CN101687005A - 采用抑制Wnt 16信号转导的试剂治疗癌症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制细胞生长的方法，尤其是过表达Wnt 16蛋白的细胞。本方法包括使细胞与结合Wnt 16的mRNA或Wnt 16蛋白的试剂接触，该试剂干扰Wnt 16的信号转导或抑制Wnt 16蛋白与其它蛋白质(例如Frizzled受体)的结合。

Description

采用抑制Wnt 16信号转导的试剂治疗癌症的方法

对相关申请的交叉参考

本申请要求2004年7月9日提交的临时申请60/586,564和2005年1月20日提交的临时申请60/645,709的优先权，每一申请以其全文纳入本文以供参考。

技术领域

本发明涉及抑制过表达Wnt 16蛋白的癌细胞生长的方法。所述方法包括使细胞与结合Wnt 16的mRNA或Wnt 16蛋白、干扰Wnt 16的信号转导或抑制Wnt 16蛋白与其它蛋白质(例如Frizzled受体)的结合的试剂接触。

背景技术

肺癌是美国和全世界癌症死亡的主要原因，美国每年约有＞170,000例的新诊断病例，而世界范围内则几乎可达1百万例(Minna等，Cancer Cell.1(1)：49-52(2002))。虽然肺癌治疗在过去的几十年中取得了有力的进展，但其5年存活率仍保持低于15％(Minna等，Cancer Cell.1(1)：49-52(2002))。肺癌分为两组：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC(全部癌症中的75-80％)由3种主要的类型组成：腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌(Minna，(2002))。肺癌和鳞状细胞癌在所有肺癌中占60-70％。在晚期疾病中已采用的外科疗法、化疗和放疗通常效果不佳。提高肺癌治疗的疗效是公共卫生中的一个主要目标。

恶性胸膜间皮瘤(MPM)是一种主要从肺部的胸膜内衬(pleural lining)产生的高侵入性和高挑战性癌症。美国每年约有3,000名患者被诊断患有MPM，预期这种肿瘤的发病率在下一时期将大幅提高，并在2020年左右达到高峰(Thatcher，肺癌45增刊1：S1-2(2004))。由于MPM通常在晚期中存在，几乎不可能采取手术切除治疗。放疗作为单一治疗模式不能显现出治疗效果，给予化疗则极大地受到晚期的限制而疗效有限(Kindler，肺癌45增刊1：S125-7(2004))。也类似地证实基于胸膜注射重组细胞因子的其它策略并不令人满意(Berd等，肺癌45增刊1：S 129-31(2004))。由于目前的干预只能提供有限的效果且总的存活率很低，迫切需要在对MPM根本分子机理的进一步理解的基础上开发出新的治疗剂。

肺癌和MPM的分子发病机理包括多种基因(涉及显性癌基因和隐性肿瘤抑制基因)的表达和功能的改变，以及细胞信号转导途径的异常。对于肺癌和MPM发病机理分子机理的更好理解应可改善对肺癌患者的治疗。

分泌的糖蛋白的无翅型(Wnt)家族是一组发育过程和肿瘤发生中广泛涉及的信号转导分子(Polakis，Genes Dev.14：1837-51(2000)；Lustig等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.129：199-221(2003))。已深入鉴别了19种人Wnt蛋白。Wnt信号的转导由Wnt配体与2个不同家族的细胞表面受体(Frizzled(frizzled，Fz)受体家族和LDL受体相关蛋白(LRP)家族)的结合引发(Akiyama，Cytokine Growth FactorRev.11：276-82(2000))。Wnt信号转导在胞内活化dishevelled(Dvl)蛋白，抑制β-连环蛋白的糖元合成酶激酶-3β(GSK-3β)磷酸化，从而导致其具有细胞溶质稳定性。然后，稳定化的β-连环蛋白进入细胞核，与LEF/TCF转录因子结合。β-连环蛋白-Tcf/Lef诱导重要下游靶基因的转录，其中有许多基因涉及癌症。缺乏Wnt信号时，游离的细胞溶质性β-连环蛋白结合入由Axin、腺瘤性结肠息肉病(APC)基因产物和糖元合成酶激酶(GSK)-3β组成的复合物中。通过GSK-3β进行的Axin、APC和β-连环蛋白的联合磷酸化指定β-连环蛋白进入泛素途径，并通过蛋白酶体降解(Uthoff等，Int J Oncol，19(4)：803-10(2001)；Matsuzawa等，Mol Cell 7(5)：915-26，2001)。

Dishevelel(Dvl)是位于Frizzled受体下游和β连环蛋白上游的Wnt信号转导正性媒介。GSK-3使Wnt途径中的多种蛋白质磷酸化，有助于β-连环蛋白下游调控。APC基因的突变是偶发性和遗传性结肠直肠肿瘤发生的起始事件。APC突变体与肿瘤发生相关，这是由于该异常蛋白是Wnt信号转导级联(cascade)中的整合部分。蛋白质产物包含用作β-连环蛋白结合和降解位点的多个功能性结构域。发生在β-连环蛋白氨基端部分的突变通常涉及到磷酸化依赖的泛素介导的降解，并由此使β-连环蛋白稳定。当稳定化的细胞质连环蛋白聚集时，其转位到核，并与调节癌基因(例如c-myc)表达的转录因子的Tcf/Lef高移动组相互作用。

已知Wnt/β-连环蛋白信号转导在各种细胞类型中促进细胞存活(Orford等，J Cell Biol，146(4)：855-68(1999)；Cox等，Genetics 155(4)：1725-40(2000)；Reya等，Immunity 13(1)：15-24(2000)；Satoh等，Nat Genet 24(3：245-50(2000)；Shih等，Cancer Res 60(6)：1671-6(2000)；Chen等，J Cell Biol，152(1)：87-69(2001)；Ioannidis等，Nat_Immunol 2(8)：691-7(2001))。Wnt信号途径也被认为与肿瘤的发展和/或进展相关(Bienz等，Cell，103(2)：311-20(2000)；Cox等，Genetics，155(4)：1725-40(2000)；Polakis等，Genes Dev，14(15)：1837-51(2000)；You等，J Cell Biol，157(3)：429-40(2002))。Wnt信号途径的异常活化与多种涉及c-Myc过表达或扩增的人类癌症相关(He等，Science，281(5382)：1509-12(1998)；Miller等，Oncogene，18(55)：7860-72(1999)；Bienz等，Cell，103(2)：311-20(2000)；Polakis等，Genes Dev，14(15)：1837-51(2000)；Brown等，乳腺癌Res，3(6)：351-5(2001))。此外，c-Myc被鉴别为结肠直肠癌细胞中β-连环蛋白/Tcf的转录靶基因之一(He等，Science，281(5382)：1509-12(1998)；Miller等，Oncogene，18(55)：7860-72(1999)；You等，J Cell Biol，157(3)：429-40(2002))。

除了Wnt配体之外，已经分离了分泌型Frizzled相关蛋白(secretedFrizzled-related proteins，sFRP)家族。sFRP似乎可以通过与跨膜Frizzled受体竞争结合分泌型Wnt配体而作为Wnt信号转导的可溶的内源性调控子发挥作用(Melkonyan等，Proc Natl Acad Sci USA，94(25)：13636-41(1997))。sFRP可以通过结合Wnt蛋白并阻碍它接近其细胞表面信号转导受体来拮抗Wnt功能，或可以通过促进配体向Frizzled受体的递呈来增强Wnt活性(Uthoff等，Int J Oncol，19(4)：803-10(2001))。sFRP似乎调节了凋亡敏感性，对程序性细胞死亡产生了拮抗效果。目前，还没有将sFRP与癌症作因果联系。然而，据报道sFRP在结肠直肠癌细胞系中发生高频度的超甲基化，而该超甲基化与基础sFRP表达的缺乏相关(Suzuki等，Nat Genet 31(2)：141-9(2002))。

发现另一种称为Dickkopf(Dkk)的蛋白也干扰Wnt信号转导并减少胞质β-连环蛋白的积累(Moon等，Cell，88(6)：725-8(1997)；Fedi等，J Biol Chem，274：19465-72(1999))。Dkk-1通过与Frizzled受体邻近的LDL受体相关蛋白6(LRP6)的结合拮抗Wnt诱导的信号(Nusse等，Nature，411(6835)：255-6(2001))。还发现Dkk-1的过表达能使脑瘤细胞对凋亡敏感化(Shou等，Oncogene，21(6)：878-89(2002))。

Wnt蛋白对细胞增殖和肿瘤生长的作用似乎取决于Wnt蛋白与其关联细胞表面受体的相互作用以及随后诱导的下游信号转导。以Wnt蛋白为分泌配体，可用抗体干扰或抑制Wnt与其细胞表面受体的结合，从而影响下游信号转导。已经产生了抗Wnt蛋白的几种抗体。例如，抗Wnt 1(G-19)(sc-6280；Santa CruzBiotechnology，Inc.)和抗Wnt 2(H-20)(sc-5208；Santa Cruz Biotechnology，Inc.)分别是针对作图(mapping)在人Wnt 1和Wnt 2蛋白的N末端附近的肽而产生的山羊多克隆抗体。Wnt 2(V-16)是针对作图在人来源的Wnt2的内部区域中的肽产生的山羊多克隆抗体(sc-5207；Santa Cruz Biotechnology，Inc.)。抗Wnt 1和抗Wnt 2抗体在WO2004/032828中也有描述。

涉及Wnt蛋白的另一感令人兴趣的领域是通常以可决定预后和治疗选择的易位为特征的急性白血病。最近报道了急性髓性白血病中的易位可活化Wnt信号转导途径(Muller-Tidow等，Mol Cell Biol 24：2890-4(2004))。在这些染色体异常中，t(1；19)易位导致显现出癌基因特性的嵌合E2A-Pbx1蛋白的产生(Kamps等，Genes Dev 5：358-68(1991))。已广泛地表征了E2a-Pbx1的分子特性，并鉴别出了多种候选靶基因。最近在Wnt 16的研究中取得了进展。在含有融合蛋白的白血病细胞系和含有其它的缺乏E2a-Pbx1的细胞系中进行了代表性差别分析，鉴别出Wnt16为假定的靶基因(Mc Whirter等，Proc Natl Acad Sci USA，96：11464-69(1999))。此外，白血病集落的基因表达分布显示Wnt 16在表达E2A-Pbx1的白血病中显著过表达(Ross等，Mol Cell 12：393-400(2003))。然而，迄今为止还未揭示Wnt 16和Wnt相关蛋白在急性白血病中所起的特殊作用。

