KR20140132712A - RNF43 돌연변이 상태를 사용한 Wnt 신호전달 억제제의 투여를 위한 암 환자 선택 - Google Patents

RNF43 돌연변이 상태를 사용한 Wnt 신호전달 억제제의 투여를 위한 암 환자 선택 Download PDF

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노파르티스 아게
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Abstract

Wnt 길항제의 치료적 투여로부터 이익을 얻을 것으로 예측되는 암 환자의 확인을 위한 바이오마커, 방법 및 검정이 개시된다. 바이오마커는 RNF43 및 ZNRF3 유전자 결실, 감소된 RNF43 및 ZNRF3 mRNA 발현, 감소된 RNF43 및 ZNRF3 단백질 발현, RNF43 및 ZNRF3 불활성화 돌연변이, 인산화 LRP6, 인산화 디쉐블드, 및 프리즐드의 발현의 검출을 포함한다. 이들 바이오마커는 Wnt 경로 억제제로 치료한 암 환자에 대한 보다 양호한 결과와 연관될 수 있다.

Description

RNF43 돌연변이 상태를 사용한 Wnt 신호전달 억제제의 투여를 위한 암 환자 선택 {CANCER PATIENT SELECTION FOR ADMINISTRATION OF WNT SIGNALING INHIBITORS USING RNF43 MUTATION STATUS}
우선권 주장
본 출원은 2012년 2월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/604,290을 우선권 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 종양 세포 또는 암 세포의 검출을 위한 세포 막 결합된 항원 또는 세포 막 결합된 수용체를 포함하는 측정 또는 시험 방법 및 조성물 또는 그의 시험 스트립, 구체적으로 Wnt 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 것으로 예측되는 암 환자를 확인하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 구체적으로 선택된 환자에서 사용하기 위한 Wnt 억제제 또는 Wnt 억제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
생물학 및 의약에서, 정규 Wnt/β-카테닌 경로는 분비된 Wnt 리간드, 세포 표면 수용체 및 전사 공동-활성화제 β-카테닌, 뿐만 아니라 이들 코어 단백질 성분의 많은 다른 이펙터 및 조절제를 포함하는 일련의 세포내 신호전달 사건이다. Wnt 리간드의 부재 하에, β-카테닌은 그의 폴리-유비퀴틴화 및 프로테아솜 분해를 유발하는 다중-단백질 복합체에 의해 지속적으로 인산화된다. Wnt 단백질의 그의 수용체에 대한 결합 시에, 시토졸 β-카테닌은 파괴 복합체의 억제를 통해 안정화되고, 핵으로 전위되어 Wnt 표적 유전자의 전사를 활성화한다.
Wnt에 대한 주요 수용체는 LRP5 또는 LRP6 (LDL 수용체 관련 단백질 5 및 6)을 Wnt/β-카테닌 신호전달에 대한 필수 보조-수용체로서 갖는 프리즐드(Frizzled) (FZD) 패밀리 단백질이다. 문헌 [Nusse R (2005), Cell Research 15(1):28-32]. 프리즐드 수용체는 긴 시스테인-풍부 도메인을 갖는 7-관통 막횡단 분자이다. LRP5/6 보조 수용체는 단일-통과 막횡단 단백질이다. 문헌 [Huang H-C and Klein PS (2004) Genome Biol. 5(7):234]. LRP6은 오직 성인 골 항상성에만 요구되는 LRP5와 비교할 때 우세하다. 문헌 [McDonald BT et al. (2009) Developmental Cell 17(1):9-26].
비-정규 Wnt 신호전달은 β-카테닌 독립성이다. 프리즐드 수용체는 비-정규 Wnt 신호전달에 참여하지만, LRP6 보조-수용체는 비-정규 경로 활성에 필수적이지 않다. 적어도 2개의 비-정규 Wnt 신호전달 경로, 평면 세포 극성 (PCP) 경로 및 Wnt 칼슘 방출 경로가 존재한다.
Wnt/β-카테닌 신호전달은 배아 발생 동안 세포 성장 및 분화를 조절하는데 중요하다. 성인에서, Wnt 신호전달은 조직 항상성을 촉진하고, 그의 조절이상은 다양한 인간 질환, 특히 암과 관련되어 있다. 문헌 [Nusse R (2005) Cell Research 15(1):28-32].
Wnt 경로의 이상 과다활성화는 종종 결장직장 암종의 종양발생에 중요하다. 다른 암 유형 또한 비정상적 Wnt 신호전달과 연관된 것으로 나타나 왔다. 이들 다른 암 유형은 췌장암, 간암, 유방암 및 피부암을 포함한다. Wnt/PCP 비-정규 경로에서의 상승된 활성 또한 종양발생과 관련되어 있다.
Wnt 신호전달 길항제는 Wnt-의존성 종양을 치료하기 위해 개발되어 왔다. 많은 Wnt 억제제, 예컨대 포큐파인(Porcupine) 억제제, 탄키라제 억제제, 프리즐드 항체 및 LRP6 항체가 암 치료를 위해 개발되고 있다. 그러나, 대부분의 이들 Wnt 억제제는 Wnt 신호전달 경로의 상류 단백질 성분을 표적화한다. 이들 Wnt 억제제는 Wnt 경로에서 하류인 유전자에서 돌연변이를 갖는 종양에서의 Wnt 신호전달은 억제하지 않을 것이기 때문에, 하류 Wnt 경로 유전자, 예컨대 APC (선종성 결장 폴립증), AXIN1/2 및 β-카테닌에서 종양원성 돌연변이를 갖는 종양에 대해서는 종종 유효하지 않다.
Wnt 경로에서 상류인 유전자에서 돌연변이를 갖는 것으로서 확인되는 종양의 이 결여는 Wnt 억제제의 임상 개발을 방해하여 왔다. 따라서, Wnt 경로의 상류 성분인 유전자 또는 유전자 산물에서 암-연관 Wnt 경로 돌연변이를 확인하는 방법에 대한 당업계에서의 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 2개의 상동 막횡단 E3 유비퀴틴 리가제 (RNF43 및 ZNRF3)에 대한 진단 용도를 제공하며, 이들 둘 다는 프리즐드 유비퀴틴화를 통해 Wnt 수용체 복합체 프리즐드/LRP6 수준을 음성적으로 조절한다. 한 측면에서, 본 발명은 Wnt 경로의 억제제에 의해 성장이 둔화되기 쉬운 종양 세포의 선택에 대한 바이오마커로서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서의 불활성화 돌연변이의 용도를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 Wnt 억제제로의 치료를 위한 암 환자의 선택이 Wnt 억제제 치료에 대한 종양 감수성에 대한 바이오마커로서의 RNF43 또는 ZNRF3 유전자에서의 불활성화 돌연변이의 용도에 의한 것인 선택을 제공한다. 특정한 측면에서, 본 발명은 RNF43 불활성화 돌연변이, 예컨대 무의미 및 프레임 이동 돌연변이가 췌장관 선암종 (PDAC)의 원발성 종양 및 세포주에 존재함을 제공한다. 내인성 야생형 RNF43은 PDAC 세포에서 Wnt 신호전달을 조절하고 PDAC에서의 내인성 RNF43의 억제는 프리즐드 수준 및 Wnt 신호전달을 증가시키기 때문에, 본 발명은 상류 Wnt 경로 성분 (RNF43)의 암에서 돌연변이되는 것으로서의 확인을 제공한다.
본 발명은 또한 RNF43 유전자 돌연변이를 갖는 암 세포가 Wnt 경로의 억제에 대해 보다 감수성임을 나타낸다. 암 세포에서의 RNF43의 억제는 프리즐드 단백질의 증가된 세포 표면 수준을 유도한다. 따라서, 증진된 Wnt 신호전달 및 돌연변이체 RNF43을 갖는 암세포, 특히 췌장암 세포는 Wnt 길항제에 대해 보다 감수성이다. 따라서, 본 발명은 RNF43 돌연변이 상태가 Wnt 신호전달 억제제의 치료적 투여를 위한 암 환자 선택 전략으로서 사용될 수 있음을 제공한다.
Wnt 억제제는 Wnt 경로의 억제가, 예를 들어 종양 또는 비정상적 세포 성장의 치료에서 지시되는, 인간 또는 수의학적 용도를 위한 제약 조성물에 유용하다. 본 발명은 Wnt 억제제 또는 Wnt 억제제를 포함하는 제약 조성물을 Wnt 억제제에 대한 감수성을 가리키는 바이오마커를 갖는 것으로 측정된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, Wnt 억제제로 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 환자 샘플은 Wnt 억제제에 대한 감수성을 가리키는 RNF43 돌연변이 또는 ZNRF3 돌연변이의 존재에 대한 DNA 서열분석 방법에 의해 시험될 수 있다. 대안적으로, 환자 샘플은 RNF43 유전자 발현, RNF43 단백질 발현, ZNRF3 유전자 발현, ZNRF3 단백질 발현 또는 또 다른 바이오마커의 수준에 대해 시험될 수 있고, 여기서 환자의 바이오마커의 수준은 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준과 통계적으로 유사하거나 또는 그보다 낮거나, 또는 환자의 종양 세포에서의 바이오마커의 수준은 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 수준과 통계적으로 유사하다. 대조 수준은 건강한 세포 또는 조직 샘플에서의 바이오마커의 수준 또는 Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준인 바이오마커의 정상 또는 기준선 수준일 수 있다.
Wnt 억제제 또는 Wnt 억제제를 포함하는 제약 조성물은 환자의 바이오마커의 수준이 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 것인 환자의 치료에 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, Wnt 억제제 또는 Wnt 억제제를 포함하는 조성물은 환자가 암을 앓고 있는 경우에 사용되도록 의도된다.
ZNRF3 및 RNF43은 기능적 상동체이고, ZNRF3은 또한 종양의 특정 유형에서 돌연변이된다. 따라서, ZNRF3의 돌연변이 상태는 또한 Wnt 길항제의 치료적 투여를 위한 암 환자 선택에 대한 정보를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Wnt 억제제의 치료적 투여로부터 이익을 얻거나 또는 이익을 얻지 못할 것으로 예측되는 암 환자를 선택하는 방법을 제공한다. 방법은
(a) 환자로부터의 종양 세포의 샘플에서 (i) 이형접합성의 상실을 결정하기 위한 RNF43 염색체 영역 또는 ZNRF3 염색체 영역에서 검출된 DNA 카피수; (ii) RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 검출하기 위한 암 조직으로부터의 서열분석된 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA; (iii) RNF43 mRNA 발현 또는 ZNRF3 mRNA 발현을 측정하기 위한 검정의 결과; (iv) RNF43 단백질 발현 또는 ZNRF3 단백질 발현을 측정하기 위한 검정의 결과; (v) RNF43 유전자 상실 또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과; 또는 (vi) 바이오마커 (i) - (v)의 조합에 의한 것일 수 있는 바이오마커의 수준을 검출하는 단계;
(b) 종양 세포 샘플에서의 바이오마커의 수준을 (i) Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준; 및 (ii) Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커의 대조 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 환자의 종양이 Wnt 억제제에 대해 감수성일 가능성이 있음을 가리키는, RNF43 또는 ZNRF3 돌연변이를 환자의 종양이 갖거나, 또는 RNF43 mRNA 또는 단백질의 감소된 발현 또는 ZNRF3 mRNA 또는 단백질의 감소된 발현을 환자 종양이 갖는 경우에, 환자를 Wnt 억제제의 치료적 투여로부터 이익을 얻을 것으로 예측되는 것으로서 선택하는 단계
를 포함한다.
종양 세포에서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 돌연변이 상태는 하기 방법 중 임의의 것에 의해, 또는 하기 방법의 조합에 의해 검정될 수 있다.
(i) 상실된 RNF43 유전자의 카피가 하나인지 또는 둘 다인지 알아보기 위한 게놈 유전자좌 17q22에서의 염색체 17 내 RNF43 영역의 DNA 카피수 분석. 대안적으로는, 상실된 ZNRF3 유전자의 카피가 하나인지 또는 둘 다인지 알아보기 위한 게놈 유전자좌 22q12.1에서의 염색체 22 내 ZNRF3 영역의 DNA 카피수 분석. RNF43 또는 ZNRF3의 이형접합성의 상실은 Wnt 억제제로의 치료에 의한 성장 속도에서의 감소를 위해 선택된 종양에 대한 바이오마커이다.
(ii) RNF43 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 검출하기 위한 암 조직으로부터의 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA의 서열분석. RNF43 또는 ZNRF3의 불활성화 돌연변이는 Wnt 억제제로의 치료에 의한 성장 속도에서의 감소를 위해 선택된 종양에 대한 바이오마커이다. 불활성화 돌연변이는 보존된 잔기에서 아미노산 변화를 유발하는 무의미 돌연변이, 프레임이동 돌연변이, 스플라이싱 변이체 또는 과오 돌연변이일 수 있다.
(iii) 택맨 또는 다른 유사한 기술을 사용한 RNF43 mRNA 발현 검정 또는 ZNRF3 mRNA 발현 검정. mRNA에서의 무의미 또는 프레임이동 돌연변이는 종종 무의미-매개 mRNA 붕괴를 유발한다. 따라서, 암 세포에서의 RNF43 mRNA 발현의 상실은 RNF43 무의미 또는 프레임이동 돌연변이에 대한 2차 또는 대안적 검정으로서 사용될 수 있다. RNF43 mRNA의 부재는 또한 후성적 침묵에 기인할 수 있고, 이 경우에는 게놈 DNA에 돌연변이가 존재하지 않는다.
(iv) 예컨대 종양 샘플에서 정상 대조군에 비해 증가된 프리즐드 단백질 수준, 증가된 LRP6 단백질 수준, 증가된 LRP6 인산화, 및 증가된 디쉐블드(Disheveled) 인산화에 대해 검정하고 이를 검출함으로써, RNF43 유전자 상실 또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과를 검정하는 것.
Wnt 억제제로의 치료에 의한 성장 속도에서의 감소를 위해 선택된 종양에 대한 바이오마커로서 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 돌연변이 상태를 사용하는 것의 이점은 약물 개발 동안의 보다 양호한 결과이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 돌연변이 상태를 시험하기 위한 검정 또는 키트를 제공한다. 검정 또는 키트는 관련된 Wnt 억제제의 약물 승인 후 사용에 대한 동반 진단 검정일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 환자의 바이오마커의 수준 (본원에 정의된 바와 같음)이 바이오마커의 대조 수준과 통계적으로 유사하거나 또는 그보다 낮고, 대조 바이오마커 수준이 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 것인, 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 Wnt 억제제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
도 1은 LGK974 처리를 이용한 콜로니 형성 검정을 나타내는 사진이다. 도 1a는 2개 농도 (300 nM 및 1 μM)의 LGK974 존재 하의 HPAFII 세포 콜로니 형성 검정을 나타낸다. 1300개 세포를 지시된 처리와 함께 배지 내에 시딩하고, 제14일에 크리스탈 바이올렛 염색을 할 때까지 5일마다 배지를 교체하였다. LGK974는 RNF43 유전자에서 무의미 돌연변이를 보유하는 HPAFII 세포의 콜로니 형성을 억제한다. 도 1b는 단독 또는 매일 10% Wnt3a 조건화 배지 (CM)의 첨가와 함께인 1 μM LGK974 존재 하의 (기능성 RNF43 단백질을 갖는) PK1 및 (비기능성 RNF43 단백질을 갖는) HPAFII 세포 콜로니 형성 검정을 나타낸다. RNF43 야생형 PK1 세포는 10일의 검정 동안 LGK974에 대해 감수성을 나타내지 않았다. RNF43 돌연변이체 HPAFII 세포는 LGK974에 의해 억제되었고, 억제는 외인성 Wnt3a의 첨가에 의해 부분적으로 구출되었기 때문에, LGK974에 의한 성장 억제는 Wnt 신호전달 의존성이었다.
도 2는 보존된 잔기를 보여주기 위한 RNF43 단백질 및 ZNRF3 단백질의 정렬을 나타내는 차트이다. 이 정보는 불활성화 돌연변이인 과오 돌연변이를 예측하는데 사용될 수 있다. 인간 RNF43 단백질의 서열은 또한 서열 3에 제공되고, 인간 ZNRF3의 서열은 또한 서열 4에 제공된다.
도 3은 야생형 RNF43을 발현하는 췌장암 세포 YAPC에서의 RNF43에 의한 Wnt 신호전달의 음성 조절을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 3a는 YAPC 췌장암 세포주에서 RNF43의 고갈이 슈퍼 탑플래쉬(Super TOPFlash) (STF) 활성을 증가시킴을 나타낸다. YAPC-STF 세포를 Wnt3a 조건화 배지 (CM)의 부재 또는 존재 하에 지시된 siRNA로 형질감염시키고, STF 루시페라제 리포터 활성을 측정하였다. pGL2 siRNA는 음성 대조군으로서 작용한다. 도 3b는 STF 활성의 RNF43 siRNA-유도된 활성화가 내인성 Wnt에 의존성임을 나타낸다. YAPC-STF 세포를 지시된 siRNA로 형질감염시킨 다음, DMSO 또는 포큐파인 억제제 LGK974로 처리하였다. 이어서, STF 리포터 활성을 측정하였다. 도 3c는 RNF43의 고갈이 β-카테닌 표적 유전자인 AXIN2의 발현을 증가시킴을 나타낸다. 공벡터 (EV) 또는 siRNA-저항성 RNF43을 발현하는 YAPC 세포를 지시된 siRNA로 형질감염시키고, AXIN2 및 RNF43의 상대 mRNA 수준을 정량적 RT-PCR에 의해 분석하였다.
도 4는 몇몇 Wnt/β-카테닌 신호전달-관련 유전자에 대한 mRNA 수준에서의 변경을 나타내는 막대 그래프 세트이다. 도 4a는 β-카테닌의 고갈이 AXIN2 및 RNF43의 mRNA 수준을 감소시킴을 나타낸다. 세포를 siRNA로 처리하고, 지시된 유전자의 상대 mRNA 수준을 정량적 RT-PCR에 의해 분석하였다. 도 4b는 포큐파인 억제제가 RNF43 mRNA 및 AXIN2 mRNA의 발현을 감소시킴을 나타낸다. YAPC 세포를 3 μM의 IWP2 또는 1 μM의 LGK974로 처리하고, 정량적 RT-PCR에 의한 유전자 발현 분석에 적용하였다.
서론
본 발명자들은 Wnt 신호전달의 2개의 음성 조절제, 아연/링 핑거 단백질 3 (ZNRF3, 스위스-프롯(Swiss-Prot) Q9ULT6, 서열 4) 및 링 핑거 단백질 43 (RNF43, 스위스-프롯 Q68DV7, 서열 3)의 기능을 발견하였다. 문헌 [Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397):195-200]. 암-연관 링 핑거 단백질인 RNF43은 핵 단백질인 HAP95와 상호작용하는 유비퀴틴 리가제이다. 문헌 [Sugiura T et al. (2008) Exp. Cell Res. 314(7):1519-28]. ZNRF3 및 RNF43은 둘 다 Wnt 수용체 프리즐드에 대한 상동 세포 표면 막횡단 E3 유비퀴틴 리가제이다. 둘 다의 단백질은 Wnt 수용체 복합체를 구성하는 프리즐드 및 LRP6의 세포 표면 수준을 억제한다.
본 발명자들은 또한 ZNRF3이 Wnt 경로 활성화에 의해 전사적으로 유도됨을 보여주었다. ZNRF3의 과다발현은 Wnt 신호전달을 감소시킨 반면, ZNRF3 siRNA 또는 우세한 음성 ZNRF3은 Wnt 신호전달을 강력하게 증가시켰다. LRP6 인산화는 ZNRF3 억제 시에 증가되었는데, 이는 ZNRF3이 Wnt 경로의 상류에서 작용함을 나타낸다. 따라서, ZNRF3은 Wnt 리간드 자극에 대한 세포 반응성을 조절한다. 본 발명자들은 제브라피쉬 및 녹아웃 마우스를 둘 다 사용한 생체내 실험에 의해 세포 시스템에서 이 관찰을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 RNF43이 ZNRF3의 기능적 상동체이고 Wnt 신호전달을 조절함을 보여주었다.
RNF43 및 췌장 종양
췌장관 선암종 (PDAC)은 췌장암의 가장 흔한 형태이다. PDAC는 극도로 공격성이고 참담한 예후와 연관된다. 문헌 [Matthaei H et al. (2011) Ann. Surg. Oncol. 18(12):3493-9; Luebke AM et al. (2012) Pancreatology 12(1):16-22; Hezel AF (2006) Genes Dev. 20(10)]. 췌장 상피내 신생물 (PanIN), 관내 유두상 점액성 신생물 (IPMN) 및 점액성 낭성 신생물 (MCN)은 PDAC에 대한 전구체로 간주된다. 그의 관 특징에도 불구하고, PDAC가 반드시 관 구획으로부터 발생하는 것은 아니다.
