JP6498114B2 - 成人t細胞白血病の診断方法および成人t細胞白血病の治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
ティジルイノシトール‐4,5‐ビスフォスフェイト(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate;PIP2)に変換する働きがあるとされている。
a.被験化合物存在下において、細胞のSCYL2遺伝子、SCYL2遺伝子転写産物またはSCYL2タンパク質の量を測定すること、および
b.aで測定したSCYL2遺伝子、SCYL2遺伝子転写産物またはSCYL2タンパク質の量と、被験化合物非存在下における細胞のSCYL2遺伝子、SCYL2遺伝子転写産物またはSCYL2タンパク質の量を比較することを含む。
a.被験化合物とSCYL2タンパク質とを接触させる工程、
b.該タンパク質と該化合物の結合活性を検出する工程、及び
c.該タンパク質に結合する化合物を選択する工程。
SCYL2遺伝子またはSCYL2タンパク質自体がこのようなPTENのリン酸化剤として有用である。
本発明で提供するPTENのリン酸化阻害および/または脱リン酸化剤、及びこれを有効成分とするPI3K/AKT情報伝達経路の活性化を病因のひとつとする予防薬、進展抑制薬、または治療薬には、SCYL2 の機能を阻害する物質が含まれる。このような機能を阻害する物質としては、SCYL2タンパク質またはそのペプチド断片に対する抗体、またはSCYL2遺伝子の阻害性核酸が含まれる。ここで、SCYL2遺伝子阻害性核酸には、SCYL2遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA、またはsiRNAが含まれる。
また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、PCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。
66:2731-2739; Johann(1992)J. Virol. 66:1635-1640参照)。また、パラミクソウイルス科に含まれるセンダイウイルス(HVJ)なども好適に使用できる。この場合、生体より取り出した組織あるいは細胞にポリヌクレオチド発現ベクターを導入した後に、生体に戻すようにしてもよい(ex vivo法)。例えば、ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、マイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の慣用的なトランスフェクション法により細胞内に導入する。
釈剤;リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤緩衝剤;等張化剤;防腐剤;湿潤剤;乳化剤;分散剤;安定化剤;溶解補助剤;アスコルビン酸のような抗酸化剤;低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド(例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド);タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン);単糖、二糖および他の炭水化物(セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む);キレート剤(例えば、EDTA);糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール);対イオン(例えば、ナトリウム);および/または非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベート、ポロキサマー)、などの医薬品添加物と適宜混合または希釈・溶解することにより調剤することができる。等張性および化学的安定性を増強するこのような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。
HTLV−1に感染していない健常人、もしくは、ATL患者ヘパリン加末梢血をHistopaque(シグマアルドリッチ)による比重遠心法を用いて単核球を遠心分離した。急性型ATL患者では、末梢血ATL分画が90%異常の検体を解析に用いた。また健常人のCD4陽性細胞はCD4+T細胞アイソレーションキットII(Miltenyi Biotec)によりCD4+T細胞以外の細胞をCD8、CD14、CD 16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRγ/σ、Glycophorin Aに対するビオチン標識抗体カクテルによりAuto MACS (Miltenyi Biotec)を用いて分離した。