最近还鉴别到了Wnt 16的两种同工型，即Wnt 16a和Wnt 16b(Fear等，Biochem Biophys Res Commun 278：814-820(2000))。这些同工型似乎是由编码5′端有所不同的同工型Wnt 16蛋白的不同同工型mRNA产生的。在胰腺中观察到了明显水平的Wnt 16a表达，而Wnt 16b的表达则更为普遍，在成年肾脏、胎盘、大脑、心脏和脾脏中的水平表达最高(Fear等，Biochem Biophys Res Commun278(3)：814-20(2000))。在外周淋巴器官(例如脾脏、阑尾和淋巴结)中也观察到Wnt 16的表达，但未在骨髓中观察到(Mc Whirter等，Proc Natl Acad Sci USA，96(20)：11464-9(1999))。然而，在获自前B急性成淋巴细胞性白血病(ALL)患者的骨髓和细胞系中观察到高水平的Wnt 16，提示Wnt 16的异常表达是t(1∶19)前B ALL发展的关键步骤(McWhirter等，Proc Natl Acad Sci USA，96(20)：11464-9(1999))。与正常B细胞相比，在B细胞急性淋巴细胞白血病(CLL)中也观察到Wnt 16的较高表达(Lu等，Proc Natl Acad Sci USA，101(9)：3118-23(2004))。

尽管在对Wnt信号转导的理解中取的了最新的进展，但对Wnt 16信号途径的作用，尤其是各Wnt 16同工型在肿瘤形成中的各自作用仍不清楚，需要得到解释说明。因而，在先的技术无法提供调控Wnt 16途径的化合物能够用于治疗过表达Wnt 16的细胞，尤其是癌症细胞的明确证据。本发明致力于解决这些问题及其它需求。

发明概述

本发明基于(至少部分基于)大部分的儿童前B急性成淋巴细胞性白血病(ALL)中的Wnt 16基因通过t(1∶19)染色体易位而活化这一发现。t(1∶19)易位产生了导致Wnt 16基因(通常是Wnt 16b基因)异常活化的嵌合转录因子(E2A-Pbx1)。然后，Wnt 16以自分泌(autocrine)形式发挥作用，扰乱其正常的细胞功能并导致前B ALL。

本发明提供了一种抑制过表达Wnt 16的细胞增殖的方法。本方法包括使细胞与足以抑制该细胞增殖的量的抑制Wnt 16信号转导的试剂接触。

在一些实施方式中，所述细胞是癌细胞。所述癌细胞选自：肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、结肠癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤或非小细胞肺癌细胞。

优选的癌细胞是白血病细胞，尤其是那些包含t(1；19)易位的白血病细胞。在一些实施方式中，所述白血病细胞是急性成淋巴细胞样细胞、前B细胞急性成淋巴细胞样白血病细胞或B细胞急性淋巴性白血病细胞。

另一种优选的癌细胞是肺癌细胞。同样优选的是乳腺癌细胞。

在一个实施方式中，所述试剂是siRNA。在一些实施方式中，所述试剂是抗Wnt 16抗体，例如，特异性结合Wnt 16蛋白(尤其是人Wnt 16蛋白)的抗体。

优选的是结合包含以下所示氨基酸序列的多肽的抗Wnt 16抗体：SEQ IDNO：3；SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15；或SEQ ID NO：16。

本发明还提供特异性与由对应于人Wnt 16(SEQ ID NO：2)的1-99氨基酸残基的氨基酸序列组成的多肽结合的抗Wnt16抗体。另一抗Wnt16抗体特异性与由人Wnt16(SEQ ID NO：2)的1-99残基组成的多肽结合。

还优选与特异性结合于包含以下所示氨基酸序列的多肽的第二抗Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白的抗Wnt 16抗体：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：4；SEQID NO：5；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9；SEQ IDNO：10；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQID NO：15；或SEQ ID NO：16。

另一优选的抗Wnt 16抗体是与特异性结合于由对应于人Wnt 16(如SEQ IDNO：2所示)1-99氨基酸残基的氨基酸序列组成的多肽的第二抗Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白的抗体。另一抗Wnt 16抗体与特异性结合于由对应于人Wnt16(如SEQ ID NO：2所示)1-99氨基酸残基组成的多肽的第二抗Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白。

本发明的抗体可为多克隆或单克隆抗体，并可以多种方式制备和修饰。例如，该抗体可为重组生产的抗体。优选的是抗Wnt16单克隆抗体，如小鼠单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗Wnt 16抗体是嵌合抗体、人源化抗体、单链Fv片段或全长人抗体。尤为优选的是人抗Wnt 16 Fab抗体。

可在体外和/或体内实施本发明的方法。

本发明还提供了治疗癌症的医治方法。在这些实施方式中，癌细胞在患者体内，接触细胞的步骤是通过给予患者所述的试剂进行的。该方法还可包括给予患者第二治疗剂，例如化疗剂或放疗剂。

本发明还提供了一种诱导过表达Wnt 16的细胞凋亡的方法。该方法包括使细胞与足以诱导该细胞凋亡的量的抑制Wnt 16信号转导的试剂接触。在另一方面，提供了一种在细胞中抑制Wnt 16信号转导的方法。该方法包括使细胞与足以抑制Wnt 16信号转导的量的抗Wnt 16抗体或Wnt 16 siRNA接触。

在本发明的优选实施方式中，提供了一种治疗Wnt 16信号转导相关疾病的方法。该方法包括给予需要该治疗的对象足以治疗该疾病的量的抑制Wnt 16信号转导的试剂。该试剂可为抗Wnt 16抗体或Wnt 16 siRNA。所述疾病可为癌症，优选选自下组的癌症：肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、结肠癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、白血病、淋巴瘤或非小细胞肺癌细胞。

此外，本发明提供了一种检测获自患者的生物样品中过表达Wnt 16的细胞的方法，该方法包括生物样品中Wnt 16表达水平的步骤。优选的生物样品是血液、唾液、尿液或粪便，尤为优选的是血清。

在本方法的另一方面，通过检测Wnt 16 mRNA水平来进行检测Wnt 16表达水平这一步骤。Wnt 16mRNA可为Wnt 16a、Wnt 16b或Wnt 16c mRNA。在另一方面，通过检测Wnt 16蛋白的水平来进行检测Wnt 16表达水平这一步骤。

可将对Wnt 16表达的检测用于预测患者或个体对治疗方案的反应。在一个实施方式中，所述治疗方案包括给予患者单克隆的抗Wnt 16抗体。

另外，本发明提供了包含抗Wnt 16抗体或Wnt 16siRNA和药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂的药物组合物。还可将该抗体与效应物成分(例如荧光标记、放射性同位素或细胞毒性化学物)结合使用。

本发明的方法、抗体、药物组合物以及试剂盒包括了本文所述的特例。

附图说明

图1显示了Wnt 16同工型的氨基酸序列比对。SEQ ID NO：1对应于GenBank登录号NP_057171；SEQ ID NO：20对应于GenBank登录号EAL24346；SEQ IDNO：22对应于GenBank登录号ADD 3380352；SEQ ID NO：2对应于GenBank登录号NP_476509，AAD 49351，Q9UBV4和EAL24347。″*″表示在所示4种序列中均相同的氨基酸残基。″·″表示在SEQ ID NO：1、20和21中相同，但不同于SEQID NO：2的序列。本文所述的抗原肽用下划线表示。用于产生本文所述人Fab的Wnt 16的1-99氨基酸残基用黑体表示。

图2显示了白血病细胞系中Wnt信号途径的基因表达分布。图A.首先从白血病细胞系中提取RNA。697和RCH-ACV都含有t(1；19)易位，而CCL-119不含该易位，将其作为对照。此处仅显示了获自CCL-119和697的数据。提取后，对RNA进行反转录酶反应，用生物素-16-dUTP标记cDNA探针，与Wnt特异性阵列杂交。采用化学发光反应并将膜在X射线胶片上曝光进行检测。用黑色方块围绕Wnt 16。在阵列中，用黑圈环绕在含t(1；19)的细胞系中上调的基因。图B.对应于生产商提供的GEArry Q系列人Wnt信号途径阵列的基因列表进行数据匹配。图C.描述了在两种细胞系中均上调和下调的基因。

图3显示了白血病细胞系中Wnt 16的表达。图A.采用Wnt 16a特异性引物(阴性结果，未示出)和Wnt 16b特异性引物，对四种细胞系(697和RCH-ACV含有t(1；19)易位，而CCL-119和NALM-6则不含该易位)进行RT-PCR。所扩增的人Wnt 16b片段的长度为236bp。采用肌动蛋白引物扩增β-肌动蛋白作为对照。图B.还进行了蛋白质印迹分析。提取获自所有4种细胞系的蛋白质，对等量(20-30微克/泳道)的蛋白质进行免疫电泳，用市售抗Wnt 16的多克隆抗体标记。图C.通过序列分析验证了(a)中扩增的PCR条严格对应于Wnt 16b。显示了已知不同于Wnt 16a第一外显子的Wnt 16b第一外显子的一部分。

图4显示了siRNA对Wnt 16b的抑制。图A.用Wnt 16b特异性siRNA转染细胞(对照：非沉默性siRNA；16a：Wnt 16a特异性siRNA；16b：Wnt 16b特异性siRNA)，三天后提取RNA，定量并采用与前述相同的引物进行RT-PCR。将肌动蛋白作为对照。根据相同的步骤对相同的细胞进行转染。转染3天后提取蛋白质，用抗Wnt 16多克隆抗体进行蛋白质印迹。图B.用对照siRNA、Wnt 16asiRNA和Wnt 16b siRNA转染细胞，3天后如实施例中所述，采用流式细胞计量术进行凋亡分析。以获自4个独立试验的数据计算凋亡细胞率的平均值。柱状图表示平均凋亡率，误差棒表示SD。报告了用流式细胞计量术进行的凋亡分析。X轴(FL1-H)表示膜联蛋白V-FITC染色，Y轴(FL-3H)表示碘化丙锭(PI)染色。上排显示了用对照siRNA处理的细胞系，下排显示了用Wnt 16b siRNA处理的相同的细胞系。图C.用对照siRNA、Wnt 16a siRNA和Wnt 16b siRNA转染细胞系，转染3天后提取蛋白质，如实施例所述地用dvl-2，β-连环蛋白和存活素抗体进行蛋白质印迹分析。进行了肌动蛋白印迹作为对照。进行了3次这些试验，获得了类似的结果。图D.如前所述进行Wnt信号传导特异性阵列研究。Wnt 16bsiRNA转染后，CCL-119和697细胞系中显示出一些差异表达的基因。将非沉默性siRNA用作对照。

图5显示了由Wnt 16抗体通过经典Wnt途径诱导的凋亡。用小鼠抗Wnt 16抗体(BD Pharmingen)处理NALM-6和RCH-ACV细胞。将细胞接种入6孔板，于次日进行如下处理：如实施例中所述，对照抗体(白色柱)，单独的Wnt 16抗体(浅灰色柱)和Wnt 16抗体加Wnt 16cDNA(深色柱)。处理后4天，收集细胞，用碘化丙锭和膜联蛋白V-FITC染色，进行流式细胞计量。由三个独立的试验计算平均值。柱状图显示了凋亡率的平均值，误差棒是s.d.。

