WO2014034798A1 - 癌の検出方法、診断薬および診断キット並びに癌治療用医薬組成物 - Google Patents

癌の検出方法、診断薬および診断キット並びに癌治療用医薬組成物 Download PDF

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WO2014034798A1
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ero1
cancer
protein
expression
cells
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保明 田村
和晴 久木田
良彦 廣橋
俊彦 鳥越
昇志 佐藤
五郎 九冨
敏充 梶原
田中 努
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北海道公立大学法人札幌医科大学
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    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • G01N33/57438Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
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    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407Specifically defined cancers
    • G01N33/57419Specifically defined cancers of colon

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting cancer using ERO1-L ⁇ protein expression as an index.
  • the present invention also relates to a diagnostic agent and diagnostic kit for cancer comprising a means for detecting ERO1-L ⁇ protein.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition for treating cancer comprising an ERO1-L ⁇ protein expression inhibitor.
  • Pancreatic cancer is known as a cancer with a poor prognosis and is one of cancers that are extremely difficult to treat. Characteristic symptoms and subjective symptoms are unlikely to appear, and many are often discovered after progress. Therefore, development of a technique for early detection is desired. Pancreatic cancer can be treated by surgical resection, but surgery is highly invasive. Therefore, establishment of an alternative method for surgical operation is desired.
  • colorectal cancer can be detected early by fecal occult blood test or the like, and is likely to be cured by surgery by early detection. Even if the disease recurs after surgery, it may be expected to be cured by early detection and early resection. However, if the discovery is delayed and metastasis that is difficult to remove occurs, anticancer drug treatment or radiotherapy is attempted. However, these treatments may not always be effective, and selection of treatment methods and evaluation of their effectiveness are extremely important. Therefore, it is desired to establish an index for selecting an optimal treatment method.
  • ERO1-L ⁇ Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1 Like ⁇
  • Non-patent Document 1 Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1 Like ⁇
  • Non-patent Document 2 Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1 Like ⁇
  • the ERO1-L ⁇ protein is known to catalyze the formation of disulfide bonds, and thus plays an essential role in protein folding (Non-Patent Document 2).
  • the specific relationship between ERO1-L ⁇ protein and cancer, particularly pancreatic cancer has not been clear.
  • An object of the present invention is to provide a cancer detection method, a diagnostic agent, and a diagnostic kit in which a sample can be easily obtained and measured.
  • the present invention further aims to provide a pharmaceutical composition for the treatment of cancer with reduced side effects.
  • ERO1-L ⁇ protein is expressed specifically in cancer cells, in particular, it is highly expressed in pancreatic cancer and colon cancer.
  • the inventors have also found that prognosis after surgery is poor in cancer patients with high expression of ERO1-L ⁇ protein.
  • the present inventors have found that the formation of cancer is suppressed when the ERO1-L ⁇ gene is knocked down in cancer cells in which ERO1-L ⁇ protein is highly expressed.
  • ERO1-L ⁇ protein known as an intracellular protein is unexpectedly secreted extracellularly. The present invention is based on these findings.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a method for detecting cancer comprising detecting ERO1-L ⁇ protein in a sample obtained from a subject, wherein the presence of ERO1-L ⁇ protein in the sample indicates that cancer in the subject A way to indicate existence.
  • the cancer is pancreatic cancer or colon cancer.
  • a diagnostic agent or diagnostic kit for cancer comprising a means for detecting ERO1-L ⁇ protein.
  • the diagnostic agent or diagnostic kit according to (5) above, wherein the cancer is pancreatic cancer or colon cancer.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising an ERO1-L ⁇ protein expression inhibitor.
  • the expression inhibitor of ERO1-L ⁇ protein is siRNA or shRNA against ERO1-L ⁇ .
  • the cancer detection method of the present invention is advantageous from the viewpoints of sample availability and ease of measurement because extracellular fluid such as blood and body fluid can be used as a sample.
  • the cancer detection method of the present invention is also advantageous in that it provides suggestions regarding the effectiveness of cancer treatment methods. Since the ERO1-L ⁇ protein targeted by the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention exhibits high expression only in cancer cells, the pharmaceutical composition of the present invention is advantageous from the viewpoint of reducing side effects.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of confirming the expression of ERO1-L ⁇ and ⁇ by PCR using a commercially available cDNA library prepared from normal human tissue.
  • FIG. 2 is a view showing the results of confirming the expression of ERO1-L ⁇ and ⁇ by RT-PCR using mRNA obtained by extraction from a cancer cell line.
  • FIG. 3 is an immunohistochemically stained image showing the expression of ERO1-L ⁇ protein in a section of pancreatic tissue of a cancer patient.
  • FIG. 4 is an immunohistochemical staining image showing the expression of ERO1-L ⁇ protein in various tissue sections.
  • FIG. 4A shows normal pancreatic tissue
  • FIG. 4B shows normal small intestine tissue
  • FIG. 4C shows ERO1-L ⁇ protein expression in tissue sections of normal rectal tissue and rectal cancer tissue.
  • FIG. 5 shows the results of confirming the expression of ERO1-L ⁇ protein in each tissue by Western blotting.
  • FIG. 6 shows the result of Western blot showing the result of shRNA knockdown of ERO1-L ⁇ gene expression.
  • FIG. 7 is a graph showing that tumor formation ability decreases when the expression of ERO1-L ⁇ gene is decreased.
  • FIG. 7A is a diagram showing that Panc1 cells in which the expression of ERO1-L ⁇ gene is reduced cannot form cancer in the body of nude mice.
  • FIG. 7B is a view showing a decrease in tumor-forming ability when mouse breast cancer cells 4T1 cells with reduced ERO1-L ⁇ gene expression were introduced into BALB / c female mice (WT: knockdown treatment was not performed).
  • FIG. 8 is a view showing a decrease in the expression level of MHC class I molecules in a knockdown clone of ERO1-L ⁇ protein.
  • FIG. 9 shows a decrease in the response to specific cytotoxic T cells (FIG. 9A) and the number of metastases to the lung (FIG.
  • FIG. 10 is a graph showing the distribution of the expression level of ERO1-L ⁇ protein in cancer patients.
  • FIG. 11 is a graph showing the relationship between the expression level of ERO1-L ⁇ protein in cancer patients and the risk of cancer recurrence.
  • FIG. 12 is a graph showing survival curves of cancer patients with high and low ERO1-L ⁇ expression.
  • FIG. 12A shows a survival curve in pancreatic cancer patients, FIG.
  • FIG. 12B shows disease-free survival in breast cancer patients
  • FIG. 12C shows overall survival in breast cancer patients.
  • FIG. 13 shows that colon cancer cells SW480 cells in which myc-tagged ERO1-L ⁇ protein is forcibly expressed secrete ERO1-L ⁇ protein into the culture supernatant.
  • ERO1-L ⁇ protein obtained by immunoprecipitation of the culture supernatant with myc antibody was detected by Western blotting.
  • FIG. 13B the culture supernatant was obtained by immunoprecipitation with anti-ERO1-L ⁇ antibody.
  • the ERO1-L ⁇ protein was detected by Western blotting.
  • FIG. 13C is a diagram showing the results of ELISA quantification of ERO1-L ⁇ protein in the culture supernatant of various cells.
  • FIG. 14 is a diagram showing the concentration of ERO1-L ⁇ protein in the serum of cancer patients.
  • FIG. 14B is a diagram showing a result when the progressive digestive cancer patient shown in FIG. 14A is divided into a pancreatic cancer patient and a colon cancer patient.
  • FIG. 15 is a diagram showing that the expression of ERO1-L ⁇ protein is associated with the secretion amount of VEGF-A (Scr: 4T1 cell introduced with scrambled shRNA as a negative control, KD: knocking down ERO1-L ⁇ gene) 4T1 cells).
  • FIG. 16 shows that ERO1-L ⁇ protein is particularly strongly expressed in cancer stem cells.
  • the detection method of the present invention is a method for determining whether or not cancer exists in a subject using the presence of ERO1-L ⁇ protein as an index.
  • the detection method of the present invention it can be determined that cancer exists in the subject, but whether or not the subject is a cancer patient is determined by the judgment of a doctor or the like. Therefore, the detection method of the present invention can be used as a method for assisting diagnosis of cancer. That is, according to the present invention, there is provided a method for detecting ERO1-L ⁇ protein for diagnosis of cancer, comprising detecting ERO1-L ⁇ protein in a sample obtained from a subject, A method is provided wherein the presence of the ERO1-L ⁇ protein indicates the presence of cancer in the subject.
  • cancer cells can be detected by the detection method of the present invention. That is, according to the present invention, there is provided a method for detecting cancer cells comprising detecting ERO1-L ⁇ protein in a sample obtained from a subject, wherein the presence of ERO1-L ⁇ protein in the sample comprises A method of detecting cancer cells is provided that indicates the presence of cancer cells in a subject.
  • ERO1-L ⁇ protein is a protein expressed in cells and detected in cancer tissues.
  • ERO1-L ⁇ protein is extracellularly detected from cancers that express ERO1-L ⁇ protein. Secreted into the body. Therefore, in the detection method of the present invention, ERO1-L ⁇ protein can be detected with the extracellular fluid obtained from the subject. That is, in the present invention, the sample to be detected may be a cancer tissue, a tissue suspected of being cancer, or an extracellular fluid obtained from a subject.
  • extracellular fluid means body fluids such as blood, lymph fluid, and tissue fluid, and the body fluid accumulated in the body cavity is also included in the extracellular fluid.
  • a liquid component of blood such as serum or plasma may be used instead of blood. Therefore, “blood” includes liquid components of blood such as serum and plasma.
  • the ERO1-L ⁇ protein that serves as an index for the detection method of the present invention is an intracellular protein and oxidizes protein disulfide isomerase (PDI). PDI is activated by oxidation and forms a disulfide bond in a target protein, thereby being involved in protein folding and quality control (Non-Patent Document 2).
  • the amino acid sequence of the ERO1-L ⁇ protein and the base sequence of the ERO1-L ⁇ gene are well known.
  • the base sequence and amino acid sequence of human ERO1-L ⁇ (hERO1-L ⁇ ) are as shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively. is there.
  • ERO1-L ⁇ protein is highly expressed in breast cancer, colon cancer (rectal cancer and colon cancer) and pancreatic cancer, and is particularly highly expressed in colon cancer (rectal cancer and colon cancer) and pancreatic cancer.
  • the cancer to be detected, diagnosed and treated is a cancer that expresses ERO1-L ⁇ protein, more preferably a cancer that highly expresses ERO1-L ⁇ protein such as breast cancer, pancreatic cancer and colon cancer, More preferred are pancreatic cancer and colon cancer.
  • ERO1-L ⁇ protein is secreted from cancers that highly express ERO1-L ⁇ protein such as colorectal cancer (rectal cancer and colon cancer) and pancreatic cancer.
  • the cancer to be detected by the detection method of the present invention is not particularly limited, but cancer that expresses ERO1-L ⁇ protein, more preferably cancer that highly expresses ERO1-L ⁇ protein, such as breast cancer, colon cancer, and pancreas Solid cancer such as cancer, more preferably pancreatic cancer.