実験に用いた細胞株は次の通りである。HTLV−1非感染T細胞リンパ性白血病(T−ALL)細胞株としてJurkat、MOLT4、MKB1、KAWAI、HTLV−1感染細胞株としてHUT102、MT2、IL2非依存性ATL細胞株Su9T-01、S1T、IL2依存性ATL細胞株KOB、KK1、SO4を、それぞれIL−2 (50 U/ml)添加もしくは無添加のfetal bovine serum (FBS)を10%添加したRPMI1640培養液で37℃、5%二酸化炭素下で培養した。
まず、細胞1 x 107個からトリアゾール溶解液 (インビトロジェン)を用いてtotal RNAを抽出し、total RNA 1 μgを用いてRNA PCR Kit ver3.1 AMV-RT (タカラバイオ)により逆転写反応を行い、cDNAを作製した。(MgCl2、10xRT buffer、dNTP mixture、RNase inhibitor、)AMV Reverse Transcriptase およびOligo dT-Adaptor primerとtotal RNAを混合し、1回反応サイクル(42℃、30分、95℃、5分)を行った。
SCYL2特異的プライマー(フォワード5’-AAGCGTGTCATTGTGCAGAG-3’(配列表の配列番号3)、リバース 5’-CCTGGATCTGAATGGAAGGA-3’(配列表の配列番号4))、β-actin特異的プライマー(フォワード 5’-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3’(配列表の配列番号5)、
リバース5’-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3’(配列表の配列番号6))、SYBR GREEN(R) PCR Master Mix(Applied biosystems)、鋳型cDNAを混合し、ABI PRISM(R) 7000 Sequence Detection SystemでPCR反応40サイクル(95度、10秒間、60度 60秒間)を行った。データは増幅曲線と閾値の交点からCt(Threshold Cycle)値を求めるCrossing Point法を用いて解析した。得られたCt値と標準サンプル(Jurkat細胞由来のcDNA)の段階希釈液を用いて作成した検量線に基づいてSCYL2 mRNAとβ-actin mRNAの発現量を算出し、それぞれの検体で、SCYL2遺伝子の発現量/β-actin遺伝子の発現量を算出し、基準となる検体の値で割る事で補正した。
細胞1 x 106個を回収後、リン酸緩衝生理食塩水 (10 mM リン酸緩衝液、 120 mM NaCl、 2.7 mM KCl、 pH 7.6 )(PBS)緩衝液で洗浄し、150μlの1x SDS サンプル緩衝液(62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)、 2% SDS、 10% グリセロール、 50 mM DTT、 0.01% ブロモフェノールブルー)を加え細胞を溶解した。95 度で5分間煮沸後、サンプルを10%ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド=36.5:1)電気泳動に供した。ミニプロテアン3セル (Bio-Rad)により定電圧100 V・2時間時間泳動した。ゲルはミニトランスブロットセル(Bio-Rad) (400 mA・3時間)を用いてPVDF 膜 (Millipore)に転写し、転写膜は1%ウシ血清アルブミン (BSA)添加トリス緩衝生理食塩水/Tween 20(TBS/T)緩衝液(150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、0.1% Tween20)により室温、2 時間ブロッキング反応を行なった。 Can Get signal(R) Solution1(TOYOBO)で2000倍希釈後の一次抗体液を用いて4度で一晩反応させ、TBS/T 緩衝液にて5分×3回洗浄した。さらに Can Get signal(R)
Solution2(TOYOBO)にて3000倍希釈後の二次抗体液にて室温で1時間反応させ、その後TBS/T緩衝液にて5分×3回洗浄した。洗浄後Lumi lightPLUS Western Blotting kit (Roche Applied Science)にて化学発光させ、ルミノイメージアナライザーLAS-3000 (Fujifilm)で画像解析を行った。