图6显示了测试本文所揭示的人抗Wnt 16 Fab的生物活性和特异性的ELISA分析。各Fab克隆用数字582-589表示。

图7显示了用流式细胞计量术测定的与RCH-ACV细胞表面结合的人抗Wnt16 Fab。

图8显示了由抗Wnt 16抗体通过经典Wnt途径诱导的凋亡。图A.用定制的人Wnt 16抗体(Fab克隆#584；参见实施例)处理CCL-119和RCH-ACV细胞。将细胞接种于6孔板中，于次日进行如下处理：对照抗体，1微克/ml的Wnt 16抗体和5微克/ml的Wnt 16抗体。处理后4天，收集细胞，用碘化丙锭和膜联蛋白V-FITC染色，进行流式细胞计量。由三个独立的试验计算凋亡细胞率的平均值。柱状图显示了凋亡率的平均值，误差棒是SD。图B.在Wnt 16抗体处理4天后提取蛋白质，采用抗β-连环蛋白、存活素和dvl-2的抗体进行蛋白质印迹分析。

图9显示了用小鼠抗Wnt 16多克隆抗体在人肺癌细胞系H460中进行处理后对凋亡细胞死亡的诱导。不用抗体(未处理)、用对照IgG抗体(对照Ab；5微克/ml)或用抗Wnt 16多克隆抗体(Wnt 16Ab；5微克/ml；BD Pharmingen)处理H460细胞3天。用流式细胞计量术进行凋亡分析。用抗Wnt 16单克隆抗体处理在75.9％的细胞中诱导了凋亡，与之相比，未处理细胞或用对照IgG抗体处理所观察到的分别为5.59％和5.86％。

图10显示了用人抗Wnt 16抗体(Fab克隆#585)在人肺癌细胞系H460中进行处理后对凋亡细胞死亡的诱导。不用抗体(未处理)、用对照IgG抗体(对照Ab；5微克/ml)或用抗Wnt 16抗体(Wnt 16Ab；5微克/ml；Fab克隆#585)处理H460细胞3天。用流式细胞计量术进行凋亡分析。用抗Wnt 16Fab克隆#585处理在37.3％的细胞中诱导了凋亡，与之相比，用对照IgG抗体处理的细胞中则为7.92％。

图11显示了采用Wnt 16多克隆抗体对不同人细胞系中的Wnt 16蛋白进行的蛋白质印迹分析。所测试的细胞包括白血病细胞系697、NB4和RCH-ACV；结肠癌细胞系SW480；间皮瘤细胞系H28；肺癌细胞系H460、H1703和A549；以及正常间皮细胞系，LP9。

图12显示了用RT-PCR分析的非小细胞肺癌和细胞系中的Wnt 16表达。图A.697是一种已知表达Wnt 16的白血病细胞系(阳性对照)；N和T代表获自同一患者的一对正常(N)和肿瘤(T)样品。″*″表示样品显示出指示Wnt 16表达的期望PCR片段。图B.肺癌细胞系H460和乳腺癌细胞系MCF7中的Wnt 16表达。图A和图B中的分子量标记是1-kb以上标记(1-kb plus marker，Invitrogen)。

定义

术语″Wnt蛋白″或″Wnt配体″是指与果蝇(Drosophila)体节极性基因(无翅型)相关的哺乳动物蛋白家族。在人类中，Wnt家族的基因通常编码38-43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白，该糖蛋白具有疏水信号序列和保守天冬酰胺连接的寡糖共有序列(Shimizu等，Cell Growth Differ 8(12)：1349-58(1997))。Wnt家族包括至少21个哺乳动物成员。示例性的Wnt蛋白包括：Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、WNT10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15、Wnt 16a、Wnt 16b和Wnt16c。本发明的优选Wnt蛋白是Wnt16a、Wnt 16b和Wnt 16c，优选的是人Wnt16a、Wnt16b和Wnt 16c，它们的序列列于序列表中。除非另有说明，术语″Wnt 16″包括本文所述的Wnt 16同工型。

术语″frizzled蛋白″或″frizzled蛋白受体″是指与果蝇frizzled基因相关的哺乳动物蛋白家族，其在组织极性的发育中发挥作用。frizzled蛋白家族包括至少10种哺乳动物基因。示例性的人类frizzled蛋白受体包括：Frizzled1，Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled6、Frizzled7、Frizzled8、Frizzled9和Frizzled10。果蝇frizzled蛋白的哺乳动物同源体共有多个共同结构基序。位于细胞外膜表面的N末端后的是一个信号序列、一个含10个半胱氨酸残基的恒定分布型的120个氨基酸的结构域以及一个由40-100个高度变化的亲水性氨基酸构成的高度多样的区域。假定的疏水片段形成由亲水环连接的7次跨膜螺旋结构，以位于细胞膜内侧的C末端结束。所述的富含半胱氨酸的结构域(CRD)和跨膜片段是高度保守的，这表明了其中细胞外CRD通过可变的连接区域与一束7次跨膜螺旋结构相连的工作模式。因此，frizzled蛋白受体参与了类似于具有氨基端配体结合结构域的G-蛋白偶联受体的跨膜信号转导的动力学模型。例如，Frizzled1、Frizzled2和Frizzled7涉及肺癌和结肠直肠癌(Sagara等，BiochemBiophys Res Commun，252(1)：117-22(1998))；Frizzled3涉及包括肺癌、宫颈癌和结肠直肠癌的人类癌细胞(Kirikoshi等，Int J Oncol 19(4)：767-71(2001))；Frizzled7涉及胃癌(Kirikoshi等，Int J Oncol，19(4)：767-71(2001))；Frizzled10涉及胃癌和结肠直肠癌(Kirikoshi等，Int J Oncol，19(4)：767-71(2001)；Terasaki等，Int JMol Med，9(2)：107-12(2002))。

术语″Dishevelled″或″Dvl″是指Dishevelled蛋白家族成员，其全长序列通常含有3个保守结构域：一个存在于Wnt拮抗蛋白轴蛋白(Axin)上的DIX结构域；一个参与蛋白质之间相互作用的PDZ结构域；和一个在调节Rho GTP酶的蛋白质中发现的DEP结构域。Dvl蛋白包括，例如Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3。包括小鼠和人类在内的多个物种的Dvl的核酸和蛋白序列是已知的。示例性的人类Dvl-1、Dvl-2和Dvl-3蛋白序列可以分别通过参照序列NP_004412、NP_004413和NM_004414得到。

Wnt信号转导尤其是Wnt 16信号转导的″抑制剂″是指例如与Wnt或Frizzled蛋白结合、或在已知的Wnt信号转导的检测方法中(例如，β-连环蛋白水平测量，或由Tcf和Lef转录因子调控的癌基因的表达)测得的部分或完全阻碍Wnt信号转导的化合物。抑制剂包括修饰形式的Wnt或Frizzled蛋白，以及天然或合成的配体、拮抗剂、激动剂、抗体、小化学分子等等。后面对检测本发明抑制剂的方法作了更详细描述。

术语″过表达Wnt 16蛋白的细胞″、″过表达Wnt 16mRNA的细胞″、″过表达Wnt 16蛋白的癌细胞″或″过表达Wnt 16mRNA的癌细胞″或其语法等效形式指其中Wnt 16蛋白或Wnt 16mRNA的表达至少是来自相同组织的正常细胞中表达水平的2倍，经常是至少5倍的细胞或癌细胞。测定具体基因表达水平的方法是本领域内所熟知的。这样的方法包括RT-PCR、使用所述基因产物抗体等。

本文所用的″抗体″包括与具体抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，包括多克隆和单克隆抗体。该术语也包括诸如嵌合抗体(如人源化小鼠抗体)和杂合抗体(如双特异性抗体)等遗传工程形式的抗体。术语″抗体″也包括抗体的抗原结合形式，这包括具有抗原结合能力的片段(例如Fab’、F(ab’)₂、Fab、Fv和rIgG，也可参见Pierce公司(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)的目录和手册，1994-1995；也可参见Kuby所著《免疫学》第3版(Immunology，W.H.Freeman&Co.，New York(1998))。该术语也包括重组单链Fv片段(scFv)。术语″抗体″也包括二价或双特异性分子、双体(diabodies)抗体、三体(tribodies)抗体和四体(tetrabodies)抗体。以下文献中对二价和双特异性分子进行了描述，例如：Kostelny等，(1992)J Immunol 148：1547；Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry31：1579；Hollinger等，1993，同上；Gruber等，(1994)J Immunol：5368；Zhu等，(1997)Protein Sci 6：781，Hu等，(1996)Cancer Res.56：3055；Adams等，(1993)Cancer Res.53：4026；以及McCartney等，(1995)Protein Eng.8：301。

可以通过诸如在噬菌体或类似载体中的重组抗体文库的筛选等重组方法产生与具体抗原具有免疫反应性的抗体(可以参见Huse等，Science246：1275-1281(1989)；Ward等，Nature 341：544-546(1989)；以及Vaughan等，Nature Biotech.14：309-314(1996))，或通过用抗原或编码该抗原的DNA免疫动物产生所述的抗体。

通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每条重链和轻链包含一个恒定区和一个可变区(这些区域也称为″结构域″)。轻链和重链可变区包含4个″构架区″，其间插入了3个高变区(也称为″互补决定区″或″CDR″)。已经确定了构架区和CDR的范围。同种内不同的轻链或重链的构架区序列相对保守。抗体的构架区，即组成型轻链和重链的组合构架区使CDR在三维空间中定位和排列。

CDR主要负责与抗原表位结合。每条链的CDR经常被称为CDR1、CDR2和CDR3，按顺序从N末端开始编号，并通常也通过具体CDR所位于的链加以鉴别。因此，V_H CDR3位于其所在抗体的重链可变区上，而V_L CDR1是来自其所在抗体的轻链可变结构域的CDR1。

所提及的″V_H″或″VH″是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，这包括Fv、scFv、dsFv(二硫键稳定的Fv)或Fab的重链。所提及的″V_L″或″VL″是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链。

术语″单链Fv″或″scFv″是指其中的传统双链抗体的轻链和重链的可变区已连接形成单链的抗体。通常，在所述两条链之间插入连接肽，以使之正确折叠并建立活性结合位点。

″嵌合抗体″是一种免疫球蛋白分子，其中：(a)改变、取代或交换恒定区或其部分，从而使抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的种类的、效应物功能和/或物种的恒定区，或是赋予嵌合抗体全新功能的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等等)相连接；或(b)用具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、取代或交换可变区或其部分。

″人源化抗体″是含有源自非人类免疫球蛋白最小序列的免疫球蛋白分子。人源化抗体包括这样的人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的诸如小鼠、大鼠或兔等非人类种属(供体抗体)的CDR的残基所取代。在有些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区残基被相应的非人源残基所取代。人源化抗体也可以包含既不存在于受体抗体、也不存在于引入的CDR或骨架序列中的残基。通常，人源化抗体将基本上包括至少一个，通常是两个全部的可变结构域，其中全部的或基本上全部的CDR区域对应于非人类免疫球蛋白的CDR区域，并且全部的或基本上全部的构架(FR)区是人免疫球蛋白共有序列的构架区。人源化抗体优选还将包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分((Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992))。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))。从而，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于一个完整的人的可变结构域已被来自非人类种属的相应序列所取代。