  • the ERO1-L ⁇ protein is secreted extracellularly and mixed in the extracellular fluid, but it may be metabolized or decomposed in the extracellular fluid while circulating in the body. Therefore, in the detection method of the present invention, when ERO1-L ⁇ protein is detected in the extracellular fluid, a metabolite and / or degradation product (for example, a fragment of ERO1-L ⁇ protein) of ERO1-L ⁇ protein is removed from the cell. It may be detected as a secreted ERO1-L ⁇ protein.
  • the subject to be subjected to the detection method of the present invention is a mammal, preferably a primate, more preferably a human.
  • the subject does not necessarily need to be a subject suspected of having cancer, but is preferably a subject suspected of having cancer (eg, human), for example, suspected to be breast cancer, pancreatic cancer or colon cancer. More preferably, it is a subject (eg, human), and more preferably a subject (eg, human) suspected of having pancreatic cancer.
  • the detection method of the present invention indicates the presence of a cancer with a poor prognosis and the presence of a cancer that is sensitive to a treatment that inhibits the expression and / or function of the ERO1-L ⁇ gene. May be a subject diagnosed with cancer (eg, a cancer patient). When a subject suspected of having cancer or a subject diagnosed with cancer is targeted, the sample to be measured may be an extracellular fluid, or a tissue suspected of having cancer or a cancer tissue. .
  • ERO1-L ⁇ protein As shown in Examples below, patients with cancers that express ERO1-L ⁇ protein have a poorer prognosis after treatment than patients with cancers that do not express ERO1-L ⁇ protein. Specifically, having a cancer that expresses ERO1-L ⁇ protein increases the risk of cancer recurrence, such as shortening the time to recurrence in patients after surgical treatment or increasing the recurrence rate. Therefore, in the detection method of the present invention, when ERO1-L ⁇ protein is detected in the sample of the subject, it is indicated that cancer with a poor prognosis exists.
  • the detection method of the present invention when the detection method of the present invention is applied to a subject diagnosed with cancer, if ERO1-L ⁇ protein is detected in the sample of the subject, it indicates that the cancer is a cancer with a poor prognosis. .
  • the ERO1-L ⁇ gene was knocked down in cancer, cancer metastasis decreased. Therefore, according to the present invention, when ERO1-L ⁇ protein is detected in a sample of a subject, it can be shown that the cancer is metastatic.
  • the expression level of the ERO1-L ⁇ protein in the sample of the subject is higher than the expression level of the ERO1-L ⁇ protein in the sample of a healthy subject or a patient with a good prognosis. If so, it indicates that there is a cancer with a poor prognosis.
  • the presence of the ERO1-L ⁇ protein in the sample of the subject indicates the presence of a cancer that expresses the ERO1-L ⁇ protein.
  • cancers that express ERO1-L ⁇ protein are sensitive to therapies targeting ERO1-L ⁇ protein, such as suppression of ERO1-L ⁇ protein expression. Therefore, in the detection method of the present invention, when ERO1-L ⁇ protein is detected in the sample of the subject, it is indicated that there is a cancer sensitive to the treatment targeting ERO1-L ⁇ protein. .
  • the detection method of the present invention is performed on a subject diagnosed with cancer, and ERO1-L ⁇ protein is detected in the sample of the subject, the cancer is treated against treatment targeting ERO1-L ⁇ protein. It is shown that the cancer is sensitive.
  • the treatment targeting ERO1-L ⁇ protein is not particularly limited.
  • it suppresses the expression of ERO1-L ⁇ protein or inhibits the activity of ERO1-L ⁇ protein. It means treatment performed by suppressing the action of ERO1-L ⁇ protein in cancer cells.
  • ERO1-L ⁇ protein by detecting ERO1-L ⁇ protein in a sample of a subject, whether the subject has cancer, whether the prognosis of cancer treatment is good, It can be determined whether the cancer is sensitive to treatment targeting the ERO1-L ⁇ protein.
  • ERO1-L ⁇ protein in a sample of a subject is not limited as long as ERO1-L ⁇ protein can be detected.
  • an antibody against ERO1-L ⁇ protein ( Anti-ERO1-L ⁇ protein antibody) is preferably used.
  • a method for detecting a protein using an antibody is not particularly limited, and methods well known to those skilled in the art such as Enzyme-Linked Immuno Immunosorbent Assay (ELISA) can be mentioned, and ELISA is also used as a diagnostic agent.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of high antigen specificity.
  • a diagnostic agent for cancer and a diagnostic kit comprising means for detecting ERO1-L ⁇ protein are provided.
  • the diagnostic agent and diagnostic kit of the present invention can be carried out according to the description relating to the detection method of the present invention. That is, the means for detecting ERO1-L ⁇ protein is not limited as long as it is an appropriate material capable of detecting ERO1-L ⁇ protein (an agent for detecting ERO1-L ⁇ protein), but as described above, anti-ERO1-L ⁇ protein antibody Can be used.
  • the diagnostic kit of the present invention may be a diagnostic kit for testing an extracellular fluid (for example, blood).
  • a device for collecting extracellular fluid (for example, blood) and / or A container may be included.
  • the diagnostic agent or diagnostic kit of the present invention may be a diagnostic agent or diagnostic kit for diagnosing cancer tissue collected from a patient from the viewpoint of improving the accuracy of diagnosis. preferable.
  • the expression of ERO1-L ⁇ protein in the cancer tissue is higher than that in the normal tissue, it can be suspected that the cancer has a poor prognosis and / or the cancer is ERO1 It can be determined that there is a high probability of being sensitive to treatment targeting the L ⁇ protein.
  • the diagnostic agent or diagnostic kit of the present invention can also be used as a companion diagnostic agent or diagnostic kit for predicting the effectiveness of a drug or therapeutic method that inhibits the expression and / or function of ERO1-L ⁇ protein.
  • the cancer to be diagnosed by the diagnostic agent and diagnostic kit of the present invention is not particularly limited, but cancer, preferably cancer expressing ERO1-L ⁇ protein, more preferably ERO1-L ⁇ protein such as pancreatic cancer and colon cancer Is a solid cancer that highly expresses, more preferably pancreatic cancer.
  • the detection method of the present invention may be performed using the diagnostic agent or diagnostic kit of the present invention. That is, according to the present invention, there is provided the detection method of the present invention, comprising detecting ERO1-L ⁇ protein in a sample obtained from a subject using the diagnostic agent or diagnostic kit of the present invention.
  • cancer expressing ERO1-L ⁇ protein for use in the treatment of cancer, preferably cancer expressing ERO1-L ⁇ protein, more preferably cancer expressing ERO1-L ⁇ protein such as breast cancer, pancreatic cancer and colon cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising an ERO1-L ⁇ protein expression inhibitor is provided.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an ERO1-L ⁇ protein expression inhibitor for suppressing cancer metastasis (eg, cancer metastasis to the lung). Furthermore, according to Examples described later, ERO1-L ⁇ protein was highly expressed in cancer stem cells. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be for cancer stem cells.
  • cancer metastasis eg, cancer metastasis to the lung.
  • ERO1-L ⁇ protein was highly expressed in cancer stem cells. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be for cancer stem cells.
  • the ERO1-L ⁇ protein expression inhibitor is not particularly limited, and examples thereof include shRNA and siRNA targeting the ERO1-L ⁇ gene.
  • the siRNA is a double-stranded RNA (nucleic acid) capable of inducing RNA interference (RNAi), and is not particularly limited, but is a double-stranded RNA consisting of 20 to 30 bp, preferably 21 to 23 bp, 25 bp, and 27 bp. Thus, it is a double-stranded RNA having a sequence homologous to the sequence of the target gene.
  • RNAi RNA interference
  • siRNA obtained by annealing nucleic acids having the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 13 and 14 can be used as siRNA.
  • nucleic acids having two Ts at the 3 ′ end were used as the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 13 and 14, but these two Ts were used by replacing one or both of them with U. Also good.
  • ShRNA is RNA that can be degraded by Dicer in vivo to generate siRNA.
  • the shRNA has a stem-loop structure including a double-stranded stem and a hairpin loop.
  • the sequence of the hairpin loop portion is not particularly limited, but can be a sequence of 5 to 12 bases (Kawasaki H. et. Al., Nucleic Acid Res. (2003) 31: 700-707, Paddison P. J. et. al., Genes and Dev. (2002) 16: 948-958, Lee N. S., Nat. Biotech. (2002) 20: 500-505 and Sui G., Proc. Natl. Acad. Sci. U S. A. (2002) 99: 5515-5520).
  • shRNA can be designed and produced based on the gene sequence of ERO1-L ⁇ by a method well known to those skilled in the art. Although it does not specifically limit in this invention, for example, shRNA of sequence number 11 or 12 used in the Example can be used as shRNA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain excipients, adjuvants and / or additives.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain one or more other anticancer agents.
  • a therapeutically effective amount of an ERO1-L ⁇ gene expression inhibitor is also applied to a mammal (eg, a human) in need thereof, eg, a mammal having a cancer that expresses an ERO1-L ⁇ protein (eg, There is provided a method of treating cancer comprising administering to a human.
  • the cancer treatment method of the present invention can be performed by inhibiting the expression or function of the ERO1-L ⁇ gene in a mammal (eg, human) having a cancer that expresses the ERO1-L ⁇ protein. Therefore, the cancer treatment method of the present invention is preferably performed after identifying a mammal (for example, human) expressing ERO1-L ⁇ protein based on the detection method of the present invention. Therefore, the cancer treatment method of the present invention determines whether or not ERO1-L ⁇ protein is present in a mammal (eg, human) sample, and diagnoses cancer using the presence of ERO1-L ⁇ protein as an index. And a therapeutically effective amount of an ERO1-L ⁇ gene expression inhibitor to the mammal.
  • a mammal eg, human
  • Example 1 Tissue specificity of ERO1-L ⁇ gene expression
  • the expression of ERO1-L ⁇ gene in various human tissues was confirmed.
  • the cDNA of each human tissue the cDNA of multiple issue cDNA panels purchased from BD Biosciences was used, and the expression of the ERO1-L ⁇ gene in normal tissues was confirmed by PCR.
  • PCR uses 5′-GCCCGTTTTATGCTTGATGT-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-AACTGGGTATGGTGGCAGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 6) as a primer for detection of ERO1-L ⁇ , and a primer for detection of ERO1-L ⁇ .
  • PCR reaction 50 ⁇ L of a PCR reaction solution containing 1 ⁇ L of cDNA, 50 pmol of each primer and KOD Plus DNA polymerase (manufactured by TOYOBO) was heated at 92 ° C. for 2 minutes, then 92 ° C. for 1 minute, 62 ° C. for 1 minute, and 30 cycles at 72 ° C. for 1 minute were performed.
  • PCR products were subjected to ethidium bromide staining after 1% agarose gel electrophoresis and detected with UV light.
  • the base sequence of the PCR product was determined using ABI Genetic analyzer PRISM 310 and Amplicycle sequencing kit (Perkin Elmer).
  • ERO1-L ⁇ was expressed in normal tissues such as lymphocytes, liver, spleen, pancreas and testis, but ERO1-L ⁇ was hardly expressed in normal tissues (FIG. 1). ).
  • Human pancreatic cancer cell lines, Panc1, HPAF2, HPAC and BxPC3 were purchased from ATCC.