SCYL2 mRNA発現を定量的real time RT-PCR法により、健常人由来CD4陽性T細胞、及び急性型ATL患者由来T細胞、T-ALL細胞株4株(Jurkat、MOLT4、MKB-1、KAWAI)、HTLV-1+細胞株(HUT102、MT2)およびATL細胞株(ED-40515(-)、Su9T-01、S1T、KOB、KK1、SO4)を用いて定量した。同様に、SCYL2タンパク質発現を、同じ細胞について、ウェスタンブロッティング法で定量した。その結果、対照である健常人由来CD4陽性T細胞と比較して、急性型ATL患者由来T細胞において、SCYL2 mRNA発現増加(図1)およびSCYL2タンパク質発現の増加(図2)が認められた。さらに、T-ALL細胞株4株と比較してATL細胞株では発現量がやや増加傾向にあった(SCYL2mRNA発現につき図3およびSCYL2タンパク質発現につき図4)。なお、図中、p-PTEN(STT)は、p-PTEN (Ser380/Thr382/Thr383)を表わす。
実施例1と同様の方法で、健常人由来CD4陽性T細胞、急性型ATL患者由来ATL細胞、およびATL細胞株を用いてウエスタンブロット法によりPTEN、AKTタンパク質発現を解析した。対照である健常人由来CD4陽性T細胞と比較して、急性型ATL患者由来ATL細胞において、AKTおよびPTENタンパク質の発現の変化は認められなかったが、リン酸化AKT(Ser473)およびリン酸化PTEN(Ser380/Thr382/Thr383)の亢進が認められた(図2)。
SCYL2コード領域を増幅する為にフォワードプライマーとして、( EcoRI-SCYL2 5’-GGAATTCGATGGAGTCCATGCTTAATAAATTGAAG-3’)(配列表の配列番号10)、リバースプライマーとして、(XbaI-SCYL2 5’-GCTCTAGATCACCCAAAAAGATCTTTTAAATCATTG-3’)(配列表の配列番号11)を用いた。増幅はPrime star MAX DNA polymerase kit (TaKaRa)を使用しPCR40反応サイクル(98℃、10秒、60℃、10秒、72℃、2分)を行った。得られたPCR産物をpCMV26 (SIGMA)のEcoRIおよびXbaI部位に挿入しSCYL2遺伝子発現増加ベクターを作製した(pCMV26-SCYL2)。
293T細胞6ウェルプレートに対して2μgの発現ベクターを遺伝子導入試薬HilyMax(DOJINDO)で導入し2日間培養した。ATL細胞株KK1細胞2x106細胞数に対して2μgの発現ベクターをAmaxa Nucleofector(Amaxa)で導入し2日間培養した。
96well plateで2x103細胞数を培養し、所定時間にcell counting kit-8(DOJINDO)を添加し、490nmの吸光度を測定し細胞増殖能の解析を行った。
sh-SCYL2によりSCYL2発現が顕著に低下し、AKTおよびPTENタンパク質発現の変化は認められなかったが、phospho-AKT(Ser473) およびPhospho-PTEN(Ser380/Thr382/Thr383)の抑制が認められた(図6)。さらに、細胞増殖能の低下も認められた(図7)。
1.免疫沈降法
細胞を回収後、PBS緩衝液で洗浄し、1%NP-40緩衝液を加えて細胞を溶解させた。遠心後、100-200μgの細胞溶解液に1-2μgの抗体を加え4℃で一晩反応させた。50μlの50%slurry Protein G Sepharose TM4 fast flow(GE Healthcare)を加えて 4℃で2時間反応させた。Protein G Sepharose TM4 fast flowをPBSで3回洗浄しSDSサンプル緩衝液を加えて、95℃5分間煮沸し、ウエスタンブロット解析を行った。
pCMV26(SIGMA) に当該遺伝子を挿入し作製した。ベクターを293T細胞株に遺伝子導入し、2日後、1%NP-40緩衝液を加えて細胞を溶解させた。50%slurry Anti-Flag M2 affinity Gel (SIGMA) を加えて 4℃で一晩反応させた。3xFlagペプチド(SIGMA)でFlag融合タンパク質の溶出を行った。
293T細胞およびKK1細胞の内因性PTENをPTEN抗体で免疫沈降し、SCYL2抗体でウエスタンブロット法を行った。
さらに、Flag-SCYL2/293T安定発現株を用いてFlag抗体(マウス抗Flag M2モノクローナル抗体(F1804)(SIGMA ALDRICH))で免疫沈降し、AKTおよびPTEN抗体でウエスタンブロット法を行った。Flag(SCYL2)免疫沈降物にAKTおよびPTENの存在が認められた(図8)。
以上のことから、SCYL2-PTENおよびAKTが細胞内で結合していることが明らかとなった。
PTENが欠損しているPC3細胞株にSCYL2を過剰発現させた時のAKTリン酸化状態および結合をウエスタンブロット法および免疫沈降法で解析した。
PC3細胞株にFlag-SCYL2を発現させるとAKTタンパク質発現の変化は認められず、phospho-AKT(Ser473)の変化も認められなかった(図10)。一方、PTENを発現させるとphospho-AKT(Ser473)の低下が認められ、また、SCYL2およびPTENを同時に発現させるとPTEN単独に比べてphospho-AKT(Ser473)の亢進が認められた。さらに、PTENが存在しない時にはSCYL2はAKTと結合できないが、PTENが存在するとSCYL2はPTENおよびAKTと結合することが明らかとなった(図9)。
