높은 메틸화 상태를 갖는 조직을 지시하는 것이다.

실시예 2: 유방암 조직 및 정상 조직에서 표적 핵산과 유전자 간의 메틸화 상태의 차이 검출

유방암 환자로부터의 동일한 환자로부터 매칭되는 쌍의 원발성 종양 및 인접한 유방 조직으로부터의 게놈 DNA를 추출하고 바이설파이트 전환을 수행하였다. 메틸화 특이적 실시간 PCR(qMSP)을 유방 종양 조직 및 인접한 정상 조직에서 DNA 메틸화 분석의 검출에서 사용하였다. ACTB 유전자를 기준 유전자로서 사용하였다. ACTB 유전자의 메틸화 수준과 비교하여 표적 유전자의 메틸화 수준이 쌍을 이루는 정상 유방 조직과 비교하여 유방 종양에서 적어도 2배 더 높을 때 타겟은 과메틸화되는 것으로 간주된다. GCM2, ITPRIPL1, C1orf114 및 ZNF177, RKL1001 및 C8orf47의 인접한 정상 조직과 비교하여 유방 종양에서의 모든 과메틸화 비율은 64%보다 더 높다.

실시예 3: 건강한 대상체 및 유방암 환자의 혈장 샘플에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태의 조기 검출

순환하는 무세포 DNA를 혈장으로부터 추출하였다. 간단하게, 3.5 mL의 혈장을 10 mL의 말초 혈액으로부터 바로 단리하였다. 순환하는 무세포 DNA(cfDNA)를 24명의 유방암 환자 및 25명의 건강한 대상체로부터 획득된 혈장으로부터 추출한 후에, cfDNA를 바이설파이트 전환에 의해 수행하였다. 프로브-기반 메틸화 특이적 실시간 PCR(qMSP)을 cfDNA 메틸화 분석을 위해 사용하였다. GCM2 , ITPRIPL1 , C1orf114 및 ZNF177에 의한 조기 예측은 91.7% 민감도 및 96.0% 특이성(AUC: 0.954)을 나타내었다.

도 2는 건강한 대상체 및 유방암 환자의 혈장 샘플에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태의 조기 검출의 차이를 도시한 것이다. 또한, 도 3에 도시된 바와 같은 수신자 조작 특성(ROC) 곡선 분석은 유방암 환자 및 건강한 대상체에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태의 조기 검출을 명시한다.

실시예 4: 유방암 환자에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태에 의해 모니터링된 치료 반응

프로브-기반 메틸화 특이적 실시간 PCR(qMSP)에 의해 유방암 환자의 혈장으로부터의 cfDNA를 분석하였다. CA-153 및 CEA 종양 마커는 현 임상 사용 암 바이오마커이며, 이는 비교 마커로서 사용되었다. 결과는 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태가 의료 수술 치료에 민감하게 반응할 수 있음을 나타낸다. 도 4에 도시된 바와 같이, 수술 전 및 후 유방암 환자에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 통한 치료 반응.

실시예 5: 유방암 환자에서 표적 유전자의 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태에 의한 예후 예측

Illumina 메틸화 450K 검정-기반 데이터 및 추적 정보를 The Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network로부터 생성하였다. 카플란-마이어 방법을 이용하여 전체 생존 곡선을 계산하였으며, SPSS 소프트웨어에 의한 log-순위 및 Wilcoxon 시험(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 비교를 수행하였다. 도 5에 도시된 카플란-마이어 곡선은 ITPRIPL1 유전자의 메틸화 상태가 유방암 환자에서 불량한 예후를 가짐을 지시한다. 전체 생존 곡선 GCM2, ITPRIPL1, C1orf114, ZNF177, C8orf47 및/또는 RKL1001 및/또는 임의의 이들의 조합물을 또한, 카플란-마이어 방법을 이용하여 계산하였다.

SEQUENCE LISTING <110> TAIPEI MEDICAL UNIVERSITY LIN, RUO-KAI HUNG, CHIN-SHENG WANG, SHENG-CHAO CHUNG, YU-MEI SU, CHIH-MING <120> METHODS FOR EARLY PREDICTION, TREATMENT RESPONSE, RECURRENCE AND PROGNOSIS MONITORING OF BREAST CANCER <130> T54267/PC0123 <150> US 62/668,435 <151> 2018-05-08 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 1 gttttttatt tttgtcgttg cgtttc 26 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 2 cgaaaaaaat tccccgacct 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 3 gtagttgttt tcggttttcg gtttc 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 4 tactatcgcc gaccttatta aaaacg 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 5 gagatagggc ggagtttttc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 6 cttaaccgcg atactaaacg tt 22 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 7 gagtgtagtt gatagtaggt acggc 25 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 8 gtaaatttac taaaaaaata aaaaaaccgt 30 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 9 ttttattggt ttttcgtaag tatcg 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 10 cataacaaca acgtacctct acgtc 25 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 11 tttagttgtt ggtcggaagc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 12 cgacctcact aataaaacgc a 21 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 13 tgtcgcgttg gtttttcgtt cgttt 25 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 14 ctaaaacaac ccattacgaa aaacgc 26 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 15 ggtcgatgtt gtcgttcggg tgga 24 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 16 agggaggtcg agtagcggag agtgtg 26 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 17 tcgggagggg tcggtggttt gag 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 18 gaagtgggcg ttcgtcgttt cgtt 24 <210> 19 <211> 149 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 19 cgcaggccag gccctctatt cctgtcgctg cgccccgcct tgccggctgc gtgtcacccc 60 cccccctgcc gcgctggctc cccgtccgtc ccaccagcct tgctgtcctg ggcaggccgg 120 ggaattcctc ccggttcctg gaaaaaaca 149