术语″完全人抗体″指除人构架区和恒定区以外还包含人可变区的免疫球蛋白。可用本领域已知的各种技术生产这种抗体。例如，体外方法包括采用在噬菌体(如，McCafferty等，1990，Nature 348：552-554；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；和Marks等，J.Mol.Biol.222：581(1991))、酵母细胞(Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol 15：553-557)或核糖体(Hanes和Pluckthun，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94：4937-4942)上展示的人抗体片段的重组文库。相似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转基因动物(如小鼠)制备人抗体。攻击后，观察人抗体产生情况，所产生抗体在所观察的各个方面(包括基因重排、组装和抗体的所有组成成分)都非常类似于人体中产生的抗体。此方法参见例如：美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及以下科学文献：如Jakobavits，Adv Drug Deliv Rev.31：33-42(1998)，Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。

″表位″或″抗原决定簇″是指抗原上结合抗体的位置。表位可以是由邻接的氨基酸或不邻接的氨基酸通过蛋白的三级折叠并置形成的。由邻接的氨基酸构成的表位通常在与变性溶剂接触下得以保持，而由三级折叠形成的表位在变性溶剂处理下通常会丧失。表位典型地包括一个独特的空间构象中的至少3个，以及更为常见地至少5个或8-10个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括，例如，X射线结晶照相术和2维核磁共振。参见例如Glenn E.Morris主编的《分子生物学方法中的表位作图法》第66卷(Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，1996))。

本文所用的″生物学样品″是指包含核酸或多肽(例如Wnt蛋白)、多核苷酸或转录物的生物组织或体液的样品。这样的样品包括但不限于分离自灵长类(例如人)或啮齿类(例如小鼠和大鼠)的组织。生物学样品也可以包括组织切片，诸如活检组织切片和剖检切片样品、出于组织学目的获取的冷冻切片、血液、血浆、血清、唾液、粪便、眼泪、粘液、头发、皮肤等等。生物学样品还包括源自患者组织的移植物以及初级的和/或转化的细胞培养物。生物学样品典型地得自真核有机体，最优选得自如灵长类(例如黑猩猩或人)、牛、狗、猫、啮齿类(例如豚鼠、大鼠、小鼠)、兔等哺乳动物；或鸟类；爬行动物；或鱼类。

“提供一种生物学样品”是指获得一种用于本发明所述方法的生物学样品。最常见地，这可以通过从动物，优选人中取出细胞样品完成，不过也可以通过使用事先分离的细胞(例如，由其他人、在其它时候和/或为其它目的分离的细胞)、或通过在活体内实行本发明的方法得以完成。具有治疗或治疗结果历史的存档的组织会是尤其有用的。

生物样品中“Wnt 16 mRNA水平”指由细胞或生物样品中存在的Wnt 16基因转录出的mRNA的量。此mRNA通常编码有功能的Wnt 16蛋白，但也可能存在改变或消除编码蛋白功能的突变。“Wnt 16mRNA水平”不必定量，但可简单地检测，如由人主观观察检测，与或不与对照样品水平或对照样品的预计水平作比较。

生物样品中“Wnt 16蛋白或多肽的水平”指翻译自细胞或生物样品中存在的Wnt 16mRNA的多肽的量。此多肽可具有或不具有Wnt 16蛋白功能。“Wnt 16蛋白水平”不必定量，但可简单地检测，如由人主观观察检测，与或不与对照样品水平或对照样品的预计水平作比较。

在两个或多个核酸序列或多肽序列的情况下，术语“相同的”或“相同性”是指如使用下述默认参数的BLAST或BLAST2.0序列比较运算法则或通过手工对齐排列并目测(参见例如，Altschul等，Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))测得的，相同的或具有特定百分数的氨基酸残基或核苷酸(即，当在一个对比窗口或指定区间上作最大对应度比较和比对时，在特定区域上约60％相同，优选70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两条或多条序列或亚序列。这样的序列则被称为“基本上相同的”。这一定义也涉及，或可以用于，对待测序列的评价。这一定义也包括具有缺失和/或添加，以及那些具有置换的序列，以及天然的(例如多态性或等位基因变体)和人造的变体。如下所述，优选的运算法则可以计算缺口等等。优选地，相同性存在于长度至少为约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地，存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

为了序列比对，通常以一条序列作为参照序列，待测序列与其比对。在使用一种序列比对算法时，待测的和参照序列被输入计算机，如果需要则指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认的程序参数，或可以指定另外的参数。序列比对算法随后在程序参数的基础上计算待测序列相对于参照序列的序列相同性百分比。

本文所用的“比对窗口”包括从通常包括20到600、经常是约50到200、更常见的是约100到150的组中选择的邻接位置的编号之一的片段，其中序列可以与具有相同邻接位置编号的参照序列在两段序列最优化对齐后进行比对。序列对齐排列用于比对的方法是本领域内熟知的。用于比对的最佳对齐排列可以通过，例如Smith&Waterman在Adv.Appl.Math.2：482(1981)中报道的局部同源度算法、通过Needleman&Wunsch在J.Mol.Biol.48：443(1970)中报道的同源排列算法、通过Pearson&Lipman在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)中报道的搜寻相似性的方法、通过这些算法的计算机化运用(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)、或通过手工排列和目测(参见，例如Ausubel等人主编的《分子生物学现有实验方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，1995增刊)进行。

适合于确定序列相同性和序列相似性百分比的优选实施方式包括BLAST和BLAST 2.0算法，这些算法在Altschul等，Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中作了描述。使用本文所述的参数，采用BLAST和BLAST 2.0来确定本发明的核酸与蛋白的序列相同性百分比。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心向公众开放。这一算法包括通过鉴别查询序列中的W长度的短字段，该短字段与数据库序列中相同长度的字段对齐排列时，两者相匹配或满足一定的正值阀值T，由此首先鉴别高分值的序列对(HSPs)。T作为邻近字段分值界限(Altschul等，同上)。这些初始邻近字段命中作为启动搜寻将其包含在内的更长的HSPs的依据。只要累积的排列分值能够提高，字段命中就沿每条序列往两侧延伸。例如对于核苷酸序列而言，累积的分值使用参数M(对一对匹配的残基的加分；总是大于0)和N(对不匹配残基的扣分；总是小于0的)进行计算。对于氨基酸序列来说，使用计分矩阵计算累计的分值。字段命中在每个方向上的延伸在以下情况下中断：累计排列分值从其达到的最高值下跌了X数量；由于一个或多个负得分残基排列的累积导致累计分值达到0或更低；或达到了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定对齐排列的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)作为默认值使用字段长度(W)值11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，并对双链进行比对。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序作为默认值使用字段长度3、期望值10以及BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))排列值(B)50、期望值10、M＝5、N＝-4，并对双链进行比对。

BLAST算法也进行两条序列间相似性的统计学分析(例如参见Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似度的一种量度是最小概率和(P(N))，它提供了一种两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然匹配的概率的指标。例如，如果在待测序列与参照序列的比对中最小概率和小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001时，一条核酸被认为与参照序列相似。对数值可以是大负数，例如5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170等等。

两个核酸序列或多肽几乎相同的一个标志是由第一条核酸编码的多肽与用第二条核酸编码的多肽所产生的抗体发生如下所述免疫交叉反应。因而，例如当两段肽只有保守性置换的差异时，一条多肽通常与第二条多肽几乎相同。两个核酸序列几乎相同的另一个标志是所述两个分子或其互补链在如以下所述的严格条件下互相杂交。两个核酸序列几乎相同的另一个标志是可以使用相同的引物扩增所述序列。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯净的”是指与其天然状态下被发现通常伴随的成分几乎或基本分开的材料。纯度和同质度通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术确定。制剂中主要的种类的蛋白或核酸被充分纯化。具体地说，分离的核酸是与一些与所述基因天然旁侧相连，而且所编码蛋白与所述基因编码蛋白不同的开放阅读框分离的。在有些实施方式中，术语“纯化的”表示核酸或蛋白在电泳胶上基本上产生单一条带。优选地，这表示所述核酸或蛋白纯度至少85％、更优选至少95％、最优选至少99％。在其它实施方式中，“进行纯化”和“纯化”表示从要纯化的组合物中去除至少一种杂质。就这种意义而言，纯化不要求经纯化的化合物是同质的，例如100％纯净的。

术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”在这里是可以交替使用的，是指氨基酸残基的聚合物。这一术语用于其中一个或多个氨基酸残基是对应于天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物、包含修饰的残基以及非天然氨基酸的聚合物。

术语“氨基酸”指天然的和合成的氨基酸，以及功能类似于天然氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是指那些由遗传密码编码的氨基酸以及那些随后被修饰的氨基酸(例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酰胺和O-磷丝氨酸)。氨基酸类似物指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构(例如，与1个氢原子、1个羧基、1个氨基和1个R基相连的α碳原子)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲锍。这样的类似物可以具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保持了如天然氨基酸一样的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸通常化学结构的结构，但其功能类似于天然氨基酸的化合物。

本文中的氨基酸可以用其通常使用的IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示或3字母符号表示。同样地，核苷酸可以用其通用的单字母编码表示。

“保守修饰变体”用于氨基酸和核酸序列。对于具体的核酸序列而言，保守修饰变体是指那些编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列，指基本相同或相关的序列，例如天然邻接的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能上相同的核酸编码大部分蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在每个由一个密码子确定丙氨酸的位置上，该密码子可以改为所述的另一个密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变体是“沉默变体”，是保守修饰变体的一种类型。本文所述每个编码多肽的核酸序列也描述了该核酸的沉默变体。本领域技术人员应当认识到，在某些情况下，核酸中的每种密码子(除了AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，通常包括编码多肽的核酸的沉默变体是隐含地关于表达产物而无关于实际探针序列来描述的。

对于氨基酸序列而言，本领域技术人员应当认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行个别的改变、添加或删除，从而在编码序列中改变、增加或删除单个氨基酸或低百分比氨基酸的是一种“保守修饰变体”，只要所述的改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域内所熟知的。这样的保守修饰变体是对本发明中多态性变体、种间同源物和等位基因的补充而不是排斥。典型地相互保守置换是：1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton所著《蛋白质》(Proteins，1984))。

可从多个水平的结构来描述诸如多肽结构的大分子结构。对这一结构的全面讨论，可以参见例如Alberts等所著《细胞分子生物学》第3版(Molecular Biologyof the Cell(第三版，1994))以及Cantor&Schimmel所著《生物物理化学》第一部分：《生物大分子构象》(Biophysical Chemistry Part I：The Conformation ofBiological Macromolecules(1980))。“初级结构”是指氨基酸序列的具体的肽。“二级结构”是指多肽中局部有序的三维结构。这些结构通常称为结构域。结构域是通常形成紧凑单位的多肽的一部分，并且通常长度为25到大约500个氨基酸。典型的结构域由诸如β-折叠和α-螺旋等更小结构水平的结构部分构成。“三级结构”是指多肽单体完整的三维结构。“四级结构”是指通常通过独立的三级单位的非共价连接形成的三维结构。各向异性的术语也称为能量术语。