Wnt/β-카테닌 신호전달 경로는 췌장 발달 동안 동적으로 조절되고, 외분비 췌장의 발달에 요구된다. 문헌 [Wells JM (2007) BMC Dev. Biol. 7:4]. Wnt/β-카테닌 신호전달의 억제는 췌장의 선방 발달은 방해하지만 섬 발달은 방해하지 않는다. 성체 마우스의 췌장에서의 안정화된 β-카테닌의 유도성 발현은 도세포에 최소한의 효과를 주면서 성숙 외분비 세포의 증식을 증가시킨다. 문헌 [Heiser PW et al. (2006) Development 133(10):2023-32]. Wnt 경로 활성화가 PDAC의 유지 및/또는 진행에 기여할 수 있다는 증거가 많아지고 있다. 문헌 [Morris JP et al. (2010) Nat. Rev. Cancer 10(10):683-95]. PDAC의 하위세트에서 β-카테닌의 핵 또는 세포질 축적이 관찰되었는데 (문헌 [Pasca di Magliano M et al. (2007) PLoS One 2(11):e1155]), 이는 경로가 활성화되었음을 가리킨다. 시토졸 및 핵 β-카테닌의 수준은 PanIN 등급 및 PDAC의 발병과 양의 상관관계가 있기 때문에 (문헌 [Wang L et al. (2009) Cancer Sci. 101(3):700-6]), β-카테닌 신호전달은 PDAC의 진행을 촉진한다. β-카테닌의 고갈은 PDAC 세포의 증식을 감소시켰고, 이는 형질전환 표현형의 유지에서의 β-카테닌의 중요성을 나타낸다.
RNF43은 IMPN 및 MCN에서 빈번하게 돌연변이된다 (문헌 [Furukawa T et al.(2011) Sci. Rep. 1:161; Wu J et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(52):21188-93]). IPMN 및 MCN은 침습성 췌장관 선암종 (PDAC)에 대한 전구체이다.
인간 RNF43의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 전장 인간 RNF43 cDNA (NM_017763.4)는 상업적 공급원 (예를 들어, 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems), 미국 06033 코네티컷주 글래스톤베리)으로부터 구입할 수 있다. RNF43에 관한 추가 정보에 대해서는 미국 특허 번호 7,425,612를 참조한다. TAT179 폴리펩티드는 신호 펩티드 뒤의 RNF43 세포외 영역과 동일하다. EP1487877B1로서 유럽에서 허여된 국제 특허 출원 WO2003/024392를 참조한다.
최근에, RNF43은 낭성 췌장 종양에서의 종양 억제자인 것으로 제안되었다. 문헌 [Wu J et. al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108:2188]. 전체 엑솜 서열분석 연구에서, 8개의 관내 유두상 점액성 신생물 (IPMN) 중 6개 및 8개의 점액성 낭성 신생물 (MCN) 중 3개가 RNF43의 불활성화 돌연변이를 보유하는 것으로 나타났다. RNF43에서의 불활성화 돌연변이의 우세 및 그의 유전자좌의 이형접합성의 상실 (LOH)은 RNF43을 IPMN 및 MCN 둘 다에서의 종양 억제자로서 확립시킨다. 그들의 보고에서, 우(Wu) 등은 RNF43의 기능적 연구는 제공하지 않았다.
보다 최근에, Znrf3 및 Rnf43 둘 다의 장-특이적 결실은 마우스에서 장음와의 과다증식 및 장 선종의 형성을 유도하는 것으로 나타났다. 문헌 [Koo BK et al. (2012) Nature 488(7413):665-9]. 또한, RNF43의 돌연변이가 낭성 췌장 종양을 비롯한 다양한 종양에서 확인되었다. 이들 연구는 RNF43이 ZNRF3과 같이 Wnt/β-카테닌 신호전달의 음성 조절제로서 작용함을 나타낸다.
그러나, RNF43이 중요한 세포 시스템은 확인되지 않았고, RNF43의 시험관내 기능 상실 연구는 가능하지 않았다. 따라서, 암에서의 RNF43 돌연변이의 생리학적 관련성은 이전에 공지된 바 없었다.
Wnt/β-카테닌 경로
진화적으로 보존된 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로는 배아 발생 및 성체 조직 항상성에 중요하다. 문헌 [Logan CY and Nusse R (2004) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:781-810; Clevers H (2006) Cell 127(3):469-80]. Wnt 신호전달은 전사 보조인자 β-카테닌의 턴-오버를 조절하고, 주요 발달 유전자 발현 프로그램을 제어한다. 문헌 [MacDonald BT et al. (2009) Dev. Cell. 17(1):9-26]. Wnt 경로 활성화의 부재 하에, 시토졸 β-카테닌은 β-카테닌 파괴 복합체와 연관되고, 이는 선종성 결장 폴립증 (APC), AXIN 및 글리코겐 신타제 키나제 3α/β (GSK3α/β)를 포함하는 다중 단백질을 함유한다. 이 복합체에서, β-카테닌은 GSK3에 의해 구성적으로 인산화되고, 인산화된 β-카테닌은 유비퀴틴 프로테아솜 경로에 의해 분해된다. Wnt 신호는 그의 2개의 수용체 프리즐드 및 LRP5/6에 의해 수용되고, 이는 β-카테인 파괴 복합체의 해리를 유발한다. 안정화된 β-카테닌은 핵에 진입하고, TCF 패밀리 전사 인자에 결합하고, 전사를 일으킨다.
Wnt/β-카테닌 신호전달의 이상 활성화는 종양발생과 관련되고, Wnt 경로의 많은 하류 성분은 암에서 돌연변이된다. APC의 말단절단 돌연변이는 결장직장암의 80%에서 발견된다. β-카테닌의 안정화 돌연변이 및 AXIN1/2의 기능 상실 돌연변이 또한 다양한 암에서 발견된다. 집중적인 연구에도 불구하고, 하류 경로 돌연변이를 보유하는 암에서 β-카테닌 신호전달을 표적화하는 것은 다루기 쉬운 표적의 결여로 인해 여전히 과제로 남아있다. 반면에, Wnt 신호전달 경로의 상류에는 몇몇 다루기 쉬운 표적이 존재한다. 상류 Wnt 신호전달을 표적화하는, LRP6 항체 (문헌 [Ettenberg S et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(35):15473-8]), 프리즐드 항체 (문헌 [Gurney A et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29):11717-22]) 및 포큐파인 억제제 (문헌 [Chen B et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2):100-7])를 포함하는 다양한 작용제가 개발되고 있다. 그러나, 이들 분자는 하류 돌연변이를 갖는 종양에서의 β-카테인 신호전달은 억제하지 않을 것이기 때문에 이전에는 이들 작용제의 임상 개발이 어려웠고, 리간드-유도된 Wnt/β-카테인 신호전달에 빠진 인간 종양을 확인하기 위한 도전은 계속되고 있다.
정의
미국 특허 번호 8,093,011 및 미국 특허 번호 8,093,011 (이들 둘 다는 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 "암"은 비조절된 성장, 분화의 결여, 및 국부 조직에 침입하고 전이하는 능력을 특징으로 하는 광범위한 세포성 악성종양의 일반명이다. 이들 신생물성 악성종양은 다양한 정도의 유병률로 신체에서의 모든 조직 및 기관에 영향을 미친다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "암"은 암-유발 세포의 전형적인 특징, 예컨대 탈제어된 증식, 불멸성, 전이 잠재력, 빠른 성장 및 증식 속도 및 특정의 특징적인 형태학적 특성을 보유하는 세포의 존재를 지칭한다. 종종, 암 세포는 종양의 형태일 수 있지만, 이러한 세포는 단독으로 존재할 수도 있고, 독립적인 세포, 예컨대 백혈병성 세포로서 혈류에서 순환할 수도 있다.
"비정상적 세포 성장"은 정상적 조절 메카니즘과 독립적인 세포 성장 (예를 들어, 접촉 억제의 상실)을 지칭한다. 이는 (1) 세포에서 Wnt 경로의 과다활성에 의해 증식하는 종양 세포 (종양); (2) 세포에서 Wnt 경로의 이상 과다활성이 발생하는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포; (4) 세포에서 Wnt 경로의 과다활성에 의해 증식하는 임의의 종양; (5) 세포에서 Wnt 경로의 과다활성에 의해 증식하는 임의의 종양; 및 (6) Wnt 경로의 이상 과다활성이 발생하는 다른 증식성 질환의 양성 및 악성 세포의 비정상적 성장을 포함한다.
"바이오마커"는 유기체, 예컨대 인간의 특정한 질환 상태 또는 일부 다른 생리학적 상태의 지시자로서 사용될 수 있는 모든 것이다. 바이오마커는 측정되고 생리학적 상태와 상관관계가 있을 수 있는, 유전자, 유전자의 대립유전자의 존재, 유전자 발현의 측정치, 단백질, 또는 단백질 활성의 기능적 효과일 수 있다. 바이오마커는 의사가 진단을 하고 치료 과정을 선택하는데 있어서의 결정을 돕기 위해 사용할 수 있는 실험 파라미터로서 의약에 사용된다.
"이형접합성의 상실" (LOH)은 정상 세포와 비교할 때 거의 모든 다양한 암이 겪는 유전 물질 (DNA)의 결실이다. 미국 특허 번호 7,718,364 (그의 전문이 참조로 포함됨)를 참조한다. 암 세포로부터의 유전 물질의 상실은 염색체 상의 특정한 유전자좌에서 세포 성장에 영향을 미칠 수 있는 유전자의 2개 이상의 대립유전자 중 1개의 선택적 상실을 유발할 수 있다. 유전적 이질성 또는 DNA 다형성에 기인하여, 다수의 유전자의 쌍을 이루는 대립유전자는 서로 다르다. 2개의 대립유전자가 동일한 경우에, 개체는 그 특정한 유전좌자에서 그 대립유전자의 쌍에 대해 동형접합이라고 언급된다. 달리, 2개의 대립유전자가 상이한 경우에, 개체는 그 유전자좌에서 이형접합이다. 전형적으로, 대립유전자는 둘 다 전사되고, 궁극적으로 동형접합의 경우에 동일한 단백질로 또는 이형접합의 경우에 상이한 단백질로 번역된다. 한 쌍의 이형접합 대립유전자 중 1개가 쌍을 이루는 염색체 중 1개로부터 DNA의 결실로 인해 상실되면, 남아있는 대립유전자만이 발현될 것이고, 영향을 받은 세포는 기능적으로 동형접합일 것이다. 이 상황이 "이형접합성의 상실" (LOH) 또는 동형접합성으로의 감소로 칭해진다. DNA 프로브의 사용을 통해, 개체의 정상 세포로부터의 DNA를 동일한 개체의 종양 세포로부터 추출된 DNA와 비교할 수 있고, LOH는 당업계에 익히 공지된 실험 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 대안적으로, LOH는 정상 이형접합 세포에서의 단백질의 2개의 다형체 형태, 및 대립유전자의 결실이 발생한 암 세포에서의 오직 1개의 형태를 입증함으로써 검정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lasko et al. (1991) Annu. Rev. Genet. 25:281-314]을 참조한다. 특정한 염색체 영역 상의 빈번한 LOH가 많은 종류의 악성종양에서 보고되어 왔고, 이는 이들 유전자좌 상에서의 또는 근처에서의 추정 종양 억제자 유전자 또는 종양-관련 유전자의 존재를 나타낸다. 따라서, LOH 분석은 추정 유전자가 존재하는 영역을 좁히고 확인함으로써 종양 억제자 유전자를 찾기 위한 강력한 도구이다. 문헌 [Vogelstein et al. (1988) New Engl. J. Med. 319(9):525-532; Fearon et al. (1990) Cell 61:759-767; 및 Friend et al., Nature 323:643-646 (1986)]을 참조한다. 분석은 많은 종류의 후보 종양 억제자 또는 종양-관련 유전자를 확인하여 왔다. 문헌 [Call et al. (1990) Cell 60:509-520; Kinzler et al. (1991) Science 253:661-665; 및 Baker et al. (1989) Science 244:217-221]을 참조한다.
"기능 상실" (LOF) 돌연변이는 그의 결과가 세포 또는 유기체 (인간 세포 또는 인간 포함)에서 유전자 산물 (예컨대, 코딩된 단백질)이 정상보다 적은 기능을 갖거나 또는 기능을 갖지 않는 것인 유전자의 돌연변이 또는 대립유전자이다. 대립유전자가 완전한 기능 상실을 갖는 경우 (널(null) 대립유전자), 이는 종종 무정형 돌연변이로 불린다. 기능 상실 돌연변이와 연관된 표현형은 종종 열성이다.
"치환"은 1개의 염기를 또 다른 것으로 교환하는 돌연변이이다 (즉, 단일 "화학적 문자"에서의 변화, 예컨대 A에서 G로의 교체). 이러한 치환은 (1) 코돈을 상이한 아미노산을 코딩하는 것으로 변화시켜 생산되는 단백질에서 작은 변화를 야기하거나 (예를 들어, 겸상 적혈구성 빈혈은 생산되는 단백질에서 단일 아미노산을 변경하는 베타-헤모글로빈 유전자에서의 치환에 의해 야기됨); (2) 코돈을 동일한 아미노산을 코딩하는 것으로 변화시켜 생산되는 단백질에서 변화를 야기하지 않거나 ("침묵 돌연변이"); 또는 (3) 아미노산-코딩 코돈을 단일 "정지" 코돈으로 변화시켜 불완전 단백질 (불완전 단백질은 통상적으로 비기능성임)을 야기할 수 있다.
"삽입"은 여분의 염기 쌍이 DNA에서의 장소 내에 삽입된 돌연변이이다.
"결실"은 DNA의 절편이 상실되거나 또는 결실된 돌연변이이다.
"프레임이동"은 DNA 서열로부터 3으로 균일하게 나눌 수 없는 다수의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실에 의해 야기되는 돌연변이이다. 코돈에 의한 유전자 발현의 트리플렛 성질에 기인하여, 삽입 또는 결실은 리딩 프레임 (코돈의 집단)을 변화시켜 본래의 것과 완전히 상이한 번역을 유발할 수 있다. 이는 기능 상실을 유발하는 말단절단된 단백질을 종종 생성한다.
"생거(Sanger) 서열분석" (그것의 발명자 프레드릭 생거(Frederick Sanger)의 이름을 따서 명명됨)은 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 사슬-종결제 방법이다. 생거 서열분석 방법의 특징은 DNA 사슬 종결제로서의 디데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (ddNTP)의 사용이다. 생거 서열분석 방법은 종종 자동화 방법이다.
"차세대 서열분석" 방법은 서열분석 과정을 평행화하여 동시에 수천 또는 수백만 개의 서열을 생성하는 최근 개발된 고처리량 서열분석 방법의 군이다. 생성되는 데이터의 증가와 이들 데이터를 생성하기 위해 요구되는 비용의 저하의 조합은 이 기술을 당업자가 다루기 쉬운 범용 도구로서 인식하게 하였다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"은, 달리 나타내지 않는 한, 환자에서 종양의 성장, 종양 전이 또는 다른 암-유발 또는 신생물성 세포를 부분적으로 또는 완전히 역전시키거나, 완화시키거나, 그의 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료"는, 달리 나타내지 않는 한, 치료하는 활동을 지칭한다.
어구 "치료하는 방법" 또는 그의 등가물은, 암 치료에 적용되는 경우에 암 세포의 수를 감소시키거나 또는 제거하도록 또는 암의 증상을 완화시키도록 설계된 활동의 절차 또는 과정을 지칭한다. 암 또는 또 다른 증식성 장애를 "치료하는 방법"은 반드시 암 세포 또는 다른 장애 세포가 실제로 제거되거나, 세포의 수 또는 장애가 실제로 감소되거나, 또는 암 또는 다른 장애의 증상이 실제로 완화되는 것을 의미하지는 않는다. 종종, 암을 치료하는 방법은 심지어 낮은 성공 가능성으로도 수행될 것이지만, 그럼에도 불구하고 병력 및 추정 기대 생존기간을 고려하여 전체적으로 유익한 활동 과정으로 간주된다.
"치료상 유효한 작용제"는 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 모색되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하는 조성물이다.
"치료 유효량" 또는 "유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 모색되는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출하는 대상 화합물 또는 조합물의 양이다.
"억제제"는 상기 기재된 바와 같은 자연 발생 또는 참조 화합물의 효과를 억제하는 (예를 들어, 길항하거나, 감소시키거나, 축소시키거나, 차단하거나, 역전시키거나, 또는 변경하는) 화합물이다. 이러한 억제제는 임의의 화합물, 단백질, 펩티드 또는 핵산 (리보자임 및 안티센스 포함) 또는 길항 효과를 제공하는 약물/화합물/펩티드 설계 또는 선택의 생성물을 포함할 수 있다.
"단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 핵산 분자는 그의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자 (즉, 인간 조작에 적용된 것)이고, 그의 천연 환경은 자연에서 핵산 분자가 발견되는 게놈 또는 염색체이다. 이에 따라, "단리된"은 반드시 핵산 분자가 정제되는 정도를 반영하는 것은 아니지만, 분자가 자연에서 핵산 분자가 발견되는 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않음을 나타낸다. 폴리뉴클레오티드, 예컨대 (예를 들어, 유전자에 대한 혼성화에 의해) 유전자를 검출하기 위해 본 발명의 방법에 사용되는 것은 전형적으로 주어진 샘플 (예를 들어, 세포 샘플)에서 전장 유전자 (또는 그의 일부)의 확인을 위한 혼성화 프로브 또는 PCR 프라이머로서 사용하기에 적합한 표적 유전자의 일부이다. 단리된 핵산 분자는 유전자 또는 유전자의 일부 (예를 들어, 조절 영역 또는 프로모터)를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자는 이러한 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라, 유전자와 연관된 코딩 영역 및 조절 영역은 포함하지만, 동일한 염색체 상에서 자연적으로 발견되는 추가의 유전자는 포함하지 않는 것이다. 단리된 핵산 분자는 또한 자연에서는 명시된 핵산 분자 서열에 일반적으로 플랭킹되지 않는 추가의 핵산 (즉, 이종 서열)이 플랭킹된 (즉, 서열의 5' 말단 또는 3' 말단, 또는 둘 다에서) 명시된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예를 들어, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA의 유도체 (예를 들어, cDNA)를 포함할 수 있다. 어구 "핵산 분자"는 주로 물리적 핵산 분자를 지칭하고, 어구 "핵산 서열"은 주로 핵산 분자 상의 뉴클레오티드의 서열을 지칭하지만, 2개의 어구는 특히 단백질을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 관해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 단리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성을 사용하여 생산될 수 있다.
"프로브" (올리고뉴클레오티드 프로브)는 전형적으로 크기가 약 50-100개 뉴클레오티드 내지 수백 개 뉴클레오티드 내지 수천 개 뉴클레오티드 길이의 범위인 핵산 분자이다. 따라서, 프로브는 정수 증가분 내에서 50 내지 수천 개 뉴클레오티드 범위의 임의의 길이를 포함하는, 본원에 기재된 검정에 사용하기 위한 임의의 적합한 길이일 수 있다. 이러한 분자는 전형적으로 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 핵산 서열에 혼성화함으로써 샘플에서 이러한 표적 핵산 서열을 확인하는데 사용된다. 혼성화 조건은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press]을 참조한다.
"프라이머" 또한 핵산 서열이다. PCR 프라이머는, 전형적으로 폴리머라제 연쇄 반응에 사용되는 매우 짧은 길이 (예를 들어, 8-30개 뉴클레오티드)의 올리고뉴클레오티드이다. PCR 프라이머 및 혼성화 프로브는 표적 서열로부터의 서열 정보를 사용하여 당업자에 의해 용이하게 개발 및 제조될 수 있다. 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press]을 참조한다.
용어 "시험 샘플" 또는 "환자 샘플"은 단리된 세포의 샘플, 조직 샘플 또는 체액 샘플을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본 발명의 방법에 의해 평가되는 세포 또는 세포로부터 분비된 생성물을 함유하는 임의 유형의 샘플을 지칭하는데 일반적으로 사용될 수 있다. 단리된 세포의 샘플은 전형적으로 현탁액 중의, 또는 생체내 조직 내에서 세포를 결합시킬 수 있는 결합 조직으로부터 분리된 세포의 시편이고, 이는 본 발명의 방법에 의한 평가에 적합한 수의 세포의 수집물을 생성하는 임의의 적합한 방법에 의해 기관, 조직 또는 유체로부터 수집된다. 세포 샘플에서의 세포는 반드시 동일한 유형의 것은 아니지만, 바람직하게 평가되는 세포의 유형을 풍부하게 하기 위해 정제 방법이 사용될 수 있다. 세포는, 예를 들어 조직의 해체, 개별 세포를 방출시키기 위한 조직 샘플의 가공, 또는 체액으로부터의 단리에 의해 수득될 수 있다.