このことから、SCYL2はPTENとの結合を介してAKTリン酸化を調節することが示唆された。
1.GST(glutathione S-transferase)融合タンパク質の精製
pGEX-6P-1ベクターに当該遺伝子を挿入し作製した。ベクターを大腸菌BL21DE3に形質転換した後、37℃で培養した。30℃、3時間で1mM IPTGを添加することにより融合タンパク質を発現させた。大腸菌に1%NP-40緩衝液を加えて、超音波粉砕を行った。遠心後、上清を回収し50%slurry Glutathione Sepharose TM4 4B(GE Healthcare)を加えて 4℃で一晩反応させた。溶出緩衝液(20mM還元型グルタチオン、100nMTris-HCl (pH8.0)、120mM NaCl)でGST融合タンパク質の溶出を行った。
精製したGST-SCYL2タンパク質と293T細胞溶解液を混合し4℃で一晩反応させた。50%slurry Glutathione Sepharose TM4 4B(GE Healthcare)を加えて 4℃で2時間反応させた後、PBSで3回洗浄しSDSサンプル緩衝液を加えて、95℃5分間煮沸し、PTEN抗体でウエスタンブロット解析を行った。
キナーゼ溶液(25mM Tris-HCl(Ph8.0)、25mM β-glycerophosphate、25mM MgCl2)にGST-PTENタンパク質、Flag-SCYL2タンパク質および100μMのATPを添加し、37℃30分間反応させた。PTENリン酸化抗体でウエスタンブロットを行った。
1.安定発現細胞株の作製
293T細胞株およびU2OS細胞株に遺伝子導入後、培養液にG418(GIBCO)を500μg/miの濃度で添加し薬剤選択を行い、安定発現細胞株を得た。
Claims (9)
- インビトロにおいて、被験者由来の試料におけるSCYL2遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む、成人T細胞白血病の診断補助方法。
- 被験者由来の試料における前記SCYL2遺伝子の発現レベルが、正常対照のSCYL2遺伝子の発現レベルと比較して、増加していることにより、被験者が成人T細胞白血病に罹患していることまたは成人T細胞白血病発症のリスクを有することが示される、請求項1記載の成人T細胞白血病の診断補助方法。
- 前記SCYL2遺伝子の発現レベルの決定が、SCYL2遺伝子転写産物またはSCYL2タンパク質の発現レベルを決定することである、請求項1または2記載の診断補助方法。
- SCYL2遺伝子の阻害または遺伝子の発現の阻害を指標とする、成人T細胞白血病の予防薬、進展抑制薬、または治療薬のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む、請求項4記載の成人T細胞白血病の予防薬、進展抑制薬、または治療薬のスクリーニング方法;
a. 被験化合物存在下において、細胞のSCYL2遺伝子、SCYL2遺伝子転写産物またはSCYL2タンパク質の発現レベルを測定する工程、および
b. aで測定したSCYL2遺伝子、SCYL2遺伝子転写産物またはSCYL2タンパク質の発現レベルと、被験化合物非存在下における細胞のSCYL2遺伝子、SCYL2遺伝子転写産物またはSCYL2タンパク質の発現レベルを比較する工程。 - SCYL2遺伝子に特異的に結合する核酸、
SCYL2タンパク質に特異的に結合する抗体、又は、
配列表の配列番号7番に示されるペプチド、配列表の配列番号8番に示されるペプチド、又は配列表の配列番号9番に示されるペプチドに結合する抗体を含む、成人T細胞白血病の診断用キット。 - 前記SCYL2遺伝子に特異的に結合する核酸が、配列表の配列番号3番および配列表の配列番号4番に示す配列の核酸の組み合わせである、請求項6記載の成人T細胞白血病の診断用キット。
- SCYL2の機能を阻害する物質を有効成分とする、成人T細胞白血病(ATL)の予防薬、進展抑制薬又は治療薬であって、
該SCYL2の機能を阻害する物質が、SCYL2タンパク質に特異的に結合する抗体、またはSCYL2遺伝子の阻害性核酸である、成人T細胞白血病(ATL)の予防薬、進展抑制薬又は治療薬。 - 前記SCYL2遺伝子の阻害性核酸が、SCYL2遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、miRNA、shRNA又はsiRNAである請求項8に記載の成人T細胞白血病(ATL)の予防薬、進展抑制薬又は治療薬。
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