MX2014010265A - Seleccion de pacientes con cancer para administracion de inhibidores de señalizacion de wnt utilizando estado de mutacion de rnf43. - Google Patents

Abstract

Se dan a conocer biomarcadores, métodos y ensayos para la identificación de pacientes con cáncer que se predice se beneficiarán de la administración terapéutica de un antagonista de Wnt. Los biomarcadores incluyen la detección de supresión de los genes RNF43 y ZNRF3, la expresión reducida del ARNm de RNF43 y ZNRF3, y la expresión reducida de proteínas de RNF43 y ZNRF3, la mutación de inactivación de RNF43 y ZNRF3, LRP6 fosforilada, Dishevelleds fosforilados, y la expresión de Frizzled. Estos biomarcadores se pueden asociar con el mejor resultado para los pacientes con cáncer tratados con inhibidores de la senda de Wnt.

Description

SELECCIÓN DE PACIENTES CON CÁNCER PARA ADMINISTRACIÓN DE INHIBIDORES DE SEÑALIZACIÓN DE WNT UTILIZANDO ESTADO DE MUTACIÓN DE RNF43 REIVINDICACIÓN DE PRIORIDAD Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional de patente estadounidense No. 61 /604,290 presentada el 28 de febrero de 2012.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere en general a medir o probar procesos y composiciones o tiras de prueba que contienen un antígeno unido a la membrana celular o un receptor unido a la membrana celular para la detección de una celula tumoral o célula cancerígena y, específicamente, a la identificación de pacientes con cáncer que se pronostica se beneficiarán de la terapia inhibitoria de Wnt. La invención también se refiere a un inhibidor de Wnt o una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de Wnt para su uso en un paciente seleccionado de manera específica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En biología y medicina, la senda canónica de Wnt / b-catenina es una serie de eventos de señalización intracelular que implican ligandos Wnt secretados, receptores de superficie celular y la transcripción del co-activador de b-catenina, así como muchos otros efectores y reguladores de estos componentes de proteína de núcleo. En ausencia de ligandos Wnt, la b-catenina está constantemente fosforilada por U P Complejo multi'PfOtOÍna C¡ue desencadena su poli-ubíquitinación y degradación proteasomal. Tras la unión de la proteína Wnt a sus receptores, la b-catenina citosólica se estabiliza a través de la inhibición del complejo de destrucción y se transloca al núcleo para activar la transcripción de los genes diana de Wnt.

Los receptores principales para Wnts son la familia de proteínas Frizzled (FZD), con LRP5 o LRP6 (proteínas relacionadas con el receptor de LDL 5 y 6) como co-receptores como esenciales para la señalización de Wnt / b-catenina. Nusse R (2005), Cell Research 15(1 ):28-32. Los receptores Frizzled son moléculas transmembranales de siete dominios de extensión con un dominio rico en císteína. Los co-receptores LRP5/6 son proteínas transmembranales de paso simple. Huang H-C y Klein PS (2004) Genome Biol. 5(7):234. LRP6 es dominante en comparación con LRP5, que sólo se requiere para la homeostasis ósea de los adultos. McDonald BT et al. (2009) Developmental Cell 17(1 ) :9-26.

La señalización Wnt no canónica es b-catenina independiente. Los receptores Frizzled participan en la señalización Wnt no canónica, pero el co-receptor LRP6 no es esencial para la actividad de la senda no canónica. Existen al menos dos sendas de la señalización no canónica de Wnt, la senda de la polaridad celular plana (PCP) y la senda de liberación de calcio de Wnt.

La señalización de Wnt / -catenina es importante para la regulación del crecimiento y la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario. En los adultos, la señalización de Wnt promueve la homeostasis tisular y su desregulación ha sido implicada en una variedad de enfermedades humanas, especialmente el cáncer. Nusse R (2005) Cell Research 15(1 ):28-32.

La sobre-activación aberrante de la senda de Wnt es a menudo importante para la tumorigenesis de los carcinomas colorrectales. También se ha mostrado que otros tipos de cáncer están asociados con la señalización anormal de Wnt. Estos otros tipos de cáncer incluyen el cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de mama y cáncer de piel. Una actividad elevada en la senda no canónica de Wnt / PCP también se ha implicado en la tumorigénesis.

Se han desarrollado antagonistas de la señalización de Wnt para el tratamiento de tumores dependientes de Wnt. Muchos inhibidores de Wnt, como los inhibidores tipo puercoespín, inhibidores de tanquirasa, anticuerpos de Frizzled y anticuerpos LRP6, se están desarrollando para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la mayoría de estos inhibidores de Wnt apuntan a componentes proteicos aguas arriba de la senda de señalización de Wnt. Estos inhibidores de Wnt no inhiben la señalización de Wnt en los tumores con mutaciones en los genes que están aguas abajo en la senda de Wnt y por lo tanto a menudo no son eficaces contra tumores con mutaciones oncogénlcas en los genes de la senda de Wnt aguas abajo tales como APC (poliposis adenomatosa coli), AXIN1 / 2 , y b-catenina.

Esta falta de tumores identificados por tener mutaciones en los genes que están aguas arriba en la senda de Wnt ha obstaculizado el desarrollo clínico de los inhibidores de Wnt. Por lo tanto, hay una necesidad en la téenica de un método para identificar una mutación de la senda de Wnt asociada al cáncer en un producto génico o gen que es un componente de aguas arriba de la senda de Wnt.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un uso diagnóstico para dos ligasas homólogas transmembranales de ubiquitina E3 ubiquitina (RNF43 yZNRF3), dos de las cuales disminuyen los niveles del complejo receptor de Wnt receptor Frizzled/LRP6 a través de la ubiquitinación de Frizzled. En un aspecto, la invención proporciona el uso de mutaciones inactivantes en el gen RNF43 o el gen ZNRF3 como biomarcadores para la selección de células tumorales que son susceptibles de retrasar su crecimiento por inhibidores de la senda de Wnt. En otro aspecto, la invención proporciona la selección de pacientes con cáncer para el tratamiento con inhibidores de Wnt, donde la selección es por el uso de mutaciones ¡nactivadoras en el gen RNF43 o ZNRF3 como biomarcadores para la susceptibilidad del tumor al tratamiento con inhibidor de Wnt. En un aspecto particular, la invención prevé que las mutaciones inactivantes de RNF43, tales como mutaciones de cambio de sentido o de cambio del marco están presentes en tumores primarios y líneas celulares de adenocarcinomas ductales pancreáticos (PDAC). Puesto que el RNF43 endógeno tipo silvestre regula la señalización de Wnt en células PDAC y la inhibición de RNF43 endógeno en PDAC aumenta el nivel Frizzled y señalización de Wnt, la invención proporciona la identificación de un componente de la senda de Wnt aguas arriba (RNF43) como mutado en cáncer.

La invención tambien muestra que las células cancerosas con mutaciones del gen RNF43 son más sensibles a la inhibición de la senda Wnt. La inhibición de RNF43 en células cancerosas conduce a niveles aumentados de proteínas Frizzled en la superficie celular. En consecuencia, la señalización de Wnt aumentada y las células cancerosas con RNF43 mutante, particularmente las células cancerosas pancreáticas, son más sensibles a antagonistas de Wnt. Por lo tanto, la invención prevé que el estado de mutación de RNF43 se puede utilizar como una estrategia de selección de pacientes con cáncer para la administración terapéutica de los inhibidores de la señalización de Wnt.

Los inhibidores de Wnt son útiles en las composiciones farmacéuticas para uso humano o veterinario donde está indicada la inhibición de la senda Wnt, por ejemplo, en el tratamiento de tumores o el crecimiento celular anormal. La invención proporciona un método de tratamiento de un paciente con cáncer con un inhibidor de Wnt, que comprende la administración de un inhibidor de Wnt o una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de Wnt a un paciente que ha sido medido por tener un biomarcador que indica la sensibilidad al inhibidor de Wnt. Por ejemplo, una muestra de paciente se puede probar por los métodos de secuenciación de ADN para la presencia de una mutación de RNF43 o una mutación de ZN RF3 que indica sensibilidad a un inhibidor de Wnt. Alternativamente, una muestra de paciente se puede probar para un el nivel de la expresión del gen RNF43, expresión de la proteína RNF43, expresión del gen ZNRF3, expresión de la proteína ZN RF3 u otro biomarcador, en donde el nivel del biomarcador del paciente es estadísticamente similar o menor que el nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt, o si el nivel del biomarcador en células tumorales del paciente es estadísticamente similar al nivel del biomarcador que se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt. El nivel de control puede ser el nivel normal o de referencia del biomarcador, un nivel del biomarcador en la muestra de células o tejido sano o un nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt.

Un inhibidor de Wnt o una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de Wnt se pueden utilizar en el tratamiento de un paciente, en el que el nivel del biomarcador del paciente se correlacionó con la sensibilidad al inhibidor de Wnt. En una modalidad particular, el inhibidor de Wnt o la composición que comprende un inhibidor de Wnt pretenden ser utilizados cuando el paciente tiene un cáncer.

ZN RF3 y RN F43 son homólogos funcionales y ZNRF3 también está mutado en cierto tipo de tumores. El estado mutacional de ZNRF3 es, pues, también informativo para la selección de pacientes con cáncer para la administración terapéutica de los antagonistas de Wnt.

En una modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar un paciente con cáncer que se predijo se beneficiaría o no se beneficiaría de la administración terapéutica de un inhibidor de Wnt. El método incluye los pasos de: (a) detectar en una muestra de células tumorales de un paciente un nivel de un biomarcador, donde el biomarcador puede ser (i) número de copia de ADN detectado en la región cromosomal de ZNRF3 para determinar un pérdida de heterocigosidad, (ii) ADN genómico, ADNc, o ARN secuencial de los tejidos cancerosos para detectar una mutación inactivante en el gen RN F43 o el gen ZNRF3; (iii) resultado de un ensayo para medir expresión de ARNm de RN F43 o expresión de ARNm de ZNRF3; (iv) resultado de un ensayo para medir expresión de ARNm de RNF43 o expresión de ARNm de ZNRF3; (v) el efecto funcional de la pérdida del gen RNF43 o la pérdida del gen ZNRF3; o (vi) o mediante una combinación de biomarcadores (i) - (v): (b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra de células del tumor a un nivel de control del biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: (i) un nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt; y (ii) un nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt; y (c) seleccionar al paciente de acuerdo a la predicción para que se beneficie de la administración terapéutica del inhibidor de Wnt, si el tumor del paciente tiene una mutación de RNF43 o ZNRF3, o el tumor del paciente tiene una disminución de expresión de ARNm o proteína de RNF43 o una disminución de expresión de ARNm o proteína de ZNRF3 indica que el tumor de los pacientes es probable que sea sensible al inhibidor de Wnt.

El estado de la mutación del gen RN F43 o gen ZNRF3 en las células tumorales puede ensayarse por cualquiera de los métodos siguientes, o por una combinación de los métodos. (i) el análisis del número de copias de ADN de la región de RNF43 en el cromosoma 17 en el sitio genómico 17q22 para ver si se pierden una o ambas copias del gen RN F43. Alternativamente, el análisis del número de copias de ADN de la región de ZNRF3 en el cromosoma 22 en el locus genómico 22q12 para ver si se pierden una o ambas copias del gen ZNRF3. La pérdida de heterocigosidad de RNF43 o ZNRF3 es un biomarcador para los tumores que se han seleccionado para la reducción en su tasa de crecimiento por tratamiento con un inhibidor de Wnt. (ii) secuenciación de ADN, ADNc o ARN genómico a partir de tejidos de cáncer para detectar una mutación inactivante en el gen RNF43. Una mutación inactivante de RNF43 o ZNRF3 es un biomarcador para los tumores que se han seleccionado para la reducción en su tasa de crecimiento por tratamiento con un inhibidor de Wnt. Una mutación inactivante puede ser una mutación cambio de sentido, mutación de cambio del marco, una variante de empalme o una mutación de sentido erróneo que resulta en un cambio de aminoácidos en los residuos conservados. (iii) ensayo de expresión de ARNm de RNF43 o ensayo de expresión de ARNm de ZNRF3 utilizando Taqman u otras téenicas similares. Mutaciones cambio de sentido o de cambio del marco en los ARNm a menudo resultan en una decadencia de ARNm mediada cambio de sentido. Por lo tanto, la pérdida de expresión del ARNm de RNF43 en células cancerosas podría ser utilizado como un ensayo secundario o alternativo para mutaciones cambio de sentido o de cambio del marco de RNF43. La ausencia de ARNm de RN F43 también podría deberse al silenciamiento epigenético, en cuyo caso no hay ninguna mutación en el ADN genómico. (iv) ensayar el efecto funcional de la pérdida del gen RNF43 o la pérdida del gen ZNRF3, tales como mediante ensayo y detección de niveles aumentados de proteína Frizzled, niveles aumentados de proteína Frizzled, fosforilación LRP6 aumentada, y aumento descontrolado de la fosforilación en muestras tumorales en comparación con el control normal.

Una ventaja de usar la condición de mutación del gen RNF43 o el gen ZNRF3 es un biomarcador para los tumores que se han seleccionado para la reducción en su tasa de crecimiento por tratamiento con un inhibidor de Wnt, da mejor resultado durante el desarrollo de fármacos En una modalidad, la invención proporciona un ensayo o kit para probar el estado de mutación del gen RNF43 o el gen ZNRF3. El ensayo o kit puede ser un ensayo de diagnóstico de acompañamiento para su uso después de la aprobación farmacológica de un inhibidor de Wnt relacionado.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de Wnt para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente, en donde el nivel del biomarcador del paciente (tal como se define) es estadísticamente similar a o menor que un nivel de control del biomarcador y el nivel de biomarcador de control se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 es una fotografía que muestra los ensayos de formación de colonias con el tratamiento de LGK974. La FIG. 1 (a) muestra un ensayo de formación de colonias de células HPAFII en presencia de LGK974 a dos concentraciones (300 nM y 1 mM). 1300 células se sembraron en medios con el tratamiento indicado y los medios fueron reemplazados cada 5 días hasta la tinción con cristal violeta en el día 14. El LGK974 inhibe la formación de colonias de células HPAFII que llevan la mutación cambio de sentido en el gen RNF43. La FIG. 1 (b) muestra ensayos de formación de colonias de células PK1 (que tiene una proteína RNF43 funcional) y HPAFII (que tiene una proteína RNF43 no funcional) en presencia de 1 mM de LGK974 solo o junto con la adición diaria de 10% de medio acondicionado de Wnt3a (CM). Las células PK1 de tipo silvestre de RNF43 no mostraron sensibilidad al LGK974 durante el ensayo de 10 días. Las células HPAFII mutantes de RNF43 fueron inhibidas por el LGK974 y la inhibición fue parcialmente rescatada por la adición exógena de Wnt3a, por lo que la inhibición del crecimiento por el LGK974 fue dependiente de señalización de Wnt.

La FIG. 2 es un gráfico que muestra la alineación de la proteína RN F43 y la proteína ZNRF3 para mostrar residuos conservados. Esta información puede ser utilizada para predecir mutaciones de sentido erróneo que son mutaciones inactivantes. La secuencia de la proteína RNF43 humana tambien se proporciona en la SEQ ID NO: 3 y la secuencia de ZN RF3 humana también se proporciona en la SEQ ID NO: 4.

La FIG. 3 es un conjunto de gráficos de barras que muestran la regulación negativa de la señalización de Wnt por RN F43 en células de cáncer de páncreas YAPO, que expresan RNF43 de tipo silvestre. La FIG. 3(a) muestra que el agotamiento de RN F43 aumenta la actividad de Super TOPflash (STF) en la línea celular de cáncer pancreático YAPO. Las células YAPC-STF se transfectaron con ARNsi indicado en ausencia o presencia de medio acondicionado (CM) de Wnt3a, y la actividad de reportero de luciferasa STF se midió. El pGL2 ARNsi actúa como un control negativo. La FIG. 3(b) muestra que la activación inducida por ARNsi de RNF43 de la actividad de STF es dependiente de Wnt endógena. Las células YAPC-STF se transfectaron con el siARN indicado, y luego se trataron con inhibidor de DMSO o tipo puercoespín LGK974. A continuación, se midió la actividad del reportero de STF. La FIG. 3(c) muestra el agotamiento de RNF43 aumenta la expresión de AXIN2, un gen diana de b-catenina. Las células YAPC que expresan el vector vacío (EV) o RNF43 resistente a ARNsi se transfectaron con el ARNsi indicado, y los niveles de ARNm relativos de AXIN2 y RNF43 mediante RT-PCR cuantitativa.

La FIG. 4 es un conjunto de gráficos de barras que muestran alteraciones en el nivel de ARNm de varios genes relacionados con la señalización de Wnt / b-catenina. La FIG. 4(a) muestra que el agotamiento de b-catenina disminuye el nivel de ARNm de AXIN2 y RN F43. Las células se trataron con ARNsi, y los niveles relativos de ARNm de los genes indicados se analizaron por RT-PCR cuantitativa. La FIG. 4(b) muestra que los inhibidores tipo puercoespín disminuyeron la expresión de ARNm de RNF43 y ARNm de AXIN2. Las células YAPC se trataron con 3 mM de IWP2 o con 1 mM de LGK974, y se sometieron a análisis de expresión de genes mediante RT-PCR cuantitativa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Introducción Los inventores habían descubierto la función de dos reguladores negativos de la señalización de Wnt, dedo de cinc / RING de la proteína 3 (ZNRF3, Swiss-Prot Q9ULT6, SEQ ID NO: 4) y el dedo RING de la proteína 43 (RNF43, Swiss-Prot Q68DV7, SEQ ID NO:3). Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200. RNF43, cáncer asociado con el dedo RING de la proteína, es una ubiquitina ligasa que interactúa con una proteína nuclear, HAP95. Sugiura T et al. (2008) Exp. Cell Res. 314(7):1519-28. ZNRF3 y RNF43 son ambas ligasas homólogas transmembranales de la ubiquitlna E3 para el receptor Frizzled de Wnt. Ambas proteínas inhiben los niveles de superficie celular de complejo receptor de Wnt que se componen de proteínas Frizzled y LRP6.