"조직 샘플"은 단리된 세포의 샘플과 유사하지만, 임의로 세포를 지탱하는 세포골격 구조와 함께인, 전형적으로 몇몇 세포 유형을 포함하는 신체의 기관 또는 조직의 절편으로서 본원에 정의된다. 용어 "조직 샘플"은 일부 경우에 "세포 샘플"과 상호교환적으로 사용될 수 있지만, 용어 "조직 샘플"이 세포 샘플보다 더 복잡한 구조를 지정하는데 더 자주 사용될 수 있다. 조직 샘플은, 예를 들어 절단, 슬라이싱 또는 펀칭에 의한 것을 포함하는 생검에 의해 수득될 수 있다.
조직 샘플과 마찬가지로, "체액 샘플"은 평가되는 세포를 함유하고, 샘플링되는 특정한 체액에 적합한 임의의 방법에 의해 수득된 유체이다. 샘플링에 적합한 체액은 혈액, 점액, 정액, 타액, 객담, 기관지 세척액, 모유, 담즙 및 소변을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"대조 수준"은 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 수준 또는 Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 수준을 포함할 수 있는 이형접합성의 대조 수준이다. 따라서, 이형접합성의 상실의 대조 또는 기준선 수준과 비교할 때, 환자 샘플이 Wnt 억제제 요법에 대해 감수성 또는 저항성일 가능성이 보다 높은지 (예를 들어, 양호한 반응자 또는 반응자 (요법으로부터 이익을 얻을 사람)인지, 또는 불량한 반응자 또는 비-반응자 (요법으로부터 이익을 얻지 못하거나 또는 이익을 거의 얻지 못할 사람)인지)를 결정할 수 있다. 보다 구체적으로, "대조 수준"은 이형접합성의 대조 수준; 야생형, 정상 또는 기준선 상태를 나타내는 DNA, cDNA 또는 RNA 서열; RNF43 mRNA 또는 활성의 대조 수준; ZNRF3 mRNA 또는 활성의 대조 수준 또는 활성, RNF43 유전자 상실 또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과를 나타낼 수 있고, 이는 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 수준, 서열 또는 효과, 또는 Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 수준을 포함할 수 있다. 따라서, 대조 이형접합성; 야생형, 정상 또는 기준선 상태를 나타내는 DNA, cDNA 또는 RNA 서열; 정상 또는 기준선 RNF43 mRNA 또는 활성, 정상 또는 기준선 ZNRF3 mRNA 또는 활성, 또는 RNF43 또는 ZNRF3 유전자의 정상 또는 기준선 기능적 효과와 비교할 때, 환자 샘플, 암 세포 또는 세포가 Wnt 억제제에 대해 감수성 또는 저항성일 가능성이 보다 높은지를 결정할 수 있다. "대조 수준"은 비-암성의 건강한 야생형 조직 또는 세포에서, 또는 특정한 실시양태에서 위약 처리된 종양 세포에서 비교를 위해 측정된 서열, 파라미터 또는 수준을 지칭할 수 있다.
용어 "매칭된 개체"는 평가되는 세포 또는 종양 성장의 유형에 적합한 하나 이상의 특징에 기반한 대조 개체의 매칭을 지칭한다. 대조 개체는 평가되는 환자와 성별, 연령, 인종, 또는 대조 개체 및 환자의 기준선에 영향을 미칠 수 있는 임의의 관련 생물학적 또는 사회학적 인자 (예를 들어, 기존 조건, 특정한 물질의 소모, 다른 생물학적 또는 생리학적 인자의 수준)에 기반하여 매칭될 수 있다.
"제약 조성물"은 활성제 및 또 다른 담체, 예를 들어 불활성 (예를 들어, 검출가능한 작용제 또는 표지) 또는 활성인 화합물 또는 조성물, 예컨대 아주반트, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지성 용매, 보존제, 아주반트 등의 조합물이다. 담체는 또한, 단독으로 또는 조합되어 존재할 수 있고, 단독으로 또는 조합되어 중량 또는 부피 기준 1-99.99%로 포함되는, 제약 부형제 및 첨가제, 예를 들어 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물 (예를 들어, 당, 예컨대 모노사카라이드 및 올리고사카라이드; 유도체화 당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당 등; 및 폴리사카라이드 또는 당 중합체)을 포함한다. 탄수화물 부형제는, 예를 들어 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 디사카라이드, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨 소르비톨 (글루시톨) 및 미오이노시톨을 포함한다. 이는 고체 또는 액체 형태일 수 있다.
방법
한 실시양태에서, 본 발명은 Wnt 억제제의 치료적 투여로부터 이익을 얻거나 또는 이익을 얻지 못할 것으로 예측되는 암 환자를 선택하는 방법을 제공한다. 방법은
(a) 환자로부터의 종양 세포의 샘플에서 (i) 이형접합성의 상실을 결정하기 위한 RNF43 염색체 영역 또는 ZNRF3 염색체 영역에서 검출된 DNA 카피수; (ii) RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 검출하기 위한 암 조직으로부터의 서열분석된 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA; (iii) RNF43 mRNA 발현 또는 ZNRF3 mRNA 발현을 측정하기 위한 검정의 결과; (iv) RNF43 mRNA 발현 또는 ZNRF3 mRNA 발현을 측정하기 위한 검정의 결과; (v) RNF43 유전자 상실 또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과; 또는 (vi) 바이오마커 (i) - (v)의 조합에 의한 것일 수 있는 바이오마커의 수준을 검출하는 단계;
(b) 종양 세포 샘플에서의 바이오마커의 수준을 (i) Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준; 및 (ii) Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커의 대조 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 환자의 종양이 Wnt 억제제에 대해 감수성일 가능성이 있음을 가리키는, RNF43 또는 ZNRF3 돌연변이를 환자의 종양이 갖거나, 또는 RNF43 mRNA 또는 단백질의 감소된 발현 또는 ZNRF3 mRNA 또는 단백질의 감소된 발현을 환자 종양이 갖는 경우에, 환자를 Wnt 억제제의 치료적 투여로부터 이익을 얻을 것으로 예측되는 것으로서 선택하는 단계
를 포함한다.
종양 세포에서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 돌연변이 상태는 하기 방법 중 임의의 것에 의해, 또는 하기 방법의 조합에 의해 검정될 수 있다.
(i) 상실된 RNF43 유전자의 카피가 하나인지 또는 둘 다인지 알아보기 위한 게놈 유전자좌 17q22에서의 염색체 17 내 RNF43 영역의 DNA 카피수 분석. 대안적으로는, 상실된 ZNRF3 유전자의 카피가 하나인지 또는 둘 다인지 알아보기 위한 게놈 유전자좌 22q12.1에서의 염색체 22 내 ZNRF3 영역의 DNA 카피수 분석. RNF43 또는 ZNRF3의 이형접합성의 상실은 Wnt 억제제로의 치료에 의한 성장 속도에서의 감소를 위해 선택된 종양에 대한 바이오마커이다.
(ii) RNF43 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 검출하기 위한 암 조직으로부터의 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA의 서열분석. RNF43 또는 ZNRF3의 불활성화 돌연변이는 Wnt 억제제로의 치료에 의한 성장 속도에서의 감소를 위해 선택된 종양에 대한 바이오마커이다. 불활성화 돌연변이는 보존된 잔기에서 아미노산 변화를 유발하는 무의미 돌연변이, 프레임이동 돌연변이, 스플라이싱 변이체 또는 과오 돌연변이일 수 있다.
(iii) 택맨 또는 다른 유사한 기술을 사용한 RNF43 mRNA 발현 검정 또는 ZNRF3 mRNA 발현 검정. mRNA에서의 무의미 또는 프레임이동 돌연변이는 종종 무의미-매개 mRNA 붕괴를 유발한다. 따라서, 암 세포에서의 RNF43 mRNA 발현의 상실은 RNF43 무의미 또는 프레임이동 돌연변이에 대한 2차 또는 대안적 검정으로서 사용될 수 있다. RNF43 mRNA의 부재는 또한 후성적 침묵에 기인할 수 있고, 이 경우에는 게놈 DNA에 돌연변이가 존재하지 않는다.
(iv) 예컨대 종양 샘플에서 정상 대조군에 비해 증가된 프리즐드 단백질 수준, 증가된 LRP6 단백질 수준, 증가된 LRP6 인산화, 및 증가된 디쉐블드 인산화에 대해 검정하고 이를 검출함으로써, RNF43 유전자 상실 또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과를 검정하는 것 (여기서, 종양 샘플에서의 증가된 프리즐드 단백질 수준, 증가된 LRP6 단백질 수준, 증가된 LRP6 인산화, 및 증가된 디쉐블드 인산화는 RNF43 유전자 바이오마커 또는 ZNRF3 유전자 바이오마커의 대조 수준보다 낮은 것을 가리킴).
검출 단계는 서열 1 (RNF43의 경우) 또는 서열 2 (ZNRF3의 경우)에 제공되는 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 프로브의 사용에 의한 것일 수 있다.
불활성화 돌연변이는 보존된 잔기에서 아미노산 변화를 유발하는 무의미 돌연변이 (표 1 및 표 2 참조), 프레임이동 돌연변이 (표 1 및 표 2 참조), 스플라이스 부위 돌연변이 또는 과오 돌연변이일 수 있다. 도 2는 인간 RNF43 및 ZNRF3 단백질의 정렬을 나타내고, 이는 단백질에서 어떤 아미노산이 보존되는지에 대한 가이드를 제공한다.
스플라이스 부위 돌연변이는 전구체 메신저 RNA의 성숙 메신저 RNA로의 프로세싱 동안 인트론의 스플라이싱이 발생하는 특정한 부위에서 다수의 뉴클레오티드를 삽입하거나 또는 결실시키는 유전자 돌연변이이다. 스플라이싱 부위의 소실은 성숙 mRNA에 남아있는 하나 이상의 인트론을 유발하여 이상 단백질의 생산을 유도할 수 있다.
mRNA에서의 무의미 또는 프레임이동 돌연변이는 종종 무의미 매개 mRNA 붕괴를 유발한다. 따라서, 암 세포에서의 RNF43 mRNA 발현의 상실은 RNF43 무의미 또는 프레임이동 돌연변이에 대한 2차 또는 대안적 검정으로서 사용될 수 있다. RNF43 mRNA의 부재는 또한 후성적 침묵에 기인할 수 있고, 이 경우에는 게놈 DNA에 돌연변이가 존재하지 않는다.
비교 단계는 종양 세포에서의 바이오마커 수준을 Wnt 억제제에 대해 저항성인 하나 이상의 대조 세포 또는 Wnt 억제제에 대해 감수성인 하나 이상의 대조 세포에서의 바이오마커의 대조 수준과 비교하는 것에 의할 수 있다. 한 측면에서, Wnt 억제제에 대한 감수성 또는 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준은 사전 결정되어 있다.
환자를 Wnt 억제제 요법으로부터 이익을 얻거나 또는 이익을 얻지 못할 것으로 예측되는 것으로서 선택하는 단계의 경우에는, 시험되는 환자의 대다수에 대해, 대부분의 환자가 Wnt 억제제에 의한 치료에 대해 저항성인 종양을 앓고 있을 것으로 생각된다. Wnt 신호전달에 대한 종양의 의존성은 성장 인자 신호전달에 대한 종양의 의존성만큼 빈번하지 않을 것으로 예상된다. 또한, Wnt 의존성 종양이 Wnt 경로에서 하류인 유전자 돌연변이를 갖는다면, 종양은 대부분의 현행 Wnt 억제제에 대해 반응하지 않을 것이다. 따라서, Wnt 억제제 치료에 대한 양호한 반응자인 암 환자의 세트를 치료를 위해 선택하는 것에 대한 당업계의 필요성이 존재한다. 양호한 반응자를 예측하는 능력은 암 환자로부터의 종양에서 RNF43 돌연변이 상태 또는 ZNRF3 돌연변이 상태를 결정하는 것의 주요 용도이다.
상기 기재된 본 발명의 방법의 임의의 실시양태는 임의 유형의 암을 앓고 있는 환자와 함께 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 환자는 관 암종, 선암종 또는 흑색종 (표 1 참조)을 앓고 있다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 췌장암, 결장암, 식도암 또는 피부암 (표 1, 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5 참조)을 앓고 있다. 본 발명의 또 다른 방법에서, 환자는 RNF43 돌연변이를 갖는 위 종양을 앓고 있다.
상기 기재된 본 발명의 임의의 실시양태에서, 임의의 Wnt 억제제에 대한 반응성을 평가할 수 있다. 시험관내에서, Wnt 억제제의 반응성은 표준 세포 증식, 분화 및 아폽토시스 검정에서 결정할 수 있다. 종양 세포에서의 Wnt 신호전달의 상태에 대한 Wnt 억제제의 효과는 β-카테닌, β-카테닌 표적 유전자 AXIN2의 mRNA 발현 및 LRP6의 인산화의 수준을 검사함으로써 평가할 수 있다. 임상에서, 평가는 그것이 고형 종양 또는 종양 상태에 대한 바이오마커인 경우에, 영상화, 예를 들어 PET 스캔에 의한 종양 수축의 양을 기반으로 한다.
종양 부피에 대한 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 [Therasse P. et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92(3): 205-216]을 참조한다. 동일한 평가 방법 및 동일한 기술이 기준선에서 및 추적조사 동안 확인되고 보고된 각각의 병변을 특성화하는데 사용되어야 한다. 둘 다의 방법이 치료의 항종양 효과를 평가하는데 사용되는 경우에, 영상화-기반 평가가 임상 검사에 의한 평가에 바람직하다.
임상 검사. 임상적으로 검출되는 병변은 그것이 표재성 (예를 들어, 피부 결절 및 촉진성 림프절)인 경우에만 측정가능한 것으로 간주될 것이다. 피부 병변의 경우에, 컬러 사진촬영에 의한 문서화 - 병변의 크기를 추정하기 위한 자 포함 - 가 권고된다.
흉부 X선. 흉부 X선 상의 병변은 이들이 통기시킨 폐에 의해 명백하게 한정되고 둘러싸인 경우에 측정가능한 병변으로서 허용된다. 그러나, CT가 바람직하다. 목적 종양 반응 평가를 위한 이 평가 방법의 사용에 관한 보다 세부적인 사항은 문헌 [Therasse P et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92 (3): 205-216]에 제공된다.
CT 및 MRI. X선 컴퓨터 단층촬영 (CT) 및 자기 공명 영상화 (MRI)는 반응 평가를 위해 선택된 표적 병변을 측정하기 위한, 가장 우수하게 현재 이용가능하고 가장 재현가능한 방법이다. 통상의 CT 및 MRI는 절편 두께가 10 mm 이하인 연속 절단면으로 수행되어야 한다. 나선형 CT는 5-mm 연속 재구성 알고리즘의 사용에 의해 수행되어야 하고; 이 명세는 흉부, 복부 및 골반의 종양에 적용되는 반면, 두경부 종양 및 사지의 것은 통상적으로 특정한 프로토콜을 요구한다. 문헌 [Therasse P et al. (2000) J. Natl. Cancer Inst. 92 (3): 205-216]을 참조한다.
초음파. 연구의 1차 종점이 목적 반응 평가인 경우에, 초음파는 임상적으로 용이하게 접근가능하지 않은 종양 병변을 측정하는데는 사용되지 않아야 한다. 이는 표재성 촉진성 림프절, 피하 병변 및 갑상선 결절에 대한 임상 측정에 대한 가능한 대안으로서 사용될 수 있다. 초음파는 또한 통상적으로 임상 검사에 의해 평가되는 표재성 병변의 완전한 소멸을 확인하는데 유용할 수 있다. 목적 반응 평가를 위한 종양 병변을 측정하기 위해 초음파를 사용하지 않는 것에 대한 정당화는 부록 I에 제공된다.
내시경검사 및 복강경검사. 목적 종양 평가를 위한 이들 기술의 이용은 아직 충분하게 또는 광범위하게 검증되지 않았다. 이 특정한 맥락에서의 그의 사용은 오직 일부 기관에서만 이용가능할 수 있는 정교한 장비 및 높은 수준의 전문기술을 요구한다. 따라서, 목적 종양 반응에 대한 이러한 기술의 이용은 특수화된 기관에서의 검증 목적으로 제한되어야 한다. 그러나, 이러한 기술은 생검 시편이 수득되는 경우에 완전한 조직병리학적 반응을 확인하는데 유용할 수 있다.
종양 마커. 종양 부피에 대한 측정치와 상호관련시키기 위해 사용되는 종양 마커 (즉, 본 발명의 마커가 아님)는 반응을 평가하는데 단독으로 사용될 수 없다. 그러나, 마커가 처음으로 정상 상한치를 초과하는 경우에는, 모든 종양 병변이 소멸되었을 때의 완전한 임상적 반응에서 고려되는 환자에 대한 정상 수준으로 복귀되어야 한다. 임상 시험을 지지하는 전립선-특이적 항원 및 CA (암 항원) 125개 반응의 표준화된 용법에 대한 특정한 추가의 기준이 검증되어 있다.
세포학 및 조직학. 세포학적 기술 및 조직학적 기술은 드문 경우에 부분 반응과 완전 반응을 구별하는데 (예를 들어, 치료 후 배세포 종양과 같은 종양 유형에서 잔류 양성 병변과 잔류 악성 병변을 구별하는데) 사용될 수 있다. 치료 동안 나타나거나 또는 악화되는 임의의 신생물성 삼출 성질의 세포학적 확인은 측정가능한 종양이 반응 또는 안정한 질환에 대한 기준을 충족하는 경우에 요구된다. 이러한 상황 하에, 수집된 유체의 세포학적 검사는 반응 또는 안정한 질환 (삼출은 치료의 부작용일 수 있음)과 진행성 질환 (유체의 신생물성 기원이 확인되는 경우)의 구별을 허용할 것이다. 목적 종양 반응을 보다 양호하게 확립하기 위한 새로운 기술은 이것이 종양 반응 평가의 맥락에서 사용되기에 충분하게 검증된 경우에 이들 기준 내에 통합될 것이다.
이형접합성의 상실
본 발명의 한 실시양태에서, RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 이형접합성의 상실을 갖는 종양은 반응성일 (즉, 그의 성장이 Wnt 억제제에 의해 둔화될) 가능성이 보다 높다. 따라서, RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 이형접합성의 상실을 갖는 종양을 앓고 있는 암 환자는 Wnt 억제제 요법에 대한 보다 높은 반응률, 진행성 질환의 보다 낮은 속도, 진행에 대한 보다 긴 시간, 및 장기간 생존자의 보다 높은 비율을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 하나의 카피를 갖는 종양 샘플을 갖는 환자는 Wnt 억제제로의 치료에 대한 양호한 반응자일 것으로 예측된다.
이형접합성의 상실의 대조 수준을 확립하기 위한 방법은 샘플 유형, 샘플이 수득되는 조직 또는 기관, 및 평가되는 환자의 상태에 기반하여 선택된다. 방법은 환자에서 샘플을 평가하는데 사용되는 방법과 동일할 수 있다. 한 실시양태에서, 대조 수준은 평가되는 세포와 동일한 세포 유형을 사용하여 확립된다. 또 다른 실시양태에서, 대조 수준은 Wnt 억제제에 대해 저항성이거나 또는 감수성인 것으로 공지된 환자 또는 세포주로부터의 대조 샘플로부터 확립된다. 한 측면에서, 대조 샘플은 매칭된 개체의 집단으로부터 수득되었다.
대조 수준을 확립하기 위해, 다수의 매칭된 개체로부터의 샘플을 시험 샘플에 대한 것과 동일한 방식으로 수득하고 평가한다. 적합한 대조 수준을 확립하기 위해 대조 샘플을 수득하여야 하는 매칭된 개체의 수 (예를 들어, 집단)는 당업자에 의해 결정될 수 있지만, 평가되는 환자 (즉, 시험 환자)와의 비교에 적합한 기준선을 확립하기에 통계적으로 적절해야 한다. 대조 샘플로부터 얻어진 값을 임의의 적합한 통계적 분석 방법을 사용하여 통계적으로 가공하여, 이러한 값을 확립하기 위한 당업계에서의 방법 표준을 사용하여 적합한 기준선 수준을 확립한다.
종양 세포당 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 카피수는 형광 계내 혼성화 (FISH)에 의해 검출될 수 있다. FISH는 DNA-기반 기술이고, 신선하거나 또는 보존된 파라핀-포매 종양 샘플에서 성공적으로 수행될 수 있다. 기술은 잘 확립되어 있고, 프로브는 임상 세포유전학 및 분자 병리학 실험실에서 짧은 턴-어라운드로 용이하게 구축될 수 있다. 마우스 RNF43에 대한 FISH 프로브는 상업적으로 입수가능하기 때문에, 당업자는 인간 RNF43에 대한 상응하는 FISH 프로브를 용이하게 구축할 수 있을 것이다. 문헌 [Rogan P et al.(2001) Genome Res. 11(6): 1086-1094]을 참조한다. 대안적으로, 인간 유전자, 예컨대 인간 RNF43 또는 인간 ZNRF3에 대한 FISH 프로브의 주문 설계 서비스가 상업적으로 입수가능한데, 예컨대 미국 뉴욕주 버팔로 소재의 엠파이어 게노믹스(Empire Genomics)로부터의 FISH 프로브이다.