Claims

유방암의 검출을 필요로 하는 인간 대상체에서 메틸화 상태를 검출하는 방법으로서, (a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계를 포함하며, 대조군의 메틸화 상태에 비해 인간 대상체의 DNA 서열에서 과메틸화의 존재는 유방암을 가리키는 것인 방법.
인간 대상체에서 유방암에 대한 소인, 또는 유방암의 발병률을 검출하거나 유방암의 치료 반응, 예후 또는 재발을 예측하는 방법으로서, (a) 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 검정하는 단계를 포함하며, 대조군의 메틸화 상태에 비해 인간 대상체의 DNA 서열에서 과메틸화의 존재는 유방암에 대한 소인, 또는 이의 발병률, 불량한 치료 반응, 불량한 예후 또는 재발을 가리키는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, GCM2 메틸화 특이적 프로브 및 ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브가 샘플에서 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편 및 대조군 DNA 서열의 메틸화 수준을 검정하기 위해 사용되는 방법.
(a) GCM2 및 ITPRIPL1 표적 DNA 서열 또는 이의 단편을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) GCM2 메틸화 특이적 프로브 및 ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브를 사용하여 샘플에서 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편 및 대조군 DNA 서열의 메틸화 수준을 검정하는 단계, (c) 과메틸화된 GCM2 및 ITPRIPL1의 존재를 검출하기 위해 대조군 DNA 서열과 비교하여 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편의 상대적 메틸화 상태를 측정하는 단계, (d) 인간 대상체의 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편이 상기 대상체에서 대조군 DNA 서열의 메틸화에 비해 과메틸화될 때 대상체를 유방암 치료를 필요로 하는 것으로서 식별하는 단계를 포함하는 방법.
(a) GCM2 및 ITPRIPL1 표적 DNA 서열 또는 이의 단편을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 (b) GCM2 메틸화 특이적 프로브 및 ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브를 사용하여 샘플에서 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편 및 대조군 DNA 서열의 메틸화 수준을 검정하는 단계, (c) 과메틸화된 GCM2 및 ITPRIPL1의 존재를 검출하기 위해 대조군 DNA 서열과 비교하여 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편의 상대적 메틸화 상태를 측정하는 단계, (d) 인간 대상체의 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITRPIPL1이 상기 대상체에서의 대조군 DNA 서열의 메틸화 상태에 비해 과메틸화될 때 대상체를 유방암에 대한 소인, 또는 유방암의 발병률, 불량한 치료 반응을 갖거나 유방암의 불량한 예후 또는 재발을 갖는 것으로서 식별하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 조직, 세포, 혈액, 소변, 혈청 또는 혈장인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서의 메틸화가 대조군의 메틸화보다 약 64% 더 높은 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서의 메틸화가 대조군의 메틸화보다, 각각 약 69% 및 약 80% 더 높은 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 과메틸화가, 인간 대상체에서 표적 DNA 서열의 메틸화가 대조군에서의 메틸화보다 적어도 0.5배 더 높을 때를 지시하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 과메틸화가, 인간 대상체에서 표적 DNA 서열의 메틸화가 대조군에서의 메틸화보다 적어도 2배 더 높을 때를 지시하는 것인 방법.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GCM2 메틸화 특이적 프로브가 서열번호 15와 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 가지며, ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브가 서열번호 16과 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 방법.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GCM2 메틸화 특이적 프로브가 서열번호 15의 서열을 가지며, ITPRIPL1 메틸화 특이적 프로브가 서열번호 16의 서열을 갖는 방법.
제12항에 있어서, 대조군 DNA 서열과 비교하여 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 DNA 서열 또는 이의 단편의 상대적 메틸화 상태의 측정이 GCM2에 대해 약 54%보다 높은 민감도 및 약 100%보다 높은 특이성, 및 ITPRIPL1에 대해 약 79%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성을 갖는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편 및 C8orf47 또는 이의 단편인 하나 이상의 표적 DNA 서열 또는 임의의 이들의 조합물의 메틸화 수준을 검정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, RKL001의 메틸화 수준이 추가로 검정되는 방법.