Los inventores han demostrado también que el ZNRF3 es inducido transcripcionalmente por la activación de la senda de Wnt. La sobreexpresión del ZNRF3 disminuyó la señalización de Wnt, mientras que el ARNsi de ZNRF3 o ZNRF3 negativo dominante aumentó de forma potente la señalización de Wnt. La fosforilación de LRP6 se incrementó al inhibir el ZNRF3, mostrando que el ZNRF3 actúa en el sentido ascendente de la senda de Wnt. Por lo tanto, el ZN RF3 regula la capacidad de respuesta celular a la estimulación del ligando de Wnt. Los inventores confirmaron esta observación en los sistemas celulares mediante experimentos ¡n vivo utilizando tanto ratones tipo Knockout como Zebrafish. Los inventores han demostrado también que el RNF43 es un homólogo funcional de ZNRF3 y regula la señalización de Wnt.

RNF43 v Tumores Pancreáticos El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es la forma más común de cáncer de páncreas. El PDAC es extremadamente agresivo y se asocia con mal pronóstico. Matthaei H et al. (201 1 ) Ann. Surg. Oncol. 18(12):3493-9; Fearon et al. (2012) Pancreatology 12(1 ) : 16-22; Hezel AF (2006) Genes Dev. 20(10). La endoplasia intraepitelial pancreática (PanlN), la neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN) y la neoplasia quística mucinosa (MCN) son consideradas como precursores del PDAC. A pesar de sus características ductales, el PDAC no necesariamente surge del compartimiento ductal.

La senda de señalización de Wnt / b-catenina se reguló dinámicamente durante el desarrollo pancreático y es necesario para el desarrollo de páncreas exocrino. Wells JM (2007) BMC Dev. Biol. 7:4. La inhibición de la señalización de Wnt/B-catenina interrumpen la señalización de las celulas acinares pero no la formación de los islotes en el páncreas. Expresión inducible de b-catenina estabilizada en el páncreas de ratones adultos aumenta la proliferación de las células exocrinas maduras con efectos mínimos sobre las células de los islotes. Heiser PW (2006) Development 133(10):2023-32. Cada vez hay más pruebas de que la activación de la senda Wnt puede contribuir al mantenimiento y/o progresión del PDAC. Morris JP et al. (2010) Nat. Rev. Cáncer 10(10):683-95. La acumulación nuclear o citoplásmica de b-catenina se observó en un subconjunto de PDAC (Pasca di Magliano M, et. al. (2007) PLoS One 2 (1 1 ):. E 1 155), lo que indica que la senda se activa. El nivel de b-catenina citosólica y nuclear se correlaciona positivamente con el grado y el desarrollo del PDAC PanlN (Wang L et. al. (2009) Cáncer. Sci. 101 (3): 700-6), por lo que la señalización de b-catenina promueve la progresión del PDAC. El agotamiento de disminución de la proliferación de b-catenina de células del PDAC, mostrando la importancia de b-catenina en el mantenimiento del fenotipo de transformación.

El RNF43 se muta frecuentemente en IMPN Y MCN (Furukawa T et al. (201 1 ) Sci. Rep. 1 : 161 ; Wu J et al. (2011 ) Proc. Nati. Sci. Acad. EE. UU. 108(52):21 188-93). IPMN y MCN son precursores de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) invasivo.

La secuencia de RNF43 humana se conoce en la teenica. El ADNc de RNF43 humano de longitud completa (NM_017763.4) se puede comprar de fuentes comerciales (por ejemplo, Open Biosystems, Glastonbury, CT, EE.UU. 06033). Para mayor información sobre RNF43, véase Patente EE UU. No. 7,425,612. El polipéptido TAT179 es idéntico a la región extracelular del RNF43 después del péptido señal. Véase, solicitud de patente internacional W02003/024392, otorgado en Europa como EP1487877B1 .

Recientemente, el RNF43 se propuso ser un supresor tumoral en los tumores pancreáticos quísticos. Wu J et. al. (201 1 ) Proc. Nati. Acad. Sci. 108:2188. En un estudio de la secuenciación del exorna completo, se mostró que 6 de 8 neoplasias intraductales papilares mucinosas (IPMNs) y 3 de 8 neoplasias quísticas mucinosas (MCNS), albergaban mutaciones inactivantes de RNF43. La preponderancia de las mutaciones inactivantes en RNF43 y la pérdida de heterocigosidad (LOH) de su locus establece el RNF43 como un supresor tumoral en ambos IPMNs y MCNs. En su informe, Wu et al. no proporcionó un estudio funcional de RNF43.

Más recientemente, se muestra que la supresión intestinal específica de ambos Znrf3 y Rnf43 induce la proliferación excesiva de las criptas intestinales y la formación de adenoma intestinal en ratones. Koo BK et al. (2012) Nature 488(7413):665-9. Además, las mutaciones de RNF43 se han identificado en diferentes tumores, incluyendo tumores pancreáticos quísticos. Estos estudios muestran que el RNF43 actúa como un regulador negativo de señalización de Wnt /B-catenina como ZNRF3.

Sin embargo, un sistema celular en el que el RNF43 es importante no ha sido identificado, y un estudio de perdida de la función in vitro de RNF43 no ha sido posible. Por lo tanto, la relevancia fisiológica de la mutación de RNF43 en el cáncer ha sido previamente desconocida.

La senda de señalización de Wnt / /B-catenina evolutivamente conservada es importante para el desarrollo embrionario y la homeostasis de los tejidos adultos. Logan CY y Nusse R (2004) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20:781 -810; Clevers H (2006) Cell 127(3):469-80. La señalización de Wnt regula la rotación de la cofactor de transcripción b-catenina y controla los programas clave de la expresión génica en el desarrollo. MacDonald BT et al. (2009) Dev. Cell. 17(1 ):9-26. En la ausencia de activación de la senda de Wnt, la B-catenina citosólica se asocia con el complejo de destrucción de B-catenina, que contiene múltiples proteínas que incluyen la poliposis coli adenomatosa (APC), AXIN, y cinasa de sintasa de glucógeno 3a/B (GSK3a/B). En este complejo, B-catenina está constitutivamente fosforilada por GSK3, y B-catenina fosforilada es degradada por la senda de ubiquitina proteasoma. La señal de Wnt es recibida por sus dos receptores, proteínas Frizzled y LRP5 / 6, lo que conduce a la disociación del complejo de destrucción de b-catenina. La b-catenina estabilizada entra en el núcleo, se une a la familia TCF de factores de transcripción, y se convierte en la transcripción.

La activación aberrante de señalización de Wnt / b-catenina se ha implicado en la tumorigenesis, y muchos de los componentes corriente abajo de la senda de Wnt se mutan en los cánceres. Las mutaciones de truncamiento de APC se encuentran en el 80% de los cánceres colorrectales. Las mutaciones de estabilización de b-catenina y las mutaciones de pérdida de función de AXIN 1 /2 también se encuentran en varios tipos de cáncer. A pesar de una intensa investigación, dirigirse a la señalización de b-catenina en los cánceres que albergan mutaciones corriente abajo sigue siendo un reto debido a la falta de objetivos manejables. Por otro lado, hay varios objetivos manejables corriente arriba de la senda de señalización de Wnt. Diversos agentes dirigidos a la señalización de Wnt corriente arriba se están desarrollando, incluyendo anticuerpos LRP6 (Ettenberg S et al. (2010) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 107(35):15473-8), el anticuerpo Frizzled (Gurncy A et al. (2012) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 109(29): 1 1717-22) y el inhibidor tipo puercoespín (Chen B et al. (2009) Nat. Chem. Blol. 5(2): 100-7). Sin embargo, el desarrollo clínico de estos agentes ha sido previamente difícil, ya que estas moléculas no inhibirán la señalización de b-catenina en los tumores con mutación corriente abajo y que ha sido un reto para identificar tumores humanos adictos a la señalización de Wnt/S-catenina inducida por ligando.

Definiciones "Cáncer", tal como se describe en la patente de EE.UU.. No. 8,093,01 1 y en la Patente EE.UU. N 0 8.093.011 (ambas de las cuales se incorporan como referencia en su totalidad) es un nombre generico para una amplia gama de tumores celulares caracterizados por el crecimiento no regulado, falta de diferenciación, y la capacidad de invadir tejidos locales y metastatizar. Estas afecciones neoplásicas afectan, con diversos grados de prevalencia, cada tejido y órgano del cuerpo. Por lo tanto, el término "cáncer" como se usa en la presente, se refiere a la presencia de células que poseen características típicas de células que causan cáncer, tales como la proliferación no controlada, inmortalidad, potencial metastásico, rápido crecimiento y velocidad de proliferación, y determinadas características morfológicas particulares. A menudo, las células cancerígenas estarán en la forma de un tumor, pero tales células pueden existir solas o pueden circular en el torrente sanguíneo como células independientes, tales como las células leucémicas.

"El crecimiento anormal celular" se refiere al crecimiento celular que es independiente de los mecanismos reguladores normales (por ejemplo, pérdida de inhibición por contacto). Esto incluye el crecimiento anormal de: (1 ) células tumorales (tumores) que proliferan por la hiperactividad de una senda de Wnt en la célula; (2) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que la hiperactividad aberrante de una senda de Wnt se produce en la célula; (4) cualquiera de los tumores que proliferan por la hiperactivídad de una senda de Wnt en la célula; (5) cualquiera de los tumores que proliferan por la hiperactivídad de una senda de Wnt en la célula; y (6) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que ocurre la hiperactivídad aberrante de una senda de Wnt.

Un "biomarcador" es cualquier cosa que se puede utilizar como un indicador de un estado de enfermedad particular, o algún otro estado fisiológico de un organismo, tal como un humano. Un biomarcador puede ser la presencia de un gen, un alelo de un gen, una medida de expresión génica, una proteína, o efecto funcional de la actividad de la proteína que se puede medir y correlacionar con un estado fisiológico. Los biomarcadores se utilizan en la medicina como parámetros de laboratorio que un médico puede utilizar para ayudar a tomar decisiones al hacer un diagnóstico y seleccionar un curso de tratamiento.

Una "pérdida de heterocigosidad" (LOH) es una deleción de material genético (ADN) al que casi todas las variedades de cáncer se someten, en comparación con las células normales. Véase, Patente Estadounidense No. 7,718,364 (incorporada como referencia en su totalidad). La pérdida del material genético de las células cancerígenas puede resultar en la pérdida selectiva de uno de dos o más alelos de un gen en un sitio particular en el cromosoma, donde el gen puede afectar el crecimiento celular. Debido a la heterogeneidad genética o polimorfismo del ADN , muchos de los alelos pareados de genes difieren el uno del otro. Cuando los dos alelos son idénticos, el individuo se dice que es homocigótico para ese par de alelos en este locus en particular. Alternativamente, cuando los dos alelos son diferentes, el individuo es heterocigoto en ese sitio. Típicamente, ambos alelos se transcriben y traducen en última instancia, en ya sea proteínas idénticas en el caso de homocigotos o proteínas diferentes en el caso de heterocigotos. Si uno de un par de alelos heterocigotos se pierde debido a la eliminación del ADN de uno de los cromosomas emparejados, sólo el alelo restante se expresa y las células afectadas serán funcionalmente de homocigotos. Esta situación se denomina como "pérdida de heterocigosidad" (LOH) o reducción a la homocigosidad. Mediante el uso de sondas del ADN, el ADN de las células normales de un individuo se puede comparar con el ADN extraído de las células tumorales del mismo individuo y LOH se puede identificar utilizando téenicas experimentales bien conocidas en la técnica. Alternativamente, LOH se puede ensayar mediante la demostración de dos formas polimórficas de una proteína en las células normales heterocigotas, y sólo una de las formas en células cancerígenas donde ha ocurrido la eliminación de un alelo. Véase, por ejemplo, Lasko et al. (1991 ) Annu. Rev. Genet. 25:281 -314. LOH frecuente en regiones cromosómicas específicas ha sido reportado en muchos tipos de tumores malignos, lo que demuestra la existencia de genes supresores de tumores putativos o genes relacionados con el tumor en o cerca de estos sitios. Por lo tanto, el análisis de LOH es una poderosa herramienta para buscar un gen supresor tumoral mediante el estrechamiento y la identificación de la región donde existe un gen putativo. Véase, Vogelstein et al. (1988) New Engl. J. Med. 319(9): 525-532; Fearon et al. (1990) Cell 61 :759-767; y Friend et al., Nature 323:643-646 (1986). Los análisis han identificado muchos tipos de supresores tumorales candidato o genes relacionados con tumor. Véase, Cali et al. (1990) Cell 60:509-520; Kinzler et al. (1991 ) Science 253:661 -665; y Baker et al. (1989) Science 244:217-221.

Una mutación de "pérdida de función" (LOF) es una mutación o alelo de un gen, el resultado de la cual es que el producto génico (tal como la proteína codificada) tenga menos de lo normal o ninguna función en una célula u organismo (incluyendo un célula humana o ser humano). Cuando el alelo tiene una pérdida completa de la función (alelo nulo) a menudo se llama una mutación amorfa. Los fenotipos asociados con la pérdida de mutaciones funcionales son a menudo recesivos.

Una "sustitución" es una mutación que intercambia una base por otra (es decir, un cambio en una sola "letra química", tal como el cambio de una A a un G). Tal sustitución podría (1 ) cambiar un codón a uno que codifica un aminoácido diferente y provocar un cambio pequeño en la proteína producida (por ejemplo, la anemia de células falciformes es causada por una sustitución en el gen de beta-hemoglobina, que altera un aminoácido sencillo en la proteína producida; (2) cambiar un codón a uno que codifica el mismo aminoácido y no causa ningún cambio en la proteína producida ("mutaciones silenciosas"), o (3) cambiar un codón de amino-ácido que codifica un codón a un sola "parada" y causar una proteína incompleta (una proteína incompleta suele ser no funcional).

Un "inserción" es una mutación en que pares base extra se insertan en un lugar en el ADN.

Una "supresión" es una mutación en la que se pierde una sección del ADN, o se elimina.

Un "marco de lectura" es una mutación causada por inserciones o deleciones) de un número de nucleótidos que no es uniformemente divisible por tres a partir de una secuencia del ADN. Debido a la naturaleza del triplete de la expresión genica por codones, la inserción o deleción puede cambiar el marco de lectura (la agrupación de los codones), lo que resulta en una traducción completamente diferente de la original. Esto a menudo genera proteínas truncadas que resultan en la pérdida de la función.

La "Secuenciación Sanger" (nombrada en honor a su inventor Frederick Sanger) es el método de terminador de cadena de polinucleótidos de secuenciación. Una característica del método de secuenciación de Sanger es el uso de trifosfatos de didesoxinucleótidos (ddNTPs) como terminadores de cadena de ADN . El método de secuenciación de Sanger es a menudo un método automatizado.

Los métodos de "secuenciación de la próxima generación" son un grupo de métodos de secuenciación de alto rendimiento recientemente desarrollado que paralelizan el proceso de secuenciación, la producción de miles o millones de secuencias a la vez. La combinación del aumento de los datos generados, acoplada con costos reducidos necesarios para generar estos datos, ha hecho que esta teenología sea reconocida por los expertos en la técnica como una herramienta manejable de propósito general.

El término "tratar" como se usa en este documento, a menos que se indique lo contrario, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir, ya sea parcial o completamente, el crecimiento de tumores, metástasis tumoral, u otras células que causan cáncer o neoplásicas en un paciente El término "tratamiento" como se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, se refiere al acto de tratar.

La frase "un método de tratamiento" o su equivalente, cuando se aplica al tratamiento del cáncer, se refiere a un procedimiento o curso de acción que está diseñado para reducir o eliminar el número de células cancerígenas o para aliviar los síntomas de un cáncer. "Un método de tratamiento" de cáncer u otro trastorno proliferativo no necesariamente significa que las células cancerígenas u otras células desordenadas en realidad serán eliminadas, que el número de células o trastorno en realidad será reducido, o que los síntomas de un cáncer u otro trastorno en realidad será aliviado. A menudo, un método para tratar el cáncer se puede realizar incluso con una baja probabilidad de éxito, pero que, dado el historial médico y estimada la expectancia de supervivencia, sin embargo se considera un curso de acción benéfico global.

Un "agente terapeuticamente efectivo" es una composición que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que está siendo buscada por el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro clínico.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" es la cantidad del presente compuesto o una combinación que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que está siendo buscada por el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro clínico.

Un "inhibidor" es un compuesto que inhibe (por ejemplo, antagoniza, reduce, disminuye, bloquea, revierte, o altera) el efecto de un compuesto de origen natural o de referencia como se describe anteriormente. Tales inhibidores pueden incluir cualquier compuesto, proteína, péptido, o ácido nucleico (incluyendo ribozimas y antisentido) o producto de diseño del fármaco / compuesto / péptido o selección que proporciona el efecto antagonista.