혼성화
유전자의 검출은 혼성화 검정을 사용하여 달성될 수 있다. 핵산 혼성화는 간단히 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 보다 큰 폴리뉴클레오티드) 및 표적 핵산을 프로브 및 그의 상보적 표적이 상보적 염기 쌍형성을 통해 안정한 하이브리드 듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 혼성화 조건은 핵산 분자가 유사한 핵산 분자를 확인하는데 사용되는 표준 혼성화 조건을 지칭한다. 이러한 표준 조건은, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press] (그의 전문이 참조로 포함됨, 특히 9.31-9.62 페이지 참조)에 개시되어 있다. 또한, 뉴클레오티드의 다양한 정도의 미스매치를 허용하는 혼성화를 달성하기 위한 적절한 혼성화 및 세척 조건을 계산하기 위한 공식은, 예를 들어 문헌 [Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284] (그의 전문이 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 하이브리드 듀플렉스를 형성하지 않는 핵산을 혼성화된 핵산으로부터 세척한 다음, 혼성화된 핵산을 전형적으로 부착된 검출가능한 표지의 검출을 통해 검출할 수 있다. 핵산을 함유하는 완충제의 온도를 증가시키거나 또는 염 농도를 감소시킴으로써 핵산을 변성시킨다. 저 엄격도 조건 (예를 들어, 낮은 온도 또는 높은 염 또는 둘 다) 하에서는 심지어 어닐링된 서열이 완벽히 상보적이지 않은 경우에도 하이브리드 듀플렉스 (예를 들어, DNA:DNA, RNA:RNA 또는 RNA:DNA)가 형성될 것이다. 따라서, 혼성화의 특이성은 보다 낮은 엄격도에서 감소된다. 반대로, 보다 높은 엄격도 (예를 들어, 보다 높은 온도 또는 보다 낮은 염)에서의 성공적 혼성화는 보다 적은 미스매치를 요구한다.
본원에 지칭된 바와 같은 고 염격도 혼성화 및 세척 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용되는 핵산 분자와 적어도 약 90%의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 허용하는 조건 (즉, 뉴클레오티드의 약 10% 이하의 미스매치를 허용하는 조건)을 지칭한다. 당업자는 문헌 [Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284]에서의 공식을 사용하여 이들 특정한 뉴클레오티드 미스매치 수준을 달성하기에 적절한 혼성화 및 세척 조건을 계산할 수 있다. 이러한 조건은 형성되는 하이브리드가 DNA:RNA인지 또는 DNA:DNA인지에 따라 달라질 것이다. 대안적으로, Tm은 문헌 [Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press., pages 9.31 to 9.62]에 설명된 바와 같이 실험적으로 계산될 수 있다.
혼성화된 핵산은 샘플 핵산에 부착된 하나 이상의 표지를 검출함으로써 검출한다. 표지는 당업자에게 익히 공지된 다수의 수단 중 임의의 것에 의해 혼입할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 검출가능한 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물을 포함한다. 본 발명에 유용한 표지는 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 알렉사 플루오르, 스펙트럼 염료 등), 양자 점, 방사성표지 (예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P) 및 비색 표지를 포함한다. 이러한 표지를 검출하는 수단은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어 방사성표지는 사진 필름 또는 섬광 계수기를 사용하여 검출할 수 있고, 형광 마커는 방출된 광을 검출하는 광검출기 및 형광 현미경을 사용하여 검출할 수 있다. 비색 표지는 유색 표지를 간단히 시각화함으로써 검출한다. 바람직하게는, 혼성화된 핵산은 형광 표지에 의해, 가장 바람직하게는 형광 계내 혼성화 (FISH) 검정의 맥락에서 검출한다. FISH 검정은 당업계에 익히 공지되어 있다.
본 발명의 방법에서, 종양 세포 샘플에서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 수준을 (i) Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 대조 수준; 및 (ii) Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 대조 수준으로부터 선택된 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 대조 수준과 비교한다. 환자의 종양 세포에서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 수준이 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 대조 수준과 통계적으로 유사하거나 또는 그보다 높은 경우, 또는 환자의 종양 세포에서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 수준이 Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 수준보다 통계적으로 높은 경우에, 환자를 Wnt 억제제, 그의 효능제, 또는 Wnt 억제제와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 약물의 치료적 투여로부터 이익을 얻을 것으로 예측되는 것으로서 선택한다. 환자의 종양 세포에서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 수준이 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 RNF43 유전자의 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 대조 수준보다 통계적으로 낮은 경우, 또는 환자의 종양 세포에서의 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 수준이 Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 수준과 통계적으로 유사하거나 또는 그보다 낮은 경우에, 환자를 Wnt 억제제, 그의 효능제, 또는 Wnt 억제제와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 약물의 치료적 투여로부터 이익을 얻지 못할 것으로 예측되는 것으로서 선택한다.
불활성화 돌연변이
본 발명의 한 실시양태에서, RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서 불활성화 돌연변이를 갖는 종양은 Wnt 억제제에 대해 반응성일 (즉, 이에 의해 그의 성장이 둔화될) 가능성이 보다 높다. RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이의 검출은 환자가 Wnt 억제제로의 치료로부터 이익을 얻을 것임을 예측한다. RNF43 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이의 이 검출에 대한 가이드는 실시예에 제공된다.
RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서의 하나 이상의 돌연변이의 검출은 환자가 Wnt 억제제 요법에 반응하거나 또는 그로부터 이익을 얻을 가능성이 보다 높을 것임을 예측한다. 돌연변이 미검출은 환자가 Wnt 억제제 요법에 반응하거나 또는 그로부터 이익을 얻을 가능성이 보다 낮을 것임을 예측한다. 유전자 돌연변이에 대한 스크리닝 방법은 당업계에 익히 공지되어 있고, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labs Press]에 기재되어 있고, 혼성화, 폴리머라제 연쇄 반응, 폴리아크릴아미드 겔 분석, 크로마토그래피 또는 분광분석법을 포함한다. "차세대 서열분석"에서 이루어낸 최근의 진보로, 폴리뉴클레오티드의 직접 서열분석이 RNF43 유전자 돌연변이 상태 또는 ZNRF3 유전자 돌연변이 상태를 검정하기 위한 최소 비용의 신뢰할만한 방법이 되고 있는 것으로 생각된다.
유전자 돌연변이에 대한 스크리닝 방법은 (예를 들어, 이뮤노블롯 (예를 들어, 웨스턴 블롯), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (RIA), 면역침전, 면역조직화학, 면역형광, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 및 면역형광 현미경검사를 통한) 유전자에 의해 코딩된 변경된 단백질 생성물에 대한 스크리닝을 추가로 포함할 수 있다.
RNF43 mRNA의 상실의 경우 또는 ZNRF3 mRNA의 상실의 경우에, mRNA에서의 적어도 50%의 감소가 기능 상실을 나타내는 것으로서 간주될 수 있는데, 이는 종양 샘플이 종양 세포로 균질하게 구성되지 않기 때문이다.
환자 샘플
환자 샘플을 수득하는 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 환자 샘플은 종양 세포 또는 종양 세포의 단백질을 함유할 수 있는 환자로부터의 임의의 체액 또는 조직을 포함할 수 있다.
일반적으로, 샘플 유형 (즉, 세포, 조직 또는 체액)은 종양 세포 성장에 대해 평가되는 기관 또는 조직의 접근성 및 구조, 또는 어떤 유형의 암이 평가되는지에 기반하여 선택된다. 본 발명은 종양, 예컨대 관 암종, 선암종 또는 흑색종 (표 1 참조) 또는 췌장암, 결장암, 식도암 또는 피부암 (표 1, 표 2, 표 3, 표 4 및 표 5 참조)을 앓고 있는 환자로부터의 종양을 평가하는데 특히 유용하다. 이들 경우에서, 전형적 샘플은 각 환자로부터의 종양 샘플의 절편 또는 췌장 조직 샘플로부터의 절편이다.
일단 샘플을 환자로부터 수득하면, 샘플을 본원에 기재된 임의의 바이오마커 중 하나 이상의 검출에 대해 평가한다. 본 발명의 일부 실시양태에서는, 조직, 세포 또는 그의 일부 (예를 들어, 조직의 절편, 세포의 성분, 예컨대 핵산 등)를 하나 이상의 핵산과 접촉시킨다. 이러한 프로토콜은, 예를 들어 유전자 발현 또는 이형접합성의 상실을 검출하는데 사용된다. 이러한 방법은 세포-기반 검정 또는 비-세포-기반 검정을 포함할 수 있다. 표적 유전자를 발현하는 조직 또는 세포는 전형적으로 임의의 적합한 방법, 예컨대 적합한 기술에 의해 표적 유전자가 검출되도록 하는 방식으로 혼합하거나, 혼성화하거나, 결합시킴으로써 검출 작용제 (예를 들어, 프로브, 프라이머, 또는 다른 검출가능한 마커)와 접촉시킨다.
환자 샘플은 이용되는 검출 기술에 적합한 임의의 방법에 의해 제조된다. 한 실시양태에서는, 환자 샘플을 신선하게, 동결시켜, 고정시켜 또는 달리 보전시켜 사용할 수 있다. 예를 들어, 환자 종양 세포는 파라핀 중에 환자 조직을 고정화시킴으로써 제조될 수 있다. 고정화된 조직을 절편화한 다음, 표적 유전자 (예를 들어, RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자)에 대한 프로브의 혼성화의 검출을 위한 프로브와 접촉시킬 수 있다.
대조군
대조 수준은 검정을 수행할 때 각각의 검정에 대해 확립될 필요가 없다. 오히려, 기준선 또는 대조군은 감수성인 환자 및 저항성인 환자 (반응자 및 비-반응자)에 대해 이전에 결정된 대조 수준에 관한 저장된 정보의 형태를 참조함으로써 확립될 수 있다. 대조 수준은 상응하는 검출 방법이 사용되는 경우에 사용하기 위해, 상기 기재된 검출 방법 중 임의의 것에 대해 확립될 수 있다. 이러한 저장된 정보의 형태는 참조 차트, 감수성 및 저항성 종양/환자에 관한 집단 또는 개별 데이터의 목록 또는 전자 파일, 또는 평가되는 환자에 유용한 이형접합성 상실 유전자 대조 수준에 관한 데이터의 임의의 다른 공급원을 포함할 수 있다.
비교를 위한 대조 수준은 정보의 형태로서 제공되는 예비-확립된 대조군을 포함하는, 임의 유형의 대조군일 수 있다. 다른 점수화 시스템을 대조군과의 비교에 기반하여 고안할 수 있고, 컷-오프(cut-off) 근처에 있는 환자는 진단을 확인하기 위해 다른 기준, 바이오마커 또는 기술에 의해 평가할 수 있다. 또한, 컷-오프는 환자 집단에 따라 임상의 또는 연구자에 의해 필요한 경우 달라질 수 있다.
Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 대조군에 대해, 바이오마커가 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서의 불활성화 돌연변이인 경우에, 대조군은 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 야생형 서열일 수 있다. 이러한 서열은 공개적으로 이용가능하고 잘 정의되어 있다. 한 실시양태에서, RNF43 유전자의 서열은 서열 1에 의해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, ZNRF3 유전자의 서열은 서열 2에 의해 제공된다.
RNF43 mRNA의 상실의 경우에, 종양 샘플에서의 mRNA 발현의 적어도 50% 감소가 관찰된다.
Wnt 억제제에 대한 저항성에 대한 또 다른 대조군은 동일한 환자로부터 비-종양 샘플일 것이다. 이러한 비-종양 샘플이 이용가능하지 않다면, 다른 환자 또는 건강한 대상체로부터의 평균 값이 비교될 수 있는데, 이는 대부분의 환자가 Wnt 억제제에 대해 반응하지 않을 것이기 때문이다.
통계적 분석
본 발명에 따른 바이오마커의 검출 단계는 상기 기재된 바와 같은 다양한 조합으로 조합할 수 있다. 단계는 임의의 순서로, 또는 실질적으로 동시에 수행할 수 있다. 대조군과 환자 샘플의 차이를 결정하기 위한 통계적 분석은, 정성적 변수에 대해서는 피셔(Fisher)의 정확 검정 또는 피어슨(Pearson)의 카이-제곱 검정을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하고, 연속적 변수에 대해서는 스튜던트 t 검정 또는 분산 분석을 사용하여 수행할 수 있다. 통계적 유의성은 전형적으로 p<0.05로서 정의된다.
Wnt 억제제
본 발명의 방법은 Wnt 억제제 또는 Wnt 억제제와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 약물을 사용한 요법에 대해 반응할 (예를 들어, 치료 이익을 가질)가능성이 가장 높은 환자를 결정하거나 또는 예측하는데, 뿐만 아니라 Wnt 억제제를 사용한 요법에 대해 반응하지 않을 가능성이 가장 높은 환자를 결정하거나 또는 예측하는데 유용하다. 본 발명은 또한 RNF43 유전자 돌연변이를 갖는 암 세포가 Wnt 경로의 억제에 대해 보다 감수성임을 제공한다. 암 세포에서의 RNF43의 억제는 증가된 세포 표면 프리즐드 수준을 유도한다. 따라서, 증진된 Wnt 신호전달 및 돌연변이체 RNF43을 갖는 암 세포, 특히 췌장암 세포는 Wnt 길항제에 대해 보다 감수성이다. 비기능성 RNF43 단백질을 갖는 세포주인 HPAFII에 관한 도 3 및 4를 참조한다. 또한, 본 발명자들은 또한 비기능성 RNF43 단백질을 갖는 세포주 Panc10.05도 포큐파인 억제제에 대해 감수성임을 관찰하였다.
한 실시양태에서, Wnt 억제제는 인간에서 사용하기에 적합한 포큐파인 억제제이다. Wnt 억제제는 공지된 포큐파인 억제제, 예컨대 IWP-2, IWP-3 또는 IWP-4와 유사한 기능을 갖는 포큐파인 억제제일 수 있으며, 이는 문헌 [Chen B et al. (2009) Nature Chem. Biol. 5: 100-107]에 기재되어 있고, 스테몰레큘(Stemolecule)™ Wnt 억제제 IWP-2 (#130-095-584), 스테몰레큘™ Wnt 억제제 IWP-3 (#130-095-585) 및 스테몰레큘™ Wnt 억제제 IWP-4로서 밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech)로부터 상업적으로 입수가능하다. 스테몰레큘™ IWP-2, 스테몰레큘™ IWP-3 및 스테몰레큘™ IWP-4는 막-결합 O-아실트랜스퍼라제인 포큐파인 (PORCN)에 의한 Wnt 단백질의 팔미트화를 방지한다.
대안적으로, Wnt 억제제는 약물 설계의 생성물일 수 있고, 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 2010년 9월 10일에 공개된 국제 특허 출원 WO2010/101849를 참조한다. 본 발명에 유용한 모방체 또는 다른 화합물을 설계하는데 유용한 약물 설계의 다양한 방법은 문헌 [Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc.] (그의 전문이 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. Wnt 억제제는 분자 다양성 전략 (대규모이고 화학적으로 다양한 분자 라이브러리의 빠른 구축을 허용하는 관련 전략의 조합)으로부터, 천연 또는 합성 화합물의 라이브러리로부터, 특히 화학적 또는 조합 라이브러리 (즉, 서열 또는 크기가 상이하지만 유사한 빌딩 블록을 갖는 화합물의 라이브러리)로부터, 또는 합리적이거나, 지정되거나 또는 무작위적인 약물 설계에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc.]을 참조한다. 분자 다양성 전략에서는, 대규모 화합물 라이브러리가, 예를 들어 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 천연 또는 합성 스테로이드성 화합물, 탄수화물 또는 천연 또는 합성 유기 및 비-스테로이드성 분자로부터, 생물학적, 효소적 또는 화학적 접근법을 사용하여 합성된다. 분자 다양성 전략을 개발하는데 있어서의 결정적인 파라미터는 서브유닛 다양성, 분자 크기, 및 라이브러리 다양성을 포함한다. 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 일반적 목적은 조합 선택의 순차적 적용을 이용하여 목적한 표적에 대한 고-친화도 리간드를 수득한 다음, 무작위적이거나 또는 지정된 설계 전략에 의해 선도 분자를 최적화하는 것이다. 분자 다양성의 방법은 문헌 [Maulik et al.(1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc.]에 상세하게 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, Wnt 억제제는 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염이다.
<화학식 1>
Figure pct00001
상기 식에서,
X1, X2, X3 및 X4는 N 및 CR7로부터 선택되고;
X5, X6, X7 및 X8 중 하나는 N이고, 다른 것들은 CH이고;
X9는 N 및 CH로부터 선택되고;
Z는 페닐, 피라지닐, 피리디닐, 피리다지닐 및 피페라지닐로부터 선택되고; 여기서 Z의 각각의 페닐, 피라지닐, 피리디닐, 피리다지닐 또는 피페라지닐은 R6 기로 임의로 치환되고;
R1, R2 및 R3은 수소이고;
m은 1이고;
R4는 수소, 할로, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸 및 메틸로부터 선택되고;
R6은 수소, 할로 및 -C(O)R10으로부터 선택되고; 여기서 R10은 메틸이고;
R7은 수소, 할로, 시아노, 메틸 및 트리플루오로메틸로부터 선택된다.
Wnt 억제제는
N-[5-(3-플루오로페닐)피리딘-2-일]-2-[5-메틸-6-(피리다진-4-일)피리딘-3-일]아세트아미드;
2-[5-메틸-6-(2-메틸피리딘-4-일)피리딘-3-일]-N-[5-(피라진-2-일)피리딘-2-일]아세트아미드 (LGK974);
N-(2,3'-비피리딘-6'-일)-2-(2',3-디메틸-2,4'-비피리딘-5-일)아세트아미드;
N-(5-(4-아세틸피페라진-1-일)피리딘-2-일)-2-(2'-메틸-3-(트리플루오로메틸)-2,4'-비피리딘-5-일)아세트아미드;
N-(5-(4-아세틸피페라진-1-일)피리딘-2-일)-2-(2'-플루오로-3-메틸-2,4'-비피리딘-5-일)아세트아미드; 및
2-(2'-플루오로-3-메틸-2,4'-비피리딘-5-일)-N-(5-(피라진-2-일)피리딘-2-일)아세트아미드
로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염일 수있다.
가장 바람직하게는, Wnt 억제제는 2-[5-메틸-6-(2-메틸피리딘-4-일)피리딘-3-일이다]-N-[5-(피라진-2-일)피리딘-2-일]아세트아미드 (LGK974)이다.
Wnt 억제제와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 약물은 생체내 또는 시험관내에서 측정되거나 또는 관찰된 바와 같은 참조 화합물에 기인하여 참조 화합물에 의해 나타나거나 또는 수행되는 실질적으로 동일한 기능을 갖는 약물을 지칭한다. 예를 들어, 포큐파인 억제제와 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 약물은 참조 화합물, 예컨대 IWP-2, IWP-3 또는 IWP-4에 의해 나타나거나 또는 수행되는 실질적으로 동일한 기능을 갖는 약물을 지칭한다.
또 다른 실시양태에서, Wnt 억제제는 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corp.) 및 다른 상업적 공급원으로부터 입수가능한 탄키라제 억제제 XAV939 (C9289)이다. 문헌 [Huang SM et al. (2009) Nature 461(7264):614-20]을 참조한다.
다른 유형의 Wnt 억제제는 압타머, RNAi 및 리보자임을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 압타머는 높은 친화도 및 특이성으로 예정된 특이적 표적 분자에 결합하는 그의 능력에 의해 무작위화된 조합 핵산 라이브러리로부터 선택된 합성 핵산 (통상적으로 RNA 뿐만 아니라 DNA)의 짧은 가닥이다. 압타머는 정의된 3차원 구조를 취하고, 구조에서 매우 작은 차이를 갖는 화합물도 구분될 수 있다. RNA 간섭 (RNAi)은 이에 의해 이중 가닥 RNA 및 포유동물 체계에서의 짧은 간섭 RNA (siRNA)가 상보적 유전자의 발현을 억제하거나 또는 침묵시키는데 사용되는 과정이다. 리보자임은 (예를 들어, 공유 결합을 파괴하거나 또는 형성함으로써) 생물학적 촉매작용을 수행할 수 있는 RNA 절편이다. 보다 구체적으로, 리보자임은 표적 RNA 모이어티에 결합함으로써 기능하고 특정한 절단 부위에서 포스포디에스테르 백본을 절단함으로써 그것을 불활성화시키는 안티센스 RNA 분자이다.