  • human leukemia cell line T2A24 (purchased from ATCC), human breast cancer cell line MCF7 (purchased from ATCC), human lung adenocarcinoma cell line LHK2 (lung cancer cell line established at Sapporo Medical University), human colon cancer cell Strain HCT15 (purchased from ATCC), human colon cancer cell line SW480 (purchased from ATCC), human kidney cancer cell line Caki1 (purchased from ATCC), human breast cancer cell line HMC1 (purchased from ATCC) and human kidney cancer
  • ERO1-L ⁇ in various cancer cell lines was confirmed using a cell line SMKTR (a kidney cancer cell line established at Sapporo Medical University).
  • ERO1-L ⁇ was relatively highly expressed in HCT15 cells, SW480 cells, Caki1 cells, HPAF2 cells, HPAC cells, and BxPC3 cells (FIG. 2).
  • ERO1-L ⁇ was hardly expressed in normal tissues, but was expressed in cancer cell lines.
  • Example 2 Expression of ERO1-L ⁇ gene in cancer tissue
  • the expression of ERO1-L ⁇ gene in cancer tissue was confirmed by immunostaining of tissue sections.
  • ERO1-L ⁇ The expression of ERO1-L ⁇ in various tissues of human cancer patients was examined.
  • tissues breast cancer tissue specimens, stomach cancer tissue specimens, colorectal cancer tissues and pancreatic cancer tissues were used.
  • the tissue was fixed with 10% formalin, embedded in paraffin, and then made into a tissue section having a thickness of 20 ⁇ m using a microtome. Thereafter, the tissue sections were deparaffinized and autoclaved at 121 ° C. for 10 minutes.
  • anti-ERO1-L ⁇ antibody (Abnova, product number: H00030001-M01), peroxidase-conjugated sheep anti-mouse antibody (DAKO, product number: K4000) and DAB (product of DAKO, product number) as secondary antibodies
  • DAKO peroxidase-conjugated sheep anti-mouse antibody
  • DAB product of DAKO, product number
  • ERO1-L ⁇ protein in each cancer tissue was evaluated based on the above-mentioned index, and the relationship between the expression level of ERO1-L ⁇ protein and the type of cancer was examined. The result was as shown in Table 1. .
  • ERO1-L ⁇ showed high expression in colorectal cancer and pancreatic cancer, and in particular, about 86% of specimens showed high expression of (++) or (++++) in pancreatic cancer. .
  • most of the breast cancer and gastric cancer remained at the expression level of ( ⁇ ) or (+). This revealed that ERO1-L ⁇ expression is characteristic of pancreatic cancer and colorectal cancer (colon cancer).
  • ERO1-L ⁇ was also highly expressed in some breast and stomach cancers (Table 1).
  • Example 3 Expression of ERO1-L ⁇ gene in normal pancreatic tissue
  • the expression of ERO1-L ⁇ in normal pancreatic tissue was confirmed by immunohistochemical staining and Western blotting.
  • ERO1-L ⁇ was not observed in normal human pancreas and small intestine (FIGS. 4A and B).
  • expression of ERO1-L ⁇ protein was not observed in normal colon, but high expression of ERO1-L ⁇ protein was observed in colon cancer tissue (FIG. 4C).
  • ERO1-L ⁇ protein in human pancreas, stomach and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) was confirmed by Western blotting.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • 293T cells expressing myc-tagged ERO1-L ⁇ SEQ ID NOs: 3 and 4 were used.
  • This cell line expresses an 80% confluent 293T cell (purchased from ATCC) by inserting a gene in which the myc gene is linked in-frame to the 5 ′ end of the human ERO1-L ⁇ gene (expressing a puromycin resistance gene) ) was transfected according to the manufacturer's manual using Lipofectamine 2000 Reagent (manufactured by Invitrogen), and 2 ⁇ g / mL puromycin (manufactured by Sigma-Aldrich) was added 48 hours later to establish a stable clone.
  • KG-1 cells (purchased from ATCC) are cell lines known as human acute myeloid leukemia cells, and KG-1 / H-2K b cells have been added to the KG-1 cells by the inventors. is an MHC class I molecule H-2K b gene was established by introducing cell line.
  • the protein-transferred PVDF membrane is blocked with a blocking buffer (PBS containing 5% nonfat dry milk) at room temperature for 1 hour, and then rabbit anti-ERO1-L ⁇ monoclonal antibody (Abnova) or mouse anti- ⁇ -actin monoclonal antibody AC Incubated for 60 minutes with -15 (Sigma Aldrich). Thereafter, the PVDF membrane was washed three times with a washing buffer (PBS containing 0.1% Tween-20), and incubated for 2 hours using a peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG antibody (manufactured by KPL). Finally, the signal was detected according to the manufacturer's manual using an enhanced chemistry (ECL) detection system (Amersham Life Science).
  • ECL enhanced chemistry
  • ERO1-L ⁇ protein was not observed in any of the pancreas, stomach and PBMC (FIG. 5).
  • high expression of ERO1-L ⁇ protein was observed in 293T cells expressing ERO1-L ⁇ having a myc tag used as a positive control (FIG. 5).
  • ERO1-L ⁇ protein could not be confirmed in normal tissues, either by immunohistochemical staining on tissue sections or by Western blotting using total protein extracted from tissues.
  • ERO1-L ⁇ protein showed high expression in human cancer patient tissues (especially pancreas and colorectal colon), but normal tissues (especially pancreas, stomach, small intestine and many others) It was clarified that almost no expression was observed in the tissue).
  • Example 4A Relationship between knockdown of ERO1-L ⁇ gene and tumor formation
  • ERO1-L ⁇ protein shows high expression only in cancer tissues (particularly pancreas and colorectal colon), and in normal tissues that are not cancer. The expression of was not observed.
  • a knockdown experiment of ERO1-L ⁇ gene was performed using a cancer model mouse.
  • DNA that transcribes shRNA for ERO1-L ⁇ gene knockdown having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 or 12 was inserted into the restriction enzyme sites of BamHI and EcoRI of RNAi-Ready pSIREN-RetroQ vector (manufactured by Invitrogen). Specifically, a BamHI restriction enzyme cleavage sequence consisting of gatcc is linked to the 5 ′ end of a single-stranded DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 11 or 12, and a terminator consisting of ttttttctagag and an EcoRI restriction enzyme are connected to the 3 ′ end.
  • a single-stranded DNA obtained by ligating the cleaved sequence and a single-stranded DNA having a complementary sequence thereto are heated at 100 ° C. for 20 minutes, and then annealed while returning to room temperature.
  • the RNAi-Ready pSIREN-RetroQ vector manufactured by Invitrogen
  • These shRNA expression vectors were transfected into 80% confluent Panc1 cells using Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's manual, and after 48 hours, 2 ⁇ g / mL puromycin (Sigma Aldrich) was added. A stable clone was established.
  • sh1-3 is a clone in which the ERO1-L ⁇ gene was knocked down using an shRNA expression vector incorporating the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and sh3-4 and sh3-6 incorporated the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • sh3-4 and sh3-6 incorporated the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • Western blotting was performed according to the method described in Example 3.
  • mice injected with panc1 cells or control shRNA clones formed tumors, but the ERO1-L ⁇ knockdown clones sh1-3 and sh3-4 showed little tumorigenicity (Fig. 7A).
  • Example 4B Relationship between knockdown of ERO1-L ⁇ gene and tumor formation
  • BALB / c female mice were used, and 4T1 mouse breast cancer cells were transplanted into the mammary gland under the same conditions as in Example 4A. The effect of knocking down the L ⁇ gene was confirmed.
  • mice 5-6 week old BALB / c female mice were purchased from Jackson Laboratory, bred in a specific pathogen-free facility, and used for experiments at 6 weeks of age. Five mice were used per group, and mice were injected with 1 ⁇ 10 5 4T1 cells or ERO1-L ⁇ gene knockdown cells into the right mammary gland. 4T1 cells were purchased from ATCC and cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FCS.
  • the ERO1-L ⁇ gene knockdown clone uses Lipo-fectamine RNAi / Max (Life technologies) as a shRNA retroviral vector (OriGene, TR502816) for knocking down the ERO1-L ⁇ gene in 4T1 cells. Was introduced and established. Cells were cultured for at least 3 days under hypoxic conditions (1% O 2 , 5% CO 2 and 94% N 2 ).
  • the size of the tumor was measured, and the average tumor diameter on day 42 was statistically analyzed by Mann-Whitney U test. On day 42, the number of lung metastases was also measured.
  • mice As a result, in comparison with untreated 4T1 cells (WT) and 4T1 cells (SCR) into which control shRNA had been introduced, tumor cells proliferated in mice (KD) into which the ERO1-L ⁇ gene knockdown clone had been introduced. Was significantly reduced (FIG. 7B).
  • mice As a result of measuring the number of metastases to the lung, as compared with untreated 4T1 cells (WT) and 4T1 cells into which control shRNA had been introduced (SCR), mice into which a knockdown clone of the ERO1-L ⁇ gene was introduced (K. D.) markedly reduced tumor cell metastasis to the lung (FIG. 9B). From these results, it was shown that an ERO1-L ⁇ gene expression inhibitor can be used for tumor treatment, and that the ERO1-L ⁇ gene can be used to predict metastasis of tumor patients.
  • Example 4B it was confirmed that the growth of the tumor can be reduced by knocking down the ERO1-L ⁇ gene as in Example 4A.
  • the results of Example 4B also revealed that the ERO1-L ⁇ gene is related to tumor metastasis.
  • Example 5 Prognosis and ERO1-L ⁇ protein expression in colorectal cancer patients
  • Example 4 it was shown that the expression of ERO1-L ⁇ protein plays an important role in tumorigenesis. Therefore, in this example, the relationship between the expression of ERO1-L ⁇ protein and the prognosis in actual colorectal cancer patients was examined.
  • ERO1-L ⁇ protein was confirmed by immunohistochemical staining in 85 colorectal cancer patients operated at Sapporo Medical University between 2005 and 2008.
  • the tissue to be evaluated was a colorectal cancer tissue obtained from each cancer patient.
  • the tissue was fixed with 10% formalin and embedded in paraffin, and then a tissue section having a thickness of 20 ⁇ m was prepared using a microtome. After deparaffinization and autoclaving at 121 ° C.
  • anti-ERO1-L ⁇ antibody manufactured by Abnova, product number: H00030001-M01
  • peroxidase-conjugated sheep anti-mouse antibody DAKO
  • Product number: K4000 and DAB manufactured by DAKO, product number K3468
  • ERO1-L ⁇ protein in each tissue was evaluated in four stages. That is, a score of 0 indicates that ERO1-L ⁇ is hardly expressed, a score of 1 indicates a slight expression, a score of 2 indicates a partially high expression, and a score of 3 indicates a high expression as a whole. (FIG. 10).
  • each patient was examined for the period until recurrence of colorectal cancer, and correlated with the expression of ERO1-L ⁇ protein.
  • the period until recurrence was significantly shorter than in the patient group (score 0-2) in which ERO1-L ⁇ protein expression was low (Fig. 3). 11).
  • the period until relapse is 2.35 years on average in the patient group (score 3) overexpressing ERO1-L ⁇ protein, and the expression of ERO1-L ⁇ protein is low It was about 80% of the duration of the patient group (score 0-2).
  • the relapse-free survival rate is 67. 7 in the patient group (score 3) overexpressing the ERO1-L ⁇ protein compared to the patient group (score 0-2) in which the expression of the ERO1-L ⁇ protein is low. It was reduced to 86%.