Un polinucleótido "aislado", o una molécula de ácido nucleico aislada, es una molécula de ácido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que ha sido objeto de manipulación humana), su medio natural es el genoma o cromosoma en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Como tal, "aislado" no necesariamente refleja el grado en que la molécula de ácido nucleico se ha purificado, pero muestra que la molécula no incluye un genoma completo o un cromosoma completo en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Los polinucleótidos tales como los utilizados en un método de la invención para detectar genes (por ejemplo, por hibridación con un gen) son típicamente una parte del gen diana que es adecuado para su uso como una sonda de hibridación o cebador de PCR para la identificación de un gen de longitud completa (o parte del mismo) en una muestra dada (por ejemplo, una muestra de células). Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir un gen o una porción de un gen (por ejemplo, la región reguladora o promotor). Una molécula aislada de ácido nucleico que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluye tal gen, sino que más bien incluye la región codificante y regiones reguladoras asociadas con el gen, pero no hay genes adicionales encontrados de forma natural en el mismo cromosoma. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir una secuencia específica de ácido nucleico flanqueado por (es decir, en el extremo 5 ’o el extremo 3' de la secuencia, o ambos) ácidos nucleicos adicionales que normalmente no flanquean la secuencia de ácido nucleico especificada en la naturaleza (es decir, secuencias heterólogas). La molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN , ARN (por ejemplo, ARNm), o derivados de ya sea ADN o ARN (por ejemplo, ADNc). Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la frase "secuencia de ácido nucleico" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos frases se pueden utilizar de manera intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, siendo capaz de codificar una proteína. Una molécula de ácido nucleico aislada puede producirse utilizando teenología de ADN recombinante (por ejemplo, la amplificación de la reacción de cadena de la polimerasa (PCR), clonación), o síntesis química.

Una "sonda" (sonda de oligonucleótido) es una molécula de ácido nucleico que típicamente oscila en tamaño de 50 a 100 nucleótidos aproximadamente a varios cientos de nucleótidos a varios miles de nucleótidos de longitud. Por lo tanto, una sonda puede ser de cualquier longitud adecuada para su uso en un ensayo descrito en la presente, incluyendo cualquier longitud en el intervalo de 50 a varios miles de nucleótidos, en incrementos de números enteros. Tal molécula se utiliza normalmente para identificar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra por hibridación a dicha secuencia de ácido nucleico diana bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones de hibridación son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Labs Press.

Los "cebadores" son también secuencias de ácidos nucleicos. Los cebadores de PCR son típicamente oligonucleótidos de longitud bastante corta (por ejemplo, 8-30 nucleótidos) que se utilizan en reacciones en cadena de la polimerasa. Los cebadores de PCR y sondas de hibridación pueden desarrollarse y producirse fácilmente por los expertos en la técnica, utilizando la información de secuencia de la secuencia diana. Véase, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Labs Press.

Los terminos "muestra de ensayo" o "muestra de paciente" se pueden utilizar generalmente para referirse a una muestra de cualquier tipo que contiene células o productos que han sido secretados a partir de células para ser evaluados mediante el método de la invención, incluyendo pero no limitado a, una muestra de células aisladas, una muestra de tejido o una muestra de fluido corporal. Una muestra de células aisladas es una espécimen de células, típicamente en suspensión o separadas de tejido conectivo que puede haber conectado las células dentro de un tejido in vivo, que ha sido recogido de un órgano, tejido o líquido mediante cualquier método adecuado que da lugar a la colección de un número adecuado de células para la evaluación mediante el método de la invención. Las células en la muestra celular no son necesariamente del mismo tipo, aunque los métodos de purificación pueden utilizarse para enriquecer el tipo de células que preferiblemente se evalúan. Las células se pueden obtener, por ejemplo, mediante el raspado de un tejido, el procesamiento de una muestra de tejido para liberar las células individuales, o el aislamiento a partir de un fluido corporal.

Una "muestra de tejido", aunque similar a una muestra de células aisladas, se define en la presente como una sección de un órgano o tejido del cuerpo que típicamente incluye varios tipos de células, opcionalmente con estructuras citoesqueléticas que tienen las células juntas. El término "muestra de tejido" se puede utilizar, en algunos casos, de manera intercambiable con una "muestra celular", aunque el término "muestra de tejido" puede más a menudo ser utilizado para designar una estructura más compleja que una muestra celular. Una muestra de tejido se puede obtener mediante una biopsia, por ejemplo, que incluye por corte, escisión o perforación.

Una "muestra de fluido corporal", como la muestra de tejido, contiene las células a ser evaluados, y es un fluido obtenido mediante cualquier método adecuado para el fluido corporal particular a ser muestreado. Los fluidos corporales adecuados para el muestreo incluyen, pero no se limitan a, sangre, moco, fluido seminal, saliva, esputo, lavado bronquial, leche materna, bilis y orina.

Un "nivel de control" es un nivel de control de heterocigosidad, que puede incluir un nivel que está correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt o un nivel que está correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt. Por lo tanto, se puede determinar, en comparación con el control o nivel de línea de base de la pérdida de heterocigosidad, si una muestra del paciente es más probable que sea sensible o resistente a la terapia inhibidora de Wnt (por ejemplo, los pacientes que responden o no responden (quienes se beneficiará de la terapia), o pacientes que presentan una pobre respuesta o que no responden (quienes no se beneficiarán o tendrán pocos beneficios de la terapia) Más específicamente, un "nivel de control" puede denotar un nivel de control de heterocigosidad; un ADN, ADNc o secuencia de ARN que muestra un estado tipo silvestre, normal o de línea de base; un nivel de control de ARNm RN F43 o actividad; un nivel de control de ARNm ZNRF3 o actividad, el efecto funcional de la pérdida del gen RNF43 o la pérdida del gen ZNRF3, que puede incluir un nivel, secuencia o efecto que está correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt o un nivel que está correlacionado con resistencia al inhibidor de Wnt. Por lo tanto, se puede determinar, en comparación con el control de la heterocigosidad; una secuencia de ADN, ADNc o ARN que muestra un estado de tipo silvestre, normal o de línea de base; ARNm o actividad RN F43 normal o de la línea de base; ARNm o actividad ZNRF3 normal o de la línea de base; o el efecto funcional normal o de línea de base de genes RNF43 o ZN RF3 ya sea una muestra del paciente, una célula cancerígena o una célula es más probable que sea sensible o resistente al inhibidor de Wnt. El "nivel de control" se puede referir a la secuencia, parámetro o nivel medido para la comparación en una célula o tejido no canceroso sano de tipo silvestre, o en una modalidad particular, la célula tumoral tratada con placebo.

El término "individuos marcados" se refiere a un mareaje de los individuos de control con base en una o más características que son adecuadas para el tipo de crecimiento celular o tumoral a ser evaluado. Los individuos de control pueden ser marcados con el paciente a ser evaluado con base en el género, edad, raza, o cualquier factor biológico o sociológico relevante que pueda afectar la línea de base de los individuos de control y el paciente (por ejemplo, las condiciones preexistentes, el consumo de determinadas sustancias, los niveles de otros factores biológicos o fisiológicos).

Una "composición farmaceutica" es una combinación de agente activo y otro vehículo, por ejemplo, un compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente o etiqueta detectadle) o activo, tal como un adyuvante, diluyente, aglutinante, estabilizante, tampones, sales, disolventes lipófilos, conservantes, adyuvante o similares. Los vehículos también incluyen excipientes farmacéuticos y aditivos, por ejemplo; proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos, e hidratos de carbono (por ejemplo, azúcares, incluyendo monosacáridos y oligosacáridos; azúcares derivatizados tales como alditioles, ácidos aldónicos, azúcares esterificados y similares, y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes solos o en combinación, que comprende 1 -99,99% en peso o volumen solo o en combinación. Los excipientes de hidratos de carbono incluyen, por ejemplo; monosacáridos tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y similares; y alditioles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol) y miomositol. Puede ser sólidos o en forma líquida.

Métodos En una modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar un paciente de cáncer que se predijo se beneficiaría o no se beneficiaría de la administración terapéutica de un inhibidor de Wnt. El método incluye los pasos de: (a) detectar en una muestra de células tumorales de un paciente un nivel de un blomarcador, donde el biomarcador puede ser (i) número de copia del ADN detectado en la región cromosomal del ZNRF3 para determinar un pérdida de heterocigosidad, (ii) ADN , ADNc, o ARN genómico secuencial de los tejidos cancerosos para detectar una mutación ¡nactlvante en el gen RNF43 o el gen ZNRF3; (iii) resultado de un ensayo para medir expresión de ARNm de RNF43 o expresión de ARNm de ZNRF3; (iv) resultado de un ensayo para medir expresión de ARNm de RNF43 o expresión de ARNm de ZNRF3; (v) el efecto funcional de la pérdida del gen RNF43 o la pérdida del gen ZNRF3; o (vi) o mediante una combinación de biomarcadores (i) - (v): (b) comparar el nivel del blomarcador en la muestra de células del tumor a un nivel de control del biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: (i) un nivel de control del blomarcador que se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt; y (ii) un nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt; y (c) seleccionar al paciente de acuerdo a la predicción para que se beneficie de la administración terapéutica del inhibidor de Wnt, si el tumor del paciente tiene una mutación de RNF43 o ZN RF3, o el tumor del paciente tiene una disminución de expresión de ARNm o proteína de RNF43 o una disminución de expresión de ARNm o proteína de ZNRF3 indica que el tumor de los pacientes es probable que sea sensible al inhibidor de Wnt.

El estado de la mutación del gen RNF43 o gen ZNRF3 en las células tumorales puede ensayarse por cualquiera de los métodos siguientes, o por una combinación de los métodos. (i) el análisis del número de copias de ADN de la región de RN F43 en el cromosoma 17 en el locus genómico 17q22 para ver si se pierden una o ambas copias del gen RNF43. Alternativamente, el análisis del número de copias de ADN de la región de ZNRF3 en el cromosoma 22 en el locus genómico 22q12 para ver si se pierden una o ambas copias del gen ZNRF3. La pérdida de heterocigosidad de RNF43 o ZNRF3 es un biomarcador para los tumores que se han seleccionado para la reducción en su tasa de crecimiento por tratamiento con un inhibidor de Wnt. (ii) la secuenciación de ADN , ADNc o ARN genómico a partir de tejidos de cáncer para detectar una mutación inactívante en el gen RN F43. Una mutación inactivante de RN F43 o ZNRF3 es un biomarcador para los tumores que se han seleccionado para la reducción en su tasa de crecimiento por tratamiento con un inhibidor de Wnt. Una mutación inactivante puede ser una mutación cambio de sentido, mutación de cambio del marco, una variante de empalme o una mutación de sentido erróneo que resulta en un cambio de aminoácidos en los residuos conservados. (iii) el ensayo de expresión de ARNm de RNF43 o ensayo de expresión de ARNm de ZNRF3 utilizando Taqman u otras téenicas similares. Mutaciones cambio de sentido o de cam bio del marco en los ARNm a menudo resultan en una decadencia de ARNm mediada cambio de sentido. Por lo tanto, la pérdida de expresión del ARNm de RNF43 en células cancerosas podría ser utilizado como un ensayo secundario o alternativo para mutaciones cambio de sentido o de cambio del marco de RNF43. La ausencia de ARNm de RN F43 también podría deberse al silenciamiento epigenético, en cuyo caso no hay ninguna mutación en el ADN genómico. (iv) ensayar el efecto funcional de la pérdida del gen RNF43 o pérdida del gen ZNRF3, tal como mediante ensayar y detectar aumento de los niveles de proteína Frizzled, aumento de los niveles de proteína LRP6, aumento de fosforilación de LRP6, y aumento incontrolado de la fosforilación en muestras tumorales en comparación con el control normal (en la que el aumento de los niveles de proteína Frizzled, aumento de los niveles de proteína LRP6, aumento de la fosforilación de LRP6, y aumento incontrolado de la fosforilación en muestras de tumores es indicativo de un nivel más bajo que el nivel de control del biomarcador del gen RNF43 o el biomarcador del gen ZNRF3).

La etapa de detección puede ser mediante el uso de una sonda de nucleótidos que se híbrida con las secuencias proporcionadas en la SEQ ID NO: 1 (para RNF43) o SEQ ID NO: 2 (para ZNRF3).

Una mutación de inactivación puede ser una mutación cambio de sentido (ver Tabla 1 y Tabla 2), una mutación de cambio del marco (ver Tabla 1 y Tabla 2), una mutación de depleción en un sitio O una mutación cambio de sentido que resulta en un cambio de aminoácidos en los residuos conservados. FIG. 2 muestra una alineación de las proteínas RNF43 y ZNRF3 humanas, que proporciona una pauta para conservar los aminoácidos en las proteínas.

Una mutación de depleción en un sitio es una mutación genética que inserta o elimina un número de nucleótidos en el sitio específico en el que el empalme de un intrón tiene lugar durante el procesamiento del ARN mensajero precursor en el ARN mensajero maduro. La abolición del sitio de empalme resulta en uno o más intrones que permanecen en ARNm maduro y puede conducir a la producción de proteínas aberrantes.

Mutaciones cambio de sentido o de cambio del marco en los ARNm a menudo resultan en una mutación cambio de sentido mediada por la decadencia del ARNm . Por lo tanto, la pérdida de expresión del ARNm de RNF43 en células cancerosas podría ser utilizado como un ensayo secundario o alternativo para mutaciones cambio de sentido o de desplazamiento de marco de RNF43. La ausencia de ARNm de RNF43 también podría ser debido al silenciamiento epigenético, en cuyo caso no hay ninguna mutación en el ADN genómico.

La etapa de comparación puede realizarse comparando el nivel de biomarcador en las células tumorales a un nivel de control del biomarcador en una o más células de control que son resistentes al inhibidor de Wnt o en una o más células de control que son sensibles al inhibidor de Wnt, o ambos. En un aspecto, se ha predeterminado el nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la sensibilidad o resistencia al inhibidor de Wnt.

Para la etapa de selección del paciente de acuerdo a la predicción para que se beneficie o no de la de la terapia de inhibidor de Wnt, se contempla que para la mayoría de los pacientes ensayados, la mayoría de los pacientes tendrán tumores que son resistentes al tratamiento por inhibidores de Wnt. Se espera que la dependencia de los tumores en la señalización de Wnt no sea tan frecuente como la dependencia de los tumores en la señalización del factor de crecimiento. Por otra parte, si los tumores dependientes de Wnt tienen mutaciones genéticas corriente abajo de la senda de Wnt, entonces los tumores no responderían a la mayoría de los inhibidores de Wnt más actuales. Por lo tanto, hay una necesidad en la téenica para seleccionar para el tratamiento el conjunto de pacientes con cáncer que responderán bien al tratamiento con inhibidores de Wnt. La capacidad de predecir pacientes que respondan bien es la principal utilidad de la determinación del estado de la mutación de RNF43 o el estado de la mutación de ZNRF3 en los tumores de pacientes con cáncer.

Cualquiera de las modalidades del método de la invención descrito anteriormente se puede utilizar con un paciente que tiene cualquier tipo de cáncer. En una modalidad, el paciente tiene un carcinoma ductal, adenocarcinoma o melanoma (ver Tabla 1 ). En otra modalidad, el paciente tiene un cáncer de páncreas, un cáncer de colon, un cáncer del esófago o un cáncer de piel (ver Tabla 1 , Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5). En otro método de la invención, el paciente tiene un tumor gástrico con una mutación de RNF43.

En cualquiera de las modalidades de la invención descrita anteriormente, se puede evaluar la capacidad de respuesta a cualquier inhibidor de Wnt. La capacidad de respuesta in vitro de inhibidor de Wnt se puede determinar en ensayos de proliferación celular estándar, diferenciación, y apoptosis. El efecto del inhibidor de Wnt sobre el estado de la señalización de Wnt en las células tumorales se puede evaluar mediante la revisión del nivel de b-catenina, la expresión de ARNm del gen diana de b-catenina AXIN2, y la fosforilación de LRP6. En la clínica, la evaluación es la base de la mediación de la cantidad de la reducción del tumor por la obtención de imágenes si es un tumor sólido o un biomarcador para el estado del tumor, por un análisis de PET, por ejemplo.

Se conocen en la téenica métodos de mediciones para el volumen del tumor. Ver, Therasse P. et al. (2000) J. Nati. Cáncer Inst. 92(3): 205-216. El mismo método de evaluación y la misma técnica se deben utilizar para caracterizar cada lesión identificada y reportada al inicio y durante el seguimiento. La evaluación basada en imágenes se prefiere a la evaluación por examen clínico cuando ambos métodos se han utilizado para evaluar el efecto antitumoral de un tratamiento.

Examinación Clínica. Las lesiones clínicamente detectadas sólo se considerarán medióles cuando son superficiales (por ejemplo, nodulos en la piel y ganglios linfáticos palpables). Para el caso de las lesiones de la piel, se recomienda la documentación mediante fotografía a color, incluyendo una regla para estimar el tamaño de la lesión.

Radiografía del tórax. Las lesiones en la radiografía del tórax son aceptables como lesiones medióles cuando están claramente definidas y rodeadas por pulmón ventilado. Sin embargo, se prefiere CT. Más detalles sobre el uso de este método de evaluación para la evaluación objetiva de respuesta tumoral son proporcionados por Therasse P. et al. (2000) J. Nati. Cáncer Inst. 92 (3): 205-216.

CT y MRI. Tomografía computarizada de rayos X (CT) y registro de resonancia magnética (RMI) son los mejores métodos disponibles en la actualidad y más reproducibles para medir las lesiones diana seleccionadas para la evaluación de la respuesta. CT convencional y MRI deben realizarse con cortes contiguos de 10 mm o menos de grosor de corte. La CT helicoidal se debe realizar mediante el uso de un algoritmo de reconstrucción contigua de 5-mm; esta especificación se aplica a los tumores del tórax, el abdomen y la pelvis, mientras que los tumores de cabeza y cuello y los de las extremidades por lo general requieren protocolos específicos. Ver, Therasse P. et al. (2000) J. Nati. Cáncer Inst. 92 (3): 205-216.