제14항에 있어서, C1orf114 메틸화 특이적 프로브, ZNF177 메틸화 특이적 프로브, 또는 C8orf47 메틸화 특이적 프로브 또는 임의의 이들의 조합물이 C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편 및 C8orf47 또는 이의 단편인 하나 이상의 표적 DNA 서열 또는 임의의 이들의 조합물의 메틸화 수준을 검정하기 위해 추가로 사용되는 방법.
제16항에 있어서, 표적 C1orf114, ZNF177 및 C8orf47 또는 이의 단편의 메틸화 특이적 프로브가 각각 서열번호 17, 18 및 14와 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 방법.
제16항에 있어서, 표적 C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편 및 C8orf47 또는 이의 단편의 메틸화 특이적 프로브가 각각 서열번호 17, 18 및 14의 서열을 갖는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 대조군 DNA 서열과 비교하여 표적 C1orf114, ZNF177, 및/또는 C8orf47 DNA 서열 또는 이의 단편의 상대적 메틸화 상태의 측정이 각각 C1orf114에 대해 약 75%보다 높은 민감도 및 약 76%보다 높은 특이성, 및 ZNF177에 대해 약 62%보다 높은 민감도 및 약 82%보다 높은 특이성을 갖는 방법.
제16항에 있어서, 표적 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편; 표적 GCM2, ITPRIPL1 및 C1orf114 또는 이의 단편; 및 GCM2, ITPRIPL1, C1orf114 및 ZNF177 또는 이의 단편의 조합물의 상대적 메틸화 상태의 측정이 대조군 DNA 서열과 비교하여 각각 약 87%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성, 약 95%보다 높은 민감도 및 약 72%보다 높은 특이성, 약 87%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성을 갖는 방법.
제13항, 제19항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 측정이 가중 합계 스코어 분석(weighted sum score analysis)에 의해 특이성 및 민감도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 표적 GCM2, ITPRIPL1 및 C1orf114 또는 이의 단편의 조합물 또는 표적 GCM2, ITPRIPL1, C1orf114 및 ZNF177 또는 이의 단편의 조합물의 상대적 메틸화 상태의 측정이 각각 약 87% 보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성, 및 약 91%보다 높은 민감도 및 약 96%보다 높은 특이성을 갖는 방법.
제15항에 있어서, RKL001 메틸화 특이적 프로브가 RKL001의 메틸화 수준을 검정하기 위해 추가로 사용되는 방법.
제23항에 있어서, RKL001 메틸화 특이적 프로브가 서열번호 13과 적어도 85%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 방법.
제23항에 있어서, RKL001 메틸화 특이적 프로브가 서열번호 13의 상동성을 갖는 서열을 갖는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸화 상태가 중합효소 연쇄 반응에 의해 검출되는 방법.
서열번호 14 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 프로브.
서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 프라이머.
표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 검정하기 위한 서열번호 5 내지 8의 서열을 갖는 프라이머 또는 서열번호 15 및 16의 서열을 갖는 프로브를 포함하는, 인간 대상체에서 유방암의 검출을 필요로 하거나 인간 대상체에서 유방암에 대한 소인, 또는 유방암의 발병률을 검출하거나 유방암의 치료 반응, 예후 또는 재발을 예측하는 것을 필요로 하는 인간 대상체에서 메틸화 상태를 검출하기 위한 키트.
제29항에 있어서, 하나 이상의 표적 DNA 서열 C1orf114 또는 이의 단편, ZNF177 또는 이의 단편, C8orf47 또는 이의 단편, 및 RKL0014 또는 임의의 이들의 조합물과 함께 표적 DNA 서열 GCM2 및 ITPRIPL1 또는 이의 단편에서 후생유전 바이오마커의 메틸화 상태를 검정하기 위한 서열번호 9 내지 12 및 1 내지 4의 서열을 갖는 하나 이상의 프라이머 및/또는 서열번호 17, 18, 12 및 13의 서열을 갖는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 키트.
제29항 또는 제30항에 있어서, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기술된 바와 같이 표적 DNA 서열에서 후생유전 바이오마커의 DNA 영역으로부터 적어도 하나의 시토신의 전환된 메틸화된 서열 및/또는 전환된 비메틸화된 서열의 존재를 정량화하기 위한 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 검출 가능하게 표지된 폴리뉴클레오타이드), 및 전체 표적 유전자 증폭을 위한 나트륨 바이설파이트 및 어댑터, 및 를 추가로 포함하는 키트.
제31항에 있어서, 전체 표적 서열 또는 유전자 증폭을 위한 메틸화 감지 제한 효소를 추가로 포함하는 키트.
제4항에 있어서, 방법이 유방암의 검출을 필요로 하는 인간 대상체에서 메틸화 상태를 검출하는 방법.