  • ERO1-L ⁇ protein is related to the recurrence rate of colon cancer and the period until recurrence, and the recurrence rate of colon cancer and the period until recurrence are evaluated by examining the expression level of ERO1-L ⁇ protein. It was shown that it is possible.
  • Example 6A Secretion of ERO1-L ⁇ protein outside the cell Furthermore, the present inventors discovered that the ERO1-L ⁇ protein is secreted outside the cell.
  • a pIRES-puro expression vector into which an ERO1-L ⁇ gene with a myc tag was introduced was prepared.
  • the obtained expression vector was transfected into colorectal cancer cell line SW480 cells using Lipofectamine 2000 Reagent (manufactured by Invitrogen) according to the manufacturer's manual, and the cell culture supernatant was collected 48 hours later.
  • ERO1-L ⁇ protein in the obtained culture supernatant was immunoprecipitated using an anti-myc antibody, and then the presence of the ERO1-L ⁇ gene was confirmed by Western blotting.
  • SW480 cells introduced with the ERO1-L ⁇ gene and 293T expressing the ERO1-L ⁇ gene were used, and these cell lysates were obtained using the method described in Example 3.
  • FIG. 13A A further test was conducted. Specifically, a culture supernatant of SW480 cells overexpressing SW480 cells and ERO1-L ⁇ was obtained, immunoprecipitated with anti-ERO1-L ⁇ antibody, and then cultured by Western blot using anti-ERO1-L ⁇ antibody. The presence or absence of secretion of ERO1-L ⁇ to Qing was confirmed. Then, it was confirmed that SW480 cells overexpressing ERO1-L ⁇ secreted ERO1-L ⁇ protein into the cell culture supernatant (FIG. 13B). The same was true for pancl cells (Fig. 13C).
  • ERO1-L ⁇ protein-expressing cancer can be estimated by examining the presence of ERO1-L ⁇ protein in the extracellular fluid obtained from the subject.
  • Example 6B Detection of ERO1-L ⁇ in patient serum
  • Example 6A showed that ERO1-L ⁇ is secreted extracellularly.
  • ERO1-L ⁇ was detected using serum from cancer patients.
  • ERO1-L ⁇ in serum obtained from 16 patients with advanced gastrointestinal cancer and 5 healthy subjects was detected by ELISA.
  • the ELISA used a sandwich method, and ERO1-L ⁇ was adsorbed to the support with an anti-ERO1-L ⁇ monoclonal antibody and detected with an anti-ERO1-L ⁇ rabbit polyclonal antibody.
  • Example 7 Relationship between ERO1-L ⁇ and VEGF-A Production
  • the amount of VEGF-A produced from mouse breast cancer cell 4T1 and the knockdown clone of ERO1-L ⁇ gene obtained in Example 7 Were measured and compared.
  • ERO1-L ⁇ is thought to be involved in the production of VEGF-A in tumors.
  • VEGF-A is involved in angiogenesis in tumors, it forms a homodimer having an intramolecular disulfide bond, and the intramolecular disulfide bond is important for VEGF-A to properly fold and function.
  • ERO1-L ⁇ is involved in tumor growth, but in this example, ERO1-L ⁇ is also involved in the production of VEGF-A. This suggested that ERO1-L ⁇ may ultimately be involved in angiogenesis in tumors.
  • Example 8 Expression of ERO1-L ⁇ in cancer stem cells
  • cancer stem cells and non-cancer stem cells were fractionated by the side population method to compare the expression of ERO1-L ⁇ .
  • Hoechst 33342 fluorescent dye (Lonza) staining was performed using human colon cancer cell line SW480. Then, using verapamil (50 ⁇ mol / L, manufactured by Sigma-Aldrich), which is an ABCG-2 transporter inhibitor, measured for 30 minutes at 37 ° C. and not treated using a flow cytometer, A comparative study was conducted. The cell fraction that disappeared after verapamil treatment was taken as a side population (SP), and the other fractions were taken as the main population (MP), and were collected using a flow cytometer. In this example, the SP fraction was used as a cancer stem cell fraction, and the MP fraction was used as a non-cancer stem cell fraction.
  • SP side population
  • MP main population
  • ERO1-L ⁇ protein expressed in each cell was detected by Western blotting using an anti-ERO1-L ⁇ antibody. Then, as shown in FIG. 16, ERO1-L ⁇ was expressed more in the cancer stem cell fraction.

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Abstract

[課題]本発明は、サンプルの入手や測定が容易な癌の検出方法の提供を目的とする。 [解決手段]本発明は、被検体から得られた試料中のERO1-Lαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の検出方法であって、試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す方法である。

Description

癌の検出方法、診断薬および診断キット並びに癌治療用医薬組成物 関連出願の参照
 本願は、先行する日本国特許出願である特願2012-189224(出願日:2012年8月29日)の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
 本発明は、ERO1-Lαタンパク質の発現を指標にした癌の検出方法に関する。本発明はまた、ERO1-Lαタンパク質の検出手段を含んでなる癌の診断薬および診断キットに関する。本発明はさらに、ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる癌治療用医薬組成物に関する。
 膵臓癌は、予後不良な癌として知られ、極めて治療が困難な癌の一つである。特徴的な症状や自覚症状が現れにくく、多くは進行が進んでから発見されることが多い。従って、早期に発見するための手法の開発が望まれる。また、膵臓癌は、外科的切除により治療が試みられるが手術は侵襲性が高い。従って、外科的手術の代替法の確立が望まれる。
 また、大腸癌は、便潜血検査などにより早期発見が可能であり、早期発見により手術により根治ができる可能性の高い癌である。手術後に再発した場合も、早期発見と早期の切除により根治が期待できる場合がある。しかし、発見が遅れ、切除困難な転移が起こった場合には、抗癌剤治療または放射線治療などが試みられる。しかし、これらの治療は必ずしも有効でない場合があり、治療法の選択やその有効性の評価が極めて重要である。従って、最適な治療法を選択する際の指標の確立が望まれる。
 ところで、Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin 1 Like α(ERO1-Lα)タンパク質が、特に低酸素環境下で誘導されるタンパク質として見出されている(非特許文献1)。ERO1-Lαタンパク質は、ジスルフィド結合の形成を触媒することが知られ、従ってタンパク質のフォールディングに不可欠な役割を果たしている(非特許文献2)。しかしながら、ERO1-Lαタンパク質と、癌、特に膵臓癌との具体的関係は不明であった。
Dalit May et al., Oncogene (2005) 24: 1011-1020 Yanyan Chu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2009) 389: 645-650
 本発明は、サンプルの入手や測定が容易な癌の検出方法、診断薬および診断キットを提供することを目的とする。本発明はさらに、副作用が低減された癌の治療のための医薬組成物を提供することを目的とする。
 本発明者らは、ERO1-Lαタンパク質が癌細胞特異的に発現していること、特に膵臓癌および大腸癌で高発現していることを見出した。本発明者らはまた、ERO1-Lαタンパク質が高発現している癌患者では、外科的手術後の予後が不良であることを見出した。本発明者らはさらに、ERO1-Lαタンパク質が高発現している癌細胞において、ERO1-Lα遺伝子をノックダウンすると癌の形成が抑制されることを見出した。本発明者らはさらにまた、細胞内タンパク質として知られるERO1-Lαタンパク質が、意外にも細胞外に分泌されていることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
 すなわち、本発明では、以下の発明が提供される。
(1)被検体から得られた試料中のERO1-Lαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の検出方法であって、試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す、方法。