Ultrasonido. Cuando el punto final primario del estudio es la evaluación de respuesta objetiva, el ultrasonido no se debe utilizar para medir lesiones tumorales que clínicamente no son fácilmente accesibles. Puede ser utilizado como una posible alternativa a las mediciones clínicas para los ganglios linfáticos palpables superficiales, lesiones subcutáneas y nodulos tiroideos. El ultrasonido también puede ser útil para confirmar la desaparición completa de las lesiones superficiales generalmente evaluadas por el examen clínico. Las justificaciones para no utilizar el ultrasonido para medir las lesiones tumorales de evaluación de respuesta objetiva se proporcionan en el Apéndice I.

Endoscopia y Laparoscopia. La utilización de estas téenicas para la evaluación objetiva del tumor aún no ha sido completamente o ampliamente validada. Sus usos en este contexto específico requieren equipos sofisticados y un alto nivel de conocimientos técnicos que pueden estar disponibles sólo en algunos centros. Por lo tanto, la utilización de tales técnicas para la respuesta tumoral objetivo debe limitarse a fines de validación en centros especializados. Sin embargo, tales técnicas pueden ser útiles para confirmar la respuesta histopatológica completa cuando se obtienen muestras de biopsia.

Marcadores tumorales. Los marcadores tumorales que se utilizan para correlacionar con las mediciones de volumen del tumor (es decir, no los marcadores de la invención) por sí solos no se pueden usar para evaluar la respuesta. Sin embargo, si los marcadores están inicialmente por encima del límite superior normal, tienen que volver a niveles normales para que un paciente se considere en respuesta clínica completa cuando todas las lesiones tumorales han desaparecido. Los criterios adicionales específicos para el uso estandarizado de 125 respuesta a un antígeno prostático específico y AC (antígeno de cáncer) en respaldo a los ensayos clínicos están siendo validados.

Citología e histología. Teenicas citológicas e histológicas se pueden utilizar para diferenciar entre respuesta parcial y respuesta completa en casos raros (por ejemplo, después del tratamiento para diferenciar entre lesiones benignas residuales y lesiones malignas residuales en tipos tumorales tales como tumores de células germinales). Se requiere confirmación citológica de la naturaleza neoplásica de cualquier efusión que aparece o empeora durante el tratamiento cuando el tumor medióle ha reunido criterios para la respuesta o enfermedad estable. Bajo tales circunstancias, el examen citológico del fluido recogido permitirá la diferenciación entre respuesta o enfermedad estable (una efusión puede ser un efecto secundario del tratamiento) y enfermedad progresiva (si se confirma el origen neoplásico del fluido). Nuevas técnicas para establecer mejor una respuesta tumoral objetiva se integrarán en estos criterios cuando estén completamente validadas para ser utilizadas en el contexto de la evaluación de la respuesta tumoral. Pérdida de heterociaosidad En una modalidad de la invención, los tumores que tienen una pérdida de heterocigosidad del gen RNF43 o gen ZNRF3 son más propensos a responder a (es decir, a retrasar su crecimiento por un inhibidor de Wnt). Por lo tanto, los pacientes de cáncer con tumores que tienen una pérdida de heterocigosidad del gen RNF43 o gen ZN RF3 son más propensos a tener una mayor tasa de respuesta a la terapia de inhibidores de Wnt, una menor tasa de progresión de la enfermedad, un tiempo mayor hasta la progresión, y una mayor tasa de sobrevivientes a largo plazo. En una modalidad, un paciente que tiene una muestra tumoral con una copia del gen RNF43 o gen ZNRF3 se prevé que sea una buena respuesta al tratamiento con el inhibidor de Wnt.

El método para establecer un nivel de control de la pérdida de heterocigosidad se selecciona basándose en el tipo de muestra, el tejido u órgano del que se obtiene la muestra, y el estado del paciente a ser evaluado. El método puede ser el mismo método que se utilizará para evaluar la muestra en el paciente. En una modalidad, el nivel de control se establece utilizando el mismo tipo de célula como la célula para ser evaluada. En otra modalidad, el nivel de control se estableció a partir de muestras de control que son de pacientes o líneas celulares conocidas por ser resistentes o sensibles a los inhibidores de Wnt. En un aspecto, las muestras de control se obtuvieron de una población de individuos marcados.

Para establecer un nivel de control, se obtienen muestras de un número de individuos marcados y se evaluaron de la misma manera que para las muestras de ensayo. El número de individuos marcados de los cuales deben obtenerse muestras de control para establecer un nivel de control adecuado (por ejemplo, una población) se puede determinar por los expertos en la téenica, pero debe ser estadísticamente apropiado para establecer una línea de base adecuada para la comparación con el paciente a ser evaluado (es decir, el paciente de ensayo). Los valores obtenidos a partir de las muestras de control se procesan estadísticamente usando cualquier método adecuado de análisis estadístico para establecer un nivel de base adecuado utilizando métodos estándar en la técnica para establecer estos valores.

El número de copias del gen RNF43 o gen ZNRF3 por célula tumoral puede ser detectado por hibridación fluorescente in situ (FISH). La FISH es una técnica basada en el ADN y se puede realizar con éxito en muestras frescas o conservadas de tumor embebidas en parafina. La tecnología está bien establecida y las sondas fácilmente se pueden construir con un breve cambio en la citogenética clínica y laboratorios de patología molecular. Una sonda de FISH para el RNF43 de ratón está disponible comercialmente, por lo que un experto en la técnica sería fácilmente capaz de construir una sonda de FISH correspondiente para el RNF43 humano. Ver, Rogan P, (2001 ) Genome Res. 1 1 (6): 1086-1094. Como alternativa, el servicio de diseño a medida de una sonda de FISH para un gen humano, tal como el RNF43 humano o el ZNRF3 humano, está disponible comercialmente, por ejemplo, por las sondas de FISH de Empire Genomics, Buffalo, Nueva York, EE.UU. Hibridización La detección de un gen se puede realizar usando ensayos de hibridación. La hibridación de ácidos nucleicos simplemente implica poner en contacto una sonda (por ejemplo, un oligonucleótido o polinucleótido más grande) y el ácido nucleico diana en condiciones en que la sonda y su diana complementaria puedan formar híbridos estables dúplex mediante el apareamiento complementario de bases. Como se usa en la presente, las condiciones de hibridación se refieren a las condiciones de hibridación estándar en las que se utilizan moléculas de ácido nucleico para identificar las moléculas de ácido nucleico similares. Tales condiciones estándar se divulgan, por ejemplo en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Labs Press (incorporado por referencia en su totalidad, ver específicamente, páginas 9.31 -9.62). Además, las fórmulas para calcular la hibridación apropiada y las condiciones de lavado para conseguir la hibridación que permite diferentes grados de disparidad de los nucleótidos se describen, por ejemplo, en Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284 (incorporado por referencia en su totalidad). Los ácidos nucleicos que no forman híbridos dúplex son lavados para separarse de los ácidos nucleicos hibridizados y los ácidos nucleicos hibridizados a continuación, se pueden detectar, típicamente a través de la detección de un marcador detectable unido. Los ácidos nucleicos se desnaturalizan aumentando la temperatura o reduciendo la concentración de sal del búfer que contiene los ácidos nucleicos. En condiciones de baja rigurosidad (por ejemplo, baja temperatura o alta concentración de sal o ambos) se forman híbridos dúplex (por ejemplo, ADN: ADN, ARN: ARN , o ARN: ADN) incluso cuando las secuencias recocidas no son perfectamente complementarias. Por lo tanto la especificidad de la hibridación se reduce a una menor tensión. Por el contrario, una hibridación exitosa de mayor rigurosidad (por ejemplo, temperatura más alta o concentración de sal más baja) requiere un menor número de desajustes.

Las condiciones de hibridación y lavado de alta rigurosidad, como se refieren en la presente, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moleculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se usó para sondear en la reacción de hibridación (es decir, las condiciones que permiten aproximadamente el 10% o menos de falta de comcidencia de nucleótidos). Alguien con experiencia en la téenica puede usar las fórmulas en Meinkoth et al. (1984) Anal. Biochem. 138, 267-284 para calcular la hibridación apropiada y las condiciones de lavado para lograr estos niveles particulares de falta de coincidencia de nucleótidos. Tales condiciones variarán, dependiendo de si los híbridos de ADN: ARN o ADN: ADN se están formando.

Alternativamente, el Tm puede calcularse empíricamente como se expone en Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Labs Press., paginas 9.31 a 9.62.

Los ácidos nucleicos hibridizados se detectan mediante la detección de una o más etiquetas unidas a los ácidos nucleicos de la muestra. Los marcadores se pueden incorporar mediante cualquiera de un número de medios bien conocidos por los expertos en la téenica. Los marcadores detectables adecuados para su uso en la invención incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, medios eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la invención incluyen tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo Texas, rodamina, compuestos fluorescentes Alexa, colorantes Spectrum, y similares), puntos cuánticos, radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125l, 35S, 14C, o 32P), y marcadores colorimétricos. Los medios para detectar tales etiquetas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Así, por ejemplo, los marcadores radiactivos se pueden detectar usando una película fotográfica o un contador de centelleo, marcadores fluorescentes se pueden detectar usando un fotodetector para detectar la luz emitida y microscopios de fluorescencia. Los marcadores colorimétricos se detectan simplemente visualizando el marcador coloreado. Preferiblemente, los ácidos nucleicos de hibridación se detectan por marcadores fluorescentes y más preferiblemente, en el contexto de un ensayo de hibridación in situ fluorescente (FISH). Los ensayos de FISH son bien conocidos en la técnica.

En un método de la invención, el nivel de pérdida de heterocigosidad de genes RNF43 o de genes ZNRF3 en la muestra de células tumorales se compara con un nivel de control pérdida de heterocigosidad de genes RNF43 o genes ZNRF3 seleccionado a partir de: (i) un nivel de control que se ha correlacionado con la sensibilidad a un inhibidor de Wnt; y (ii) un nivel de control que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt. Un paciente se selecciona de acuerdo a la predicción para que se beneficie de la administración terapéutica de un inhibidor de Wnt, un agonista del mismo, o un fármaco que tiene actividad biológica sustancialmente similar como el inhibidor de Wnt, si el nivel de pérdida de heterocigosidad de genes RNF43 o de genes ZNRF3 en las células tumorales del paciente es estadísticamente similar o mayor que el nivel de control de pérdida de heterocigosidad de genes RNF43 o genes ZNRF3 que ha sido correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt, o si el nivel de pérdida de heterocigosidad de genes RN F43 o genes ZNRF3 en las células tumorales del paciente es estadísticamente mayor que el nivel de pérdida de heterocigosidad de genes RNF43 o de genes ZNRF3 que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt. Un paciente se selecciona de acuerdo a la predicción para que no se beneficie de la administración terapéutica de un inhibidor de Wnt, un agonista del mismo, o un fármaco que tiene actividad biológica sustancialmente similar como el inhibidor de Wnt, si el nivel de pérdida de heterocigosidad de genes RNF43 o de genes ZNRF3 en las células tumorales del paciente es estadísticamente menor que el nivel de control de pérdida de heterocigosidad de genes RN F43 o genes ZNRF3 que ha sido correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt, o si el nivel de pérdida de heterocigosidad de genes RN F43 o genes ZN RF3 en las células tumorales del paciente es estadísticamente similar o menor al nivel de pérdida de heterocigosidad de genes RNF43 o de genes ZNRF3 que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt.

Mutación Inactivante En una modalidad de la invención, los tumores que tienen una mutación inactivante en el gen RNF43 o gen ZNRF3 son más propensos a responder a (es decir, a tener su crecimiento se desaceleró por) un inhibidor de Wnt. La detección de una o más mutaciones en el gen RNF43 o gen ZNRF3 es predictiva de que el paciente se beneficiará del tratamiento con el inhibidor de Wnt. Las directrices para este detección de una o más mutaciones en el gen RNF43 se proporciona en los EJEMPLOS.

La detección de una o más mutaciones en el gen RNF43 o el gen ZNRF3 es predictiva de que es más probable que un paciente responda o se beneficie de la terapia con inhibidor de Wnt. La detección de ninguna mutación es predictiva de que es menos probable que un paciente responda o se beneficie de la terapia con inhibidor de Wnt. Los métodos para la selección de mutaciones de genes son bien conocidos en la téenica, se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Press laboratorios, e incluyen la hibridación, reacción en cadena de la polimerasa, análisis en gel de poliacrilamida, cromatografía o espectroscopia. Con los recientes avances que se realizan en "la secuenciación de próxima generación", se contempla que la secuenciación directa de los polinucleótidos se está convirtiendo en el método fiable menos caro para el ensayo del estado de mutación del gen RNF43 o estado de mutación del gen ZNRF3.

Los métodos para la detección de mutaciones genéticas puede incluir además la detección de un producto de proteína alterado codificado por el gen (por ejemplo, a través de inmunoanálisis (por ejemplo, Western blot), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radiommunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y microscopía de inmunofluorescencia).

Para la pérdida de ARNm de RNF43 o para la pérdida de ARNm de ZN RF3, se puede considerar que una caída de por lo menos 50% en el ARNm indica una pérdida de función, ya que las muestras tumorales no se componen homogéneamente de células tumorales. Muestra del paciente Los métodos adecuados de obtención de una muestra del paciente son conocidos por una persona experta en la téenica. Una muestra del paciente puede incluir cualquier fluido corporal o tejido de un paciente, que puede contener células tumorales o proteínas de células tumorales.

En general, se selecciona el tipo de muestra (es decir, célula, tejido o fluido corporal) en base a la accesibilidad y la estructura del órgano o tejido que se ha evaluado para el crecimiento de células tumorales o de qué tipo de cáncer se va a evaluar. La invención es particularmente útil para la evaluación de un tumor, tal como un carcinoma ductal, adenocarcinoma o melanoma (ver Tabla 1 ) o tumores de pacientes con cáncer de páncreas, un cáncer de colon, un cáncer de esófago o cáncer de la piel (ver Tabla 1 , Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5). En estos casos, una muestra típica es una sección de una muestra de tumor o es de una muestra de tejido pancreático del paciente, respectivamente.

Una vez que se obtiene una muestra del paciente, la muestra se evalúa para la detección de uno o más de cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente. En algunas modalidades de la invención, un tejido, una celula o una porción del mismo (por ejemplo, una sección de tejido, un componente de una célula tal como ácidos nucleicos, etc.) se pone en contacto con uno o más ácidos nucleicos. Tales protocolos se utilizan para detectar la expresión génica o la pérdida de heterocigosidad, por ejemplo. Tales métodos pueden incluir ensayos basados en células o ensayos no basado en células. El tejido o célula que expresa un gen diana se pone en contacto típicamente con un agente de detección (por ejemplo, una sonda, cebador, u otro marcador detectable), por cualquier método adecuado, tal como mediante mezcla, hibridación, o combinación de una manera que permite la detección del gen diana mediante una téenica adecuada.

La muestra del paciente se prepara mediante cualquier método adecuado para la técnica de detección utilizada. En una modalidad, la muestra del paciente se puede utilizar fresca, congelada, fija o conservada de otro modo. Por ejemplo, las celulas tumorales del paciente se pueden preparar mediante la inmovilización de tejido del paciente en parafina. El tejido inmovilizado puede seccionarse y luego ponerse en contacto con una sonda para la detección de hibridación de la sonda a un gen diana (por ejemplo, gen RNF43 o el gen ZNRF3).

Controles Un nivel de control no necesita ser establecido para cada ensayo en la medida en que se realiza el ensayo. Más bien, una línea de referencia o control se puede establecer haciendo referencia a una forma de información almacenada con respecto a un nivel de control determinado previamente para pacientes sensibles y resistentes (pacientes que responden y pacientes que no responden). Un nivel de control se puede establecer para cualquiera de los métodos de detección descritos anteriormente, para su uso cuando se utiliza un método de detección correspondiente. Tal forma de información almacenada puede incluir una tabla de referencia, la lista o archivo electrónico de la población o datos individuales con respecto a tumores / pacientes sensibles y resistentes, o cualquier otra fuente de datos con respecto a la pérdida de heterocigosidad de genes del nivel de control que es útil para el paciente a evaluarse.

Un nivel de control para la comparación puede ser cualquier tipo de control, incluyendo un control pre-establecido que se proporciona como una forma de información. Otros sistemas de puntuación se pueden idear basado en comparaciones con los controles, y los pacientes que caen cerca del corte, se pueden evaluar mediante otros criterios, biomarcadores, o téenicas con el fin de confirmar un diagnóstico. Además, el corte se puede variar según se desee por el médico o el investigador de acuerdo a las poblaciones de pacientes.

Para un control que se ha correlacionado con la resistencia a los inhibidores de Wnt, cuando el biomarcador es una mutación inactivante en el gen RN F43 o el gen ZNRF3, el control puede ser la secuencia de tipo silvestre del gen RNF43 o el gen ZNRF3. Tales secuencias están disponibles públicamente y bien definidas. En una modalidad, la secuencia del gen RNF43 se proporciona por la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, la secuencia del gen ZNRF3 se proporciona por la SEQ ID NO: 2.

Para la pérdida de ARNm de RNF43, se ha de observar al menos un 50% de disminución de la expresión de ARNm en las muestras tumorales.