“标记”或“可检测部分”是能通过分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的合成物。例如，有用的标记包括荧光染料、电子密度试剂、酶(如经常用于ELISA的)、生物素、地高辛或半抗原以及蛋白质或其他能够通过例如将放射性标记掺入肽中而进行检测的，或能用于检测与所述肽特异性反应的抗体的试剂。放射性同位素可以是例如³H，¹⁴C，³²P，³⁵S或¹²⁵I。在有些情况下，特别是使用针对本发明蛋白的抗体的情况下，放射性同位素如以下所述用作有毒部分。标记可以结合到核酸、蛋白质和抗体的任何位置上。任何本领域内已知的抗体和标记偶联的方法均可使用，这些方法包括由Hunter等，Nature，144：945(1962)；David等，Biochemistry，13：1014(1974)；Pain等，J.Immunol.Meth.，40：219(1981)；以及Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407(1982)中描述的那些方法。通过添加稳定放射性标记的肽或抗体并保护其免受降解的试剂可以延长放射性标记的肽或放射性标记的抗体组合物的寿命。可以使用任何稳定放射性标记肽或抗体的试剂或试剂组合，这包括美国专利No.5,961,955中所公开的那些试剂。

“效应物”或“效应物部分”或“效应物组分”是指通过连接物或化学键以共价方式或通过离子键、范德华力、静电作用或氢键以非共价方式与抗体结合(或连接，或偶联)的分子。“效应物”可以是各种分子，包括例如包括放射性化合物、荧光化合物、酶或底物、标记物(如表位标签)、毒素等的检测部分；可激活部分，化疗剂；脂肪酶；抗生素；或发射“重”射线(如β射线)的同位素的部分。

在涉及例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变进行改造，或所述细胞源自这样改造的细胞。因此，例如重组细胞表达细胞在天然(未重组)状态下未发现的基因或表达以另外方式异常表达、低表达或完全不表达的基因。本文的术语“重组核酸”表示通常通过核酸操作，例如通过使用聚合酶和内切酶，最初在体外形成的核酸，其以通常自然界中不存在的形式存在。通过这样的方式，实现了不同序列以可操作方式连接。因此，分离的线性核酸，或通常不连接的DNA分子通过体外连接形成的表达载体，均可认为是符合本发明目的的重组子。需要理解的是，一旦制备了重组核酸并将其重新导入宿主细胞或有机体，该核酸将以非重组方式复制，也就是说使用宿主细胞的体内细胞机器而不是体外操控方式复制；然而，这样的核酸一旦以重组方式产生，虽然随后以非重组方式复制，仍被认为适于本发明目的的重组子。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术制造(即通过如上所述的重组核酸的表达)的蛋白。

当用于核酸的部分时，术语“异源的”表示所述核酸包括两个或多个亚序列，这些亚序列通常在自然条件下相互间不存在相同的关系。例如，所述核酸通常以重组方式产生，具有两个或多个例如来自无关基因(例如，一种来源的启动子和另一来源的编码区)的序列，经过组织形成新的功能性核酸。类似地，异源蛋白质通常包括自然条件下相互间不存在相同的关系的两个或多个亚序列(例如融合蛋白)。

当提及蛋白质或肽或抗体时，短语与抗体或抗原(如蛋白质，优选Wnt 16蛋白)“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)地发生免疫反应”是指在含有蛋白质和其他生物样品的异质性种群中决定所述蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的免疫检测条件下，具体的抗体与特定蛋白结合比背景高两倍、更典型地是比背景高10到100倍。

在这样的条件下与抗体的特异性结合需要选择具有针对特定蛋白的特异性的抗体。例如，针对特定蛋白质、多态性变体、等位基因、直向同源基因、以及保守修饰变体、或剪接变体、或其部分产生的抗体可以进行选择以仅获得那些与Wnt 16蛋白但不与其他蛋白质特异性免疫反应的抗体。这一选择可以通过扣除与其他分子交叉反应的抗体实现。多种免疫检测方式可以用于选择与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫检测经常用于选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(至于对可以用于确定特异性免疫反应的免疫检测方式和条件的描述，可以参见，例如Harlow&Lane所著《抗体：实验室手册》(Antibodies，A Laboratory Manual(1988))。

“肿瘤细胞”包括肿瘤中的癌前期细胞、癌细胞以及正常细胞。

组织培养物中的“癌细胞”、“转化的”细胞或“转化”是指自发或诱导的、不一定包括新遗传材料摄取的表型改变。虽然转化可以用转化病毒感染和新的基因组DNA的引入或外源DNA的摄取产生，也可以自发地或与致癌试剂接触后使内源基因发生突变而产生。在本发明中，转化通常与Wnt(尤其是Wnt 16)和/或Frizzled蛋白的过表达相关。转化与其它诸如细胞无限增殖、异常生长调控、非形态学变化和/或恶性等表型改变有关(参见Freshney所著《动物细胞培养：基础技术手册》第3版(Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique(第三版，1994))。

“小干扰RNA”或“siRNA”指已证明能用作引发序列特异性RNA降解中的关键中间体的分离的RNA分子，优选长度大于10个核苷酸，更优选长度大于15个核苷酸，最优选长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。19-25个核苷酸是最优选的siRNA大小。siRNA也可包括小发夹RNA(shRNA)，其中siRNA双链体的两条链被包括在一个RNA分子中。双链siRNA通常由正义和反义链组成。单链siRNA通常仅由与靶基因或mRNA互补的反义链组成。siRNA包括任何形式的RNA，优选dsRNA(较大dsRNA的蛋白酶水解切割产物、部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA)以及通过加入、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸与天然存在的RNA不同的修饰RNA。

发明详述

WO 04/032838在一定程度上描述了Wnt-Fz信号传导途径在癌发生中的作用。本发明提供了可在过表达Wnt 16的许多细胞和癌症中诱导凋亡的Wnt 16信号传导途径抑制剂。本发明可用于治疗与Wnt 16信号转导相关的疾病，特别是受Wnt 16信号转导(尤其是Wnt16b信号转导)影响癌细胞生长和存活的癌症。本发明特别可用于治疗癌症，例如：急性类淋巴母细胞白血病(ALL)、前B急性类淋巴母细胞白血病(前BALL)和B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，以及肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、结肠癌、脑癌、乳腺癌、肾癌、白血病和淋巴瘤。本发明还可用于治疗胎盘、心脏或脾脏中与Wnt 16信号传导异常或不规则相关的疾病。

I.抗WNT 16蛋白的抗体

如上所述，本发明提供了抑制过表达Wnt 16的细胞，尤其是癌细胞中Wnt16信号转导的方法。在本发明的一些实施方式中，用抗体阻断Wnt 16配体与Frizzled受体之间的结合。可针对Wnt或Frizzled受体蛋白产生该抗体。优选的是抗Wnt 16抗体。用于本发明中的抗体的产生在例如WO 04/032838中有所描述。

A.抗Wnt 16单克隆抗体的产生

可用于本发明方法、药物组合物和试剂盒的抗体可以是在本文中全面描述的多克隆抗-Wnt 16抗体、单克隆抗-Wnt 16抗体或抗-Wnt 16Fab。该抗体优选为单克隆抗-Wnt 16抗体。可用多种方式制备本发明单克隆抗体。优选方法是采用杂交瘤方法，如和Milstein，Nature 256：495(1975)所述。在杂交瘤方法中，一般用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以引发产生或能够产生特异性结合于免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外免疫淋巴细胞。

通常，如果需要人来源的细胞，则采用外周血淋巴细胞(″PBL″)，或者如果需要非人哺乳动物来源，则采用脾细胞或淋巴结细胞。然后，用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与无限繁殖细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal抗体：Principles and Practice)，59-103页(1986))。无限繁殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是啮齿类、牛和人来源的骨髓瘤细胞。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在优选含有能抑制未融合的无限繁殖细胞系生长或存活的一种或多种物质的合适培养基中培养杂交瘤细胞。例如，如果亲本细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么此杂交瘤培养基一般包含次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(″HAT培养基″)，这些物质能防止HGPRT缺陷型细胞的生长。

B.抗原性Wnt 16多肽

可采用本文所述的方法和免疫剂来产生多种抗-Wnt 16单克隆抗体。在本发明的一个方面中，免疫剂通常可包括Wnt 16多肽，例如如SEQ ID NO：1(Wnt 16a)或SEQ ID NO：2(Wnt 16b)所示的Wnt 16同工型。其它可用作免疫剂的Wnt 16同工型如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO 21所示。将Wnt 16蛋白的同工型描述为由355个氨基酸残基(Wnt 16a；GenBank登录号为EAL24346和NP_057171(SEQ IDNO：1))、365个氨基酸残基(Wnt 16b；GenBank登录号为NP_476509(SEQ ID NO：2)；Q9UBV4、EAL24346和AAD49351)或361个氨基酸残基(Wnt 16c；GenBank登录号为AAD38052)组成。这些同工型的区别主要在于它们的N-末端(图1)。Wnt 16a在其N-末端具有独特的氨基酸序列MQLTTCLRETLFTGASQKTSLW(SEQ ID NO：22；图1)；Wnt 16c除了SEQ IDNO：22外，在其N-末端还包括序列MERHPP(SEQ ID NO：23；图1)。Wnt 16b在其N-末端具有不同的序列：MDRAALLGLARLCALWAALLVLFPYGAQGNWM(SEQ ID NO：24；图1)。然而，还存在2种可变内部位点：Wnt 16a在第72位具有甘氨酸(G)(参见，SEQ ID NO：1和图1)或精氨酸(R；参见，SEQ ID NO：20和图1)。在相应位置，Wnt 16b所具有的是甘氨酸(G；参见，SEQ ID NO：2和图1)，而Wnt16c则具有精氨酸(R；参见，SEQ ID NO：21)。其它可变位点存在于Wnt 16a的第253位、Wnt 16b中相应的第263位以及Wnt 16c中相应的第259位。在该位点，Wnt 16a和Wnt 16b具有苏氨酸(T；参见，SEQ ID NO：1、20和2；图1)，而在Wnt 16c中发现的是异亮氨酸(I；参见SEQ ID NO：21；图1)。

因此，在本发明的另一方面中，采用对具体Wnt 16同工型具有特异性的肽作为免疫肽来产生抗-Wnt 16抗体，例如SEQ ID NO：22、23和24中所示的肽。优选的抗原肽包括SEQ ID NO：2(图1)中所示的人Wnt 16中的1-99氨基酸残基。可通过合成或体内表达(如在大肠杆菌中)来产生抗原肽。例如可在大肠杆菌中表达包含如SEQ ID NO：2(图1)所示的人Wnt 16的1-99氨基酸残基的多肽，对其进行纯化并用作抗原。

在本发明的另一方面中，所述免疫剂是人Wnt 16的抗原肽。可采用多种方法确定人Wnt 16蛋白的抗原肽。例如，采用EMBOSS法(Parker等，Biochemistry25：5425-5432(1986))可发现蛋白质中的抗原性位点。也可采用Kolaskar和Tangaonkar的方法(K&T；FEBS Lett.(1990)276(1-2)：172-4)确定抗原肽。两种方法均可鉴别出人Wnt 16中类似的抗原肽(表1)。虽然可将大部分鉴别出的抗原肽序列用于产生特异性结合人Wnt 16的抗体，由于这些Wnt 16同工型间的氨基酸序列同源性，有些抗体可结合于Wnt 16a、Wnt 16b和/或Wnt 16c蛋白。