(2)癌が、膵臓癌または大腸癌である、上記(1)に記載の方法。
(3)試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、ERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌の存在を示す、上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、予後不良の癌の存在を示す、上記(1)~(3)のいずれかに記載の方法。
(5)試料が被検体から得られた細胞外液である、上記(1)~(4)のいずれかに記載の方法。
(6)ERO1-Lαタンパク質の検出手段を含んでなる、癌の診断薬または診断キット。
(7)癌が、膵臓癌または大腸癌である、上記(5)に記載の診断薬または診断キット。
(8)癌が、ERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌である、上記(6)または(7)に記載の診断薬または診断キット。
(9)癌が、予後不良の癌である、上記(6)~(8)のいずれかに記載の診断薬または診断キット。
(10)検出手段がERO1-Lαタンパク質に対する抗体である、上記(6)~(9)のいずれかに記載の診断薬または診断キット。
(11)ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる、癌治療用医薬組成物。
(12)癌が、膵臓癌または大腸癌である、上記(11)に記載の医薬組成物。
(13)ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤が、ERO1-Lαに対するsiRNAまたはshRNAである、上記(11)または(12)に記載の医薬組成物。
 本発明の癌の検出方法は、血液や体液などの細胞外液をサンプルとして用いることができるので、サンプルの入手容易性および測定容易性の観点で有利である。本発明の癌の検出方法はまた、癌の治療方法の有効性に関する示唆が得られる点で有利である。本発明の医薬組成物の有効成分が標的とするERO1-Lαタンパク質は、癌細胞でのみ高発現を示すため、本発明の医薬組成物は、副作用低減の観点で有利である。
図1は、正常なヒト組織から作製された市販のcDNAライブラリを用いてERO1-Lαおよびβの発現をPCRにより確認した結果を示す図である。 図2は、癌細胞株から抽出して得られたmRNAを用いてERO1-Lαおよびβの発現をRT-PCR法により確認した結果を示す図である。 図3は、癌患者の膵臓組織の切片におけるERO1-Lαタンパク質の発現を示す免疫組織化学染色像である。 図4は、各種組織切片におけるERO1-Lαタンパク質の発現を示す免疫組織化学染色像である。図4Aは、正常な膵臓組織、図4Bは、正常な小腸組織、図4Cは、正常な直腸組織および直腸癌の組織の組織切片におけるERO1-Lαタンパク質の発現を示す。 図5は、各組織におけるERO1-Lαタンパク質の発現を、ウェスタンブロット法により確認した結果を示す図である。 図6は、ERO1-Lα遺伝子の発現のshRNAによるノックダウンの結果を示すウェスタンブロットの結果である。 図7は、ERO1-Lα遺伝子の発現を低下させると腫瘍形成能が低下することを示す図である。図7Aは、ERO1-Lα遺伝子の発現が低下したPanc1細胞が、ヌードマウスの体内では癌を形成できなくなることを示す図である。図7Bは、ERO1-Lα遺伝子の発現を低下させたマウス乳癌細胞4T1細胞のBALB/c雌マウスに導入した際の腫瘍形成能の低下を示す図である(WT:ノックダウン処理を行わなかった4T1細胞、SCR:負の対照としてスクランブルshRNAを導入した4T1細胞、K.D.:ERO1-Lα遺伝子をノックダウンした4T1細胞)。 図8は、ERO1-Lαタンパク質のノックダウンクローンにおける、MHCクラスI分子の発現量の低下を示す図である。 図9は、ERO1-Lαタンパク質のノックダウンクローンにおける、特異的細胞傷害性T細胞への応答の低下(図9A)および肺への転移数(図9B)を示す図である(WT:ノックダウン処理を行わなかった4T1細胞、SCR:負の対照としてスクランブルshRNAを導入した4T1細胞、KD:ERO1-Lα遺伝子をノックダウンした4T1細胞)。 図10は、癌患者におけるERO1-Lαタンパク質の発現量の分布を示す図である。 図11は、癌患者におけるERO1-Lαタンパク質の発現量と癌の再発リスクとの関係を示す図である。 図12は、ERO1-Lαの発現が高い癌患者と低い癌患者の生存曲線を示す図である。図12Aは、膵臓癌患者における生存曲線を示し、図12Bは、乳癌患者における無病生存率を示し、図12Cは、乳癌患者における全体生存率を示す図である。 図13は、mycタグERO1-Lαタンパク質を強制発現させた大腸癌細胞SW480細胞が、培養上清にERO1-Lαタンパク質を分泌することを示す図である。図13Aでは、培養上清をmyc抗体で免疫沈降して得られたERO1-Lαタンパク質をウェスタンブロット法により検出し、図13Bでは、培養上清を抗ERO1-Lα抗体で免疫沈降して得られたERO1-Lαタンパク質をウェスタンブロット法により検出している。図13Cは、各種細胞の培養上清中のERO1-Lαタンパク質のELISAによる定量結果を示す図である。 図14は、癌患者の血清中のERO1-Lαタンパク質の濃度を示す図である。図14Bは、図14Aで示される進行性消化器癌患者を膵臓癌患者と大腸癌患者に分けたときの結果を示す図である。 図15は、ERO1-Lαタンパク質の発現がVEGF-Aの分泌量と関連することを示す図である(Scr:負の対照としてスクランブルshRNAを導入した4T1細胞、KD:ERO1-Lα遺伝子をノックダウンした4T1細胞)。 図16は、ERO1-Lαタンパク質が癌幹細胞に特に強く発現することを示す図である。
発明の具体的な説明
 後記実施例で示されるように、ERO1-Lαタンパク質は正常組織では発現せず癌特異的に発現する。従って、本発明の検出方法では、ERO1-Lαタンパク質が被検体の試料で検出された場合には、被検体に癌が存在する可能性が高いと判定することができる。すなわち、本発明の検出方法は、ERO1-Lαタンパク質の存在を指標として、被検体に癌が存在するか否かを判定する方法である。
 このように本発明の検出方法では被検体に癌が存在すると判定することができるが、被験体が癌患者であるか否かは医師等の判断により決定される。従って、本発明の検出方法は、癌の診断を補助する方法として用いることができる。すなわち、本発明によれば、被検体から得られた試料中のERO1-Lαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の診断のためのERO1-Lαタンパク質の検出方法であって、試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す方法が提供される。本発明の検出方法による結果に基づいて診断を行う際には、医師等は、例えば、癌マーカーを測定する方法および生検による方法などの当業者に周知の検査方法および/または診断方法を用いることができる。さらに、本発明の検出方法では癌細胞を検出することができる。すなわち、本発明によれば、被検体から得られた試料中のERO1-Lαタンパク質を検出することを含んでなる、癌細胞の検出方法であって、試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、被検体中の癌細胞の存在を示す、癌細胞の検出方法が提供される。
 後記実施例で示されるように、ERO1-Lαタンパク質は細胞内にて発現するタンパク質であり癌組織内にて検出されるが、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌からはERO1-Lαタンパク質が細胞外に分泌される。従って、本発明の検出方法では、ERO1-Lαタンパク質を被検体から得られた細胞外液で検出することができる。すなわち、本発明では、検出対象となる試料は、癌組織または癌であると疑われる組織としてもよく、また、被検体から得られた細胞外液としてもよい。
 本明細書では、細胞外液とは、血液、リンパ液および組織液などの体液を意味し、体腔内にたまった体腔液も細胞外液に含まれる。本発明では、血液の代わりに、血清または血漿などの血液の液体成分を用いてもよい。従って、「血液」には血清や血漿などの血液の液体成分も含まれる。
 本発明の検出方法の指標となるERO1-Lαタンパク質は、細胞内タンパク質であり、プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)を酸化する。PDIは酸化により活性化し、標的タンパク質にジスルフィド結合を形成させ、これにより、タンパク質のフォールディングおよび品質管理に関与するとされている(非特許文献2)。ERO1-Lαタンパク質のアミノ酸配列およびERO1-Lα遺伝子の塩基配列は周知であり、例えば、ヒトERO1-Lα(hERO1-Lα)の塩基配列およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1および2に示される通りである。
 後記実施例に示される通り、ERO1-Lαタンパク質は、乳癌、大腸癌(直腸癌および結腸癌)および膵臓癌で高発現し、大腸癌(直腸癌および結腸癌)および膵臓癌で特に高い発現を示す。従って、本発明では、検出、診断および治療の対象となる癌は、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌、より好ましくは、乳癌、膵臓癌および大腸癌などのERO1-Lαタンパク質を高発現する癌、さらに好ましくは、膵臓癌および大腸癌である。そして、大腸癌(直腸癌および結腸癌)および膵臓癌などのERO1-Lαタンパク質を高発現する癌からはERO1-Lαタンパク質が分泌される。従って、本発明の検出方法の検出対象となる癌は、特に限定されないが、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌、より好ましくはERO1-Lαタンパク質を高発現する癌、例えば、乳癌、大腸癌および膵臓癌などの固形癌、さらに好ましくは膵臓癌である。
 ERO1-Lαタンパク質は、細胞外に分泌されて細胞外液中に混入するが、体内を循環中に細胞外液中で代謝または分解されることがある。従って、本発明の検出方法では、細胞外液中でERO1-Lαタンパク質を検出する際には、ERO1-Lαタンパク質の代謝物および/または分解物(例えば、ERO1-Lαタンパク質の断片)を細胞から分泌されたERO1-Lαタンパク質として検出してもよい。
 本発明の検出方法の対象となる被検体は、哺乳類動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。被検体は、必ずしも癌が疑われる被検体である必要はないが、例えば、癌が疑われる被検体(例えば、ヒト)とすることが好ましく、乳癌、膵臓癌または大腸癌であることが疑われる被検体(例えば、ヒト)とすることがより好ましく、膵臓癌であることが疑われる被検体(例えば、ヒト)とすることがさらに好ましい。本発明の検出方法では、予後不良な癌の存在が示され、また、ERO1-Lα遺伝子の発現および/または機能を阻害する治療法に対して感受性を有する癌の存在が示されるので、被検体は癌と診断された被検体(例えば、癌患者)であってもよい。癌であると疑われる被検体または癌と診断された被検体を対象とする場合には、測定する試料は、細胞外液としてもよいし、癌であると疑われる組織または癌組織としてもよい。
 後記実施例に示されるように、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌を有する患者は、ERO1-Lαタンパク質を発現しない癌を有する患者に比べて、治療後の予後が不良であった。具体的には、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌を有すると、外科的治療後の患者における再発までの期間が短くなる、または、再発率が高まるなど、癌の再発のリスクが高まる。従って、本発明の検出方法では、被検体の試料中でERO1-Lαタンパク質が検出された場合には、予後不良の癌が存在することが示される。例えば、本発明の検出方法を癌と診断された被検体に実施する場合に、被検体の試料中でERO1-Lαタンパク質が検出されたときは、癌が予後不良の癌であることが示される。また、癌においてERO1-Lα遺伝子をノックダウンしたときには、癌の転移性が低下した。従って、本発明によれば、被検体の試料中でERO1-Lαタンパク質が検出されたときは、癌が転移性であることが示され得る。
 また、後記実施例に示されるように、ERO1-Lαタンパク質の発現量が高い癌を有する患者は、ERO1-Lαタンパク質の発現量が低い癌を有する患者に比べて、治療後の予後が不良であった。具体的には、ERO1-Lαタンパク質の発現量が高い癌を有すると、外科的治療後の患者における再発までの期間が短くなる、または、再発率が高まるなど、癌の再発のリスクが高まる。従って、本発明の検出方法では、被検体の試料中のERO1-Lαタンパク質の発現量が、健常者または予後が良好であった患者の試料中のERO1-Lαタンパク質の発現量よりも増加している場合には、予後不良の癌が存在することが示される。