Otro control para la resistencia a los inhibidores de Wnt sería muestras no tumorales del mismo paciente. Si tales muestras no tumorales no están disponibles, entonces un promedio de los valores de otros pacientes o sujetos sanos se pueden comparar, porque la mayoría de los pacientes no responderá a los inhibidores de Wnt. Análisis estadístico Los pasos de la detección de los biomarcadores según la invención pueden combinarse en diferentes combinaciones como se describió anteriormente. Los pasos se pueden realizar en cualquier orden, o de forma sustancialmente simultánea. El análisis estadístico para determinar las diferencias entre los controles y muestras del paciente se puede realizar mediante cualquier metodo conocido en la téenica, incluyendo la prueba exacta de Fisher de la prueba de chi cuadrado de Pearson para variables cualitativas, y utilizando la prueba t de Student o análisis de la varianza para las variables continuas. Que sea estadísticamente significativo se define típicamente como p <0,05.

Inhibidores de Wnt El método de la invención es útil para determinar o predecir los pacientes que tienen más probabilidades de responder (por ejemplo, con un beneficio terapéutico) a la terapia con un inhibidor de Wnt o un fármaco que tiene actividad biológica sustancialmente similar como el inhibidor de Wnt, así como para determinar o predecir los pacientes que tienen más probabilidades de no responder a la terapia con el uso de un inhibidor de Wnt. La invención también proporciona que las células cancerosas con mutaciones del gen RNF43 son más sensibles a la inhibición de la senda Wnt. La inhibición de la RNF43 en células cancerosas conduce a niveles incrementados de proteínas Frizzled en la superficie celular. En consecuencia, la señalización Wnt y las células cancerosas mejoradas, particularmente las células cancerosas pancreáticas, con RNF43 muíante son más sensibles a un antagonista de Wnt. Ver, Figuras 3 y 4, en relación con la HPAFII, una línea celular con una proteína RNF43 no funcional. Los inventores también han observado que la línea celular Pand O.05, que también tiene una proteína RNF43 no funcional, también es sensible a los inhibidores tipo puercoespín.

En una modalidad, el inhibidor de Wnt es un inhibidor tipo puercoespín adecuado para su uso en seres humanos. El inhibidor de Wnt puede ser un inhibidor tipo puercoespín que tiene una función similar a un inhibidor tipo puercoespín conocido tal como IWP-2, IWP-3 o IWP-4, que se describen por Chen B et al. (2009) Nature Chem. Biol. 5: 100-107 y comercialmente disponible en Miltenyi Biotech como Stemolecule™ Inhibidor de Wnt IWP-2 (# 130-095-584), Stemolecule™ Inhibidor de Wnt IWP-3 (# 130-095-585) y Stemolecule™ Inhibidor de Wnt IWP-4. Stemolecule™ IWP-2, Stemolecule™ IWP-3, y Stemolecule™ IWP-4 previene palmitilación de las proteínas Wnt por puercoespín (PORCN), una O-aciltransferasa unida a la membrana.

Alternativamente, los inhibidores de Wnt pueden ser los productos de diseño de fármacos y pueden producirse usando diversos métodos conocidos en la téenica. Ver, solicitud de patente internacional W02010/101849, publicada el 10 de Septiembre de 2010. Varios métodos de diseño de fármacos, útiles para diseñar miméticos u otros compuestos útiles en la invención se describen en Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wilcy-Liss, Inc. (incorporados por referencia en su totalidad). Un inhibidor de Wnt puede obtenerse a partir de las estrategias de diversidad molecular (una combinación de estrategias relacionadas que permitan la rápida construcción de grandes librerías moleculares químicamente diversas), librerías de compuestos naturales o sintéticos, en particular, a partir de librerías químicas o combinatorias (es decir, librerías de compuestos que difieren en la secuencia o el tamaño, pero que tienen bloques de construcción similares) o por el diseño racional, dirigido o al azar de fármacos. Ver, por ejemplo, Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wilcy-Liss, Inc.. En una estrategia de diversidad molecular, librerías de compuestos de gran tamaño se sintetizan, por ejemplo, a partir de péptidos, oligonucleótidos, compuestos esteroideos naturales o sintéticos, carbohidratos o moléculas orgánicas naturales o sintéticas y moléculas no esteroideas, usando enfoques biológicos, enzimáticos o químicos. Los parámetros críticos en el desarrollo de una estrategia de diversidad molecular incluyen diversidad de la subunidad, tamaño molecular, y diversidad de la librería. El objetivo general de tales librerías es utilizar la aplicación secuencial de selección combinatoria para obtener ligandos de alta afinidad para una diana deseada, y a continuación, para optimizar las moléculas líderes ya sea mediante estrategias de diseño aleatorias o dirigidas. Métodos de diversidad molecular se describen en detalle en Maulik et al. (1997) Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies. Wiley-Liss, Inc..

En una modalidad preferida el inhibidor de Wnt es un compuesto de la Formula (1 ): (D o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, en donde: X1 , X2, X3 y X4 son seleccionados de N y CR7; uno de X5, X6, X7 y X8 es N y los otros son CH; X9 se selecciona a partir de N y CH; Z se selecciona de fenilo, pirazinilo, piridinilo, piridazinilo y piperazinilo; en el que cada fenilo, pirazinilo, piridinilo, piridazinilo o piperazinilo de Z está opcionalmente sustituido con un grupo R6; R1 , R2 y R3 son hidrógeno; m es 1 ; R4 se selecciona a partir de hidrógeno, halo, difluorometilo, trifluorometilo y metilo; R6 se selecciona de hidrógeno, halo y -C(O)R10; en el que R10 es metilo; y R7 se selecciona a partir de hidrógeno, halo, ciano, metilo y trifluorometilo.

El inhibidor de Wnt puede ser un compuesto seleccionado a partir del grupo de: N-[5-(3-fluoro-fenil)-piridin-2-il]-2-[5-metil-6-(piridazin-4-il)-piridin-3-il]-acetamida; 2-[5-metil-6-(2-metilpindin-4-il)-piridin-3-il]-N-[5-(pirazm-2-il)-piridin-2-il]-acetamida (LGK974); N-(2,3'-bipiridin-6,-il)-2-(2',3-dimetil-2,4'-bipiridin-5-il)-acetamida; N-(5-(4-a cetil pipe razin- 1 -il)-piridin-2-i l)-2-(2'-met¡ 1-3-(trifluorometil)-2,4'-bipiridin-5-il)-acetamida; N-(5-(4-acet¡lpiperazin-1 -il)-piridin-2-il)-2-(2’-fluo ro-3 -m et¡ I -2 , 4 bipiridin-5-il)-acetamida; y 2-(2,-fluoro-3-metil-2,4'-bipiridin-5-il)-N-(5-(pirazin-2-il)-piridin- 2-il)-acetamida ; o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

Más preferiblemente el inhibidor de Wnt es 2-[5-metil-6-(2-metilpirid¡n-4-il)-pirid¡n-3-il]-N-[5-(pirazin-2-il)-piridin-2-il]-acetamida (LGK974).

Un fármaco que tiene actividad biológica sustancialmente similar a la de un inhibidor de Wnt se refiere a un fármaco que tiene sustancialmente las mismas funciones exhibidas o realizadas por el compuesto de referencia que se atribuyen a la del compuesto de referencia medidas u observadas in vivo o in vitro. Por ejemplo, un fármaco que tiene actividad biológica sustancialmente similar como un inhibidor tipo puercoespín se refiere a un fármaco que tiene sustancialmente las mismas funciones expuestas o realizados por un compuesto de referencia tal como IWP-2, IWP-3 o IWP-4.

En otra modalidad, el inhibidor de Wnt es el inhibidor de tanquirasa XAV939 (C9289), que está disponible en Sigma-Aldrich Corp. , St. Louis, MO, EE.UU . , y otras fuentes comerciales. Ver, Huang SM et al. (2009) Nature 461 (7264):614-20.

Otros tipos de inhibidores de Wnt pueden incluir, pero no se limitan a, aptámeros, ARNi, y ribozimas. Los aptámeros son hebras cortas de ácidos nucleicos sinteticos (por lo general de ARN pero también ADN) seleccionadas a partir de librerías de ácidos nucleicos combinatorias aleatorizadas en virtud de su capacidad para unirse a una molécula diana específica predeterminada con alta afinidad y especificidad. Los aptámeros asumen una estructura tridimensional definida y son capaces de discriminar entre los compuestos con muy pequeñas diferencias en la estructura. Interferencia de ARN (ARNi) es un proceso por el que ARN de doble cadena, y en sistemas de mamíferos, ARN interferente corto (ARNsi), se usa para inhibir o silenciar la expresión de genes complementarios. Una ribozima es un segmento de ARN que es capaz de realizar la catálisis biológica (por ejemplo, por rotura o formación de enlaces covalentes). Más específicamente, las ribozimas son moléculas de ARN antisentido que funcionan mediante la unión a la fracción de ARN diana y se inactivan mediante la escisión del esqueleto de fosfodiéster en un sitio de corte específico.

Los otros tipos de inhibidores pueden tener similitud con los inhibidores naturales de Wnt. Los antagonistas naturales conocidos de la señalización de Wnt incluyen proteínas de Dickkopf, proteínas secretadas relacionadas con las proteínas Frizzled (sFRP), Factor Inhibidor de Wnt 1 (WIF-1 ) y Soggy. Los miembros de la familia de proteínas relacionadas con Dickkopf (DKK-1 a -4) son proteínas secretadas con dos dominios ricos en cisteína, separadas por una región de enlace. La familia Dkk también incluye Soggy, que es homologa a DKK-3, pero no a los otros miembros de la familia.

Los SFRPs son una familia de cinco glucoproteínas de unión a Wnt que se asemejan a las proteínas Frizzled unidas a la membrana. La familia más grande de los inhibidores de Wnt, que contiene dos grupos, el primero consiste en sFRP-1 , 2, y 5, y la segunda incluye sFRP-3 y 4.

En una modalidad, el antagonista de la señalización de Wnt puede ser un receptor de Wnt soluble, tal como un Frizzled8CRD-hFc, que se reporta que ha inhibido el crecimiento de teratocarcinomas in vivo. DeAlmeida VI et al. (2007) Cáncer Res. 67(1 1 ):5371 -9.

Otros antagonistas naturales de señalización de Wnt incluyen WIF-1 (Factor Inhibidor de Wnt 1 ), una proteína secretada que se une a las proteínas Wnt e inhibe su actividad.

Aún, otro tipo de inhibidor de Wnt puede ser un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o un péptido de unión a antígeno o "pareja de unión". Los anticuerpos se caracterizan porque comprenden dominios de inmunoglobulina y, como tal, son miembros de la superfamilia de proteínas de ¡nmunoglobulinas. Un anticuerpo puede incluir anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos divalentes y monovalentes, anticuerpos b¡- o multi-específicos, el suero que contiene dichos anticuerpos, los anticuerpos que se han purificado en diversos grados, y cualesquiera equivalentes funcionales de los anticuerpos completos. Anticuerpos aislados útiles como inhibidores de Wnt pueden incluir suero que contiene dichos anticuerpos, o anticuerpos que se han purificado a diversos grados. Los anticuerpos enteros de la invención pueden ser policlonales o monoclonales. Alternativamente, los equivalentes funcionales de anticuerpos completos, tales como fragmentos de unión al antígeno en el que uno o más dominios de anticuerpo son truncados o ausentes (por ejemplo, fragmentos Fv, Fab, Fab', o F(ab)2), así como anticuerpos de ingeniería genetica o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla o anticuerpos que pueden unirse a más de un epítopo (por ejemplo, anticuerpos bi-específicos), o anticuerpos que pueden unirse a uno o más antígenos diferentes (por ejemplo, anticuerpos bi-o multi-específicos ), también se pueden emplear como inhibidores de Wnt.

Diversos anticuerpos dirigidos a la señalización de Wnt corriente arriba se están desarrollando, incluyendo anticuerpos LRP6 (Ettenberg S et al. (2010) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 107(35): 15473-8) y el anticuerpo Frizzled (Gurncy A et al. (2012) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 109(29): 1 1717-22).

Ensayos y kits Los kits de ensayo y métodos de la invención pueden ser utilizados para identificar pacientes, células, o tejido que se prevé que sea sensible a un inhibidor particular de Wnt. El uso de tal kit de diagnóstico de acompañamiento sería similar a otras pruebas diagnósticas de acompañamiento aprobadas por las agencias gubernamentales de registro de fármacos para su uso con fármacos aprobados. Ver, por ejemplo, las aprobaciones por parte de la Administración de Alimentos y Fármacos en 201 1 de crizotinib para el tratamiento del cáncer de pulmón ALK4-mutado y de vemurafenib para el melanoma BRAF mutado.

Los kits y métodos de ensayo de la invención también pueden ser útiles para identificar tratamientos que pueden mejorar la capacidad de respuesta de las células cancerosas que son resistentes a los inhibidores de Wnt, y para desarrollar tratamientos adyuvantes que mejoren la respuesta de los inhibidores de Wnt.

Los kits de ensayo y métodos de la invención son útiles para los pacientes con cualquier tipo de cáncer que se pueden tratar con inhibidores de Wnt, tal como o cáncer pancreático (ver Tabla 2), o cualquier tumor cuyo crecimiento puede ser frenado por los inhibidores de Wnt, como carcinomas ductales , adenocarcinomas o melanomas (ver Tabla 1 ). Tales pacientes pueden, como resultado de los métodos proporcionados en la presente, se libran de los efectos secundarios y los costes financieros de una terapia ineficaz en el caso que no tengan una expresión génica reducida de RNF43 o ZNRF3. Los kits y métodos de ensayo de la invención también son útiles para los médicos, que pueden recomendar, una terapia inhibidora de Wnt, o no, a los pacientes particulares basados en información sobre las características moleculares de sus tumores. Los kits de ensayo y metodos de la invención también aumentarán útilmente la demanda de desarrollo de un ensayo FISH eficiente para 5 la RNF43 humana con sondas a desarrollar de nucleótidos.

En una modalidad, la invención proporciona un kit de ensayo para la selección de un paciente de cáncer que se predijo para beneficiarse o no beneficiarse de la administración terapéutica de un inhibidor de Wnt. El kit de ensayo incluye: (Q) un medio para detectar en una muestra de las células tumorales un nivel de un biomarcador o una combinación de biomarcadores seleccionados a partir de: (i) un nivel de amplificación del gen RNF43 o gen ZNRF3; o (¡i) un nivel de pérdida de heterocigosidad del gen RNF43 o gen ZNRF3. tB) un control seleccionado a partir de: (i) una muestra de control para la detección de la sensibilidad al inhibidor de Wnt; (ii) una muestra de control para la detección de resistencia al inhibidor de Wnt; (iii) información que contiene un nivel de control predeterminado del biomarcador que se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor 20 de Wnt; o (iv) información que contiene un nivel de control predeterminado del biomarcador que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt.

En una modalidad, el kit puede incluir además un medio para detectar una mutación en el gen RNF43 o gen ZNRF3. 25 En una modalidad, el medio para detectar la mutación es una sonda de nucleótidos que se hibridiza con una porción del gen RNF43 o gen ZNRF3. En una modalidad particular, los medios para detectar es una sonda de hibridación in situ fluorescente (FISH). Cualquiera de los medios para detectar pueden contener un marcador detectable. Cualquiera de los medios para detectar se pueden inmovilizar sobre un sustrato.

En una modalidad, un medio para detectar la perdida de heterocigosidad del gen RNF43 o gen ZNRF3 en general puede ser cualquier tipo de reactivo que se puede utilizar en un método de la invención. Tales medios para la detección incluyen una sonda o cebador que se hibridiza en condiciones de hibridación rigurosas con gen RNF43 o ZNRF3. Secuencias de ácidos nucleicos para el gen RNF43 o ZNRF3 son conocidos en la téenica y se pueden utilizar para producir tales reactivos para la detección. Reactivos adicionales útiles para realizar un ensayo utilizando dichos medios para la detección también pueden incluirse, tales como reactivos para realizar la hibridación in situ, reactivos para la detección de marcadores fluorescentes, reactivos para realizar la reacción en cadena de polimerasa, etc.

Los medios para la detección del kit de ensayo de la invención pueden conjugarse con una etiqueta detectable o marcador detectable. Tal marcador puede ser cualquier marcador adecuado que permite la detección de los reactivos utilizados para detectar el gen o proteína de interés, e incluye, pero no se limita a, cualquier composición o marcador detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, medios eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores útiles en la invención incluyen: biotina para la tinción con conjugado de estreptavidina marcada, perlas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads ™), tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo texas, rodamina, proteína fluorescente verde, y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H , 125l, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras comúnmente utilizadas en un ELISA), y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o perlas de vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex , etc.).

Además, los medios para la detección del kit de ensayo de la invención pueden ser inmovilizados sobre un sustrato. Tal sustrato puede incluir cualquier sustrato adecuado para la inmovilización de un reactivo de detección tal como se utiliza en cualquiera de los métodos de detección descritos anteriormente. Brevemente, un sustrato adecuado para la inmovilización de un medio para detectar incluye cualquier soporte sólido, tal como cualquier sólido orgánico, biopolímero o soporte inorgánico que puede formar un enlace con los medios para detectar sin afectar significativamente la actividad o la capacidad de los medios de detección para detectar la molécula diana deseada. Soportes sólidos orgánicos ejemplares incluyen polímeros tales como poliestireno, nailon, resinas de fenol-formaldehído, y copolímeros acrílicos (por ejemplo, poliacrilamida). El kit también puede incluir reactivos adecuados para la detección del reactivo o para el marcado de los controles positivos o negativos, soluciones de lavado, búfers de dilución y similares. El kit también puede incluir un conjunto de instrucciones escritas para el uso del kit y la interpretación de los resultados.