다른 유형의 억제제는 천연 Wnt 억제제에 대해 유사성을 가질 수 있다. Wnt 신호전달의 공지된 천연 길항제는 딕코프(Dickkopf) 단백질, 분비된 프리즐드-관련 단백질 (sFRP), Wnt 억제 인자 1 (WIF-1) 및 소기(Soggy)를 포함한다. 딕코프-관련 단백질 패밀리의 구성원 (Dkk-1 내지 -4)은 링커 영역에 의해 분리된 2개의 시스테인-풍부 도메인을 갖는 분비된 단백질이다. Dkk 패밀리는 또한 Dkk-3에 대해 상동이지만 다른 패밀리 구성원에 대해서는 상동이 아닌 소기를 포함한다.
sFRP는 막-결합 프리즐드와 유사한 5개 Wnt-결합 당단백질의 패밀리이다. Wnt 억제제의 가장 큰 패밀리인 그들은 2개의 군, sFRP-1, 2 및 5로 이루어진 제1 군, 및 sFRP-3 및 4를 포함하는 제2 군을 함유한다.
한 실시양태에서, Wnt 신호전달의 길항제는 가용성 Wnt 수용체, 예컨대 프리즐드8CRD-hFc일 수 있고, 이는 기형암종의 생체내 성장을 억제하는 것으로 보고되어 있다. 문헌 [DeAlmeida VI et al. (2007) Cancer Res. 67(11):5371-9].
Wnt 신호전달의 다른 천연 길항제는 Wnt 단백질에 결합하여 그의 활성을 억제하는 분비된 단백질인 WIF-1 (Wnt 억제 인자 1)을 포함한다.
Wnt 억제제의 또 다른 유형은 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 펩티드 또는 "결합 파트너"일 수 있다. 항체는 이뮤노글로불린 도메인을 포함하고, 이에 따라 단백질의 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이 됨을 특징으로 한다. 항체는 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 2가 및 1가 항체, 이중- 또는 다중-특이적 항체, 이러한 항체를 함유하는 혈청, 다양한 정도로 정제된 항체, 및 전체 항체의 임의의 기능적 등가물을 포함할 수 있다. Wnt 억제제로서 유용한 단리된 항체는 이러한 항체를 함유하는 혈청, 또는 다양한 정도로 정제된 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 전체 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 대안적으로, 전체 항체의 기능적 등가물, 예컨대 하나 이상의 항체 도메인이 말단절단되거나 또는 부재하는 항원 결합 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab)2 단편), 뿐만 아니라 유전자-조작된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 단일 쇄 항체 또는 하나 초과의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 (예를 들어, 이중-특이적 항체), 또는 하나 이상의 다양한 항원에 결합할 수 있는 항체 (예를 들어, 이중- 또는 다중-특이적 항체) 또한 Wnt 억제제로서 사용될 수 있다.
LRP6 항체 (문헌 [Ettenberg S et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(35):15473-8]) 및 프리즐드 항체 (문헌 [Gurney A et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(29):11717-22])를 포함하는 상류 Wnt 신호전달을 표적화하는 다양한 항체가 개발되고 있다.
검정 및 키트
본 발명의 검정 키트 및 방법은 특정한 Wnt 억제제에 대해 반응성일 것으로 예측되는 환자, 세포 또는 조직을 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 동반 진단 키트의 용도는 승인된 약물과의 사용에 대해 정부 약물 등록 기관에 의해 승인된 다른 동반 진단 시험과 유사할 것이다. 예를 들어, ALK4-돌연변이된 폐암의 치료를 위한 크리조티닙 및 BRAF-돌연변이된 흑색종을 위한 베무라페닙의 2011년의 미국 식품 의약품국에 의한 승인을 참조한다.
본 발명의 검정 키트 및 방법은 또한 Wnt 억제제에 대해 저항성인 암 세포의 반응성을 개선시킬 수 있는 치료를 확인하고 Wnt 억제제의 반응을 증진시키는 아주반트 치료를 개발하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 검정 키트 및 방법은 Wnt 억제제로 치료할 수 있는 임의의 암, 예컨대 췌장암 (표 2 참조), 또는 그의 성장이 Wnt 억제제에 의해 둔화될 수 있는 임의의 종양, 예컨대 관 암종, 선암종 또는 흑색종 (표 1 참조)을 앓고 있는 환자에게 유용하다. 이러한 환자는, 본원에 제공된 방법의 결과로서, 그들이 RNF43 또는 ZNRF3의 감소된 유전자 발현을 갖지 않는 경우의 비효과적인 요법의 부작용 및 재정적 비용으로부터 벗어날 수 있다. 본 발명의 검정 키트 및 방법은 또한 특정한 환자의 종양의 분자 특징에 대한 정보에 기반하여 그에게 Wnt 억제제 요법을 권고하거나 또는 권고하지 않을 수 있는 의사에게 유용하다. 본 발명의 검정 키트 및 방법은 효율적인 인간 RNF43 FISH 검정의 개발에 대한 요구를 유용하게 증가시켜 아직 개발되지 않은 뉴클레오티드 프로브를 이용가능하게 만들 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Wnt 억제제의 치료적 투여로부터 이익을 얻거나 또는 이익을 얻지 못할 것으로 예측되는 암 환자를 선택하기 위한 검정 키트를 제공한다. 검정 키트는
(a) 종양 세포의 샘플에서 (i) RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 증폭의 수준; 또는 (ii) RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 이형접합성의 상실의 수준으로부터 선택된 바이오마커 또는 바이오마커의 조합의 수준을 검출하기 위한 수단,
(b) (i) Wnt 억제제에 대한 감수성을 검출하기 위한 대조 샘플; (ii) Wnt 억제제에 대한 저항성을 검출하기 위한 대조 샘플; (iii) Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 사전 결정된 대조 수준을 함유하는 정보; 또는 (iv) Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 사전 결정된 대조 수준을 함유하는 정보로부터 선택된 대조군
을 포함한다.
한 실시양태에서, 키트는 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자에서 돌연변이를 검출하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 돌연변이를 검출하기 위한 수단은 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자의 일부에 혼성화하는 뉴클레오티드 프로브이다. 특정한 실시양태에서, 검출하기 위한 수단은 형광 계내 혼성화 (FISH) 프로브이다. 검출하기 위한 수단 중 임의의 것은 검출가능한 표지를 함유할 수 있다. 검출하기 위한 수단 중 임의의 것은 기질 상에 고정화될 수 있다.
한 실시양태에서, RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실을 검출하기 위한 수단은 일반적으로 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 임의 유형의 시약일 수 있다. 검출하기 위한 이러한 수단은 엄격한 혼성화 조건 하에 RNF43 유전자 또는 ZNRF3에 혼성화하는 프로브 또는 프라이머를 포함한다. RNF43 유전자 또는 ZNRF3에 대한 핵산 서열은 당업계에 공지되어 있고, 검출을 위한 이러한 시약을 제조하는데 사용될 수 있다. 검출을 위한 이러한 수단을 사용한 검정을 수행하는데 유용한 추가의 시약, 예컨대 계내 혼성화를 수행하기 위한 시약, 형광 마커를 검출하기 위한 시약, 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하기 위한 시약 등이 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 검정 키트의 검출하기 위한 수단은 검출가능한 태그 또는 검출가능한 표지에 접합될 수 있다. 이러한 태그는, 관심 유전자 또는 단백질을 검출하는데 사용되는 시약의 검출을 허용하고 분광학적, 광화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물 또는 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 태그일 수 있다. 본 발명에 유용한 표지는 표지된 스트렙타비딘 접합체로 염색하기 위한 비오틴, 자기 비드 (예를 들어, 디나비즈(Dynabeads)™), 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 녹색 형광 단백질 등), 방사성표지 (예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C 또는 32P), 효소 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에 통상적으로 사용되는 다른 것) 및 비색 표지, 예컨대 콜로이드성 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다.
또한, 본 발명의 검정 키트의 검출하기 위한 수단은 기질 상에 고정화될 수 있다. 이러한 기질은, 예컨대 이전에 기재된 검출 방법 중 임의의 것에 사용되는 검출 시약의 고정화에 적합한 임의의 기질을 포함할 수 있다. 간단히, 검출하기 위한 수단의 고정화에 적합한 기질은 목적한 표적 분자를 검출하는 검출 수단의 활성 또는 능력에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 검출하기 위한 수단과 결합을 형성할 수 있는 임의의 고체 지지체, 예컨대 임의의 고체 유기, 생체중합체, 또는 무기 지지체를 포함한다. 예시적인 유기 고체 지지체는 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 나일론, 페놀-포름알데히드 수지 및 아크릴 공중합체 (예를 들어, 폴리아크릴아미드)를 포함한다. 키트는 또한 시약의 검출 또는 양성 또는 음성 대조군의 표지에 적합한 시약, 세척 용액, 희석 완충제 등을 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트의 사용 및 결과의 해석을 위한 서면 지침 세트를 포함할 수 있다.
검정 키트는 또한 하나 이상 대조군을 포함할 수 있다. 대조군은 (i) 환자에서의 사용을 위해 평가되는 Wnt 억제제에 대한 감수성을 검출하기 위한 대조 샘플; (ii) Wnt 억제제에 대한 저항성을 검출하기 위한 대조 샘플; (iii) Wnt 억제제 감수성 또는 저항성과 관련하여 측정되는 특정한 바이오마커의 사전 결정된 대조 수준(예를 들어, Wnt 억제제에 대한 감수성 또는 Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 RNF43 유전자 또는 ZNRF3 유전자 이형접합성 상실의 사전 결정된 대조 수준)을 함유하는 정보를 포함할 수 있었다.
키트는 또한 샘플링되는 세포 유형의 특징인 대조 마커를 검출하기 위한 수단을 포함할 수 있고, 이는 일반적으로, 예컨대 본원에서 이전에 기재된 바이오마커의 존재를 검출하는 방법에 의해, 샘플에서 공지된 마커 (핵산 또는 단백질 수준)의 존재를 검출하는 방법에서 사용될 수 있는 임의 유형의 시약일 수 있다. 특히, 수단은 세포 유형을 양성적으로 확인시켜주는 분석되는 세포 유형의 특정한 마커를 확인시켜주는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 폐 종양 검정에서는, 바이오마커 발현 또는 생물학적 활성의 수준에 대해 폐 상피 세포를 스크리닝하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 대조 마커를 검출하기 위한 수단은 상피 세포, 바람직하게는 폐 상피 세포의 특징인 마커를 확인시켜줌으로써 세포를 다른 세포 유형, 예컨대 결합 조직 또는 염증 세포로부터 구별한다. 이러한 수단은 본 발명의 검정의 정확도 및 특이성을 증가시킨다. 대조 마커를 검출하기 위한 이러한 수단은 엄격한 혼성화 조건 하에 단백질 마커를 코딩하는 핵산 분자에 혼성화하는 프로브; 이러한 핵산 분자를 증폭시키는 PCR 프라이머; 표적 분자 상의 구조적으로 뚜렷한 부위에 특이적으로 결합하는 압타머; 또는 샘플에서 대조 마커에 선택적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 단편, 또는 항원 결합 펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 많은 세포 마커에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고, 검출을 위한 이러한 시약을 제조하는데 사용될 수 있다.
후술되는 실시예는 본 발명의 구체적 실시양태 및 그의 다양한 용도를 예시한다. 이는 오직 설명의 목적을 위해 제시된 것이며 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
표 1에 나타낸 바와 같이, RNF43 유전자는 원발성 췌장관 선암종 및 다른 종양에서 돌연변이된다. 췌장, 대장, 식도 및 피부의 원발성 종양으로부터의 9개의 게놈 DNA에서의 무의미 및 프레임이동 돌연변이. 그들 중에, 5개는 췌장 종양이고, 검사한 췌장 종양의 전체 수는 19개이다 (잠재적으로 손상되는 과오 돌연변이를 제외하고, 샘플의 25% 초과에서 돌연변이됨).
Figure pct00002
실시예 2
표 2에 나타낸 바와 같이, RNF43 유전자는 다중 췌장암 세포주에서 돌연변이된다. 카피수 분석에 기반하여 남은 RNF43 유전자의 오직 하나의 카피만을 잠재적으로 갖는 10종의 췌장암 세포주에서 생거 서열분석에 의해 확인된 유전자 변이. RNF43 불활성화 돌연변이를 갖는 3종의 특유한 세포주가 확인되었다: HPAFII (무의미 돌연변이), Panc 10.05 (프레임이동 돌연변이, PL45 세포와 관련됨), PaTu-8988S (유해 돌연변이, PaTu-8988T 세포와 관련됨).
Figure pct00003
HPAFII, Panc 10.05, PaTu-8988S 세포주, 뿐만 아니라 RNF43 불활성화 돌연변이를 갖는 다른 세포주 (예를 들어, Capan-2)에 대한 추가의 정보는 하기 실시예 3 및 실시예 4에 제공된다.
실시예 3
LGK974에 의한 정규 Wnt 경로 억제
LGK974 치료에 대한 췌장 세포의 감수성을 시험관내 세포 증식 검정에서 시험하였다. 24종의 인간 췌장암 세포주를 LGK974로 처리하거나 또는 처리하지 않았다.
세포 증식 데이터를 384 웰 포맷에서 생성시켰다. 세포를 수확하고, mL당 1.5 X 104개 세포의 밀도로 그의 적절한 성장 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 바이오텍 마이크로필(BioTek μFill) 분배기 (일련 번호 000-3586)를 사용하여 웰당 50μL의 최종 부피로 384 웰 조직 배양 플레이트 (그라이너-바이오원(Greiner-BioOne) 789163) 내에 세포를 플레이팅하여 웰당 750개 세포의 웰당 밀도를 달성하였다. 이어서, 플레이트를 ACP-1 시스템 (37℃, 5% CO2) 상의 인큐베이터로 옮기고, 세포가 밤새 부착되도록 하였다. LGK974에 대한 12 지점 용량 반응 곡선을 2 mM의 최고 농도 및 1.13 x 10-5 mM의 최저 농도로 384 웰 ECHO 상용성 공급원 플레이트 (랩사이트(Labcyte) P-05525)에서 생성시켰다. 플레이팅 후 대략 18시간째에, 한 플레이트 내의 복제 IC50 곡선 및 세포주마다의 복제 플레이트로 랩사이트 ECHO555를 사용하여 세포에 LGK974 50 nL를 투여하였다. 화합물을 첨가한 후에, 플레이트를 120시간 동안 인큐베이터로 복귀시켰다. 검정 플레이트를 제조업체의 지침에 따라 1x 셀 타이터 글로(Cell Titer Glo) (프로메가(Promega) G7573) 10 μL의 첨가에 의해 판독하였다. 이어서, 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 통합 퍼킨 엘머 뷰럭스(Perkin Elmer Viewlux) (2초 노출, 2x 저장, 고감도) 상에서 판독하였다. 미가공 데이터를 각각의 플레이트 내에서 DMSO 대조 웰을 사용하여 정규화하고, IC50 결정을 위한 곡선 피팅을 수행하였다.
세포 성장을 세포 타이터 글로 (프로메가)를 사용하여 5일 후에 측정하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, LGK974는 Capan-2, PA-TU-8988S 및 HPAFII를 포함하는 췌장암 세포주의 하위세트에서 nM IC50으로 세포 성장을 억제하였다. 표 4 및 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 모든 4종의 세포주는 RNF43 기능-상실 (LOF) 돌연변이를 보유한다.
Figure pct00004
표 4는 췌장 세포주의 목록, 세포주에서의 RNF43 돌연변이 및 LGK974에 의한 경로 억제를 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 4
RNF43의 불활성화 돌연변이는 췌장암에서 Wnt-의존성을 부여한다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 RNF43이 췌장암 세포에서 음성 피드백 메카니즘으로서 Wnt/β-카테닌 신호전달을 억제하고, 프리즐드의 막 수준을 감소시킴을 보여주었다. 내인성 Wnt 신호전달의 억제는 프리즐드의 세포 표면 수준을 증가시켰다.
Wnt 분비를 차단하는 포큐파인 억제제인 LGK974를 사용하여 Wnt 의존성에 대해 다중 췌장암 세포주를 시험하였다. 췌장암 세포를 10% FBS로 보충한 ATCC에 의해 권고된 배지 중에서 성장시켰다.
놀랍게도, 모든 포큐파인 억제제 감수성 세포주는 RNF43의 불활성화 돌연변이를 보유한다. Wnt 분비의 억제 또는 β-카테닌의 고갈은 RNF43 돌연변이체의 증식을 억제하지만 RNF43 WT 췌장 종양 세포의 증식은 억제하지 않는다. RNF43 돌연변이 세포주 내로의 야생형 RNF43의 재도입 또한 그의 증식을 억제한다. LGK974는 RNF43 돌연변이 췌장 종양의 생체내 성장을 억제한다. 본 발명자들의의 데이터는 췌장암에서의 RNF43의 돌연변이가 Wnt-의존성을 부여하고 RNF43 돌연변이가 Wnt 억제제의 개발을 위한 환자 선택에 대한 바이오마커로 사용되어야 함을 나타낸다.
포큐파인 억제제 LGK974를 사용하여 3종의 Wnt-의존성 췌장암 세포주가 확인되었고, 놀랍게도 모든 이들 세포주는 RNF43 기능-상실 돌연변이를 보유한다. 이들 RNF43 돌연변이 세포주의 성장은 β-카테닌 고갈 또는 RNF43 재발현 시에 억제되고, 그들의 성장은 LGK974에 의해 억제된다. 본 발명자들의 데이터는 RNF43을 췌장암에서의 종양 억제자로서 확립시키고, RNF43 돌연변이가 Wnt 신호전달 경로를 표적화하는 작용제의 효능을 예측하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명자들은 현재 임상에서 검사되고 있는 포큐파인 억제제인 LGK974를 사용하여 Wnt-의존성에 대해 39종의 췌장암 세포주의 패널을 시험하였다. 놀랍게도, 모든 LGK974-감수성 세포주는 RNF43의 불활성화 돌연변이를 보유한다. Wnt 분비의 억제, β-카테닌의 고갈, 또는 야생형 RNF43의 발현은 RNF43 돌연변이체의 증식을 차단하였지만 RNF43 야생형 췌장암 세포의 증식은 차단하지 않았다. LGK974는 마우스 이종이식편 모델에서 RNF43 돌연변이된 췌장 종양의 성장을 억제하였다.
Figure pct00007
병소 형성을 검정하기 위해, 지시된 세포주의 6,000~12,000개 세포를 6 웰 조직 배양 플레이트에서 2 ml 성장 배지 중에 시딩하였다. 세포 부착을 위해 밤새 배양한 후에, 배지를 재조합 Wnt3a의 부재 또는 존재 하에 1 μM LGK974를 함유하는 신선한 성장 배지로 대체하였다. DOX-유도성 β-카테닌 shRNA 실험을 위해, 세포를 5 ng/ml 독시시클린으로 처리하였다. 세포 콜로니가 바람직한 크기에 도달했을 때, 세포를 PBS 중 4% 포르말린으로 고정시키고, 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. 몇 번의 세척 후에, 플레이트를 건조시키고 영상화하였다.
역전사 및 정량적 PCR (qPCR)을 위해, 전체 RNA를 RNeasy 플러스 미니 키트(Plus Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 세포 또는 종양으로부터 추출하였다. RNA 1 μg을 제조업체의 지침에 따라 택맨 역전사 시약 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))으로 역전사시켰다. 정량적 PCR을 0.6 μl의 20X 택맨 프로브 및 PCR 프라이머 믹스, 6μl 2X 택맨 패스트 어드밴스드 마스터 믹스 (Taqman FAST Advanced Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈), 및 5.4 μl 희석 cDNA 주형으로 이루어진 12 μl 반응물 중에서 수행하였다. 이용된 열순환 조건은 95℃에서 20초, 이어서 95℃에서 1초 및 60℃에서 20초의 40 주기였다. 모든 실험은 4벌로 수행하였다. 유전자 발현 분석을 비교 ㅿㅿCT 방법으로 수행하고, 하우스키핑 유전자 GUSB 또는 18S로 정규화하였다. 택맨 프로브는 어플라이드 바이오시스템즈로부터 구입하였다.
췌장암 세포에서의 RNF43에 의한 Wnt 신호전달의 음성 조절.
RNF43의 고갈은 Wnt-유도된 STF를 증가시킨다. RNF43은 낭성 췌장 종양에서 빈번하게 돌연변이되기 때문에 (문헌 [Furukawa T et al.(2011) Sci. Rep. 1:161; Wu J et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(52):21188-93]), RNF43은 췌장암 세포에서의 Wnt/β-카테닌 신호전달의 필수 조절제일 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 췌장암 세포주인 YAPC에서 기능 상실 실험을 수행하였다. 독립적 siRNA를 사용한 RNF43의 고갈은 외인성 Wnt3a 조건화 배지의 부재 또는 존재 하에 슈퍼탑플래쉬 (STF) Wnt 리포터 활성을 유의하게 증가시켰다. 도 3a를 참조한다.