表1：人Wnt 16b的抗原肽

人Wnt 16b抗原肽序列以及在SEQ ID NO：2中的位置	SEQ ID NO	多个SEQ ID NO中存在的抗原肽
			4AALLGLARLCALWAALLVLFPY 25	3
56QKELCKRKPYLLPS 69	4	1，20，21
			75RLGIQECGS 83	5	1，21
104GASPLFGYEL 113	6	1，20，21
			120TAFIYAVMAAGLVHSVTRSC 139	7	1，20，21
145TECSCDT 151	8	1，20，21
			179SRKFLDF 185	9	1，20，21
195NKVLLAM 201	10	1，20，21
			209GRQAVAKLMSVDCRCHGVSGSCAVKT 234	11	1，20，21
243EKIGHLLK 250	12	1，20，21
			275RKIPIHKDDLYVNKSPNYCVED 297	13	1，20，21
318DGCNLLCCG 326	14	1，20，21
			329YNTHVVRHVERCECKFIWCCYVRCRR 354	15	1，20，21
34LGLASFGVPEKLGCANLPL 52	16	1，20，21

C.抗-Wnt 16抗体

可将本文所揭示的抗原肽用于产生多克隆和单克隆抗-Wnt16抗体。优选为单克隆抗体。

在本发明的优选实施方式中，抗-Wnt 16抗体是特异性结合包含如下序列号所示氨基酸序列的多肽的抗体：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、或SEQ ID NO：16。同样优选的是特异性结合包含如下序列号所示氨基酸序列的多肽的抗-Wnt 16抗体：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16，其中该多肽由不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成，同时也不同于已从其序列上切除信号肽的成熟Wnt 16蛋白(即Wnt 16蛋白)的序列。

在本发明的另一优选实施方式中，抗-Wnt 16抗体是特异性结合包含SEQID NO：2所示Wnt 16的1-99氨基酸残基的多肽的抗体。同样优选的是特异性结合包含对应于SEQ ID NO：2所示人Wnt 16的1-99氨基酸残基的氨基酸序列的多肽的抗-Wnt 16抗体。该抗体优选为人抗体，更为优选的是人Fab。

在本发明的另一优选实施方式中，抗-Wnt 16抗体是特异性结合由SEQ IDNO：2所示Wnt 16的1-99氨基酸残基组成的多肽的抗体。同样优选的是特异性结合于由对应于SEQ ID NO：2所示人Wnt 16的1-99氨基酸残基的氨基酸序列组成的多肽的抗体。该抗体优选为人抗体，更为优选的是人Fab。

在本发明的一个实施方式中，抗-Wnt 16抗体特异性结合Wnt 16蛋白或Wnt16肽。在本发明的另一个实施方式中，本发明的抗-Wnt 16抗体结合表达Wnt 16的细胞的细胞表面抗原。在本发明的另一个实施方式中，抗-Wnt 16抗体抑制Wnt 16蛋白与受体(例如Frizzled受体)的结合。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16抗体抑制Wnt 16信号传导。

D.重组抗-Wnt 16抗体的产生

可用多种方法制备本发明的抗-Wnt 16抗体。在本发明的一个方面中，通过重组产生抗-Wnt 16抗体。在该方法中，对编码由杂交瘤细胞产生的抗-Wnt 16单克隆抗体的核酸进行测序。优选对编码单克隆抗体互补决定区(CDR)的核酸进行测序。因此，在本发明的一个方面，通过将编码抗-Wnt 16抗体的核酸插入表达载体，然后将其转化或转染入适宜的宿主细胞来产生抗-Wnt 16抗体。然后在适于表达的条件下培养所述宿主细胞。

这些方法在本领域中是普遍知晓的，正如纳入本文作为参考的Maniatis等，《分子克隆：实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982))中的总体描述。“载体”指含有能够在细胞中转录的核酸的任何类型的遗传构建物。该定义也包括用于扩增核苷酸序列(编码和非编码)的载体。除了编码序列以外，载体通常包括常用于载体以帮助其构建和使用的限制性酶切位点和其它起始、终止和中间DNA序列。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它们的单链或双链形式的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成、天然产生和非天然产生的，它们与参比核酸的结合特性相似，它们的代谢方式类似于参比核苷酸。这些类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸(酯)、氨基磷酸(酯)、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-氧-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。

可用化学技术合成本发明的抗-Wnt 16单克隆抗体的编码序列或其片段和CDR序列，例如Matteucci等(J Am Chem Soc.1981，103：3185)的磷酸三酯法。在核酸序列中，术语“编码序列”指多个连续的三联核苷酸(称为密码子，各密码子对应于根据通用遗传密码由生化因子翻译出的一个氨基酸)、编码表达蛋白的整个序列或抑制蛋白质表达的反义链。“遗传编码序列”是连续密码子被非编码的间插序列或“内含子”间歇性隔断的编码密码。在mRNA加工期间，去除了内含子序列，恢复了编码该蛋白的连续密码子序列。

可通过简单地用合适碱基取代编码所需氨基酸序列的碱基来对DNA或RNA序列进行任何修饰。然后，可提供具有合适接头的编码序列，并将其连接入本领域通常可用的表达载体中，用该载体转化合适的宿主，产生免疫刺激肽或蛋白。可购得许多此类载体和合适的宿主系统。为了表达，可提供给编码序列可操作性连接的启动密码子和终止密码子、启动子和终止区及通常还有复制系统，以提供用于在所需细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有用于插入所需编码序列的方便的限制性位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列。将得到的表达载体转化入合适的细菌宿主中。当然，也可应用酵母或哺乳动物细胞宿主，其采用本领域技术人员已知的合适载体和控制序列。

E.嵌合和人源化抗-Wnt 16抗体

在本发明的一些实施方式中，抗-Wnt 16抗体是嵌合或人源化抗体。如上所述，抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白，其中人抗体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和容量的非人物种如小鼠、大鼠或兔的CDR残基取代。

可用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库产生人抗体(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222：581(1991))。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，《单克隆抗体和癌症疗法》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，77页(1985)和Boerner等，J.Immunol.147(1)：86-95(1991))。相似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物(如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠)来制备人抗体。攻击后，观察人抗体产生情况，所产生抗体在所观察的各个方面(包括基因重排、组装和抗体的所有组成成分)都和人体中产生的抗体非常像。此方法参见例如：美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及以下科学文献：Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。

F.与Wnt 16结合的单链Fv抗体

在一些实施方式中，抗体是单链Fv(scFv)。scFv抗体的V_H和V_L区含有经折叠产生与双链抗体相似的抗原结合位点的单链。折叠后，非共价相互作用使单链抗体稳定。虽然一些抗体实施方式的V_H和V_L区可以直接连接在一起时，本领域技术人员将理解，可用一个或多个氨基酸组成的肽接头分开这些区域。肽接头和其应用是本领域熟知的。参见例如，Huston等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA8：5879(1988)；Bird等，Science 242：4236(1988)；Glockshuber等，Biochemistry29：1362(1990)；美国专利号4,946,778、美国专利号5,132,405和Stemmer等，Biotechniques 14：256-265(1993)。通常，肽接头除了连接这些区域或保持V_H和V_L之间的最小距离或其它空间关系以外没有特别的生物活性。然而，可选择肽接头的组成氨基酸，以影响分子的一些特性，如折叠、净电荷或疏水性。单链Fv(scFv)抗体任选地包含不多于50个氨基酸，通常不多于40个氨基酸，优选不多于30个氨基酸，更优选不多于20个氨基酸的肽接头。在一些实施方式中，肽接头是序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，优选是2、3、4、5或6个上述序列的多联体。然而，应理解，可在接头内产生一些氨基酸取代。例如，可用缬氨酸取代甘氨酸。

已描述了制备scFv抗体的方法。参见，Huse等，同上；Ward等，同上；Vaughan等，同上。简要说，分离免疫动物的B细胞的mRNA，制备cDNA。用对免疫球蛋白的重链和轻链的可变区特异的引物扩增cDNA。纯化PCR产物，连接核酸序列。如果需要接头肽，将编码该肽的核酸序列插入重链和轻链核酸序列之间。将编码scFv的核酸插入载体，并在合适的宿主细胞中表达。一般通过淘选(panning)噬菌体展示文库发现特异性结合于所需抗原的scFv。可用几种方法进行淘选。可用在表面表达所需抗原的细胞或用所需抗原包被的固体表面方便地进行淘选。方便的是，该表面可以是磁珠。洗掉表面上未结合的噬菌体，洗脱结合的噬菌体。

不管所选的淘选方法是什么，噬菌体展示提供的基因型和表型之间的物理联系使得测试cDNA文库，甚至是大的克隆文库中每个成员与抗原的结合成为可能。

G.双特异性和偶联的抗-Wnt 16抗体

在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是单克隆抗体，优选人或人源化抗体，该抗体至少对两种不同抗原具有结合特异性或对同一抗原上两个表位具有结合特异性。在一个实施方式中，结合特异性之一是对Wnt 16蛋白的结合特异性，另一结合特异性是对另一种蛋白质(例如癌抗原)的结合特异性。或者，四聚体型技术可产生多价试剂。

在一些实施方式中，将该抗体偶联于效应物部分。效应物部分可以是任何数目的分子，包括标记部分，如放射性标记或荧光标记，或者可以是治疗部分。如果效应物部分是治疗部分，它一般是细胞毒剂。此方法中，将细胞毒剂靶向癌细胞导致直接杀伤靶细胞。一般用抗Frizzled受体的抗体进行此实施方式。细胞毒剂很多并且不同，包括但不限于：细胞毒性药物或毒素或这些毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包括白喉A链、内毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素、依诺霉素、耳他汀(auristatin)等。细胞毒剂还包括放射性化学物质，通过将放射性同位素偶联于针对Wnt 16蛋白产生的抗体，或将放射性核素结合于已共价连接于抗体的螯合剂而制得放射性化学物质。

H.本发明抗体的结合亲和性

一般通过标准的抗体-抗原试验，如Biacore竞争试验、饱和试验或免疫试验如ELISA或RIA测定或确定靶抗原的结合亲和力。

可用这种试验测定抗体的解离常数。术语“解离常数”指抗体与抗原的亲和力。如果抗体的解离常数(K_D＝1/K，K是亲和常数)＜1μM、优选＜100nM、最优选＜0.1nM，那么抗体和抗原之间存在结合特异性。抗体分子一般具有较低范围的K_D。K_D＝[Ab-Ag]/[Ab][Ag]，[Ab]是抗体平衡浓度，[Ag]是抗原平衡浓度，[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的平衡浓度。一般地，抗原和抗体之间的结合作用包括可逆的非共价结合，如静电吸引、范德华力和氢键。