 また、後記実施例に示されるように、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌において、ERO1-Lαタンパク質の発現を抑制すると、癌の発達が阻害された。本発明の検出方法によれば、被検体の試料中のERO1-Lαタンパク質の存在は、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌の存在を示す。そして、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌は、上述の通り、ERO1-Lαタンパク質の発現抑制などのERO1-Lαタンパク質を標的とした治療法に感受性を有する。従って、本発明の検出方法では、被検体の試料中のERO1-Lαタンパク質が検出された場合には、ERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌が存在することが示される。本発明の検出方法を癌と診断された被検体に実施する場合に、被検体の試料中でERO1-Lαタンパク質が検出されたときは、癌が、ERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌であることが示される。
 なお、本明細書では、ERO1-Lαタンパク質を標的とした治療は、特に限定されないが、例えば、ERO1-Lαタンパク質の発現を抑制すること、または、ERO1-Lαタンパク質の活性を阻害することなど、癌細胞内でERO1-Lαタンパク質の働きを抑えることにより行う治療を意味する。
 このように、本発明によれば、被検体の試料中のERO1-Lαタンパク質を検出することにより、被検体が癌を有しているか否か、癌治療の予後が良好であるか否か、癌がERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有するか否かを判定することができる。
 被検体の試料中のERO1-Lαタンパク質の検出は、ERO1-Lαタンパク質を検出できる限り限定されるものではないが、例えば、簡便性、感度および特異性の観点から、ERO1-Lαタンパク質に対する抗体(抗ERO1-Lαタンパク質抗体)を用いて行うことが好ましい。抗体を用いたタンパク質の検出法としては、特に限定されないが、Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay(ELISA)などの当業者に周知の方法が挙げられ、ELISAは診断薬にも利用されている。また、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、抗原特異性の高さの観点からはモノクローナル抗体であることが好ましい。
 本発明によれば、ERO1-Lαタンパク質の検出手段を含んでなる、癌の診断薬および診断キットが提供される。本発明の診断薬および診断キットは本発明の検出方法に関する記載に従って実施することができる。すなわち、ERO1-Lαタンパク質の検出手段はERO1-Lαタンパク質を検出できる適切な材料(ERO1-Lαタンパク質の検出剤)である限り限定されるものではないが、上記のように抗ERO1-Lαタンパク質抗体を用いることができる。
 前述のように、ERO1-Lαタンパク質は細胞外液中に分泌される。従って、本発明の診断キットは、細胞外液(例えば、血液)検査用の診断キットとしてもよく、その場合、診断薬の他に細胞外液(例えば、血液)採取のための器具および/または容器を含んでいてもよい。本発明の細胞外液検査用の診断キットでERO1-Lαタンパク質が検出された場合には、癌、特に膵臓癌または大腸癌を疑うことができ、癌が予後不良であると疑うことができ、および/または、癌がERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する可能性が高いと判断することができる。
 癌が既に同定されている場合には、本発明の診断薬または診断キットは、診断の正確性を高める観点で、患者から採取した癌組織を診断するための診断薬または診断キットとすることが好ましい。このとき、正常組織と比較して癌組織でのERO1-Lαタンパク質の発現がより高いことが示された場合には、癌が予後不良であると疑うことができ、および/または、癌がERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する可能性が高いと判断することができる。
 従って、本発明の診断薬または診断キットは、ERO1-Lαタンパク質の発現および/または機能を阻害する薬剤や治療方法の有効性を予測するための、コンパニオン診断薬または診断キットとして用いることもできる。
 本発明の診断薬および診断キットの診断対象となる癌は、特に限定されないが、癌、好ましくは、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌、より好ましくは、膵臓癌および大腸癌などのERO1-Lαタンパク質を高発現する固形癌、さらに好ましくは膵臓癌である。
 本発明の検出方法は、本発明の診断薬または診断キットを用いて行ってもよい。すなわち、本発明によれば、本発明の診断薬または診断キットを用いて、被検体から得られた試料中のERO1-Lαタンパク質を検出することを含んでなる、本発明の検出方法が提供される。
 後記実施例によれば、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌においてERO1-Lαタンパク質の発現を抑制した場合には、癌はほとんど増殖しなくなった。従って、本発明によれば、癌、好ましくは、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌、より好ましくは、乳癌、膵臓癌および大腸癌などのERO1-Lαタンパク質を高発現する癌の治療に用いるための、ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる医薬組成物が提供される。後記実施例によればまた、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌においてERO1-Lαタンパク質の発現を抑制した場合には、癌の転移が抑制された。従って、本発明によれば、癌の転移(例えば、癌の肺への転移)を抑制するための、ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる医薬組成物が提供される。後記実施例によればさらに、ERO1-Lαタンパク質は癌幹細胞で高発現を示した。従って、本発明の医薬組成物は、癌幹細胞に対するものであり得る。
 ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤としては、特に限定されないが、ERO1-Lα遺伝子を標的としたshRNAおよびsiRNAなどが挙げられる。
 siRNAとは、RNA干渉(RNAi)を誘導することができる二本鎖RNA(核酸)、特に限定されないが、20~30bp、好ましくは、21~23bp、25bp、27bpからなる二本鎖RNAであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖RNAである。このような二本鎖RNAは、当業者であれば、周知の方法を用いて、ERO1-Lαの遺伝子配列を元に設計し製造することができる。本発明では、特に限定されないが、例えば、siRNAとして、配列番号13および14の塩基配列を有する核酸をアニールして得られるsiRNAを用いることができる。また、本発明では、配列番号13および14の塩基配列として、3’末端に2つのTを有する核酸を用いたが、この2つのTは、そのうちの一つまたは両方をUに代えて用いてもよい。
 shRNAとは、生体内でDicerにより分解を受けてsiRNAを生成することができるRNAである。shRNAは、二本鎖のステムとヘアピンループを含むステムループ構造を有する。このヘアピンループ部分の配列は特に限定されないが、5~12塩基の配列とすることができる(Kawasaki H. et. al., Nucleic Acid Res. (2003) 31: 700-707、Paddison P. J. et. al., Genes and Dev. (2002) 16: 948-958、Lee N. S., Nat. Biotech. (2002) 20: 500-505およびSui G., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (2002) 99: 5515-5520)。このようなshRNAは、当業者に周知の方法によりERO1-Lαの遺伝子配列を元に設計し製造することができる。本発明では、特に限定されないが、例えば、shRNAとして、実施例で用いた配列番号11または12のshRNAを用いることができる。
 本発明の医薬組成物は、賦形剤、補助剤および/または添加剤を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物はまた、1以上の他の抗癌剤をさらに含んでいてもよい。
 本発明によればまた、治療上有効量のERO1-Lα遺伝子の発現抑制剤を、それを必要とする哺乳類(例えば、ヒト)、例えば、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌を有する哺乳類(例えば、ヒト)に投与することを含んでなる、癌の治療法が提供される。
 本発明の癌の治療法は、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌を有する哺乳類(例えば、ヒト)に対してERO1-Lα遺伝子の発現または機能を阻害することにより行われ得る。従って、本発明の癌の治療法は、ERO1-Lαタンパク質を発現する哺乳類(例えば、ヒト)を、本発明の検出方法に基づいて同定した後に行うことが好ましい。従って、本発明の癌の治療法は、哺乳類(例えば、ヒト)の試料中にERO1-Lαタンパク質が存在するか否かを決定すること、ERO1-Lαタンパク質の存在を指標として癌を診断すること、および治療上の有効量のERO1-Lα遺伝子の発現抑制剤を該哺乳類に投与することを含んでなる、癌の治療法とすることができる。
実施例1:ERO1-Lα遺伝子の発現の組織特異性
 本実施例では、様々なヒト組織におけるERO1-Lα遺伝子の発現を確認した。
 ヒトの各組織のcDNAとしては、BDバイオサイエンシズ社から購入したmultiple tissue cDNA panelsのcDNAを用い、PCR法により正常組織におけるERO1-Lα遺伝子の発現を確認した。
 PCRは、ERO1-Lαの検出用プライマーとしては、5’-GCCCGTTTTATGCTTGATGT-3’(配列番号:5)および5’-AACTGGGTATGGTGGCAGAC-3’(配列番号:6)を用い、ERO1-Lβの検出用プライマーとしては、5’-ATCCATGTTTGCAGGTGACA-3’(配列番号:7)および5’-ATTTCCTGTCGGGTGAGTTG-3’(配列番号:8)を用い、インターナルコントロールとしてのグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(G3PDH)の検出用プライマーとしては、5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’(配列番号:9)および5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(配列番号:10)を用いた。
 PCR反応では、1μLのcDNA、各50pmolのプライマーおよびKOD Plus DNAポリメラーゼ(TOYOBO社製)を含むPCR反応液50μLを用い、92℃で2分加熱した後に、92℃1分、62℃1分および72℃1分のサイクルを30サイクル行った。
 PCR産物は、1%アガロースゲル電気泳動の後にエチジウムブロマイド染色を行い、UV光により検出した。また、PCR産物の塩基配列は、ABI Genetic analyzer PRISM 310およびAmpliCycle sequencing kit(パーキンエルマー社製)を用いて決定した。
 その結果、ERO1-Lβは、リンパ球、肝臓、脾臓、膵臓および精巣などの正常組織にて発現が認められたが、ERO1-Lαは、正常組織での発現はほとんど認められなかった(図1)。
 次に、ERO1-Lαの癌細胞株における発現を確認した。
 ヒト膵臓癌細胞株である、Panc1、HPAF2、HPACおよびBxPC3は、ATCC社から購入した。その他、ヒト白血病細胞株T2A24(ATCC社から購入)、ヒト乳癌細胞株MCF7(ATCC社から購入)、ヒト肺腺癌細胞株LHK2(札幌医科大学で樹立された肺癌細胞株)、ヒト結腸癌細胞株HCT15(ATCC社から購入)、ヒト大腸癌細胞株SW480(ATCC社から購入)、ヒト腎臓癌細胞株Caki1(ATCC社から購入)、ヒト乳癌細胞株HMC1(ATCC社から購入)およびヒト腎臓癌細胞株SMKTR(札幌医科大学で樹立された腎臓癌細胞株)を用いて、各種癌細胞株でのERO1-Lαの発現を確認した。
 これらの細胞からISOGEN試薬(ニッポンジーン社製)を用いて全RNAを抽出し、SuperscriptIIIおよびオリゴ(dT)プライマー(Life Technologies社製)を用いて製造者マニュアルに従ってcDNAを合成した。PCR反応は、正常組織における条件と同一の条件で行った。
 その結果、ERO1-Lαは、HCT15細胞、SW480細胞、Caki1細胞、HPAF2細胞、HPAC細胞、およびBxPC3細胞において比較的高い発現が認められた(図2)。
 このように、ERO1-Lαは、正常組織では発現がほとんど認められなかったが、癌細胞株では発現が認められた。
実施例2:癌組織におけるERO1-Lα遺伝子の発現
 本実施例では、癌組織におけるERO1-Lα遺伝子の発現を組織切片の免疫染色により確認した。