루시페라제 리포터 검정을 위해, YAPC-STF 리포터 세포를 siRNA로 형질감염시키고, 적용가능한 경우 Wnt3a 조건화 배지 또는 화합물로 처리하였다. STF 루시페라제 검정을 제조업체의 지침에 따라 브라이트글로(BrightGlo) 루시페라제 검정 키트 (프로메가)를 사용하여 수행하였다.
STF 리포터를 발현하는 췌장 세포주를 구축하기 위해, HEK293 세포를 10% FBS로 보충한 ATCC에 의해 권고된 배지 중에서 성장시켰다. 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 FuGENE 6 (로슈(Roche)) 형질감염 시약을 사용하여 표준 바이러스 패키징 절차에 의해 HEK293 세포로부터 생산하였다. STF 리포터, RNF43 구축물 또는 DOX-유도성 β-카테닌 shRNA를 발현하는 췌장 세포주를 바이러스 감염 및 약물 선택에 의해 생성시켰다.
제조업체의 지침에 따라 다마펙트 1(Dharmafect 1) 형질감염 시약 (다마콘(Dharmacon))을 사용하여 siRNA 형질감염을 수행하였다. siRNA의 서열은 하기와 같이 열거된다: pGL2 (다마콘 D-001100-01), 표적 서열, 5'-CGTACGCGGAATACTTCGA-3'; RNF43-1 (다마콘 J-007004-12), 표적 서열, 5'-GGUGGAGUCUGAAAGAUCA-3'; RNF43-2 (다마콘 J-007004-11), 표적 서열, 5'-GGAGAAAGCUAUUGCACAG-3'; CTNNB1- 1 (다마콘 J-003482-10), 표적 서열, 5'-UAAUGAGGACCUAUACUUA-3'; 및 CTNNB1- 2 (다마콘 J-003482-12), 표적 서열, 5'-GGUACGAGCUGCUAUGUUC-3'.
RNF43의 고갈은 Dvl 인산화 및 β-카테닌 안정화를 유도한다. LGK974는 Wnt 분비를 강력하게 억제하고 현재 임상 평가 하에 있는 포큐파인 억제제이다. 외인성 Wnt3a의 부재 하에 RNF43 siRNA-유도된 STF 활성은 LGK974 및 이전에 공지된 포큐파인 억제제 IWP-2에 의해 억제된다. 문헌 [Chen B et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2):100-7]. 이 활성은 내인성 Wnt 단백질의 발현에 의존성임을 나타내는 도 3b를 참조한다. 이들 결과는 RNF43이 YAPC 세포에서 자가분비 Wnt/β-카테닌 신호전달을 활발하게 억제함을 나타낸다.
RNF43의 고갈은 FACS에 의한 FZD 수준을 증가시킨다. 본 발명자들은 이어서 YAPC 세포에서의 RNF43의 기능을 특성화하기 위한 생화학적 검정을 수행하였다. RNF43의 고갈은 증가된 STF 리포터 활성과 일치하게 시토졸 β-카테닌의 수준을 증가시켰다.
디쉐블드 (DVL)는 프리즐드 하류의 세포내 신호전달 단백질이고, 그의 인산화는 프리즐드에 의해 자극된다. RNF43의 고갈은 면역조직화학 검정에서 DVL2의 인산화를 증가시켰다. 항-DVL 항체는 미국 매사추세츠주 댄버스 소재의 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 획득하였다.
실제로, 범-프리즐드항체 18R5를 사용한 유동 세포측정법에 의해 검정된 바와 같이, RNF43의 고갈은 프리즐드의 세포 표면 수준을 극적으로 증가시켰다. 표 6은 RNF43의 고갈이 프리즐드 (FZD)의 세포 표면 수준을 증가시킴을 나타낸다. YAPC 세포를 지시된 siRNA로 형질감염시키고, 프리즐드의 막 수준을 범-프리즐드 항체 18R5를 사용한 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
Figure pct00008
유동 세포측정 분석을 위해, 세포를 트립신-무함유 세포 해리 완충제 (인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 수확하고, FACS 완충제 (1% BSA 및 0.02% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS) 중에 재현탁시켰다. 차단한 후, 세포를 4℃에서 1시간 동안 항-범-프리즐드 (18R5) 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서 알로피코시아닌(Allophycocyanin) (APC)-접합된 염소 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. FACS 완충제를 사용한 광범위한 세척 후에, 세포를 아이오딘화프로피듐 (PI)으로 염색하고, BD LSR II 유동 세포측정기를 사용한 다중-채널 분석에 적용하였다. PI-음성 세포로부터의 형광 신호를 히스토그램 플롯에 나타냈다.
야생형 RNF43의 과다발현은 막 FZD를 감소시킨다. RNF43 siRNA의 효과가 오프-타겟(off-target) 활성에 의해 매개될 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 YAPC 세포에서 siRNA-저항성 RNF43 cDNA를 안정하게 발현시킴으로써 cDNA 구출 실험을 수행하였다.
siRNA-저항성 RNF43의 발현은 프리즐드 수준에 대한 RNF43 siRNA의 효과를 거의 소실시켰기 때문에, RNF43 siRNA의 활성은 온-타켓(on-target)이다.
RNF43ΔRING의 과다발현은 막 FZD를 증가시킨다. RNF43의 고갈은 또한 β-카테닌 표적 유전자인 AXIN2의 발현을 증가시켰고, 이 효과도 또한 siRNA 저항성 RNF43의 발현에 의해 소실된다. 도 3c를 참조한다.
RNF43 siRNA에 대해 저항성인 RNF43 cDNA, RNF43 ΔRING (아미노산 272-312 손실) 및 F69C 돌연변이체를 2단계 돌연변이유발 PCR에 의해 생성시키고, 다양한 포유동물 발현 벡터 내에 클로닝하였다. pLenti6-STF 리포터 플라스미드 및 β-카테닌 shRNA 바이러스 플라스미드는 이전에 문헌 [Hao H-X et al. (2012) Nature 485(7397):195-200]에 기재된 바 있다.
본 발명자들이 정량적 PCR 검정에서 관찰한 역치 사이클 (Ct) 값에 기반할 때, RNF43은 YAPC 세포에서 ZNRF3에 비해 우세하게 발현된다. 본 발명자들의 결과는 RNF43이 췌장 세포에서 프리즐드의 막 발현을 감소시키는 것을 통해 Wnt 신호전달을 음성적으로 조절함을 나타낸다.
RNF43은 Wnt 신호전달 조절에서의 그의 중요성과 일치하게, qPCR에 의해 췌장암 YAPC에서 ZNRF3보다 높은 수준으로 발현된다. Wnt/β-카테닌 신호전달은 췌장의 외분비 구획의 발달 및 선방 세포의 안정화된 β-카테닌 증식의 이소성 발현을 촉진한다. 문헌 [Heiser PW et al. (2006) Development 133(10):2023-32]. 본 발명자들은 R-스폰딘 단백질이 ZNRF3 및 RNF43을 억제하고 프리즐드를 안정화시키는 것을 통해 Wnt 신호전달을 자극한다는 것을 이전에 보여준 바 있다. 문헌 [Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397):195-200].
Wnt/β-카테닌 신호전달은 프리즐드의 막 발현을 억제한다.
Wnt/β-카테닌 신호전달은 FZD 막 발현을 음성적으로 조절한다. 포큐파인 억제제 LGK974는 FZD의 막 수준을 증가시킨다. RNF43 및 ZNRF3은 β-카테닌 표적 유전자인 것으로 나타나 있다. 문헌 [Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397):195-200; Koo BK et al. (2012) Nature 488(7413):665-9]. 그러나, 프리즐드 발현에 대한 내인성 Wnt/β-카테닌 신호전달의 효과는 시험되지 않았다.
본 발명자들은 유동 세포측정법에 의해 독립적 β-카테닌 siRNA가 YAPC 세포에서 프리즐드의 세포 표면 수준을 유의하게 증가시켰음을 발견하였다. β-카테닌의 고갈은 또한 β-카테닌 표적화 유전자 AXIN2 및 RNF43의 mRNA 수준을 감소시켰다. 도 4a를 참조한다. 표 7은 β-카테닌의 고갈이 프리즐드의 세포 표면 수준을 증가시킴을 나타낸다. YAPC 세포를 지시된 siRNA에 의해 형질감염시키고, 프리즐드의 막 수준을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
Figure pct00009
이 관찰과 일치하게, 포큐파인 억제제 IWP2 또는 LGK974의 처리는 프리즐드의 세포 표면 수준을 증가시키고, AXIN2 및 RNF43의 mRNA 수준을 감소시켰다. 도 4b를 참조한다. 표 8은 포큐파인 억제제가 프리즐드의 세포 표면 수준을 증가시킴을 나타낸다. YAPC 세포를 3 μM의 IWP-2 또는 1 μM의 LGK974로 처리하고, 막 프리즐드 발현에 대한 유동 세포측정법 분석에 적용하였다.
Figure pct00010
이들 결과는 Wnt/β-카테닌 신호전달이 프리즐드의 막 수준을 강하게 억제함을 나타낸다.
췌장 종양에서의 RNF43 돌연변이의 특성화
RNF43의 불활성화 돌연변이를 함유하는 췌장암 세포주의 확인. 포큐파인의 강력하고 선택적인 억제제인 LGK974의 발견은, 본 발명자들에게 암 세포주의 대규모 패널에서 Wnt 의존성을 계통적으로 검사하기 위한 특유의 화학적 도구를 제공하였다. 본 발명자들은 병소 형성 검정을 사용하여 췌장암 세포주의 대규모 패널에서 LGK974를 시험하였다. 병소 형성 검정을 이용하였는데, 이는 그것이 상용 성장 검정, 예컨대 셀타이터-글로보다 민감하고, 다양한 세포주의 상이한 성장 속도에 의해 덜 영향받기 때문이다. 스크리닝된 39종의 췌장 세포주 중에, LGK974는 오직 3종의 세포주, PaTu-8988S, HPAFII 및 Capan-2에서만 강한 성장 억제 활성을 나타냈다.
본 발명자들은 이어서 Wnt 의존성을 부여할 수 있는 유전적 병변을 결정하는 것을 모색하였다. RNF43은 암에서 돌연변이된 Wnt 경로의 상류에서의 유일하게 공지된 음성 조절제이다. 이 이유로, 본 발명자들은 모든 췌장암 세포주에서 RNF43 엑손 서열분석을 수행하였다. 놀랍게도, 모든 3종의 LGK974-감수성 세포주는 RNF43의 동형접합 돌연변이 (HPAFII, E174X; PaTu-8988S, F69C; Capan-2, R330fs)를 갖는다. E174X 및 R330fs 돌연변이는 대다수의 RNF43 단백질을 말단절단하고, 단백질을 불활성화시킬 가능성이 가장 높다. 여분의 시스틴을 RNF43의 세포외 도메인에 도입하는 F69C 돌연변이의 결과는 보다 덜 명백하다.
세포주에서의 돌연변이를 게놈 서열 분석에 의해 결정하였다. 서열 분석을 위해 일반적으로, 게놈 DNA를 제조업체의 지침에 따라 QIAamp DNA 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 추출하였다. RNF43의 엑손을 PCR에 의해 증폭시키고, 어플라이드 바이오시스템즈 플랫폼을 사용하여 서열분석하였다.
F69C 돌연변이의 기능을 정의하기 위해, 본 발명자들은 YAPC 세포에서 C-말단 HA-태그부착된 야생형 RNF43, RNF43 ΔRING, 및 RNF43 F69C를 안정하게 발현시켰다.
전장 인간 RNF43 cDNA (NM_017763.4)를 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems)로부터 구입하여, PCR에 의해 C-말단 HA 에피토프로 태그부착하였다. RNF43 siRNA에 대해 저항성인 RNF43 cDNA, RNF43 ΔRING (아미노산 272-312 손실) 및 F69C 돌연변이체를 2단계 돌연변이유발 PCR에 의해 생성시키고, 다양한 포유동물 발현 벡터 내에 클로닝하였다. pLenti6-STF 리포터 플라스미드 및 β-카테닌 shRNA 바이러스 플라스미드는 이전에 문헌 [Hao H-X et al. (2012) Nature 485(7397):195-200]에 기재된 바 있다.
프리즐드 턴오버의 조절에서의 RNF43의 기능과 일치하게, 야생형 RNF43의 과다발현은 프리즐드의 막 수준을 감소시킨 반면, RNF43 ΔRING의 과다발현은 우세한 음성 활성을 나타냈고, 프리즐드의 막 수준을 증가시켰다. RNF43 F69C의 과다발현은 프리즐드의 막 수준을 소폭으로 증가시켰기 때문에, F69C는 기능 상실 돌연변이체이고, 과다발현 시 부분적으로 우세한 음성 활성을 갖는다.
표 9는 공벡터 (EV), 야생형 (WT) RNF43 또는 돌연변이체 (ΔRING 또는 F69C) RNF43을 안정하게 발현하는 YAPC 세포에서의 막 프리즐드의 유동 세포측정 분석을 나타낸다.
Figure pct00011
또한, RNF43 ΔRING의 과다발현 및 RNF43 F69C에 대한 더 낮은 정도로의 발현은 DVL2 인산화를 증가시켰고, Wnt3a-유도된 STF 리포터 활성을 강화하였다. 이들 데이터는 F69C가 RNF43에 대한 불활성화 과오 돌연변이임을 입증한다.
RNF43의 고갈은 RNF43 야생형에서 FZD 막 발현을 증가시키지만, RNF43 돌연변이 세포에서는 증가시키지 않는다. 본 발명자들은 이어서 이들 췌장암 세포주에서의 RNF43의 기능을 검사하였다. 야생형 RNF43을 갖는 2종의 췌장암 세포주 YAPC 및 PK1에서는 RNF43의 고갈이 DVL2 인산화를 증가시켰지만, HPAFII, PaTu-8988S 및 Capan-2 세포에서의 RNF43의 고갈은 DVL2 인산화를 증가시키지 않았다. 일관되게, RNF43의 고갈은 RNF43 야생형 (YAPC 및 PK1)에서 프리즐드의 세포 표면 수준을 증가시켰지만, RNF43 돌연변이체 (HPAFII, PaTu-8988S 및 Capan-2) 췌장암 세포주에서는 증가시키지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 RNF43 돌연변이를 갖는 췌장암 세포주에서는 프리즐드 수준이 RNF43에 의해 더 이상 억제되지 않음을 나타낸다.
표 10은 RNF43 siRNA로 처리된 췌장암 세포주에서의 막 프리즐드의 유동 세포측정 분석을 나타낸다.
Figure pct00012
RNF43 돌연변이는 췌장 종양에서의 Wnt 억제에 대한 감수성을 예측한다.
LGK974는 모든 세포주에서 시토졸 β-카테닌을 감소시킨다. 본 발명자들은 이어서 췌장암 세포주에서의 Wnt-의존성을 특성화하였다. 병소 형성 검정에서, LGK974는 PK1 및 YAPC에 유의한 영향을 미치지 않으면서 PaTu-8988S, HPAFII 및 Capan-2의 성장을 강하게 억제하였다 (표 6 참조). 중요하게는, RNF43 돌연변이 세포에서의 LGK974의 성장 억제 효과는 외인성 Wnt3a에 의해 구출되기 때문에, LGK974의 효과는 Wnt 분비의 차단에 의해 매개된다 (병소 형성 검정에서 췌장암 세포주를 DMSO, 1 μM의 LGK974, 또는 재조합 Wnt3a와 함께인 LGK974로 처리함). 이뮤노블롯 및 qPCR 검정은 LGK974가 RNF43 돌연변이체에서 β-카테닌 표적 유전자인 MYC의 발현을 감소시키고 시클린 의존성 키나제 억제제 p21의 발현을 증가시켰지만, RNF43 야생형 세포주에서는 그렇지 않았음을 나타냈다. LGK974는 RNF43 돌연변이체 및 RNF43 야생형 세포주 둘 다에서 시토졸 β-카테닌을 감소시키고 β-카테닌 표적 유전자 AXIN2의 발현을 감소시켰기 때문에, 모든 이들 세포주는 활성 자가분비 Wnt 신호전달을 갖는다.
또한, LGK974는 RNF43 돌연변이 세포에서 분화 마커 MUC2, MUC5A/C의 발현을 유도하였다. LGK974는 RNF43 돌연변이 세포주에서 EDU 혼입을 차단하였기 때문에, 이들 세포에서의 Wnt 억제는 세포 주기 정지를 유도한다. LGK974-유도된 성장 억제 및 RNF43 돌연변이 세포의 세포 분화는 또한 Ki67 염색 (미국 94010 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories)로부터의 항-Ki67 (SP6)) 및 알시안 블루(Alcian Blue) 염색을 사용할 때 명백하다. 또한, LGK974는 연질 한천 검정에서 PaTu-8988S 및 HPAFII의 증식을 강하게 억제하였지만, PK1에 대해서는 그렇지 않았다. Capan-2는 연질 한천 검정에서 성장하지 않기 때문에 시험할 수 없다. 종합하면, 이들 결과는 RNF43 돌연변이 세포에서의 자가분비 Wnt 신호전달의 억제가 성장 정지 및 세포 분화를 유도함을 나타낸다.
연질 한천 검정을 위해, 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM 중 0.3% 저융점 아가로스 (론자(Lonza)) 250 μl 중에 재현탁시키고, 웰당 5,000-10,000개 세포의 밀도로 48-웰 배양 플레이트 내 고체화된 0.8% 아가로스 함유 DMEM 250μl에 플레이팅하였다. 플레이트를 30분 동안 실온으로 냉각시킨 후에, 성장 배지 250μl를 세포 상부에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 분위기에서 37℃로 인큐베이션하였다. 세포를 3-4일마다 DMSO 또는 1 μM LGK974를 함유하는 신선한 성장 배지로 처리하였다. 콜로니가 바람직한 크기에 도달했을 때, 사진을 촬영하고, 콜로니를 제조업체의 지침에 따라 알라마르블루(AlamarBlue) (미국 14072 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 인비트로젠, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)으로부터의 것)로 염색하였다. 이들 실험을 3회 반복하고, 적어도 4개 웰을 각각의 조건에 대해 매번 복제하였다.
EdU 증식 검정을 위해, 세포를 웰당 6000-12,000개 세포의 밀도로 96 웰 플레이트 내 성장 배지 중에 플레이팅하고, DMSO 또는 1μM LGK974로 처리하였다. 3일 후에, 세포를 클릭-iT EdU 알렉사 플루오르 488 HCS 검정 키트 (인비트로젠) 내에 포함된 20 μM EdU를 함유하는 신선한 성장 배지로 처리하고, 플레이트를 5% CO2를 함유하는 가습 분위기에서 2시간 동안 37℃로 인큐베이션하였다. 세포를 최종 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정시키고, PBS로 세척하고, 투과시키고, 30분 동안 PBS 중 0.75% 트리톤엑스-100(TritonX-100) 및 50 μg/ml 훽스트(Hoechst)로 염색하였다. 세척 후에, 클릭-iT EdU 검정 키트의 지침에 따라 세포의 EdU 검출을 진행하였다. 3중 웰을 각각의 조건에 대해 수행하였다.
뮤신에 대한 알시안 블루 염색을 위한 절차는 하기와 같다: 췌장암 세포주를 다양한 밀도로 225 cm³조직 배양 플라스크에 플레이팅하고, 72시간 동안 DMSO 또는 LGK974 (100 nM)로 처리하였다. 배지를 제거하고, 1x PBS로 세척하고, 10% 완충 포르말린 10 ml를 첨가함으로써 세포 펠릿을 수확하였다. 이어서, 세포를 플라스크의 바닥으로부터 수거하여 50 ml 원추형 튜브에 넣고, 10% 완충 포르말린으로 ~50 ml로 채우고, 1-2시간 동안 고정되도록 하였다. 이어서, 고정된 세포를 함유하는 원추형 튜브를 5분 동안 1200 rpm으로 원심분리하고, 펠릿화 세포를 렌즈 페이퍼로 감싸고, 조직학 카세트에 넣고, 가공하고, 파라핀 포매시켰다. FFPE 절편을 5 μm로 절단하고, 슬라이드 상에 올리고, 적어도 30분 동안 60℃에서 굽고, 탈파라핀화하였다. 이어서, 슬라이드를 H2O 중에서 2회 헹구고, 3분 동안 3% 수성 아세트산으로 옮기고, 바로 30분 동안 3% 아세트산 pH 1 중 알시안 블루 1%로 이동시켰다. 이어서, 슬라이드를 10분 동안 흐르는 물에 넣고, 그 후 증류된 H2O 중에서 헹군 다음, 뉴클리어 패스트 레드(Nuclear Fast Red) 0.1% (케르네크트로트(Kernechtrot))에 5분 동안 넣었다. 슬라이드를 흐르는 물에서 다시 세척한 다음 탈수시켰다. 마지막으로, 슬라이드를 퍼마슬립(Permaslip)®으로 커버슬립하였다.