本发明抗体特异性结合于Wnt 16蛋白。本文中“特异性结合”指抗体与Wnt 16蛋白结合的K_D至少约为0.1mM，更通常至少约为1μM，优选至少约为0.1μM或更多，最优选0.01μM或更多。

I.抗-Wnt 16单克隆抗体的竞争性结合

在一些实施方式中，采用抗-Wnt 16单克隆抗体。优选实施方式是与第二种抗-Wnt 16抗体结合于同一表位的抗-Wnt 16单克隆抗体，例如下文实施例中所述的抗-Wnt16单克隆抗体。一般通过一种抗体竞争性抑制第二种抗体与抗原结合的能力测定具体抗体与另一种抗体识别同一表位的能力。可用许多竞争性结合试验测定两种抗体对同一抗原的竞争。例如，夹心ELISA试验可用于此目的。采用捕获抗体包被孔表面，以进行此方法。然后，将亚饱和浓度的标记抗原加到捕获表面上。此蛋白将通过特异性抗体：表位相互作用结合于抗体。洗涤后，将已共价连接于可检测部分(如HRP，标记抗体定义为检测抗体)的第二抗体加入ELISA。如果此抗体能与捕获抗体识别同一表位，那么它将不能结合于靶蛋白，引物该具体表位不再可用于结合。但是，如果此第二抗体识别靶蛋白上的不同表位，那么它能够结合，并且可通过用相关底物定量活性水平(从而测定结合的抗体)检测此种结合。用一种抗体作为捕获和检测抗体，确定背景，而可通过用抗原特异性抗体捕获，并用针对抗原上标记的抗体检测获得最大信号。将背景和最大信号用作参比，可以配对方式评价抗体，以确定表位特异性。

在本发明的优选实施方式中，抗-Wnt 16抗体是与第二抗-Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白的抗-Wnt 16抗体，所述第二抗体特异性结合包含如下序列号所示氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、或SEQ ID NO：16。同样优选的是与第二抗-Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白的抗-Wnt 16抗体，所述第二抗体特异性结合包含如下序列号所示氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16，其中所述多肽由不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO：21，且也不同于成熟Wnt 16蛋白(即已切除了信号肽的Wnt 16蛋白)的氨基酸序列组成。

在本发明的另一优选实施方式中，抗-Wnt 16抗体与第二抗-Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白，所述第二抗-Wnt 16抗体特异性结合包含如SEQ ID NO：2所示的Wnt 16的1-99氨基酸残基的多肽。同样优选的是与第二抗-Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白的抗-Wnt 16抗体，所述第二抗-Wnt 16抗体特异性结合包含对应于如SEQ ID NO：2所示人Wnt 16的1-99氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。优选的与第二Wnt 16抗体竞争的抗-Wnt 16抗体是人抗体，更优选人Fab。

在本发明的另一优选实施方式中，抗-Wnt 16抗体与第二抗-Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白，所述第二抗-Wnt 16抗体特异性结合由SEQ ID NO：2所示的Wnt 16的1-99氨基酸残基组成的多肽。同样优选的是与第二抗-Wnt 16抗体竞争结合Wnt 16蛋白的抗-Wnt 16抗体，所述第二抗-Wnt 16抗体特异性结合由对应于SEQ ID NO：2所示的人Wnt 16的1-99氨基酸残基的氨基酸序列组成的多肽。优选的与第二Wnt 16抗体竞争的抗-Wnt 16抗体是人抗体，更优选人Fab。

如果在第一抗体的存在下，采用任何上述的分析方法测得第二抗体对抗原的结合降低了至少30％，通常为至少约40％、50％、60％或75％，常为至少约90％，则认为第一抗体竞争性抑制第二抗体。

II.检测WNT 16表达水平的分析

本发明还提供了用于检测Wnt 16的诊断分析。在优选的实施方式中，通过测定基因转录(例如mRNA)、通过测定翻译蛋白质的量或通过测定基因产物活性来测定Wnt 16基因的活性。

用核酸杂交技术检测和/或定量基因转录物(mRNA或cDNA)的方法是本领域技术人员已知的。例如，评价mRNA的存在、不存在或量的一种方法涉及Northern印迹转移。

探针可以是全长或小于全长的编码Wnt 16蛋白的核酸序列。通常用(例如)放射性核苷酸或生物素标记探针，可通过本领域已知的切口平移、随机或特定引物扩增产生探针。本领域也已描述了杂交条件。这些方法通常是本领域已知的，如Maniatis等，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，纽约(1982)所综述。根据经验测定较短探针的特异性。可采用本现有技术中所描述的方法来检测独特的Wnt 16同工型mRNA(即Wnt 16a、Wnt 16b或Wnt 16c mRNA)或编码SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示的Wnt 16蛋白的WntmRNA。可用这些方法鉴别差异仅为一个碱基对错配的核酸(Wallace等，NucleicAcids Res 9(4)：879-94(1991)；Conner等，Proc Natl Acad Sd USA 80(1)：278-82(1983))。核酸探针的长度优选为20个碱基或更长。使杂交部分可视化能够定性地确定mRNA的存在与否。

在另一优选的实施方式中，可用上述基于扩增(如PCR)的方法测定转录物(如mRNA)，以直接评价DNA或mRNA的拷贝数。在优选实施方式中，用逆转录PCR(RT-PCR)评价转录物水平。用于这些方法的引物对参见SEQ ID NO：17-19。

也可通过检测或定量表达多肽检测和/或定量Wnt 16基因的“活性”。可通过本领域技术人员熟知的许多方法中的任何一种检测和定量多肽。这些方法可包括分析生化方法，如电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、高扩散层析等。也可根据标准技术对分离的蛋白质进行测序，以鉴定多态性。

也可用许多熟知的免疫结合试验中的任何一种，用本发明抗体检测Wnt 16蛋白或表达它们的细胞(参见例如，美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。通用免疫试验的综述也参见Asai编的《细胞生物学方法》(Methodsin细胞Biology)，第37卷，Academic Press，Inc.New York(1993)；《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology)，第七版，Stites和Terr编(1991)。

因此，本发明提供了检测过表达Wnt 16蛋白的细胞，尤其是癌细胞的方法。一般地，在生物样品中分析Wnt 16的表达。在一种方法中，对对象进行活检，在体外测试收集的组织。然后，将该组织或该组织的细胞与本发明抗-Wnt 16抗体相接触。得到的免疫复合物说明活检样品中存在Wnt 16蛋白。为了便于所述检测，可放射性标记抗体，或将抗体偶联于作为可检测标记的效应物分子，如放射性标记。

在另一方法中，在体内用(例如)典型的成像系统检测过表达Wnt 16的细胞或癌细胞。然后，用检测该标记的任何已知方法确定该标记的定位。可采用用于使诊断图像显影的方便方法。例如，可将顺磁性同位素用于MRI。抗体内化对使生物体内的寿命延长并超过细胞外结合所提供的寿命起到更为重要的作用，细胞外结合易受胞外酶环境清除加上循环系统清除的影响。

上述方法也可用于预后试验或预测药物反应，即作为药物基因组学标记。具体说，可用上述方法预测对本文所述治疗方案的反应。例如，可用这种方法预测对采用本发明抗-Wnt 16抗体的治疗方法的反应。

III.采用抗-WNT16抗体和siRNA的方法

可以各种方式应用抑制Wnt 16信号转导的物质(如本发明的抗-Wnt 16抗体和siRNA)。在本发明的优选实施方式中，提供了抑制过表达Wnt 16的细胞增殖的方法。过表达的Wnt 16可以是Wnt 16蛋白或Wnt 16mRNA。此方法包括将细胞与抑制Wnt 16信号转导的物质相接触的步骤，试剂的用量能有效抑制细胞增殖。“增殖”指细胞的生长、或者细胞或病态囊肿的再生或繁殖。

在本发明的优选实施方式中，在体外实施该方法。如本文中进一步描述，也可在体内实施本发明的方法。

在本发明的优选实施方式中，与试剂接触的细胞是癌细胞。可用本发明的试剂抑制选自下组的癌细胞的增殖：急性类淋巴母细胞白血病(ALL)细胞、前B急性类淋巴母细胞白血病(前B ALL)细胞、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、肺癌细胞、间皮瘤细胞、黑色素瘤细胞、结肠癌细胞、脑癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、白血病细胞和淋巴瘤细胞。在本发明的一个实施方式中，所述癌细胞是肺癌细胞。在本发明的另一实施方式中，所述癌细胞是ALL细胞。在另一优选的实施方式中，所述癌细胞是前B ALL细胞。在本发明的另一优选实施方式中，所述癌细胞是CLL细胞。还可将本发明用于治疗胎盘、心脏或脾脏中Wnt 16信号转导异常或不标准相关的疾病。

A.对凋亡的诱导

可以各种方式应用抑制Wnt 16信号转导的物质(如本发明抗-Wnt 16抗体和siRNA)。在本发明的优选实施方式中，提供了诱导过表达Wnt 16的细胞凋亡的方法。此方法包括将细胞与抑制Wnt 16信号转导的试剂相接触的步骤，试剂的用量能有效诱导细胞的凋亡。在本文中揭示了用于本方法的试剂，例如抗Wnt 16抗体或siRNA。

B.对Wnt 16信号转导的抑制

可以各种方式应用本发明的试剂(如本发明抗-Wnt 16抗体和siRNA)。在本发明的另一优选实施方式中，提供了抑制细胞中Wnt 16信号转导的方法。该方法包括将过表达Wnt 16的细胞与有效抑制Wnt 16信号转导的量的试剂接触的步骤。本文揭示了用于此方法的试剂，如抗-Wnt 16抗体或siRNA。

C.疾病的治疗

可以各种方式应用本发明的试剂(如本发明抗-Wnt 16抗体和siRNA)。在本发明的优选实施方式中，提供了治疗与Wnt 16信号转导相关的疾病的方法。此方法包括给予对象，优选需要这种治疗的对象有效治疗该疾病的量的抑制Wnt16信号转导的试剂的步骤。该对象优选为人。本文揭示了用于此方法的试剂，如抗-Wnt 16抗体或siRNA。

在优选的实施方式中，所述疾病是癌症。本发明的试剂可用于治疗选自下组的癌症：急性或成淋巴细胞性白血病(ALL)、前B急性类淋巴母细胞白血病(前B ALL)、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、结肠癌、脑癌、乳腺癌、肾癌、白血病和淋巴瘤。在本发明的一个实施方式中，所述癌症是肺癌。在本发明的另一实施方式中，所述癌症是ALL。在另一优选的实施方式中，所述癌症是前B ALL。在本发明的另一优选实施方式中，所述癌症是CLL。

本发明还可用于治疗胎盘、心脏或脾脏中与Wnt 16异常或不规则相关的疾病。

本文中所用的术语″治疗″、″进行治疗″包括：(1)预防疾病如癌症，即在可能倾向于发生该疾病的但仍未经历该疾病的任何症状的对象中使该疾病的临床症状不发生；(2)抑制该疾病，即阻滞或降低疾病或其临床症状的发展；或(3)缓解该疾病，即使该疾病或其临床症状消退。需要这种治疗的对象优选哺乳动物，更优选人。