 ヒトの癌患者の各種組織におけるERO1-Lαの発現を調べた。組織としては、乳癌組織検体、胃癌組織検体、結腸直腸癌組織および膵臓癌組織を対象とした。組織は、10%ホルマリンにより固定し、パラフィン包埋してから、ミクロトームを用いて20μm厚の組織切片とした。その後、組織切片に対して、脱パラフィン処理および121℃10分間のオートクレーブ処理を行った。さらに、抗ERO1-Lα抗体(Abnova社製、製品番号:H00030001-M01)、二次抗体としてペルオキシダーゼコンジュゲート羊抗マウス抗体(DAKO社製、製品番号:K4000)およびDAB (DAKO社製、製品番号K3468)を用いて常法に従って免疫組織化学染色を行った。その後、光学顕微鏡を用いて染色した各種組織切片を観察した。
 観察の際、各組織のERO1-Lαタンパク質の発現量は4段階で評価した。4段階評価は以下の指標に基づいて行った。すなわち、図3AのようにERO1-Lαがほとんど発現しないものは(-)とし、図3Bのようにわずかに発現が認められるものを(+)とし、図3Cのように部分的に高い発現が認められるものを(++)とし、図3Dのように全体的に高い発現が認められるものを(+++)とした。
 各癌組織でのERO1-Lαタンパク質の発現を上記指標に基づいて評価し、ERO1-Lαタンパク質の発現レベルと癌の種類との関係を調べたところ、結果は表1に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 表1に示されるように、ERO1-Lαは、直腸結腸癌および膵臓癌において高い発現を示し、特に、膵臓癌では検体のうち約86%が(++)または(+++)の高発現を示した。一方で、乳癌や胃癌では(-)または(+)の発現レベルに留まるものが大半を占めた。このことから、ERO1-Lαの発現は、膵臓癌および直腸結腸癌(大腸癌)に特徴的であることが明らかとなった。ERO1-Lαは、乳癌や胃癌の一部でも高発現を認めた(表1)。
実施例3:正常な膵臓組織におけるERO1-Lα遺伝子の発現
 本実施例では、正常な膵臓組織におけるERO1-Lαの発現を免疫組織化学染色法とウェスタンブロット法により確認した。
 正常なヒト膵臓、小腸および大腸、並びに大腸癌組織の正常な部分を対象とし、これらの組織切片におけるERO1-Lαの発現解析は、実施例2に記載の免疫組織化学染色法により確認した。
 その結果、正常なヒト膵臓および小腸では、ERO1-Lαの発現は認められなかった(図4AおよびB)。また、正常な大腸でもERO1-Lαタンパク質の発現は認められなかったが、大腸癌の組織では、ERO1-Lαタンパク質の高い発現が認められた(図4C)。
 次に、ヒト膵臓、胃および末梢血単核球(PBMC)中のERO1-Lαタンパク質の発現をウェスタンブロット法により確認した。正の対照としては、mycタグを付したERO1-Lα(配列番号:3および4)を発現する293T細胞を用いた。この細胞株は、80%コンフルエントの293T細胞(ATCC社から購入)にヒトERO1-Lα遺伝子の5’末端にmyc遺伝子をインフレームで連結した遺伝子を挿入した発現ベクター(ピューロマイシン耐性遺伝子を発現する)を、Lipofectamine 2000 Reagent(インビトロジェン社製)を用いて製造者マニュアルに従ってトランスフェクションし、48時間後に2μg/mL ピューロマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加して安定クローンとして樹立した株である。なお、KG-1細胞(ATCC社から購入)は、ヒト急性骨髄性白血病細胞として知られる細胞株であり、KG-1/H-2K細胞は、本発明者らがKG-1細胞にマウスのMHCクラスI分子であるH-2K遺伝子を導入して樹立した細胞株である。
 各組織を氷冷したPBSで洗浄し、次いで、細胞を溶解させるために、細胞溶解バッファー(50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1% NP-40、およびComplete Protease Inhibitor Cocktail(ロッシュ社製))中で、氷上でインキュベートした。その後、15,000rpm、4℃の条件で溶解したサンプルは20分間遠心分離を行った。得られた全細胞抽出液は、常法に従ってSDSサンプルバッファー中で5分間煮沸し、10%アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEを行い、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜(Immobilon-P社製)に転写した。タンパク質を転写したPVDF膜は、ブロッキングバッファー(5%脱脂粉乳を含むPBS)で室温で1時間ブロッキングし、その後、ウサギ抗ERO1-Lαモノクローナル抗体(Abnova社製)またはマウス抗β-アクチンモノクローナル抗体AC-15(シグマアルドリッチ社製)を用いて60分間インキュベートした。その後、PVDF膜は、洗浄バッファー(0.1% Tween-20を含むPBS)で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ-ラベルしたヤギ抗マウスIgG抗体(KPL社製)を用いて2時間インキュベートした。最後に、シグナルをenhanced chemiluminescence(ECL)detectionシステム(Amersham Life Science社製)を用いて製造者マニュアルに従って検出した。
 すると、膵臓、胃およびPBMCのいずれにおいても、ERO1-Lαタンパク質の発現は認められなかった(図5)。一方、正の対照として用いたmycタグを有するERO1-Lαを発現する293T細胞では、ERO1-Lαタンパク質の高い発現が認められた(図5)。
 このように、組織切片における免疫組織化学染色法によっても、組織から抽出した全タンパク質を用いたウェスタンブロット法によっても、正常な組織ではERO1-Lαタンパク質の発現を確認することはできなかった。
 実施例1および2の結果を総合すると、ERO1-Lαタンパク質は、ヒト癌患者の組織(特に膵臓および直腸結腸)において高い発現を示したが、正常な組織(特に膵臓、胃、小腸を含む多くの組織)においてはほとんど発現していないことが明らかとなった。
実施例4A:ERO1-Lα遺伝子のノックダウンと腫瘍形成の関係
 実施例1~3により、ERO1-Lαタンパク質は、癌組織(特に膵臓や直腸結腸)でのみ高い発現を示し、癌でない正常組織での発現は認められなかった。本実施例では、ERO1-Lαタンパク質が癌治療の標的となり得るかを調べるため、癌モデルマウスを用いてERO1-Lα遺伝子のノックダウン実験を行った。
 まず、配列番号11または12の塩基配列を有するERO1-Lα遺伝子ノックダウン用のshRNAを転写するDNAをRNAi-Ready pSIREN-RetroQベクター(インビトロジェン社製)のBamHIとEcoRIの制限酵素部位に挿入した。具体的には、配列番号11または12の塩基配列を有する一本鎖DNAの5’末端にgatccからなるBamHIの制限酵素切断配列を連結し、3’末端にttttttctagagからなるターミネータおよびEcoRIの制限酵素切断配列を連結して得られた一本鎖DNAと、これに相補的な配列を有する一本鎖DNAとを100℃で20分加熱し、その後、室温に戻しながらアニールして得たDNAをRNAi-Ready pSIREN-RetroQベクター(インビトロジェン社製)のBamHIとEcoRIの制限酵素部位に挿入した。これらのshRNA発現ベクターは、80%コンフルエントにしたPanc1細胞にLipofectamine 2000 Reagent(インビトロジェン社製)を用いて製造者マニュアルに従ってトランスフェクションし、48時間後に2μg/mL ピューロマイシン(シグマアルドリッチ社製)を添加して、安定クローンを樹立した。得られたERO1-Lαノックダウンクローン3種(sh1-3、sh3-4およびsh3-6)のERO1-Lαタンパク質の発現をウェスタンブロット法により確認した。sh1-3は、配列番号11の塩基配列を組み込んだshRNA発現ベクターを用いてERO1-Lα遺伝子をノックダウンしたクローンであり、sh3-4およびsh3-6は、配列番号12の塩基配列を組み込んだshRNA発現ベクターを用いてERO1-Lα遺伝子をノックダウンしたクローンであった。なお、ウェスタンブロット法は、実施例3に記載の方法に従って行った。
 その結果、いずれのクローンにおいても、ERO1-Lαタンパク質の発現が大きく抑制されていることが分かった(図6)。
 得られたERO1-Lαノックダウンクローン3種のうち、sh1-3またはsh3-4を導入した2種、panc1細胞、スクランブルshRNAを発現するpanc1細胞をそれぞれ1×10細胞ヌードマウスの腹腔内に注射してその後の腫瘍形成を調べた。実験は、1群あたり5匹のマウスを用いて行った。
 その結果、panc1細胞またはコントロールshRNAのクローンを注射したマウスは、腫瘍を形成したが、ERO1-Lαノックダウンクローンであるsh1-3およびsh3-4は、腫瘍形成能がほとんど認められなかった(図7A)。
 また、配列番号13および配列番号14の塩基配列を有するRNAをアニールして得られるsiRNAを用いて、大腸癌細胞株SW480でERO1-Lα遺伝子の発現をノックダウンする実験を行った。その結果、このsiRNAを用いた場合でも、ERO1-Lα遺伝子の発現のノックダウンが確認できた(データ省略)。なお、このsiRNAの3’末端のオーバーハングは、TTをUUに変えてもノックダウンの効果に差は無いことが知られている。また、ERO1-Lα遺伝子の発現をノックダウンした大腸癌細胞株SW480細胞において、細胞表面に提示されるMHCクラスI分子の量を、W6/32-FITC抗体を用いたフローサイトメーターを用いて調べた。すると、MHCクラスI分子の発現量は40%低下した(図8)。さらに、ERO1-Lα遺伝子の発現のノックダウンとT細胞応答との関係を調べるために、siRNAを導入した上記SW480細胞と細胞傷害性T細胞(cep55 specific CTL)とを24時間共培養し、細胞傷害性T細胞からのインターフェロン-γ(INF-γ)の産生量をELISA法を用いて測定した。すると、ERO1-Lα遺伝子の発現をノックダウンした細胞では特異的細胞傷害性T細胞の応答が低下した(図9A)。このように、ERO1-Lα遺伝子の発現をノックダウンした細胞で、MHCクラスI分子の細胞表面での発現が低下したことから、ERO1-Lαタンパク質の発現が低下すると癌免疫機能が低下する可能性が示唆されたが、この結果に反して、ERO1-Lα遺伝子の発現のノックダウンクローン(sh1-1、sh3-4およびsh3-6)では腫瘍形成能が抑えられたことは驚きであった。
 これらの結果から、ERO1-Lαタンパク質の発現は、腫瘍形成に重要な役割を果たしていることが示唆された。
実施例4B:ERO1-Lα遺伝子のノックダウンと腫瘍形成の関係
 本実施例では、BALB/c雌マウスを用い、4T1マウス乳癌細胞を乳腺に移植する以外は実施例4Aと同じ条件で、ERO1-Lα遺伝子のノックダウンの効果を確認した。
 具体的には、5~6週齢のBALB/c雌マウスをJackson Laboratory社から購入し、特定病原体フリーの施設において飼育して、6週齢において実験に使用した。1群あたり5匹のマウスを使用し、マウスには、1×10個の4T1細胞またはERO1-Lα遺伝子のノックダウン細胞を右乳腺に注入した。4T1細胞はATCC社から購入し、10%FCSを添加したRPMI-1640培地で培養した。また、ERO1-Lα遺伝子のノックダウンクローンは、4T1細胞にERO1-Lα遺伝子のノックダウン用のshRNAレトロウイルスベクター(OriGene社製、TR502816)をLipo-fectamine RNAi/Max(Life technologies社製)を用いて導入して樹立した。細胞は、低酸素条件下(1%O、5%COおよび94%N)で少なくとも3日間培養した。
 その後、腫瘍の大きさを測定し、42日目の平均腫瘍直径をMann-WhitneyのU検定により統計的に分析した。また、42日目には、肺への転移数も測定した。
 その結果、未処理の4T1細胞(WT)およびコントロールshRNAを導入した4T1細胞(SCR)と比べて、ERO1-Lα遺伝子のノックダウンクローンを導入したマウス(K.D.)では、腫瘍細胞の増殖が有意に低減した(図7B)。また、肺への転移数を測定した結果、未処理の4T1細胞(WT)およびコントロールshRNAを導入した4T1細胞(SCR)と比べて、ERO1-Lα遺伝子のノックダウンクローンを導入したマウス(K.D.)では、腫瘍細胞の肺への転移が顕著に低減した(図9B)。この結果から、腫瘍の治療にERO1-Lα遺伝子の発現抑制剤を用いることができること、および、腫瘍患者の転移の予測にERO1-Lα遺伝子を用いることができることが示された。
 このように、実施例4Bの結果からも、実施例4A同様に、腫瘍の増殖がERO1-Lα遺伝子のノックダウンにより低減できることが確認できた。また、実施例4Bの結果からは、ERO1-Lα遺伝子が腫瘍の転移に関係していることも明らかとなった。
実施例5:大腸癌患者における予後とERO1-Lαタンパク質の発現
 実施例4で、ERO1-Lαタンパク質の発現が腫瘍形成に重要な役割を果たしていることが示された。そこで、本実施例では、実際の直腸結腸癌患者におけるERO1-Lαタンパク質の発現と予後の関連について調べた。