이뮤노블롯팅을 위해, 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제로 보충한 RIPA 완충제 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 1 mM EDTA)를 사용하여 세포를 용해시킴으로써 전체 세포 용해물을 제조하고, 이어서 4℃에서 10분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 시토졸 β-카테닌 추출을 위해, 세포 펠릿을 저장성 완충제 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5 및 10 mM KCl, 프로테아제/포스파타제 억제제로 보충함) 중에 재현탁시키고, 3회의 동결-해동 주기에 의해 용해시켰다. 등량의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분해시키고, 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. HRP 또는 적외선 염료와 접합된 2차 항체를 ECL 필름 또는 리-코르 오디세이(LI-COR Odyssey) 스캐너 각각에 의한 신호 시각화를 위해 사용하였다.
LGK974는 RNF43 돌연변이체에서 MYC를 억제하고 p21 단백질 발현을 유도하지만, RNF43 야생형 췌장암 세포주에서는 그렇지 않다. 프리즐드 단백질은 정규 Wnt/β-카테닌 신호전달 및 비정규 Wnt 신호전달 둘 다를 강화하기 때문에, RNF43의 돌연변이 불활성화는 정규 및 비정규 Wnt 신호전달 둘 다를 증가시킬 것으로 생각된다. 본 발명자들이 연구한 췌장 세포주의 세포 성장에서의 Wnt/β-카테닌 신호전달의 기여를 결정하기 위해, 본 발명자들은 β-카테닌 shRNA를 사용하였다. 이전에 검증된 β-카테닌 shRNA의 유도성 발현 (문헌 [Scholer-Dahirel A et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(41):17135-40])은 RNF43 돌연변이체 (PaTu-8988S, HPAFII 및 Capan-2)의 증식을 강하게 억제하였지만, RNF43 야생형 (PK1 및 YAPC) 췌장암 세포주에 대해서는 그렇지 않았다. β-카테닌의 고갈은 또한 RNF43 돌연변이 세포주에서 β-카테닌 표적 유전자 AXIN2 및 MYC (항-MYC는 미국 02139 매사추세츠주 캠브리지 소재의 압캠(Abcam)으로부터 입수가능함)의 발현을 감소시켰고, p21 (항-p21은 미국 01730 매사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포어(Millipore)로부터 입수가능함), MUC2 및 MUC5A/Cs의 발현을 증가시켰다. 이들 결과는 세포 성장에 대한 LGK974의 효과가 정규 Wnt/β-카테닌 신호전달에 의해 매개될 가능성이 있음을 나타낸다.
본 발명자들은 이어서 RNF43 돌연변이가 RNF43 돌연변이 세포의 성장에 요구되는지를 검사하였다. 본 발명자들은 LacZ 또는 RNF43 ΔRING이 아닌 RNF43 야생형의 발현이 RNF43 돌연변이된 PaTu-8988S 및 Capan-2 세포의 증식을 유의하게 억제하였지만, RNF43 야생형 YAPC 세포에 대해서는 아무런 영향도 미치지 않았음을 발견하였다. 야생형 RNF43의 과다발현은 아마도 PaTu-8988S 세포에서 내인성으로 발현되는 RNF43 F69C의 소수의 우세한 활성을 극복한 것 같다. HPAFII는 이 검정에서 시험할 수 없는데, 이는 이 세포주의 바이러스 감염 효율이 너무 낮아서, 본 발명자들이 LacZ 또는 RNF43 ΔRING을 발현하는 레트로바이러스를 사용하여 안정하게 감염된 세포를 수득할 수 없었기 때문이다.
종합하면, 본 발명자들의 결과는 RNF43 돌연변이에 의해 증진된 Wnt/β-카테닌 신호전달이 RNF43 돌연변이 췌장암 세포의 증식에 요구되고, 이들 세포에서의 Wnt/β-카테닌 신호전달의 억제가 세포 주기 정지 및 분화 마커의 유도를 유도함을 나타낸다.
Wnt 분비의 차단은 생체내 RNF43 돌연변이 췌장 종양의 성장을 억제한다. 생체내 RNF43 돌연변이 췌장 종양의 유지에서의 Wnt 경로 활성화의 역할을 분석하기 위해, 본 발명자들은 2종의 PDAC 이종이식편 모델 (HPAFII 및 Capan-2)을 이용하였다.
생체내 효능 및 약동학적 연구를 위해, 세포를 95-110% 전면생장률의 밀도에서 수확하였다. BD 매트리겔 매트릭스 기저막 (매트리겔(Matrigel)) (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))과 50:50 혼합된 1000만 개 세포 (HPAFII) 또는 300만 개 세포 (Capan-2)를 nu/nu (하를란(Harlan)) (HPAFII) 또는 scid.bg (하를란) (Capan-2) 마우스의 오른쪽 앞다리 액와 위 영역 내에 피하 이식하였다. 종양을 매주 2회 캘리퍼링에 의해 모니터링하고, 종양 부피 (TV)를 타원체 공식 TV(mm3) = ((l x w2) x 3.14159))/6을 사용하여 계산하였다. 평균 종양 부피가 223 mm3 (200-250 mm3 범위)에 도달한 경우에는 종양 이식 후 14일 째에 (Capan-2), 평균 종양 부피가 341 mm3 (272-418 mm3 범위)에 도달한 경우에는 이식 후 11일 째에 (HPAFII), 이종이식 종양-보유 마우스를 처리군 (군당 n=8)으로 무작위화하였다. 마우스를 매일 2회 (BID) 경구 위관영양 (p.o.)에 의해 10 ml/kg의 투여 부피로 비히클 (0.5% 메틸셀룰로스 (MC) / 0.5% 트윈(Tween) 80) 또는 0.5% MC / 0.5% 트윈 80 중 LGK974의 푸마레이트 염 형태 (LGK974-AE-4, 유리 염기 분자량 전환 인자 1.293)의 0.65 mg/mL 현탁액으로 처리하였다. 생체내 용량은 유리 염기 등가물로서 보고된다. 14일 (HPAFII) 또는 35일 (Capan-2) 동안의 처리 후에, 항종양 활성을 퍼센트 처리군/대조군 (%T/C) 또는 %퇴행 (%REG) 값으로서 보고하였다. 항종양 활성을 하기 공식을 사용하여 계산하였다: ΔTt ≥ 0인 경우 %T/C = 100 ΔΔTt/ΔCt; 또는 ΔTt < 0인 경우 %REG = 100 ΔΔTt/T0; 여기서, T0 = 무작위화 당일의 약물-처리군의 평균 종양 부피 (TV); Tt = 연구 끝에서의 약물-처리군의 평균 TV; ΔTt = T0 - Tt; Ct= 연구 마지막 날의 대조군의 평균 TV; C0 = 무작위화 당일의 대조군의 평균 TV; 및 ΔCt = C0 - Ct *42 내지 100% 범위의 %T/C 값은 항종양 활성을 갖지 않는 것으로 해석되고; ≤ 42% 및 > 10%의 %T/C 값은 항종양 활성을 갖는 것으로 해석되고, ≤ 10%의 %T/C 값 또는 ≥ -10%의 %REG는 종양 정체인 것으로 해석된다. < -10%의 %REG 값은 퇴행으로서 해석된다. 별개로, 동물의 평행 코호트 (처리 및 시점당 n=3)를 상기와 같은 비히클 또는 LGK974로 처리하여 약동학적 마커의 생체외 분석을 위한 종양 조직을 수득하였다.
HPAFII 이종이식편을 보유하는 마우스의 14일 동안의 5 mg/kg LGK974, p.o. BID로의 처리는 비히클 처리에 비해 종양 성장의 유효한 억제 (T/C=33%)를 유발하였다. 또한, Capan-2 이종이식편을 보유하는 마우스의 35일 동안의 5 mg/kg LGK974, p.o. BID로의 처리는 종양 정체 (T/C=5%)를 달성하였다. LGK974의 작용 메카니즘과 일치하게, β-카테닌 표적 유전자 AXIN2의 발현은 처리된 HPAFII 및 Capan-2 이종이식편에서 감소하였다. RNF43 돌연변이 PDAC 세포에서의 시험관내 발견과 유사하게, LGK974로의 처리는 이종이식 종양 내에서 세포 주기 정지 및 분화를 유도하였다.
면역조직화학 및 영상 분석을 위해, 이종이식 종양 샘플을 6-24시간 동안 10% 중성-완충 포르말린 중에 고정시키고, 가공하고, 파라핀 포매시켰다. 면역조직화학 염색을 벤타나 디스커버리 시스템(Ventana Discovery System) 상에서 수행하였다. 영상을 아페리오 스캔스코프(Aperio Scanscope)를 사용하여 캡쳐하였다. 마우스 췌장 및 이종이식 종양의 전체 절편의 영상을 비지오팜(Visiopharm)으로 분석하였다. 이종이식 종양에 대해, 기질 조직은 섹션 어셈블러(Section Assembler) 모듈을 사용하여 자동으로 배제시켰다. 괴사 영역은 분석 소프트웨어에 의해 제공되는 드로잉 도구를 사용하여 수동으로 배제시켰다. 조직을 티슈모르프DP(TissuemorphDP) 모듈을 사용하여 절편화하고, DAB 강도를 핵 단백질에 대한 양성 핵 퍼센트 또는 핵에 국한되지 않은 단백질에 대한 양성 픽셀 퍼센트로서 정량화하였다.
논의.
본 실시예에서, 본 발명자들은 RNF43이 프리즐드의 막 발현을 억제함으로써 췌장 세포에서 Wnt 경로의 음성 피드백 조절제로서 작용함을 입증하였다. 본 발명자들은 Wnt/β-카테닌 신호전달이, 아마도 RNF43의 유도를 통해, 프리즐드 막 발현을 강력하게 억제함을 보여주었다. 이 발견은 췌장암 세포가 이 강력한 음성 피드백 조절로부터 벗어나서 Wnt/β-카테닌 신호전달의 높은 수준을 달성하기 위해 RNF43을 돌연변이시키는 것을 선택하는 이유를 설명해준다. 본 발명자들의 데이터는 RNF43을 췌장암에서의 종양 억제자로서 확립하고, RNF43 돌연변이가 Wnt 신호전달 경로를 표적화하는 작용제의 효능을 예측하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 발명자들은, LGK974가 29종의 췌장암 세포주 중 22종 (76%)에서 AXIN2의 발현을 감소시키기 때문에, 높은 백분율의 췌장암 세포주가 자가분비 Wnt 신호전달을 갖는다는 것을 발견하였다. 그러나, 대부분의 이들 세포주의 성장은 병소 형성 검정에서 LGK974에 의해 영향을 받지 않는다. 놀랍게도, 성장 검정에서 LGK974에 대해 명백한 감수성을 나타내는 모든 3종의 췌장암 세포주는 RNF43 기능 상실 돌연변이를 보유한다. 이들 결과는 RNF43 돌연변이된 종양이 RNF43 야생형 종양에 비해 Wnt 의존성일 가능성이 더 높음을 나타낸다.
흥미롭게도, RNF43 돌연변이를 갖는 모든 세포주가 LGK974에 대해 감수성인 것은 아니다. 본 발명자들은 RNF43의 동형접합 돌연변이를 보유하는 3종의 췌장암 세포주인 Patu-8988T (F69C), Panc10.05 (M18fs) 및 PL45 (M18fs)를 발견했지만, 이들 세포주의 성장은 LGK974에 대해 감수성이 아니었다. Patu-8988S 및 Patu-8988T는 동일한 환자로부터 유도되었고, Panc10.05 및 PL45도 동일한 환자로부터 유도되었음에 주의한다. 이들 결과는 다른 메카니즘이 RNF43 돌연변이된 종양을 Wnt 신호전달에 대해 독립적으로 만들 수 있음을 나타낸다.
임상 시험에서, 요법에 대해 반응할 가능성이 가장 높은 환자를 풍부하게 하는 것은, 분자적으로 표적화된 암 치료제의 독성 및 분자 병변 수준에서의 종양의 이종성에 기인하여, 이들 작용제의 성공적 개발에 유익하다. 그러나, 이들 작용제의 임상 개발은 Wnt-의존성 종양을 확인하기 위한 양호한 전략이 이용가능하지 않기 때문에 어렵다. Wnt 단백질의 과다발현 또는 Wnt 억제제의 과소발현에 기반한 전략은 환자 선택에 충분하도록 견고하지 않을 것이다. 실제로, 명백한 자가분비 Wnt/β-카테닌 신호전달을 갖는 많은 PDAC 세포주는 시험관내 성장에 대해 Wnt에 대해 의존적이지 않다. 또한, β-카테닌 신호전달은 리간드 독립적 방식으로 활성화될 수 있기 때문에, β-카테닌의 핵 축적에 기반한 전략 역시 신뢰할만하지 않을 것이다.
본 발명자들의 연구는 RNF43을 췌장암에서 상류 Wnt 신호전달을 억제하는 종양 억제자로서 확립하였다. 시험관내에서 Wnt 억제제에 대해 감수성인 모든 Wnt 억제제 췌장암 세포주가 RNF43 돌연변이를 보유한다는 본 발명자들의 발견은 RNF43 돌연변이가 Wnt 억제제 효능을 시험하기 위한 임상 시험을 위한 췌장 종양을 선택하기 위해 사전 결정된 바이오마커로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
본원에 인용된 각각의 특허 및 간행물의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 제공된 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 그의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 다른 변형은 당업자에게 매우 명백할 것이고, 첨부된 특허청구범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG Cong, Feng Hao, Huaixiang Hsieh, Hsin-I Jiang, Xiaomo Liu, Jun Ng, Nicholas <120> CANCER PATIENT SELECTION FOR ADMINISTRATION OF Wnt SIGNALING INHIBITORS USING RNF43 MUTATION STATUS <130> PAT054993-US-PCT <150> US 61/604,290 <151> 2012-02-28 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4573 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Human RNF43 cDNA sequence <222> (1)..(4573) <223> NCBI Reference Sequence: NM_017763.4 <400> 1 agaacaccaa ttacaaacca caggcttcct gctctaggga gttgatccag aattgtcttt 60 ctgaaaggaa gcactcggaa tccttccgaa ctttccaagt ccatccatga ttcagagata 120 ctgccttctc tctctctggg attttatgtg tttctgatag tgaattgttg atgtatttgc 180 tactttgctt cttttctctt tcaagacttg atcattttat atgctgtttg gagaaaaaaa 240 gaacttttgt tagcaaggag gtttcagaaa tgattttgga ttttctgtaa gtgtttaatt 300 tagttctagg ggacagcatc tctcatcccg gagtaaattt ctgcctttga cctgcatgga 360 ttattttttc aggctgcgga atttctcggc acctacctgt agtatggggc acttggtttg 420 gttgcagagt aagaaggtgg aagaatgagc tgtacttggt 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Pro Ala 485 490 495 Arg Ala Phe Pro Pro Ser Gly Ser Gly Ser Leu Leu Phe Pro Thr Val 500 505 510 Val His Val Ala Pro Pro Ser His Leu Glu Ser Gly Ser Thr Ser Ser 515 520 525 Phe Ser Cys Tyr His Gly His Arg Ser Val Cys Ser Gly Tyr Leu Ala 530 535 540 Asp Cys Pro Gly Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gln Cys 545 550 555 560 His Cys Ser Ser Ser Asp Ser Val Val Asp Cys Thr Glu Val Ser Asn 565 570 575 Gln Gly Val Tyr Gly Ser Cys Ser Thr Phe Arg Ser Ser Leu Ser Ser 580 585 590 Asp Tyr Asp Pro Phe Ile Tyr Arg Ser Arg Ser Pro Cys Arg Ala Ser 595 600 605 Glu Ala Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Arg Gly Pro Ala Leu Cys Phe 610 615 620 Glu Gly Ser Pro Pro Pro Glu Glu Leu Pro Ala Val His Ser His Gly 625 630 635 640 Ala Gly Arg Gly Glu Pro Trp Pro Gly Pro Ala Ser Pro Ser Gly Asp 645 650 655 Gln Val Ser Thr Cys Ser Leu Glu Met Asn Tyr Ser Ser Asn Ser Ser 660 665 670 Leu Glu His Arg Gly Pro Asn Ser Ser Thr Ser Glu Val Gly Leu Glu 675 680 685 Ala Ser Pro Gly Ala Ala Pro Asp Leu Arg Arg Thr Trp Lys Gly Gly 690 695 700 His Glu Leu Pro Ser Cys Ala Cys Cys Cys Glu Pro Gln Pro Ser Pro 705 710 715 720 Ala Gly Pro Ser Ala Gly Ala Ala Gly Ser Ser Thr Leu Phe Leu Gly 725 730 735 Pro His Leu Tyr Glu Gly Ser Gly Pro Ala Gly Gly Glu Pro Gln Ser 740 745 750 Gly Ser Ser Gln Gly Leu Tyr Gly Leu His Pro Asp His Leu Pro Arg 755 760 765 Thr Asp Gly Val Lys Tyr Glu Gly Leu Pro Cys Cys Phe Tyr Glu Glu 770 775 780 Lys Gln Val Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Tyr Thr Glu 785 790 795 800 Asp Tyr Ser Val Ser Val Gln Tyr Thr Leu Thr Glu Glu Pro Pro Pro 805 810 815 Gly Cys Tyr Pro Gly Ala Arg Asp Leu Ser Gln Arg Ile Pro Ile Ile 820 825 830 Pro Glu Asp Val Asp Cys Asp Leu Gly Leu Pro Ser Asp Cys Gln Gly 835 840 845 Thr His Ser Leu Gly Ser Trp Gly Gly Thr Arg Gly Pro Asp Thr Pro 850 855 860 Arg Pro His Arg Gly Leu Gly Ala Thr Arg Glu Glu Glu Arg Ala Leu 865 870 875 880 Cys Cys Gln Ala Arg Ala Leu Leu Arg Pro Gly Cys Pro Pro Glu Glu 885 890 895 Ala Gly Ala Val Arg Ala Asn Phe Pro Ser Ala Leu Gln Asp Thr Gln 900 905 910 Glu Ser Ser Thr Thr Ala Thr Glu Ala Ala Gly Pro Arg Ser His Ser 915 920 925 Ala Asp Ser Ser Ser Pro Gly Ala 930 935 <210> 5 <211> 784 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> Mouse RNF43 protein sequence <222> (1)..(784) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(23) <220> <221> mat_peptide <222> (24)..(784) <220> <221> DOMAIN <222> (272)..(316) <223> RING-finger domain <400> 5 Met Ser Gly Gly His Gln Leu Gln Leu Ala Val Leu Trp Pro Trp Leu -20 -15 -10 Leu Met Ala Thr Leu His Ala Gly Phe Gly His Thr Gly Arg Val Leu -5 -1 1 5 Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gln Lys Ala Val Ile 10 15 20 25 Arg Val Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn Leu Thr 30 35 40 Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu Val Thr Pro Ala Glu Gly 45 50 55 Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu Cys Asn Ala Ser Asp Asp 60 65 70 Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser Ile Val Lys Leu Glu Ser Pro 75 80 85 Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Met 90 95 100 105 Ala Gly Glu Arg Gly Ala Asn Ala Val Leu Phe Asp Ile Thr Glu Asp 110 115 120 Arg Ser Ala Ala Glu Gln Leu Gln Gln Pro Leu Gly Leu Thr Lys Pro 125 130 135 Val Val Leu Ile Trp Gly Ser Asp Ala Ala Lys Leu Met Glu Phe Val 140 145 150 Tyr Lys Asn Arg Lys Ala Tyr Val Trp Ile Glu Leu Lys Glu Pro Pro 155 160 165 Ala Gly Ala Asn Tyr Asp Val Trp Ile Leu Leu Thr Val Val Gly Thr 170 175 180 185 Val Phe Val Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu Arg Ile Arg Cys Arg Pro 190 195 200 His His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gln Gln Arg Thr Ala Arg Ala Ile 205 210 215 Ser Gln Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gln Ala Gly Cys Arg Arg Ala Arg 220 225 230 Ala Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Thr Pro Val Cys 235 240 245 Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gln Glu Leu Arg Val Ile 250 255 260 265 Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Thr Cys Val Asp Pro Trp Leu Tyr 270 275 280 Gln His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Met Phe Asn Ile Val Glu Gly Asp 285 290 295 Ser Phe Ser Gln Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ser Tyr Gln Glu Pro Gly 300 305 310 Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gln His Pro Gly His Ala His Tyr His 315 320 325 Leu Pro Ser Ala Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Thr Ser Val Ala Arg 330 335 340 345 Thr Pro Arg Pro Arg Pro Phe Leu Pro Ser Gln Glu Pro Ser Met Gly 350 355 360 Ser Arg His Gln Arg Leu Pro Arg Thr Ser His Leu Arg Ala Pro Glu 365 370 375 Glu Gln Gln His Leu Ala Val Ser Pro His Pro Tyr Ala Gln Gly Trp 380 385 390 Gly Leu Asn Arg Leu Arg Cys Thr Ser Gln His Pro Ala Ala Cys Pro 395 400 405 Val Ala Leu Arg Arg Ala Arg Pro His Glu Ser Ser Gly Ser Gly Glu 410 415 420 425 Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro Ala Ser 430 435 440 Asp Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser Val Val 445 450 455 Asn Cys Thr Asp Val Ser Leu Gln Gly Ile His Gly Ser Ser Ser Thr 460 465 470 Phe Arg Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr Cys Ser 475 480 485 Pro Glu Gly Asp Leu Gln Gly Lys Gly Ile Gln Pro Ser Val Thr Ser 490 495 500 505 Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Arg Gly Glu Thr Gln Val 510 515 520 Ser Ser His Ile His Tyr His Arg His Arg His His His Tyr Lys Arg 525 530 535 Gln Phe Gln Trp His Gly Arg Lys Pro Gly Pro Glu Thr Gly Ile Pro 540 545 550 Gln Ser Met Pro Ala Ala Ser His Thr Gln Leu Glu Pro Ser Leu Pro 555 560 565 Asp Gln Gln Leu Ile Thr Pro Asn Pro Thr Ala Ser Ser Met Leu Pro 570 575 580 585 Asn Pro Gln Arg Pro Arg Ala Leu Thr Glu Pro Ala Pro Gly Leu Ala 590 595 600 Glu Ala Ser Ser Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Asn Pro Ser Gly Leu 605 610 615 Leu Asn Leu Gln Lys Ser Ser Leu Thr Val Arg His Pro His Arg Lys 620 625 630 Arg Arg Gly Gly Pro Ser Glu Pro Leu Pro Thr Ser Leu Pro Pro Asp 635 640 645 Leu Thr Val His Thr Ala Cys Pro Val Phe Pro His Tyr Ser Pro Arg 650 655 660 665 Leu Ala Tyr Pro Trp Pro Pro Glu Val His Pro Leu Met Phe Arg Pro 670 675 680 Pro Gly Pro Asp Arg Arg Leu Leu His Glu Val Pro Gly Pro Cys Tyr 685 690 695 Ser Ser Ser Gln Pro Val Trp Leu Tyr Leu Asn Pro Cys Gln Pro Leu 700 705 710 Gly Pro Cys Leu Pro Gly Glu Gly His Ser Lys Trp Thr Phe Asp Ser 715 720 725 Pro Glu Gly Arg Arg Cys Pro Tyr Ser His Cys Gln Val Leu Pro Ala 730 735 740 745 Gln Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu Gln Ala Val 750 755 760 <210> 6 <211> 913 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> Mouse ZNRF3 protein sequence <222> (1)..