El kit de ensayo también puede incluir uno o más controles. Los controles pueden incluir: (i) una muestra de control para la detección de la sensibilidad al inhibidor de Wnt que se está evaluando para su uso en un paciente;(ii) una muestra de control para la detección de resistencia al inhibidor de Wnt; (iii) información que contiene un nivel de control predeterminado del biomarcador especial a medirse con respecto a la sensibilidad de inhibidor de Wnt o la resistencia (por ejemplo, un nivel de control predeterminado de pérdida de heterocigosidad del gen RNF43 o gen ZNRF3 que ha sido correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt o resistencia al inhibidor de Wnt).

El kit también puede incluir un medio para detectar un marcador de control que es característica del tipo de células que se muestrea generalmente puede ser cualquier tipo de reactivo que se puede utilizar en un método para detectar la presencia de un marcador conocido (en el nivel de ácido nucleico o proteína) en una muestra, tal como por un método para detectar la presencia de un biomarcador descrito anteriormente en la presente. Específicamente, el medio se caracteriza en que se identifica un marcador específico del tipo de célula que se está analizando que identifica positivamente el tipo de célula. Por ejemplo, en un ensayo de tumor de pulmón, es deseable detectar células epiteliales del pulmón para el nivel de expresión de biomarcadores o actividad biológica. Por lo tanto, los medios para detectar un marcador de control identifican un marcador que es característico de una célula epitelial y preferiblemente, una célula epitelial de pulmón, de manera que la célula se distingue de otros tipos de células, tales como un tejido conjuntivo o células inflamatorias. Tal medio aumenta la precisión y la especificidad del ensayo de la invención. Tal medio para la detección de un marcador de control incluye, pero no se limita a: una sonda que se hibridiza en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico que codifica un marcador de proteína; cebadores de PCR que amplifican una molécula de ácido nucleico; un aptámero que se une específicamente a un sitio conformacionalmente distinto en la molécula diana; o un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo, o péptido de unión a antígeno que se une selectivamente al marcador de control en la muestra. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para muchos marcadores celulares son conocidos en la téenica y se pueden utilizar para producir tales reactivos para la detección.

Los EJEMPLOS, que siguen, son ilustrativos de las modalidades específicas de la invención, y diversos usos de las mismas. Ellos se exponen sólo con fines explicativos y no deben tomarse como limitantes de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Como se muestra en la Tabla 1 , el gen RNF43 está mutado en el adenocarcinoma ductal pancreático principal y otros tumores. Mutaciones de cambio de sentido y de cambio del marco en ADN genómico de tumores primarios de páncreas, intestino grueso, esófago y piel. De ellos, cinco son tumores pancreáticos y el número total de tumores pancreáticos estudiados es 19 (mutado en más del 25% de las muestras, con exclusión de las mutaciones cambio de sentido potencialmente dañinas).

TABLA 1 Ejemplo 2 Como se muestra en la Tabla 2, el gen RNF43 está mutado en múltiples líneas celulares cancerosas pancreáticas. Variaciones genómicas identificadas por secuenciación Sanger en 10 líneas celulares cancerosas pancreáticas potencialmente con sólo una copia del gen de RNF43 basado en el número de copias de análisis. Se identificaron tres líneas celulares con mutaciones inactivantes de RNF43: HPAFI I (mutación cambio de sentido), Pane 10.05 (mutación de cambio del marco, relacionado con las células PL45), Patu-8988S (mutación perjudicial, relacionado con las células Patu-8988T).

TABLA 2 Información adicional acerca de las líneas celulares HPAFII, Pane 10.05, Patu-8988S, así como otras líneas celulares con mutaciones inactivantes de RNF43 (por ejemplo, celulas Capan-2) se proporcionan en el Ejemplo 3 y el Ejemplo 4 a continuación.

Ejemplo 3 Inhibición de la senda de Wnt canónica oor LGK974 La sensibilidad de las células pancreáticas para el tratamiento con LGK974 se ensayaron en un ensayo de proliferación celular in vitro. Veinte cuatro líneas celulares cancerosas pancreáticas humanas se trataron con o sin LGK974.

Datos de proliferación celular se generan en formato de 384 pozos. Las celulas se recogieron y se resuspendieron en su medio de crecimiento apropiado a una densidad de 1 .5 X 104 células por mi. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de 384 pozos (Greiner-BioOne 789163) en un volumen final de 50pL por pozo para conseguir una densidad por pozo de 750 células por pozo usando un dosificador m Fi II de BioTek (número de serie 000-3586). Las placas se transfirieron luego a las incubadoras sobre el sistema ACP-1 (37 ° C, CO2 al 5%) y las células se dejan unir durante la noche. Una curva de respuesta a la dosis de 12 punto para LGK974 se preparó en una placa de fuente compatible ECHO de 384 pozos (Labcyte P-05525) con una concentración más alta de 2 mM y una concentración más baja de 1 .13 x 10 5 mM. Aproximadamente 18 horas después de sembrar en las placas las células se dosificaron con 50 ni de LGK974 utilizando el Labcyte ECH0555, con curvas de IC50 replicadas dentro de una placa y planchas replicadas por línea celular. Después de la adición del compuesto, las placas se devolvieron a la incubadora durante 120 horas. Las placas de ensayo se lcyeron con la adición de 10 mI de 1 x Cell Titer Glo (Promega G7573) según las instrucciones del fabricante. Las placas se incubaron a continuación a temperatura ambiente durante diez minutos y se leyeron en el Perkin Elmer Viewlux integrado (exposición de 2 segundos, bin 2x, alta sensibilidad). Los datos en bruto se normalizaron utilizando los pozos de control de DMSO en cada plato y se llevó a cabo el ajuste de curvas para la determinación de IC50.

El crecimiento celular se midió cinco días más tarde con Cell Titer Glo (Promega). Como se muestra en la Tabla 3, LGK974 inhibió el crecimiento de celulas con nM IC50 en un subconjunto de líneas celulares cancerosas pancreáticas, incluyendo Capan-2, PA-TU-8988S y HPAFII. Como se muestra en la Tabla 4 y en el Ejemplo 4, las cuatro líneas celulares albergan mutaciones de pérdida de función (LOF) de RNF43.

TABLA 3 La Tabla 4 muestra una lista de las líneas celulares pancreáticas, las mutaciones de RNF43 en las líneas celulares y la inhibición de la senda por LGK974 TABLA 4 Ejemplo 4 La inactivación de Mutaciones de RNF43 confiere dependencia de Wnt en Cáncer Pancreático En este Ejemplo, se muestra que RNF43 inhibe la señalización de Wnt/S-catenina y reduce el nivel de membrana de proteínas Frizzled en celulas de cáncer pancreático como un mecanismo de retroalimentación negativa. La inhibición de señalización de Wnt endógena aumentó el nivel de superficie celular de proteínas Frizzled.

Múltiples líneas celulares de cáncer pancreático se probaron para la dependencia de Wnt utilizando LGK974, un inhibidor tipo Porcupine que bloquea la secreción de Wnt. Las células de cáncer pancreático fueron cultivadas en medio recomendado por la ATCC suplementado con FBS al 10%.

Sorprendentemente, todas las líneas sensibles inhibidoras tipo puercoespín portan la mutación inactivante de RNF43. La inhibición de la secreción de Wnt o el agotamiento de b-catenina inhibe la proliferación de RNF43 muíante pero no de las células tumorales pancreáticas de RNF43 WT. La reintroducción de RNF43 de tipo silvestre en líneas mutantes de RN F43 también inhibe su proliferación. LGK974 inhibe el crecimiento de los tumores pancreáticos mutantes de RNF43 in vivo. Nuestros datos muestran que la mutación de RNF43 en el cáncer pancreático confiere dependencia a Wnt y la mutación de RNF43 se debe utilizar como biomarcador para la selección de pacientes para el desarrollo de inhibidores de Wnt.

Tres líneas celulares cancerosas pancreáticas dependientes a Wnt han sido identificadas usando inhibidor tipo puercoespín LGK974, y sorprendentemente todas estas líneas celulares albergar mutaciones de pérdida de función de RNF43. El crecimiento de estas líneas celulares mutantes de RNF43 se inhibe en el agotamiento de b-catenina o la re-expresión de RNF43, y su crecimiento es inhibido por LGK974. Nuestros datos establecen RNF43 como un supresor de tumores en el cáncer pancreático, y muestran que la mutación de RNF43 se puede utilizar como un biomarcador para predecir la eficacia de los agentes que se dirigen a la senda de señalización de Wnt.

Probamos un panel de 39 líneas celulares cancerosas pancreáticas para dependencia a Wnt utilizando LGK974, un inhibidor tipo puercoespín que se está examinando actualmente en clínicas. Sorprendentemente, todas las líneas sensibles a LGK974 portan la mutación inactivante de RNF43. La inhibición de la secreción de Wnt, el agotamiento de b-catenina, o la expresión de RN F43 bloqueó la proliferación de tipo silvestre de RNF43 mutante pero no de celulas cancerosas pancreáticas de tipo silvestre de RN F43. LGK974 inhibió el crecimiento de los tumores pancreáticos mutados de RNF43 en modelos de xenomjerto de ratón.

TABLA 5 Para ensayar la formación de focos, 6.000 - 12.000 celulas de líneas celulares indicadas fueron sembradas en placa de cultivo de tejidos de 6 pozos en un medio de crecimiento de 2 mi. Después de cultivo durante la noche para la fijación celular, el medio se reemplazó con medio de crecimiento fresco que contenía 1 mM LGK974 en ausencia y presencia de Wnt3a recombinante. Experimento para DOX-inducible de b-catenina shARN, las células fueron tratadas con doxicielina 5ng/ml. Cuando las colonias de células alcanzaron el tamaño deseable, las células se fijaron con formalina al 4% en PBS y se tiñeron con solución de violeta cristal. Después de algunos lavados, las placas se secaron y registraron.

Para la transcripción inversa y PCR cuantitativa (qPCR), el ARN total fue extraído de las células o tumores utilizando el kit RNeasy Plus Mini (Qiagen). 1 mg de ARN se transcribió de forma inversa con Reactivos de Transcripción Inversa de Taqman (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa se realizó en reacciones de 12 m I que consisten en 0.6 m I de una sonda 20X Taqman y una mezcla primaria de cebadores de PCR, 6 m I de mezcla maestra avanzada Taqman 2X Fast (Applied Biosystems), y 5.4 mI de plantilla de ADNc diluido. Las condiciones de termocielado utilizadas fueron 20 segundos a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de 1 segundo a 95 C y 20 segundos a 60 0 C. Todos los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Se realizó el análisis de expresión génica utilizando el método comparativo DDOT y normalizado con el gen de mantenimiento GUSB o 18S. Las sondas Taqman se compraron en Applied Biosystems.

Regulación negativa de la señalización de Wnt por RNF43 en células El agotamiento de RNF43 aumenta el STF inducido por Wnt. Puesto que RNF43 se muta frecuentemente en tumores pancreáticos quísticos (Furukawa T et al. (201 1 ) Sci. Rep. 1 : 161 ; Wu J et al. (201 1 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 108 (52): 21 188- 93), RNF43 podría ser un regulador esencial de la señalización de Wnt / b-catenina en células cancerígenas pancreáticas. En consecuencia, se realizó experimentos de pérdida de función en el YAPC, una línea celular cancerígena pancreática. El agotamiento de RNF43 utilizando siARNs independientes aumentó significativamente la actividad del reportero Wnt SuperTOPFIash (STF), ya sea en ausencia o en presencia del medio acondicionado de Wnt3a exógeno. Ver, FIG 3(a).

Para el ensayo reportero de la luciferasa, las celulas reporteras YAPC-STF se transfectaron con siARN y se trataron con un medio acondicionado de Wnt3a o compuesto donde sea aplicable. Los ensayos de la luciferasa STF se realizaron utilizando kits de ensayo de luciferasa BrightGlo (Promega) según las instrucciones del fabricante.

Para la construcción de líneas de células pancreáticas que expresan STF reportero, las células HEK293 se cultivaron en un medio recomendado por ATCC suplementado con FBS al 10% . El retrovirus o lentivirus se produjo a partir de células HEK293 mediante el procedimiento de envasado de virus estándar utilizando el reactivo de transfección FuGENE 6 (Roche). Las líneas de células pancreáticas que expresan STF reportero, construcciones de RNF43 o ARNsh de b-catenina DOX-inducible, se generaron por la infección viral y la selección de fármacos.

La transfección del ARNsi se realizó utilizando el reactivo de transfección Dharmafect 1 (Dharmacon) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de ARNsi se enlistan de la siguiente manera: pGL2 (Dharmacon D-001 100-01 ), secuencia diana, 5 '-CGTACGCGGAATACTTCGA -3'; RNF43-1 (Dharmacon J-007004-12), secuencia diana, 5 '-GGUGGAGUCUGAAAGAUCA-3'; RNF43-2 (Dharmacon J-007004-1 1 ), secuencia diana, 5 '-GGAGAAAGCUAU UG CACAG 3'; CTNNB 1 -1 (Dharmacon J-003482-10), secuencia diana, 5 '-UAAUGAGGACCUAUACUUA -3'; y CTNNB1 -2 (Dharmacon J-003482-12), secuencia diana, 5 '-GGUACGAGCUGCUAUGUUC-3'.

El agotamiento de RNF43 induce la fosforilación de Dvl y la estabilización de la b-catenina. El LGK974 es un inhibidor tipo puercoespín que inhibe potentemente la secreción de Wnt y se encuentra actualmente bajo evaluación clínica. La actividad de STF inducida por ARNsi RNF43 en la ausencia de Wnt3a exógeno es inhibida por LGK974 y un inhibidor tipo puercoespín IWP-2 anteriormente conocido. Chen B et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5(2): 100-7. Ver, la FIG 3 (b), que muestra que esta actividad es dependiente de la expresión de proteínas Wnt endógenas. Estos resultados muestran que RNF43 suprime activamente la señalización autocrina de Wnt / /B-catenina en las celulas YAPC.

El agotamiento de RNF43 aumenta el nivel FZD por FACS. A continuación se realizaron los ensayos bioquímicos para caracterizar la función de RNF43 en células YAPC. El agotamiento de RNF43 aumentó el nivel de b-catenina citosólica, de acuerdo con el aumento de la actividad reportera de STF.

Dishevelled (DVL) es una proteína de señalización intracelular corriente abajo de Frizzled, y su fosforilación es estimulada por Frizzled. Agotamiento de fosforilación aumentada de RNF43 de DVL2 en un ensayo de inmunohistoquímica. El anticuerpo Anti-DVL se obtuvo en Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.

De hecho, el agotamiento de RNF43 aumentó drásticamente el nivel de superficie celular de Frizzled, como se ensayó por citometría de flujo utilizando el anticuerpo pan-Frizzled 18R5 La TABLA 6 muestra que el agotamiento de RNF43 aumenta el nivel de superficie celular de Frizzled (FZD). Las células YAPC se transfectaron con el ARNsi indicado, y los niveles de la membrana de Frizzled se analizaron por citometría de flujo utilizando el anticuerpo pan- Frizzled 18R5.

TABLA 6 Para el análisis de citometría de flujo, las células se recogieron usando un buffer de disociación celular libre de tripsina-(lnvitrogen) y se resuspendieron en buffer FACS (PBS con 1 % de BSA y 0,02% de azida de sodio). Después del bloqueo, las células fueron incubadas con el anticuerpo pan-Frizzled (18R5) durante 1 hora a 4 ° C, seguido por la incubación con un anticuerpo secundario de IgG anti-humano de cabra conjugado con aloficocianina (APC). Después de extensos lavados usando buffer FACS, las células se tiñeron con yoduro de propidio (Pl) y se sometieron a análisis multi-canal con citómetro de flujo BD LSR II. Las señales de fluorescencia de las células-PI negativas se muestran en los histogramas.

La sobreexpresión de RNF43 tipo salvaje disminuye la membrana FZD. Para descartar la posibilidad de que el efecto de RNF43 siARN está mediado por la actividad colateral, se realizó un experimento de rescate de ADNc al expresar establemente el ADNc de RNF43 resistente a ARNsi en las células YAPC.

La expresión de RNF43 resistente a siARN abolió en gran medida el efecto de siARN RNF43 en los niveles Frizzled, por lo que la actividad de siARN RNF43 está en la diana.

La sobreexpresión de RNF43ARING aumenta el FZD de membrana. El agotamiento de RNF43 también aumentó la expresión de AXIN2, un gen diana de b-catenina, y este efecto también fue abolido por la expresión de RNF43 resistente a ARNsi. Ver, la FIG 3(c).

RNF43 cADN resistente a RNF43 siARN, RNF43 ARING (los aminoácidos faltantes 272-312) y F69C muíante fueron generados por mutagénesis PCR de dos pasos y clonados en diversos vectores de expresión de mamíferos. El plásmido reportero de pLenti6-STF y plásmido viral de b-catenina shARN fueron descritos previamente por Hao HX et ai. (2012) Nature 485(7397): 195-200.

Sobre la base del ciclo umbral (Ct), los valores que se observaron en un ensayo PCR cuantitativo, RNF43 se expresa predominantemente en comparación con ZNRF3 en células YAPC. Nuestros resultados muestran que RNF43 regula negativamente la señalización de Wnt a través de la disminución de expresión en la membrana de Frizzled en células pancreáticas.

RNF43 se expresa en un nivel más alto que ZNRF3 en cáncer pancreático YAPC mediante qPCR, consistente con su importancia en la regulación de la señalización de Wnt. Wnt/B-catenin signaling promotes the development of the exocrine compartment of páncreas and ectopic expression of stabilized b-catenin proliferation of acinar cells. Heiser PW et al. (2006) Development 133(10): 2023-32. Anteriormente se mostró que las proteínas R-Espondina estimulan la señalización de Wnt a través de la inhibición de ZNRF3 y RNF43 y la estabilización Frizzled. Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200.