 2005年~2008年の間に札幌医科大学で手術を行った85人の直腸結腸癌患者におけるERO1-Lαタンパク質の発現を免疫組織化学染色法により確認した。まず、本実施例では、評価対象の組織は、各癌患者から得た直腸結腸癌の組織とした。組織は、10%ホルマリンにより固定し、パラフィン包埋してから、ミクロトームを用いて20μm厚の組織切片を作製した。脱パラフィン処理を行い、121℃で10分間オートクレーブ処理を行ってから、抗ERO1-Lα抗体(Abnova社製、製品番号:H00030001-M01)および二次抗体としてペルオキシダーゼコンジュゲート羊抗マウス抗体(DAKO社製、製品番号:K4000)およびDAB(DAKO社製、製品番号K3468)を用いて常法に従って免疫組織化学染色を行った。その後、光学顕微鏡を用いて染色した各種組織切片を観察した。
 観察の際、各組織のERO1-Lαタンパク質の発現量は4段階で評価した。すなわち、ERO1-Lαがほとんど発現しないものはスコア0、わずかに発現が認められるものはスコア1、部分的に高い発現が認められるものはスコア2、全体的に高い発現が認められるものはスコア3と評価した(図10)。
 次に、患者が直腸結腸癌を再発するまでの期間を各患者に調べ、ERO1-Lαタンパク質の発現と関連付けた。すると、ERO1-Lαタンパク質を過剰発現する患者群(スコア3)では、ERO1-Lαタンパク質の発現が低い患者群(スコア0~2)と比較して、再発までの期間が有意に短かった(図11)。具体的には、表2に示されるように、再発までの期間は、ERO1-Lαタンパク質を過剰発現する患者群(スコア3)では平均2.35年であり、ERO1-Lαタンパク質の発現が低い患者群(スコア0~2)の期間の約8割であった。また、無再発生存率(relapse free survival)は、ERO1-Lαタンパク質を過剰発現する患者群(スコア3)では、ERO1-Lαタンパク質の発現が低い患者群(スコア0~2)に対して67.86%に低下していた。
 この結果から、ERO1-Lαタンパク質の発現量と大腸癌の再発率および再発までの期間は関連し、ERO1-Lαタンパク質の発現量を調べることにより大腸癌の再発率および再発までの期間を評価することが可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 さらに、再発しなかった例と再発した例とで各スコアの占める割合を調べると、再発しなかった71例中スコア3の症例は19例(71例中26.8%)であったのに対して、再発した14例中ではスコア3の症例は9例(14例中64.3%)であった。このことから、ERO1-Lαの発現量が高いほど、再発リスクが高まることが示唆された(表3および4)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 さらに、実施例2の表1に示される膵臓癌患者51名に関して、カプランマイヤー曲線を作成した。すると、表1で(-)または(+)に分類された低発現の群(7名)では、(++)または(+++)に分類された高発現の群(44名)に比べ、生存日数が長くなる傾向が見られた(図12A)。生存中央値を比較すると、低発現群では1517日であり、高発現群は527日であり、高発現群と低発現群の生存中央値の差は統計的に有意であった(P=0.0019)。
 次に、同様の解析を浸潤性乳癌患者71名に対して行った。浸潤性乳癌患者71名におけるERO1-Lαタンパク質の発現を、85人の直腸結腸癌患者に行った方法で、免疫組織化学染色法により確認した。その結果、71名の浸潤性乳癌患者のうち、38例(53.5%)ではERO1-Lαタンパク質の発現は見られず、残りの33例(46.5%)ではERO1-Lαタンパク質の発現が観察された(データ省略)。ERO1-Lαタンパク質の発現は、エストロゲン受容体(ER)の発現と逆相関し(P=0.021)、核異型度とは正の相関を示した(P=0.001)。また、ERO1-Lαタンパク質の発現は、患者の年齢、組織診断、腫瘍サイズまたはリンパ節転移とは相関は見られなかった。
 次に、ERO1-Lαタンパク質の発現が見られなかった乳癌患者(ERO1-Lα(-))とERO1-Lαタンパク質が見られた乳癌患者(ERO1-Lα(+))とで無病生存率および全体的生存率を比較した。その結果、ERO1-Lαタンパク質が見られた乳癌患者(ERO1-Lα(+))では、ERO1-Lαタンパク質の発現が見られなかった乳癌患者(ERO1-Lα(-))と比較して、有意に短い無病生存(P=0.01)および全体生存(P=0.04)を示した(図12BおよびC)。このように、乳癌患者においても、直腸結腸癌患者や膵臓癌患者と同様にERO1-Lαタンパク質の発現と予後に関係することが示された。
 このことから、ERO1-Lαタンパク質が発現する癌を有する患者では、予後が不良であることが示唆された。
実施例6A:ERO1-Lαタンパク質の細胞外への分泌
 さらに、本発明者らは、ERO1-Lαタンパク質は、細胞外に分泌されることを発見した。
 まず、mycタグを付したERO1-Lα遺伝子を導入したpIRES-puro発現ベクターを調製した。得られた発現ベクターは、Lipofectamine 2000 Reagent(インビトロジェン社製)を用いて製造者マニュアルに従って大腸癌細胞株SW480細胞にトランスフェクションし、48時間後に、細胞の培養上清を回収した。次に、得られた培養上清中のERO1-Lαタンパク質を抗myc抗体を用いて免疫沈降し、その後、ウェスタンブロット法によりERO1-Lα遺伝子の存在を確認した。正の対照として、ERO1-Lα遺伝子を導入したSW480細胞およびERO1-Lα遺伝子を発現する293Tを用い、これらの細胞溶解物は実施例3に記載の方法を用いて得た。
 その結果、抗myc抗体を用いて免疫沈降した細胞の培養上清中に、ERO1-Lαタンパク質の62kDaのバンドを認めた(図13A)。さらに追試を行った。具体的には、SW480細胞とERO1-Lαを過剰発現させたSW480細胞の培養上清を取得し、抗ERO1-Lα抗体により免疫沈降した後に、抗ERO1-Lα抗体を用いたウェスタンブロットにより培養上清へのERO1-Lαの分泌の有無を確認した。すると、ERO1-Lαを過剰発現させたSW480細胞は、細胞の培養上清中にERO1-Lαタンパク質が分泌することが確かめられた(図13B)。panc1細胞でも同様であった(図13C)。
 このことから、ERO1-Lαタンパク質は、細胞外に分泌されることが明らかとなった。
 生体内では細胞外に分泌されたタンパク質は組織液と一緒になってリンパ液に流入し、最終的には血液に流入する。従って、被検体から得られた細胞外液中のERO1-Lαタンパク質の存在を調べることにより、細胞外に分泌されたERO1-Lαタンパク質を検出することができる。
 正常組織ではERO1-Lαタンパク質はほとんど産生されず、ERO1-Lαタンパク質を細胞外に分泌するのは、ERO1-Lαタンパク質を発現する組織、すなわち、癌(例えば、膵臓癌または大腸癌)である。従って、被検体から得られた細胞外液中のERO1-Lαタンパク質の存在を調べることにより、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌の存在を推定できる。
 ERO1-Lαタンパク質を発現する癌は、ERO1-Lαタンパク質の発現を抑制することで、増殖が困難となる。癌患者の細胞外液中のERO1-Lαタンパク質の存在を確認することにより、ERO1-Lαタンパク質を発現する癌の存在、および、ERO1-Lαタンパク質の阻害剤などが抗癌剤としての有効性を評価し得る。この結果は、血清中のERO1-Lαタンパク質の存在を調べることにより、ERO1-Lαタンパク質の阻害剤などの抗癌剤としての有効性が評価可能であることを示すものである。
実施例6B:患者血清中でのERO1-Lαの検出
 実施例6Aでは、ERO1-Lαが細胞外に分泌されることが示された。本実施例では癌患者の血清を用いてERO1-Lαを検出した。
 まず、進行消化器癌患者16人および健常者5人から得られた血清中のERO1-LαをELISAにより検出した。ELISAは、サンドイッチ法を用い、ERO1-Lαは抗ERO1-Lαモノクローナル抗体で支持体に吸着させ、抗ERO1-Lαウサギポリクローナル抗体で検出した。
 その結果、癌患者では、健常人と比べて血清中のERO1-Lα濃度が有意に高かった(図14A)。
 さらに、進行消化器癌患者16人を膵臓癌患者4人と大腸癌患者12人とに分けて比較した。その結果、膵臓癌患者では4例全例で血清中のERO1-Lα濃度が極めて高い値を示し、大腸癌患者では約半数が高い値を示した(図14B)。この結果は、実施例2の表1で示されるERO1-Lαタンパク質を高発現する試料の割合とほぼ一致した。すなわち、表1に示されるように、(++)および(+++)の発現レベルを示した試料の割合は、直腸結腸癌では約40%程度であるのに対して、膵臓癌では約85%であり、図14Bの結果とほぼ一致していた。
実施例7:ERO1-LαとVEGF-Aの産生との関係
 本実施例では、マウス乳癌細胞4T1と実施例7で得られたERO1-Lα遺伝子のノックダウンクローンから産生されるVEGF-Aの量を測定し、比較した。
 具体的には、10×10細胞/ウェルの実施例7で得られたERO1-Lα遺伝子のノックダウンクローンおよびコントロールshRNAを導入した4T1細胞をそれぞれ平底96穴プレートに播種した。24時間後、上清を回収して希釈し、ELISAによりVEGF-Aの産生量を測定した。ELISAは、R&Dシステムズ社製のVEGF-A測定用キットを用いて行った。吸光は450nmで測定した。
 その結果、ERO1-Lα遺伝子のノックダウンクローン(KD)では、コントロールshRNAを導入した4T1細胞(Scr)と比べて、VEGF-Aの培養上清への産生量が低下していた(図15)。ERO1-Lαは、腫瘍におけるVEGF-Aの産生に関与していると考えられる。なお、VEGF-Aは、腫瘍における血管新生などに関わるが、分子内ジスルフィド結合を有するホモダイマーを形成し、その分子内ジスルフィド結合はVEGF-Aが適切にフォールディングし、機能する上で重要である。
  実施例1~7の結果によれば、ERO1-Lαは、腫瘍の増殖に関わるが、本実施例では、ERO1-LαはVEGF-Aの産生にも関与していることが明らかとなった。このことからERO1-Lαは最終的には腫瘍における血管新生に関与している可能性が示唆された。 
実施例8:癌幹細胞におけるERO1-Lαの発現
 本実施例では、サイドポピュレーション法により癌幹細胞と非癌幹細胞とを分画してERO1-Lαの発現を比較した。
 具体的には、ヒト大腸癌細胞株SW480を用いて、Hoechst33342蛍光色素(Lonza)染色を行った。そこにABCG-2トランスポーター阻害剤であるベラパミル(50μmol/L、シグマ-アルドリッチ社製)を用いて37℃で30分間処理したものと、処理しないものをそれぞれフローサイトメーターを用いて測定し、比較検討した。ベラパミル処理後消失する細胞分画をサイドポピュレーション(SP)とし、それ以外の分画をメインポピュレーション(MP)として、フローサイトメーターにより分収した。本実施例では、SP画分を癌幹細胞分画とし、MP画分を非癌幹細胞分画として用いた。
 それぞれの細胞中で発現するERO1-Lαのタンパク質を抗ERO1-Lα抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した。すると、図16に示されるように、ERO1-Lαは癌幹細胞画分でより多く発現していた。
 実施例1~7の結果によれば、血清中でのERO1-Lαの検出は、癌の悪性度を評価する上で重要なマーカーとして用いることができるが、本実施例の結果により、悪性の癌への癌幹細胞の関与も示唆された。特に、ERO1-Lαの発現抑制剤は、癌幹細胞にも効くと考えられた。

Claims (13)

  1.  被検体から得られた試料中のERO1-Lαタンパク質を検出することを含んでなる、癌の検出方法であって、試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、被検体中の癌の存在を示す、方法。
  2.  癌が、膵臓癌または大腸癌である、請求項1に記載の方法。
  3.  試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、ERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌の存在を示す、請求項1または2に記載の方法。
  4.  試料中のERO1-Lαタンパク質の存在が、予後不良の癌の存在を示す、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
  5.  試料が被検体から得られた細胞外液である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
  6.  ERO1-Lαタンパク質の検出手段を含んでなる、癌の診断薬または診断キット。
  7.  癌が、膵臓癌または大腸癌である、請求項5に記載の診断薬または診断キット。
  8.  癌が、ERO1-Lαタンパク質を標的とした治療に対して感受性を有する癌である、請求項6または7に記載の診断薬または診断キット。
  9.  癌が、予後不良の癌である、請求項6~8のいずれか一項に記載の診断薬または診断キット。
  10.  検出手段がERO1-Lαタンパク質に対する抗体である、請求項6~9のいずれか一項に記載の診断薬または診断キット。
  11.  ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤を含んでなる、癌治療用医薬組成物。
  12.  癌が、膵臓癌または大腸癌である、請求項11に記載の医薬組成物。
  13.  ERO1-Lαタンパク質の発現抑制剤が、ERO1-Lαに対するsiRNAまたはshRNAである、請求項11または12に記載の医薬組成物。
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