(913) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(52) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(52) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(52) <220> <221> mat_peptide <222> (53)..(913) <400> 6 Met Arg Pro Arg Ser Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Arg Arg Arg -50 -45 -40 Arg Arg Leu Arg Arg Gly Pro Arg Gly Arg Arg Leu Pro Pro Pro Pro -35 -30 -25 Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Gly Pro Gly -20 -15 -10 -5 Ala Ala Arg Ala Lys Glu Thr Ala Phe Val Glu Val Val Leu Phe Glu -1 1 5 10 Ser Ser Pro Ser Gly Asp Tyr Thr Thr His Thr Thr Gly Leu Thr Gly 15 20 25 Arg Phe Ser Arg Ala Gly Ala Met Leu Ser Ala Glu Gly Glu Ile Val 30 35 40 Gln Met His Pro Leu Gly Leu Cys Asn Asn Asn Asp Glu Glu Asp Leu 45 50 55 60 Tyr Glu Tyr Gly Trp Val Gly Val Val Lys Leu Glu Gln Pro Glu Leu 65 70 75 Asp Pro Lys Pro Cys Leu Thr Val Leu Gly Lys Ala Lys Arg Ala Val 80 85 90 Gln Arg Gly Ala Thr Ala Val Ile Phe Asp Val Ser Glu Asn Pro Glu 95 100 105 Ala Ile Asp Gln Leu Asn Gln Gly Ser Glu Asp Pro Leu Lys Arg Pro 110 115 120 Val Val Tyr Val Lys Gly Ala Asp Ala Ile Lys Leu Met Asn Ile Val 125 130 135 140 Asn Lys Gln Lys Val Ala Arg Ala Arg Ile Gln His Leu Pro Pro Arg 145 150 155 Gln Pro Thr Glu Tyr Phe Asp Met Gly Ile Phe Leu Ala Phe Phe Val 160 165 170 Val Val Ser Leu Val Cys Leu Ile Leu Leu Val Lys Ile Lys Leu Lys 175 180 185 Gln Arg Arg Ser Gln Asn Ser Met Asn Arg Leu Ala Val Gln Ala Leu 190 195 200 Glu Lys Met Glu Thr Arg Lys Phe Asn Ser Lys Ser Lys Gly Arg Arg 205 210 215 220 Glu Gly Ser Cys Gly Ala Leu Asp Thr Leu Ser Ser Gly Ser Thr Ser 225 230 235 Asp Cys Ala Ile Cys Leu Glu Lys Tyr Ile Asp Gly Glu Glu Leu Arg 240 245 250 Val Ile Pro Cys Thr His Arg Phe His Arg Lys Cys Val Asp Pro Trp 255 260 265 Leu Leu Gln His His Thr Cys Pro His Cys Arg His Asn Ile Ile Glu 270 275 280 Gln Lys Gly Asn Pro Gly Ala Val Cys Val Glu Thr Ser Asn Leu Thr 285 290 295 300 Arg Gly Arg Gln Pro Arg Val Thr Leu Pro Val His Tyr Pro Gly Arg 305 310 315 Val His Arg Thr Asn Ala Ile Pro Ala Tyr Pro Thr Arg Thr Ser Met 320 325 330 Asp Ser His Gly Asn Pro Val Thr Leu Leu Thr Met Asp Arg His Gly 335 340 345 Glu Gln Asn Leu Tyr Ser Pro Gln Thr Pro Thr Tyr Val Arg Gly Tyr 350 355 360 Pro Pro Leu His Leu Asp His Thr Leu Ala Pro His Arg Cys Ser Leu 365 370 375 380 Glu His Arg Ala Tyr Ser Pro Ala His Pro Phe Arg Arg Pro Lys Phe 385 390 395 Ser Ser Arg Ser Phe Ser Lys Ala Ala Cys Phe Ser Gln Tyr Glu Thr 400 405 410 Met Tyr Gln His Tyr Tyr Phe Gln Gly Leu Ser Tyr Pro Glu Gln Glu 415 420 425 Gly Gln Thr Ile Pro Ser Val Thr Pro Arg Gly Gln Ser Arg Ala Phe 430 435 440 Pro Pro Ser Gly Ala Ser Ser Leu Leu Phe Pro Thr Met Val His Val 445 450 455 460 Ala Pro Pro Thr His Val Glu Ser Gly Ser Thr Ser Ser Phe Ser Cys 465 470 475 Tyr His Gly His Arg Ser Val Cys Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Cys Pro 480 485 490 Gly Ser Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ser Gly Gln Cys Arg Cys Ser Ser 495 500 505 Ser Asp Ser Val Val Asp Cys Thr Glu Val Ser Asn Gln Gly Val Tyr 510 515 520 Gly Ser Cys Ser Thr Phe Arg Ser Ser Leu Ser Ser Asp Tyr Asp Pro 525 530 535 540 Phe Ile Tyr Arg Ser Arg Gly Pro Ala Val His Leu Glu Gly Ser Pro 545 550 555 Pro Pro Glu Glu Leu Pro Ala Gly His Ser Gln Ser Ala Gly Arg Gly 560 565 570 Glu Pro Trp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Ser Gly Asp Gln Leu Ser Thr 575 580 585 Cys Ser Leu Glu Met Asn Tyr Ser Ser Asn Ser Ser Leu Glu Pro Arg 590 595 600 Gly Pro Asn Ser Ser Thr Ser Glu Val Gly Leu Glu Val Ser Pro Gly 605 610 615 620 Ala Ala Leu Asp Leu Arg Arg Thr Trp Lys Gly Gly Pro Glu Gly Pro 625 630 635 Ser Cys Ala Cys Cys Phe Glu Pro Gln Pro Phe Pro Pro Gly Ser Gly 640 645 650 Ile Glu Thr Ser Ala Gly Gly Ser Ser Leu Phe Leu Gly Pro Arg Leu 655 660 665 Leu Glu Asp Cys Asn Pro Pro Ser Gly Glu Pro Gln Leu Gly Ser Ser 670 675 680 Gln Gly Leu Tyr Gly Leu His Ser Asp His Tyr Pro Arg Thr Asp Gly 685 690 695 700 Val Lys Tyr Glu Gly Leu Pro Cys Cys Phe Tyr Glu Glu Lys Gln Val 705 710 715 Ala His Ser Ala Gly Arg Gly Asn Gly Cys Tyr Thr Glu Asp Tyr Ser 720 725 730 Val Ser Val Gln Tyr Thr Leu Thr Glu Glu Pro Pro Pro Ser Cys Tyr 735 740 745 Ala Gly Pro Arg Asp Leu Ser Gln Arg Ile Pro Ile Ile Pro Glu Asp 750 755 760 Val Asp Cys Asp Leu Gly Leu Pro Gln Asp Cys His Gly Met His Asn 765 770 775 780 His Ser Pro Trp Gly Gly Ala Leu Ser Leu Asp Val Pro Arg Leu His 785 790 795 Trp Ser Leu Gly Thr Thr Arg Glu Glu Glu Gln Ala Pro Cys Tyr Gln 800 805 810 Ala Glu Val Gln Pro Gly Cys Ser Pro Glu Glu Ala Gly Ala Ser Arg 815 820 825 Ala Ser Leu Ser Ser Ala Pro Gln Asp Thr Gln Glu Ser His Ala Leu 830 835 840 Ala Ala Glu Ala Ser Gly Pro Gly Ser Gly Pro Gly Ile Gly Thr Gly 845 850 855 860 Ala <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)..(19) <223> pGL2 (Dharmacon D-001100-01), target sequence <400> 7 cgtacgcgga atacttcga 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> snRNA <222> (1)..(19) <223> RNF43-1 (Dharmacon J-007004-12), target sequence <400> 8 gguggagucu gaaagauca 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> snRNA <222> (1)..(19) <223> RNF43-2 (Dharmacon J-007004-11), target sequence <400> 9 ggagaaagcu auugcacag 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> snRNA <222> (1)..(19) <223> CTNNB1- 1 (Dharmacon J-003482-10), target sequence <400> 10 uaaugaggac cuauacuua 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> snRNA <222> (1)..(19) <223> CTNNB1- 2 (Dharmacon J-003482-12), target sequence <400> 11 gguacgagcu gcuauguuc 19

Claims (30)

  1. (a) 환자로부터의 종양 세포의 샘플에서
    (i) 이형접합성의 상실을 결정하기 위한 RNF43 염색체 영역 및/또는 ZNRF3 염색체 영역에서의 DNA 카피수,
    (ii) RNF43 유전자 및/또는 ZNRF3 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 검출하기 위한 암 조직으로부터의 서열분석된 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA;
    (iii) RNF43 mRNA 발현 및/또는 ZNRF3 mRNA 발현;
    (iv) RNF43 단백질 발현 및/또는 ZNRF3 단백질 발현;
    (v) RNF43 유전자 상실 및/또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과; 또는
    (vi) 바이오마커 (i) - (v)의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커의 수준을 검출하고;
    (b) 종양 세포 샘플에서의 바이오마커의 수준을
    (i) Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준; 및
    ii) Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커의 대조 수준과 비교하고;
    (c) 환자의 종양이 Wnt 억제제에 대해 감수성일 가능성이 있음을 가리키는, 불활성화 RNF43 또는 ZNRF3 돌연변이를 환자의 종양이 갖는 경우, RNF43 또는 ZNRF3의 감소된 카피수를 환자의 종양이 갖는 경우, 또는 RNF43 mRNA 또는 단백질의 감소된 발현 또는 ZNRF3 mRNA 또는 단백질의 감소된 발현을 환자 종양이 갖는 경우에, 환자를 Wnt 억제제의 치료적 투여로부터 이익을 얻을 것으로 예측되는 것으로서 선택하는 것
    을 포함하는, Wnt 억제제에 의한 억제에 대한 종양 세포 성장의 감수성을 예측하는 방법.
  2. 종양 세포를 적어도 하나의 Wnt 억제제와 접촉시키고;
    (a) 종양 세포에서
    (i) 이형접합성의 상실을 결정하기 위한 RNF43 염색체 영역 및/또는 ZNRF33 염색체 영역에서의 DNA 카피수,
    (ii) RNF43 유전자 및/또는 ZNRF3 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 검출하기 위한 종양 세포로부터의 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA;
    (iii) RNF43 mRNA 발현 및/또는 ZNRF3 mRNA 발현;
    (iv) RNF43 단백질 발현 및/또는 ZNRF3 단백질 발현;
    (v) RNF43 유전자 상실 및/또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과; 또는
    (vi) 바이오마커 (i) - (v)의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커의 수준을 검출하고;
    (b) 종양 세포에서의 바이오마커의 수준을 대조 수준과 비교하고;
    (c) 종양 세포에서의 바이오마커 수준과 대조 수준의 차이에 기반하여 Wnt 억제제에 대한 종양 세포의 감수성을 결정하는 것
    을 포함하는, Wnt 억제제에 대한 종양 세포의 감수성을 예측하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 1(a)(i)에서의 RNF43 염색체 영역에서의 DNA 카피수의 검출이 서열 1의 서열을 갖는 뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브를 사용한 혼성화에 의한 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1(a)(i)에서의 ZNRF3 염색체 영역에서의 DNA 카피수의 검출이 서열 2의 서열을 갖는 뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브를 사용한 혼성화에 의한 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1(a)(i)에서의 ZNRF3 염색체 영역에서의 DNA 카피수의 검출 단계가 형광 계내 혼성화 (FISH)에 의한 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 1(a)(iii)에서 RNF43 mRNA 발현을 측정하기 위한 검정이 서열 1의 서열을 갖는 뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브를 사용한 혼성화에 의한 것인 방법.
  7. 제1항, 제2항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1(a)(iii)에서 ZNRF3 mRNA 발현을 측정하기 위한 검정이 서열 2의 서열을 갖는 뉴클레오티드와 혼성화하는 프로브를 사용한 혼성화에 의한 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 1(a)(iv)에서 RNF43 단백질 발현을 측정하기 위한 검정이 면역조직화학에 의한 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 1(a)(v)에서 기능 상실을 측정하기 위한 검정이 항-프리즐드(Frizzled) 항체를 이용한 FACS 검정을 사용한 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 1(a)(v)에서 기능 상실을 측정하기 위한 검정이 Wnt 리포터 검정을 사용한 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, Wnt 리포터 검정이 단백질 활성을 측정하는 것이고, 여기서 단백질 활성이 증가된 프리즐드 단백질 수준, 증가된 LRP6 단백질 수준, 증가된 LRP6 인산화 및 증가된 디쉐블드(Disheveled) 인산화로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비교 단계가 종양 세포에서의 바이오마커 수준을 Wnt 억제제에 대해 저항성인 하나 이상의 대조 세포에서의 바이오마커의 대조 수준과 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비교 단계가 종양 세포에서의 바이오마커 수준을 Wnt 억제제에 대해 감수성인 하나 이상의 대조 세포에서의 바이오마커의 대조 수준과 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준이 사전 결정된 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준이 사전 결정된 것인 방법.
  16. (a) 종양 세포의 샘플에서
    (i) RNF43 유전자 및/또는 ZNRF3 유전자의 이형접합성의 상실;
    (ii) RNF43 유전자 및/또는 ZNRF3 유전자의 기능 상실의 수준;
    (iii) RNF43 mRNA 및/또는 ZNRF3 mRNA 발현의 수준;
    (iv) RNF43 단백질 및/또는 ZNRF3 단백질 발현의 수준; 및
    (v) RNF43 유전자 및/또는 ZNRF3 유전자 상실의 기능적 효과
    로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커 또는 바이오마커의 조합의 수준을 검출하기 위한 수단;
    (b) 대조군
    을 포함하는, Wnt 억제제의 치료적 투여로부터 이익을 얻거나 또는 이익을 얻지 못할 것으로 예측되는 암 환자를 선택하기 위한 검정 키트.
  17. 제16항에 있어서, 대조군이
    (i) Wnt 억제제에 대한 감수성을 검출하기 위한 대조 샘플;
    (ii) Wnt 억제제에 대한 저항성을 검출하기 위한 대조 샘플;
    (iii) Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 바이오마커의 사전 결정된 대조 수준을 함유하는 정보; 및
    (iv) Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 사전 결정된 대조 수준을 함유하는 정보
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 검정 키트.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 단계 15(a)(i) 및 21(a)(i) 중 임의의 것에서 RNF43 유전자를 검출하기 위한 수단이 서열 1의 서열을 갖는 뉴클레오티드에 혼성화하는 뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것인 검정 키트.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 15(a)(i) 및 21(a)(i) 중 임의의 것에서 ZNRF3 유전자를 검출하기 위한 수단이 서열 2의 서열을 갖는 뉴클레오티드에 혼성화하는 뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것인 검정 키트.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 단계 15(a)(i)에서 RNF43 유전자를 검출하기 위한 수단이 게놈 유전자좌 17q22에 혼성화하는 뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것인 검정 키트.
  21. 제16항, 제17항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 16(a)(i)에서 ZNRF3 유전자를 검출하기 위한 수단이 게놈 유전자좌 22q12.1에 혼성화하는 뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것인 검정 키트.
  22. 제16항, 제17항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 16(a)(iii)에서 RNF43 단백질을 검출하기 위한 수단이 서열 3의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 검정 키트.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 16(a)(iii)에서 ZNRF3 단백질을 검출하기 위한 수단이 서열 4의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 검정 키트.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 검출하기 위한 수단이 검출가능한 표지를 포함하는 것인 검정 키트.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 검출하기 위한 수단이 기질 상에 고정화된 것인 검정 키트.
  26. 제1항에 정의된 바와 같은 환자의 바이오마커의 수준이 바이오마커의 대조 수준과 통계적으로 유사하거나 또는 그보다 낮고, 대조 바이오마커 수준이 Wnt 억제제에 대한 감수성과 상관관계가 있는 것인, 환자에서 암의 치료에 사용하기 위한 Wnt 억제제를 포함하는 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 대조 수준이, 건강한 세포 또는 조직 샘플에서의 바이오마커의 수준 또는 Wnt 억제제에 대한 저항성과 상관관계가 있는 바이오마커의 대조 수준인 바이오마커의 정상 또는 기준선 수준인, Wnt 억제제를 포함하는 제약 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 암이 췌장암인, Wnt 억제제를 포함하는 제약 조성물.
  29. Wnt 억제제가 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 생리학상 허용되는 염인, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법, 또는 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항의 검정, 또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 제약 조성물.
    <화학식 1>
    Figure pct00013

    상기 식에서,
    X1, X2, X3 및 X4는 N 및 CR7로부터 선택되고;
    X5, X6, X7 및 X8 중 하나는 N이고, 다른 것들은 CH이고;
    X9는 N 및 CH로부터 선택되고;
    Z는 페닐, 피라지닐, 피리디닐, 피리다지닐 및 피페라지닐로부터 선택되고; 여기서 Z의 각각의 페닐, 피라지닐, 피리디닐, 피리다지닐 또는 피페라지닐은 R6 기로 임의로 치환되고;
    R1, R2 및 R3은 수소이고;
    m은 1이고;
    R4는 수소, 할로, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸 및 메틸로부터 선택되고;
    R6은 수소, 할로 및 -C(O)R10으로부터 선택되고; 여기서 R10은 메틸이고;
    R7은 수소, 할로, 시아노, 메틸 및 트리플루오로메틸로부터 선택된다.
  30. Wnt 억제제가
    N-[5-(3-플루오로페닐)피리딘-2-일]-2-[5-메틸-6-(피리다진-4-일)피리딘-3-일]아세트아미드;
    2-[5-메틸-6-(2-메틸피리딘-4-일)피리딘-3-일]-N-[5-(피라진-2-일)피리딘-2-일]아세트아미드;
    N-(2,3'-비피리딘-6'-일)-2-(2',3-디메틸-2,4'-비피리딘-5-일)아세트아미드;
    N-(5-(4-아세틸피페라진-1-일)피리딘-2-일)-2-(2'-메틸-3-(트리플루오로메틸)-2,4'-비피리딘-5-일)아세트아미드;
    N-(5-(4-아세틸피페라진-1-일)피리딘-2-일)-2-(2'-플루오로-3-메틸-2,4'-비피리딘-5-일)아세트아미드; 및
    2-(2'-플루오로-3-메틸-2,4'-비피리딘-5-일)-N-(5-(피라진-2-일)피리딘-2-일)아세트아미드
    로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법, 또는 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항의 검정, 또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 제약 조성물.
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