La señalización de Wnt / b-catenina regula negativamente la expresión de la membrana FZD. El inhibidor tipo puercoespín LGK974 aumenta el nivel de membrana de FZD. RNF43 y ZNRF3 se han mostrado como genes diana de b-catenina. Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200; Koo BK, (2012) Nature 488(7413): 665-9. Sin embargo, el efecto de la señalización de Wnt / b-catenina endógena en la expresión Frizzled no ha sido probado.

Encontramos por citometría de flujo que ARNs-si de b-catenina independientes aumentaron significativamente el nivel de superficie celular de Frizzled en células YAPC. El agotamiento de la b-catenina también disminuyó los niveles de ARNm de b-catenina dirigida a los genes AXIN2 y RNF43 Ver, la FIG 4(a). La TABLA 7 muestra que el agotamiento de la b-catenina aumenta el nivel de la superficie celular de Frizzled. Las células YAPC fueron transfectadas con el siARN indicado, y los niveles de la membrana de Frizzled fueron analizados por citometría de flujo.

TABLA 7 Consistente con esta observación, el tratamiento del inhibidor tipo puercoespín IWP2 o LGK974 aumenta el nivel de superficie celular de Frizzled y disminuye los niveles de mARN de AXIN2 y RN F43. Ver, la FIG 4(b). La TABLA 8 muestra que los inhibidores tipo puercoespín aumentan el nivel de superficie celular de Frizzled. Las celulas YAPC se trataron con 3 mM de IWP-2 o 1 mM de LGK974, y se sometieron a análisis de citometría de flujo para la expresión de la membrana Frizzled.

TABLA 8 Estos resultados muestran que la señalización de Wnt / b-catenina inhibe fuertemente el nivel de la membrana de Frizzled.

Caracterización de la mutación RNF43 en los tumores pancreáticos La identificación de líneas de cáncer pancreático que contienen la mutación de inactivación de RNF43. El descubrimiento de LGK974, un inhibidor potente y selectivo tipo puercoespín, nos ofreció una herramienta química única para examinar sistemáticamente la dependencia de Wnt en un panel grande de líneas celulares cancerígenas. Se probó LGK974 en un panel grande de líneas celulares cancerígenas pancreáticas utilizando un ensayo de formación de focos. El ensayo de formación de focos se utilizó debido a que es más sensible que los ensayos de crecimiento de rutina, tales como CelITiter-Glo, y se ve menos afectado por las diferentes tasas de crecimiento de diversas líneas celulares. De las 39 líneas celulares pancreáticas seleccionas, LGK974 sólo mostró una fuerte actividad inhibidora del crecimiento en tres líneas celulares, Patu-8988S, HPAFII y Capan-2.

Luego se trató de determinar la lesión genetica que podría conferir a la dependencia de Wnt. RN F43 es el único regulador negativo conocido en la corriente arriba de la senda de Wnt mutada en cáncer. Por esta razón, se realizó la secuenciación de exones RN F43 en todas las líneas celulares cancerígenas pancreáticas. Sorprendentemente, las tres líneas celulares sensibles a LGK974 tienen mutaciones homocigóticas de RNF43 (HPAFII , E 174X; Patu-8988S, F69C; Capan-2, R330fs). Las mutaciones E174X y R330fs truncan la mayoría de la proteína RNF43 y lo más probable inactivan la proteína. La consecuencia de la mutación F69C, que introduce una cistina extra al dominio extracelular de RN F43, es menos clara.

Las mutaciones en las líneas celulares se determinaron mediante el análisis de secuenciación genómica. Para el análisis de secuenciación general, el ADN genómico fue extraído utilizando un M i ni Kit de ADN QlAamp (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los exones de RN F43 se amplificaron por PCR y se secuenciaron utilizando la plataforma de Applied Biosystems.

Para definir la función de la mutación F69C, se expresa de forma estable RNF43, RNF43 ARING, y RNF43 F69Q-tipo silvestre, C-terminal, HA etiquetados en células YAPC.

Se adquirió el ADNc RNF43 humano de longitud completa (NM_01 7763.4) de Open Biosystems y se etiquetó con un epítopo HA de terminal- C mediante PCR. RNF43 cADN resistente a RNF43 ARNsi, RNF43 ARING (los aminoácidos faltantes 272-312) y F69C muíante fueron generados por mutagénesis PCR de dos pasos y clonados en diversos vectores de expresión de mamíferos. El plásmido reportero de pLenti6-STF y plásmido viral de b-catenina shARN fueron descritos previamente por Hao HX et al. (2012) Nature 485(7397): 195-200.

Consistente con la función de RNF43 en la regulación del giro de Frizzled, la sobreexpresión de tipo salvaje RNF43 disminuyó el nivel de la membrana de Frizzled, mientras que la sobreexpresión de RNF43 ARING mostró actividad negativa dominante y disminuyó el nivel de membrana de Frizzled. La sobre-expresión de RNF43 F69C aumentó moderadamente el nivel de la membrana de Frizzled, por lo tanto F69C es una pérdida de la función mutante y tiene una actividad dominante negativa parcial a la sobreexpresión.

La TABLA 9 muestra el Análisis de citometría de flujo de la membrana Frizzled en células YAPC que expresan establemente el vector vacío (EV), RNF43 tipo salvaje (WT) o RNF43 mutante (ARING o F69C).

TABLA 9 Además, la sobreexpresión de RNF43 ARING, y en menor grado para RNF43 F69C, aumentó la fosforilación DVL2 y potencia la actividad del indicador STF inducida por Wnt3a. Estos datos demuestran que el F69C es una mutación de cambio de sentido para la inactivación de RNF43.

El agotamiento de RNF43 aumenta la expresión de membrana FZD en células de RNF43 tipo silvestre, pero no RNF43 mutante. Seguidamente, se examinó la función de RNF43 en estas líneas celulares cancerígenas pancreáticas. Aunque el agotamiento de RNF43 aumentó la fosforilación de DVL2 en YAPC y PK1 , dos líneas celulares cancerígenas pancreáticas con RNF43 tipo silvestre, el agotamiento de las células RNF43 en HPAFII, Patu-8988S y Capan-2 no aumento la fosforilación DVL2. Consistentemente, el agotamiento de RNF43 aumentó el nivel de la superficie celular de Frizzled en RNF43 tipo silvestre (YAPC y PK1 ), pero no en las líneas celulares cancerígenas pancreáticas de RNF43 mutante (HPAFI I, Patu-8988S y Capan-2) . Tomados en conjunto, estos resultados muestran que el nivel de Frizzled ya no está inhibido por RNF43 en las líneas celulares cancerígenas pancreáticas con mutación RN F43.

La TABLA 10 muestra un análisis de citometría de flujo de la membrana Frizzled en las líneas celulares cancerígenas pancreáticas tratados con ARNsiRNF43.

TABLA 10 La mutación de RNF43 predice la sensibilidad a la inhibición de Wnt en los tumores pancreáticos.

LGK974 disminuye la b-catenina citosólica en todas las líneas celulares. A continuación se caracterizó la dependencia a Wnt en las líneas celulares cancerígenas pancreáticas. En un ensayo de formación de focos, LGK974 inhibe fuertemente el crecimiento de Patu-8988S, HPAFII y Capan-2, sin un efecto significativo en PK1 y YAPC (vease la Tabla 6). Es importante destacar que, el efecto inhibidor del crecimiento de LGK974 en las células de RNF43 muíante es rescatado por Wnt3a exógeno, por lo que el efecto de LGK974 está mediado por el bloqueo de la secreción de Wnt. (Las líneas celulares cancerígenas pancreáticas fueron tratadas con DMSO, 1 mM de LGK974 o LGK974 junto con Wnt3a recombinante en el ensayo de formación de focos.) Los ensayos de inmunotransferencia y qPCR indicaron que LGK974 disminuyó la expresión de MYC, un gen diana de b-catenina, y aumentó la expresión del inhibidor de cinasa p21 dependiente de cielina en RNF43 mutante, pero no las líneas celulares RNF43 de tipo silvestre. LGK974 disminuyó la b-catenina citosólica y disminuyó la expresión del gen diana de b-catenina AXIN2 en ambas líneas celulares RNF43 mutante y RNF43 de tipo silvestre, por lo que todas estas líneas celulares tienen la señalización autocrina de Wnt activa.

Además, LGK974 indujo a la expresión del marcador de diferenciación MUC2, MUC5A / C en células RNF43 mutantes. LGK974 bloqueó la incorporación EDU en líneas celulares de RNF43 mutante, de modo que la inhibición de Wnt en estas células lleva a la detención del ciclo celular. La inhibición del crecimiento inducida por LGK974 y la diferenciación celular de células de RNF43 mutante también son evidentes utilizando la tinción Ki67 (anti-K¡67 (SP6) de Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU . 94010) y una tinción con azul de alcian. Además, LGK974 inhibió fuertemente la proliferación de PaTu-8988S y HPAFII, pero no PK1 , en agar suave de ensayo Capan-2 no puede ser probado ya que no crece en agar suave de ensayo. Juntos, estos resultados muestran que la inhibición de la señalización autocrina de Wnt en células de RNF43 mutante induce a la detención del crecimiento y la diferenciación celular.

Para el agar suave de ensayo, las células se suspendieron en 250mI de agarosa de baja fusión al 0.3% (Lonza) en DM EM que contiene FBS al 10%, y se sembraron en 250mI de agarosa solidificada al 0.8% que contiene DMEM en 48 pozos de placas de cultivo a una densidad de 5,000-10,000 células por pozo. Se agregó 250mI de medio de crecimiento en la parte superior de las células después de que la placa se enfrió a temperatura ambiente durante 30 minutos. La placa se incubó a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene CO2 al 5%. Las células se trataron con un medio de crecimiento fresco que contiene DMSO o 1 mM de LGK974 cada 3-4 días. Cuando las colonias alcanzaron un tamaño deseable, se tomaron fotografías y las colonias se tiñeron con AlamarBIue (de Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU. 14 072) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos experimentos se repitieron tres veces, y al menos cuatro pozos fueron replicados cada vez para cada condición.

Para el ensayo de la proliferación de EDU , las celulas se sembraron en un medio de crecimiento en placas de 96 pozos a una densidad de 6000-12,000 células por pozo, y se trataron con DM SO o 1 mM de LGK974. Después de 3 días, las células se trataron con un medio de crecimiento fresco que contiene 20mM de EdU, que estaba incluido en el kit de ensayo HCS Click-iT EdU Alexa Fluor 488 (Invitrogen), y la placa se incubó durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera hum idificada que contiene CO2 al 5%. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% final durante 30 min, se lavaron con PBS, se permeabilizaron y se tiñeron con Tritón X-100 al 0.75% y 50 g/ml de Hoechst en PBS durante 30 min. Después del lavado, se procedió a la detección de EdU en las células según la instrucción del kit de ensayo EdU Click-iT. Se prepararon los pozos por triplicado para cada condición.

El procedimiento para la tinción con azul de Alcian para la mucina es el siguiente: las líneas celulares cancerígenas pancreáticas se sembraron en matraces de cultivo de tejido de 225 cm3 a varias densidades, y se trataron con DMSO o LGK974 (100 nM) durante 72 horas. Los sedimentos celulares se recolectaron mediante la eliminación de medios, el lavado con 1 x PBS, y la adición de 10 mi de tampón de formalina al 10%. Las células fueron retiradas de la parte inferior del matraz y se colocaron en un tubo cónico de 50 mi, lleno hasta ~ 50 mi con formalina tamponada al 10%, y se dejaron fijar durante 1 -2 horas. Luego el tubo cónico que contenía las células fijadas se centrifugó a 1200 rpm durante 5 min, y las células sedimentadas se envolvieron en papel de lentes, se colocaron en un casete de histología, se procesaron, y se etiquetaron en parafina. Las secciones FFPE se cortaron cada 5 pm y se montaron en placas, se metieron al horno a 60 ° C durante al menos 30 minutos, y se desparafinaron. Luego las placas se enjuagaron dos veces en H2O, se transfirieron a ácido acético al 3% acuoso durante 3 minutos, y se trasladaron directamente a azul de Alcian al 1 % en ácido acético al 3% pH 1 durante 30 minutos. Luego las placas se colocaron en corriente de agua durante 10 minutos después de lo cual se enjuagaron en H20 destilada antes de colocarse en colorante rojo rápido nuclear al 0.1 % (Kernechtrot) durante 5 minutos. Las placas se lavaron de nuevo con corriente de agua, y luego se deshidrataron. Por último, las placas se cubrieron con Permaslip ®.

Para la inmunotransferencia, se prepararon Usados de células totales mediante la lisis de células utilizando tampón RIPA (50 mM de Tris-HCI, pH 7,4, NaCI 150 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0, 1 %, 1 mM de EDTA ) suplementado con inhibidores de la proteasa y inhibidores de la fosfatasa, seguido por la centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Para la extracción de b-catenina citosólica, los sedimentos celulares se resuspendieron en un tampón hipotónico (10 mM de Tris-HCI, pH 7.5 y 10 mM de KCI, suplementado con los inhibidores de la proteasa / fosfatasa) y se Usaron mediante tres ciclos de congelación-descongelación. La misma cantidad de proteínas se resolvieron por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Anticuerpos secundarios conjugados con ya sea HRP o colorantes infrarrojos se utilizaron para la visualización de la señal mediante la película ECL o un escáner Odysscy LI-COR, respectivamente.

LGK974 inhibe MYC e induce a la expresión de la proteína p21 en las líneas cancerígenas pancreáticas de RN F43 mutante pero no RNF43 tipo salvaje. Las proteínas Frizzled potencian tanto la señalización de Wnt / b-catenina canónica y la señalización de Wnt no canónica, por lo tanto la inactivación de RN F43 aumentaría de una manera concebible tanto la señalización Wnt canónica como la no canónica. Para determinar la contribución de la señalización de Wnt / b-catenina en el crecimiento celular de las líneas pancreáticas estudiadas, se utilizó shARN de b-catenina. La expresión inducible de un ARNsh de b-catenina previamente validado (Scholer-Dahirel A, et al. (201 1 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 108 (41 ): 17135-40) inhibió fuertemente la proliferación de las líneas cancerígenas pancreáticas de RNF43 mutante (Pátu-8988S , H P A F 11 y Capan-2), pero no RNF43 de tipo salvaje (PK1 y YAPC). El agotamiento de la b-catenina tambien disminuyó la expresión del gen diana de b-catenina AXIN2 y MYC (anti-MYC está disponible de Abcam, Cambridge, MA, EE.UU. 02139), y aumentó la expresión de p21 (anti-p21 está disponible de Millipore, Bedford, MA, EE.UU. 01730), MUC2 y MUC5A/Cs en líneas celulares de RNF43 muíante. Estos resultados muestran que el efecto de LGK974 sobre el crecimiento celular está probablemente mediado por la señalización de Wnt / b-catenina canónica.

A continuación se examinó si la mutación de RNF43 era requerida para el crecimiento de las células mutantes de RN F43. Se encontró que la expresión de RNF43 tipo salvaje, pero no LacZ o RN F43 ARING significativamente inhibió la proliferación de células PaTu-8988S y Capan-2 mutadas de RN F43, mientras que no tuvo efectos sobre las células YAPC de RN F43 de tipo silvestre. La sobreexpresión de RNF43 de tipo silvestre presumiblemente supera la actividad dominante menor de F69C RNF43 expresada de manera endógena en las células Patu-8988S. HPAFII no puede ser probado en este ensayo ya que la eficiencia de la infección viral de esta línea celular es demasiado baja y no se pudo obtener células infectadas de forma estable utilizando retrovirus que expresan LacZ o RN F43 ARING.

Todo junto, los resultados muestran que la señalización de Wnt / b-catenina mejorada por la mutación de RNF43 es requerida para la proliferación de células cancerígenas pancreáticas de RNF43 mutante, y que la supresión de señalización de Wnt / b-catenina en estas células induce la detención del ciclo celular y la inducción de los marcadores de diferenciación.

El bloqueo de la secreción de Wnt inhibe el crecimiento de los Para analizar el papel de la activación de la senda de Wnt en el mantenimiento de los tumores pancreáticos de RNF43 muíante in vivo, se utilizó dos modelos de xenomjertos PDAC (HPAFII y Capan-2).

Para la eficacia in vivo y estudios farmacodinámicos, se recolectaron las celulas a una densidad de confluencia al 95-1 10% . Se implantaron 10 millones de células (HPAFII) o 3 millones de células (Capan-2) mezclado 50:50 con membrana basal Matrigel BD de la matriz (Matrigel) (BD Biosciences) por senda subcutánea en la región superior supra-axilar derecha de ratones nu/nu (Harían) (HPAFI I) o scid.bg (Harían) (Capan-2). Los tumores fueron controlados dos veces por semana con un calibrador y los volúmenes tumorales (TV) se calcularon utilizando la fórmula del elipsoide: TV(mm3) = ((I x w2) x 3.14159)) / 6. Los ratones portadores de xenoinjertos tumorales fueron asignados al azar a grupos de tratamiento (n = 8 por grupo) bien sea 14 días después del implante tumoral (Capan-2), cuando el volumen tumoral medio alcanzó 223 mm3 (intervalo de 200-250 mm3) o 1 1 días después del implante (HPAFI I), cuando el volumen tumoral medio alcanzó 341 mm3 (intervalo 272-418 mm3). Los ratones se trataron por sonda oral (p.o.) dos veces al día (BID) a un volumen de dosificación de 10 mi / kg con ya sea un vehículo (metilcelulosa al 0.5% (MC) / Tween 80 al 0.5%) o una suspensión de 0.65 mg / mi de la forma de sal de fumarato de LGK974 (LGK974-AE-4, base libre del factor de conversión de peso molecular 1.293) en MC al 0.5% / Tween 80 al 0.5%. Las dosis In vivo son reportadas como equivalentes de base libre. Después del tratamiento durante 14 días (HPAFII) o 35 días (Capan-2), se reportó actividad anti-tumoral como valores del porcentaje de tratamiento/control (% T / C) o % de regresión (% REG). La actividad anti-tumoral se calculó utilizando la siguiente fórmula: %T/C = 100 AATt/ACt si DT{ ³ 0; o %REG = 100 DDT¾/T0 si ATt < 0; donde: T0 = volumen tumoral medio (TV) del grupo tratado con el fármaco en el día de la aleatorización; Tt = TV medio del grupo tratado con el fármaco al final del estudio; ATt = T0 - Tt; Ct = TV medio del grupo de control en el día final del estudio; C0 = TV medio del grupo de control en el día de la aleatorización; y ACt = C0 - Ct * valores del %T/C en el rango de 100 a 42% se interpreta que no tenían actividad antitumoral; valores del % T / C £ 42% y> 10% se interpreta que no tienen actividad anti-tumoral, valores del % T / C £ 10% o %REG ³ -10% se interpreta que son estasis del tumor. Valores del % de regresión <-10% se interpretan como regresiones. Cohortes paralelas separadas de animales (n = 3 por tratamiento y punto de tiempo) se trataron con un vehículo o LGK974 como anteriormente para obtener un tejido tumoral para el análisis ex vivo de los marcadores farmacodinámicos.

El tratamiento de ratones portadores de xenomjertos de HPAFII con 5 mg / kg de LGK974, p.o. BID durante 14 días resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral (T / C = 33%) con relación al tratamiento con un vehículo. Además, el tratamiento de ratones portadores de xenoinjertos Capan-2 con 5 mg / kg de LGK974, p.o. BID durante 35 días obtuvo estasis del tumor (T / C = 5%). De acuerdo con el mecanismo de acción de LGK974, la expresión del gen diana de b-catenina, AXI N2, se redujo en HPAFII $ tratado y xenomjertos Capan-2. De manera similar a los hallazgos in vitro en células de RNF43 mutante PDAC, el tratamiento con la detención del ciclo celular de LGK974 inducido y la diferenciación dentro de los xenoinjertos tumorales.

Para los análisis de inmunohistoquímica e imagen, las muestras de xenoinjertos tumorales fueron fijadas en formalina neutra tamponada al 10% durante 6-24 horas, procesadas y embebidas en parafina. La tinción inmunohistoquímica se realizó sobre el sistema Ventana Discovery Las imágenes se capturaron utilizando Aperio ScanScope. Las imágenes de secciones completas del páncreas y xenoinjertos tumorales del ratón se analizaron con Visiopharm . Para los xenoinjertos tumorales, el tejido estromal fue excluido de forma automática utilizando el módulo de la Sección ensambladora. Las regiones necróticas fueron excluidas manualmente utilizando las herramientas de dibujo que ofrece el software de análisis. Los tejidos fueron segmentados utilizando el módulo TissuemorphDP, y la intensidad de DAB se cuantificó, como ya sea porcentaje de núcleos positivos para las proteínas nucleares o porcentaje de píxeles positivos para las proteínas no confinadas al núcleo.

Discusión En este ejemplo, hemos demostrado que RNF43 sirve como un regulador de retroalimentación negativa de la senda de Wnt en las celulas pancreáticas mediante la supresión de expresión de la membrana de Frizzled. Se ha demostrado que la señalización de Wnt / IJ-catenina inhibe potentemente la expresión de la membrana Frizzled, probablemente a través de la inducción de RNF43. Este descubrimiento proporciona una explicación de por qué las células cancerígenas pancreáticas seleccionan mutar RNF43 para escapar de esta regulación poderosa de retroalimentación negativa y alcanzan un alto nivel de señalización de Wnt /S-catenina. Nuestros datos establecen RNF43 como un supresor de tumores en el cáncer pancreático, y muestran que la mutación de RN F43 se puede utilizar como un biomarcador para predecir la eficacia de los agentes que se dirigen a la senda de señalización de Wnt.

Se encontró que LGK974 disminuye la expresión de AXIN2 en 22 de 29 (76%) líneas celulares cancerígenas pancreáticas, por lo que un alto porcentaje de líneas celulares cancerígenas pancreáticas tienen señalización de Wnt autocrina. Sin embargo, el crecimiento de la mayoría de estas líneas celulares no se ve afectado por LGK974 en un ensayo de formación de focos. Sorprendentemente, las tres líneas cancerígenas pancreáticas que muestran sensibilidad clara a LGK974 en un ensayo de crecimiento llevan la pérdida de RNF43 de función de la mutación. Estos resultados muestran que los tumores RNF43 mutados tienen una oportunidad mayor de ser dependientes a Wnt en comparación con tumores RN F43 de tipo salvaje.

Curiosamente, no todas las líneas celulares con mutaciones de RN F43 son sensibles a LGK974. Se encontró que tres líneas cancerígenas pancreáticas llevan la mutación homocigótica de RNF43, Patu-8988T (F69C), Pand O.05 (M 18fs), y PL45 (M 18fs), pero el crecimiento de estas líneas celulares no es sensible a LGK974. Note que Patu-8988S y Patu-8988T se derivaron del mismo paciente, y Pand O.05 y PL45 también se derivaron del mismo paciente. Estos resultados muestran que otros mecanismos pueden hacer tumores de RNF43 mutados independientes de la señalización de Wnt.

Pacientes enriquecedores que tienen más probabilidades de responder a una terapia en ensayos clínicos son beneficiosos para el desarrollo exitoso de la terapia del cáncer molecularmente orientada, debido a la toxicidad de estos agentes y la heterogeneidad de los tumores en el nivel de la lesión molecular. Sin embargo, el desarrollo clínico de estos agentes es difícil debido a que una buena estrategia para identificar tumores de Wnt-dependientes no está disponible. Una estrategia basada en la sobreexpresión de las proteínas de Wnt o infraexpresión de inhibidores de Wnt no sería lo suficientemente robusta como para la selección de pacientes. De hecho, muchas líneas de PDAC con la señalización clara de Wnt / b-catenina autocrina no dependen de Wnt para el crecimiento in vitro. Además, la señalización de b-catenina se puede activar de una manera independiente de ligando, por lo que una estrategia basada en la acumulación nuclear de b-catenina no sería fiable tampoco.

Nuestro estudio ha establecido a RNF43 como un supresor tumoral que inhibe la señalización de Wnt corriente arriba en cáncer pancreático. El hallazgo de que todas las líneas celulares cancerígenas pancreáticas del inhibidor de Wnt sensibles al inhibidor de Wnt ¡n vitro que lleva la mutación RNF43 muestra que la mutación de RNF43 se puede utilizar como un biomarcador predicativo para la selección de tumores pancreáticos para un ensayo clínico para probar la eficacia inhibidor de Wnt.

Los contenidos de cada una de las patentes, y publicaciones citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.

La descripción detallada proporcionada en la presente es para ilustrar la invención pero no para limitar su enfoque. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto normal en la teenica y están contempladas por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para predecir la sensibilidad del crecimiento celular tumoral a la inhibición mediante un inhibidor de Wnt, que comprende: (a) detectar en una muestra de células tumorales de un paciente, un nivel de un biomarcador, donde el biomarcador se selecciona del grupo que consta de: (i) el número de copias de ADN en la región cromosómica RNF43 y/o en la región cromosómica ZNRF3 para determinar una pérdida de heterocigosidad, (ii) ADN genómico, ADNc o ARN secuenciado a partir de tejidos de cáncer para detectar una mutación inactivante en el gen RNF43 y/o en el gen ZNRF3;. (iii) expresión del ARNm de RNF43 y/o expresión del ARNm de ZNRF3; (iv) expresión de proteína de RNF43 y/o expresión de proteína de ZNRF3; (v) el efecto funcional de pérdida de genes RNF43 y/o de pérdida de genes ZNRF3; o (vi) una combinación de biomarcadores (i) - (v): (b) comparar el nivel del biomarcador en la muestra de células del tumor a un nivel de control del biomarcador seleccionado del grupo que consiste en: (i) un nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt; y (ii) un nivel de control del biomarcador que se ha correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt; y (c) seleccionar al paciente de acuerdo a la predicción para que se beneficie de la administración terapéutica del inhibidor de Wnt, si el tumor del paciente tiene una mutación inactivante de RNF43 o ZNRF3, o si el paciente tiene un número de copias disminuido de RNF43 o ZNRF3, o el tumor del paciente tiene una disminución de expresión de ARNm o proteína de RNF43 o una disminución de expresión de ARNm o proteína de ZNRF3, indica que el tumor del paciente es probable que sea sensible al inhibidor de Wnt.

2. Un método de predicción de la sensibilidad de una célula tumoral a un inhibidor de Wnt, donde el método comprende poner en contacto una célula tumoral con por lo menos un inhibidor de Wnt y (a) detectar en una muestra de células tumorales, un nivel de un biomarcador, donde el biomarcador se selecciona del grupo que consta de: (i) el número de copias de ADN en la región cromosómica RN F43 y/o en la región cromosómica ZNRF33 para determinar una pérdida de heterocigosidad, (ii) ADN genómico, ADNc o ARN a partir de células tumorales para detectar una mutación inactivante en el gen RNF43 y/o en el gen ZNRF3; (iii) expresión del ARNm de RNF43 y/o expresión del ARNm de ZNRF3; (iv) expresión de proteína de RNF43 y/o expresión de proteína de ZNRF3; (v) el efecto funcional de perdida de genes RNF43 y/o de pérdida de genes ZNRF3; o (vi) una combinación de biomarcadores (i) - (v): (b) comparar el nivel del biomarcador en la célula tumoral con un nivel de control; (c) determinar la sensibilidad de la célula tumoral a un inhibidor de Wnt sobre la base de la diferencia del nivel de biomarcador en la célula tumoral y el nivel de control.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la detección del número de copias de ADN en la región cromosómica RN F43 en el paso 1 (a ) (i) es por hibridación utilizando una sonda que se híbrida con un nucleótido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 1 .

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la detección del número de copias de ADN en la región cromosómica ZN RF3 en el paso 1 ( a ) ( i ) es por hibridación utilizando una sonda que se híbrida con un nucleótido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 2.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa de detección del número de copias de ADN en la región cromosómica ZN RF3 en el paso 1 (a )(i ) es por hibridación fluorescente in situ (FISH).

6. El metodo de la reivindicación 1 o 2, en donde el ensayo para medir la expresión de ARNm de RNF43 en el paso 1 (a)(iii) es por hibridación utilizando una sonda que se híbrida con un nucleótido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 1 .

7. El método de la reivindicación 1 , 2 o 6, en donde el ensayo para medir la expresión de ARNm de ZNRF3 en el paso 1 (a)(iii) es por hibridación utilizando una sonda que se híbrida con un nucleótido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 2.

8. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el ensayo para medir la expresión de la proteína de RNF43 en el paso 1 (a)(iv) es por inmunohistoquímica.

9. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el ensayo para medir la pérdida de la función en el paso 1 (a)(v) es mediante el uso de un ensayo FACS con un anticuerpo anti-Frizzled.

10. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el ensayo para medir la pérdida de la función en el paso 1 (a)(v) es mediante el uso de un ensayo reportero de Wnt.

1 1 . El método de la reivindicación 10, en donde el ensayo reportero de Wnt mide una actividad de la proteína, en donde la actividad de la proteína se selecciona del grupo que consiste en el aumento de los niveles de proteína Frizzled, el aumento de los niveles de proteína LRP6, el aumento de la fosforilación de LRP6, y el aumento de la fosforilación de Disheveled.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , en donde la etapa de comparación comprende comparar el nivel de biomarcador en las células tumorales con un nivel de control del biomarcador en una o más células de control que son resistentes al inhibidor de Wnt.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , en donde la etapa de comparación comprende comparar el nivel de biomarcador en las células tumorales con un nivel de control del biomarcador en una o más células de control que son sensibles al inhibidor de Wnt.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , en donde el nivel de control del biomarcador que se haya correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt, se ha predeterminado.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , en donde el nivel de control del biomarcador que se haya correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt, se ha predeterminado.

16. Un kit de ensayo para la selección de un paciente con cáncer que se predijo se beneficiaría o no de la administración terapéutica de un inhibidor de Wnt; donde el kit de ensayo comprende: (a) un medio para detectar en una muestra de células tumorales, un nivel de un biomarcador o una combinación de biomarcadores seleccionados a partir de: (i) una pérdida de heterocigosidad del gen RNF43 y/o del gen ZNRF3; (ii) un nivel de pérdida de la función del gen RNF43 y/o del gen ZN RF3; (iii) un nivel de expresión del ARNm de RNF43 y/o del ARNm de ZNRF3; (vi) un nivel de expresión de proteína de RNF43 y/o de proteína de ZN RF3; (v) un efecto funcional de pérdida de genes RNF43 y/o de pérdida de genes ZNRF3; (b) un control.

17. El kit de ensayo de la Reivindicación 16, en donde el control se selecciona del grupo que consta de: (i) una muestra de control para la detección de la sensibilidad al inhibidor de Wnt; (ii) una muestra de control para la detección de la resistencia ai inhibidor de Wnt; (iii) información que contiene un nivel de control predeterminado del biomarcador que se haya correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt; y (iv) información que contiene un nivel de control predeterminado del biomarcador que se haya correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt.

18. El kit de ensayo de la reivindicación 16 o 17, en donde los medios para detectar el gen RNF43 en cualquiera de las etapas 15 (a) (i) y 21 (a) (i) comprende una sonda de nucleótidos que se híbrida con un nucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

19. El kit de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 16 o 18, en donde los medios para detectar el gen RNF43 en cualquiera de las etapas 15 (a) (i) y 21 (a) (i) comprende una sonda de nucleótidos que se híbrida con un nucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 2.

20. El kit de ensayo de la reivindicación 16 o 17, en donde los medios para detectar el gen RNF43 en el paso 15 (a) (i) comprende una sonda de nucleótidos que se híbrida con el sitio genó ico 17q22.

21 . El kit de ensayo de la reivindicación 16, 17 o 20, en donde los medios para detectar el gen RNF43 en el paso 16 (a) (i) comprende una sonda de nucleótidos que se híbrida con el sitio genómico 22q12.1.

22. El kit de ensayo de la reivindicación 16, 17 o 20, en donde los medios para detectar la proteína RNF43 en el paso 16 (a) (iii) comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une selectivamente a un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 3.

23. El kit de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en donde el medio para detectar la proteína RN F43 en el paso 16 (a) (iii) comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une selectivamente a un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

24. El kit de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, donde el medio para detección comprende un marcador detectable.

25. El kit de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, donde el medio para detección se inmoviliza sobre un sustrato.

26. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de Wnt para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente, en donde el nivel del biomarcador del paciente tal como se define en la reivindicación 1 es estadísticamente similar a, o menor que, un nivel de control del biomarcador, y el nivel de biomarcador de control se ha correlacionado con la sensibilidad al inhibidor de Wnt.

27. La composición farmacéutica que com prende un inhibidor de Wnt de la reivindicación 26, en donde el nivel de control es el nivel normal o de referencia del biomarcador, un nivel del biomarcador en la muestra de células o tejido sano, o un nivel de control del biomarcador que se haya correlacionado con la resistencia al inhibidor de Wnt.

28. La composición farmacéutica que com prende un inhibidor de Wnt de la reivindicación 26 o 27, en donde el cáncer es cáncer de páncreas.

29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o el ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en donde un inhibidor de Wnt es un compuesto de la Fórmula (1 ): (1 ) o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, en donde: X1 , X2, X3 y X4 son seleccionados de N y CR7; uno entre Xs, X6, X7 y X8 es N y los otros son CH; X9 se selecciona a partir de N y CH; Z se selecciona de fenilo, pirazinilo, piridinilo, piridazinilo y piperazinilo; en el que cada fenilo, pirazinilo, piridinilo, piridazinilo o piperazinilo de Z está opcionalmente sustituido con un grupo R6; R1 , R2 y R3 son hidrógeno; m es 1 ; R4 se selecciona a partir de hidrógeno, halo, difluorometilo, trifluorometilo y metilo; R6 se selecciona de hidrógeno, halo y -C(O)R1°; en el que R10 es metilo; y R7 se selecciona a partir de hidrógeno, halo, ciano, metilo y trifluorometilo.

30. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o el ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en donde un inhibidor de Wnt es un compuesto seleccionado del grupo de: N-[5-(3-fluoro-fenil)-pmdm-2-M]-2-[5-metil-6-(piridazin-4- M)-piridin-3-il]-acetamida; 2-[5-metil-6-(2-metilpiridin-4-il)-piridin-3-il]-N-[5-(pirazin- 2-il)-piridin-2-il]-acetamida; N-(2,3’-bipirid¡n-6,-il)-2-(2',3-dimet¡l-2,4,-b¡p¡rid¡n-5-¡l)-acetamida; N-(5-(4-acetilpiperazin-1 -il)-piridm-2-il)-2-(2'-metil-3- (tnfluorometil)-2,4'-bipiridin-5-il)-acetamida; N-(5-(4-acetilpiperazin-1 -il)-piridin-2-il)-2-(2'-fluoro-3-metil-2,4,-bipiridin-5-M)-acetamida; y 2-(2'-fluoro-3-metil-2,4'-bipiridin-5-il)-N-(5-(pirazin-2-il)-piridin-2-il)-acetamida; o una sal farmaceuticamente aceptable de las mismas.