本发明还提供了治疗过表达Wnt 16的癌症的方法。此方法包括给予需要这种治疗的对象能有效治疗该癌症的试剂。本文揭示了用于此方法的试剂，如抗-Wnt 16抗体或siRNA。

D.在对象中检测癌细胞

可以各种方式应用本发明的试剂(如本发明抗-Wnt 16抗体和siRNA)。在本发明的优选实施方式中，提供了在对象中检测癌细胞的方法。此方法包括以下步骤：提供来自该对象的生物样品，该生物样品包含怀疑是癌细胞的细胞，并检测该细胞中Wnt 16表达水平。任选地，此方法包括将该细胞中的Wnt 16表达水平与来自一个或多个健康对象的细胞中的Wnt 16表达水平作比较，或与以前测定的Wnt 16表达水平参比范围作比较。在本发明的一个实施方式中，通过检测Wnt 16mRNA水平检测Wnt 16表达水平。在本发明的另一实施方式中，通过检测Wnt 16蛋白水平检测Wnt 16表达水平。本文揭示了用于此方法的试剂，如抗-Wnt 16抗体或siRNA。

可因各种原因检测Wnt 16的表达水平。检测Wnt 16的表达水平可以是：(i)在对象中进行癌症的筛选、诊断或预后的一部分；(ii)确定该对象对癌症的易感性的一部分；(iii)测定对象癌症的阶段或严重性的一部分；(iv)鉴定对象发生癌症的风险的一部分；或(v)监测给予诊断患有癌症的对象的抗癌药或治疗的效果的一部分。给予对象的抗癌药或治疗可包含本发明抗-Wnt 16抗体或siRNA。

在本发明优选实施方式中，提供了鉴定对象癌症的阶段或严重性的方法。如本文所示，在多种癌细胞中Wnt 16过表达，例如白血病细胞、肺癌细胞和乳腺癌细胞。如本文进一步所示，抗Wnt 16抗体和siRNA以剂量依赖方式诱导这些细胞凋亡。因此，Wnt 16的量是各种癌症风险状态(如高、中或低)的特征。可测定Wnt 16，然后根据分类算法或将它们与癌症具体阶段或严重性相关的Wnt 16参比量和/或模式作比较，从而确定该癌症的阶段或严重性。

采用本发明方法，测定来自要测定其癌症发生风险的对象的生物样品中的Wnt 16水平。来自要测定癌症发生风险的对象的生物样品中检测到的Wnt 16水平高于来自正常或健康对象的同等生物样品中检测到的Wnt 16水平，或低于预先确定的基础水平，表明要测定癌症发生风险的对象具有发生癌症的风险。

在本发明的另一优选实施方式中，作为对象癌症的筛选、诊断或预后的一部分，测定对象的癌症。采用本发明方法，测定来自要进行癌症筛选的对象的生物样品中的Wnt 16水平。来自要筛选癌症的对象的生物样品中检测到的Wnt16水平高于来自正常或健康对象的同等生物样品中检测到的Wnt 16水平，或高于预先确定的基础水平，这表明所述筛选癌症的对象患有或可能患有癌症。

如上所述，Wnt 16组合物可用于治疗Wnt 16过表达的癌症。然而，如本文所述，其它药物，如包含Wnt 16抑制剂的组合物也可用于治疗Wnt 16过表达的癌症患者。因此，在本发明优选实施方式中，将测定癌症的状态作为监测手术效果(如切除肿瘤)、给予诊断患有Wnt 16过表达性癌症的对象的抗癌药或治疗的效果的一部分。对癌症患者进行手术或给予抗癌药或治疗的效果可包括癌症复发、癌症进展(恶化)和癌症消退(改善)。

采用本发明组合物、方法和试剂盒，在手术后的不同时间或给予抗癌药或治疗后的不同时间测定对象的生物样品中的Wnt 16水平。第一时间点(t1；例如在给予抗癌药或治疗之前)检测的来自对象的生物样品中的Wnt 16水平高于第二时间点(t2；例如给予抗癌药或治疗之后)检测来自同一对象的相应生物样品中的Wnt 16水平，表明该对象的癌症正在消退。同样，与第一时间点检测的Wnt 16水平相比第二时间点检测的Wnt 16水平较高表明该对象的癌症正在发展。类似地，第一时间点(t1；如刚刚手术后)检测来自对象的生物样品中的Wnt 16水平高于第二时间点(t2；如术后数周或数月)检测来自同一对象的相应生物样品中的Wnt 16水平，可能表明对象的癌症没有复发。同样，与第一时间点检测的Wnt 16水平相比第二时间点检测的Wnt 16水平较高说明可能表明该对象的癌症正在复发。

E.用于本发明方法的siRNA

用于实施本发明方法的本发明的试剂包括但不限于：抗-Wnt 16抗体和Wnt16的siRNA。这些试剂一般能够(i)结合于Wnt 16mRNA或Wnt 16蛋白，(ii)干扰Wnt 16信号转导，和/或(iii)抑制Wnt 16蛋白与其它蛋白质(如Frizzled蛋白受体)的结合。在优选实施方式中，抑制细胞增殖的试剂是Wnt 16的siRNA。本发明提供了采用RNA干扰的组合物和方法来调节Wnt 16表达。这些方法和组合物可用于治疗疾病(尤其是癌症)、诱导凋亡和干扰Wnt 16信号转导。

在许多种类中，引入在本文中也可被称作小干扰RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)能诱导强效和特异的基因沉默，这种现象称为RNA干扰或RNAi。在线虫类秀丽新小杆线虫(C.elegans)中广泛记录了这种现象(Fire等，Nature，391，806-811，1998)，而且在其它生物体(从锥虫到小鼠)中也很普遍。根据所讨论的生物体，将RNA干扰称为“共抑制”、“转录后基因沉默”、“正义抑制”和“压抑”。RNAi是吸引人的生物科技工具，因为它提供了敲除特定基因活性的方法。它尤其可用于在以前认为不适于遗传试验或操作的物种中敲除基因表达。

RNAi通常被描述为转录后基因沉默(PTGS)现象，其中dsRNA引发胞质中的同源mRNA降解。基本过程涉及加工成较短单位(称为短干扰RNA(siRNA))的dsRNA，所述较短单位能指导同源的信使RNA(mRNA)的识别和靶向切割。可以多种方式在细胞核或胞质中产生(加工后)引发RNAi/PTGS的dsRNA。将dsRNA加工成siRNA，进而降解mRNA，是两步RNA降解过程。第一步涉及将dsRNA加工成长为21-25个核苷酸(nt)的正义和反义RNA(即siRNA)的dsRNA核酸内切酶(核糖核酸酶III型；RNA酶III型)活性。在果蝇中，此RNA酶III型蛋白称为切酶(Dicer)。在第二步中，产生的反义siRNA与称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的不同的核糖核酸酶复合物组合，并用作RISC的指导物，指导其切割同源性单链mRNA。RISC在与反义siRNA配对的区域中部附近切割mRNA，然后mRNA进一步降解。不同来源的dsRNA可进入导致RNAi/PTGS的加工途径。

因此，在本发明优选实施方式中，用于本发明方法的试剂是Wnt 16的siRNA。可用siRNA降低Wnt 16的表达水平。Wnt 16的siRNA能杂交Wnt 16mRNA，从而降低或抑制Wnt 16蛋白的产生。

在设计RNAi实验中，有几个需要考虑的因素，如siRNA的特性、沉默作用的持续时间和递送系统的选择。为了产生RNAi作用，引入生物体的siRNA应该含有外显子序列。而且，RNAi过程依赖于同源性，所以必须仔细选择序列，以最大程度提高基因特异性，同时最大程度降低同源的但非基因特异性序列之间交叉干扰的可能性。siRNA与所抑制基因之间的序列相同性优选大于90％，甚至为100％。与靶基因相同性低于约80％的序列基本上很少有效。因此，Wnt 16的siRNA和要抑制其表达的Wnt 16基因之间的同源性越大，不相关基因表达可能性越小。

此外，siRNA的大小很重要。本发明总地涉及Wnt 16的siRNA分子，它是双链或单链，至少包含约19-25个核苷酸，能够调节Wnt 16的基因表达。在本发明上下文中，siRNA的长度优选小于500、200、100、50或25个核苷酸。siRNA的长度更优选约为19个核苷酸-25个核苷酸。

[0152]在一个方面中，本发明通常涉及至少19个核苷酸的分离siRNA分子，它具有至少一条与至少10个但不多于30个Wnt 16的连续核苷酸基本互补的链，并能够降低Wnt 16基因或蛋白的表达。在本发明的优选实施方式中，siRNA分子具有至少一条与至少10个、优选至少19个但不多于30个人Wnt 16(GenBank登录号NM_057168，SEQ ID NO：25)或人Wnt 16基因(如GenBank登录号NM_016087、AF 152584、AF 169963所示)的连续核苷酸基本互补的链。

在本发明的优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列是5′-r(AGAUGGAAAGGCACCCACC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：26)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列包括序列5′-r(AGAUGGAAAGGCACCCACC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：26)。

在优选的实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列是5′-r(GGUGGGUGCCUUUCCAUCU)d(TT)-3′(SEQ ID NO：27)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列包含序列5′-r(GGUGGGUGCCUUUCCAUCU)d(TT)-3′(SEQ ID NO：27)。

在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16siRNA包含由5′-r(AGAUGGAAAGGCACCCACC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：26)和5′-r(GGUGGGUGCCUUUCCAUCU)d(TT)-3′(SEQ ID NO：27)形成的双链形式。

在优选的实施方式中，siRNA核酸序列是5′-r(UGGCAUUGCAACCAGAGAG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：28)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的iRNA核酸序列包括序列5′-r(UGGC AUUGC AACCAGAGAG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：28)。

在优选的实施方式中，siRNA核酸序列是5′-r(CUCUCUGGUUGCAAUGCCA)d(TT)-3′(SEQ ID NO：29)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列包括序列5′-r(CUCUCUGGUUGCAAUGCC A)d(TT)-3′(SEQ ID NO：29)。

在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16siRNA包括5′-r(UGGC AUUGCAACC AGAGAG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：28)和5′-r(CUCUCUGGUUGC AAUGCCA)d(TT)-3′(SEQ ID NO：29)之间形成的双链形式。

在优选的实施方式中，siRNA核酸序列是5′-r(GGAAACUGGAUGUGGUUGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：30)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列包括序列5′-r(GGAAACUGGAUGUGGUUGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：30)。

在优选的实施方式中，siRNA核酸序列是5′-r(CCAACCACAUCCAGUUUCC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：31)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列包括序列5′-r(CCAACCACAUCCAGUUUCC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：31)。

在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA包含5′-r(GGAAACUGGAUGUGGUUGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：30)和5′-r(CCAACCACAUCCAGUUUCC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：31)之间形成的双链形式。

在优选的实施方式中，siRNA核酸序列是5′-r(UGCAACCGUACAUCAGAGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：32)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列包括序列5′-r(UGC AACCGUAC AUCAGAGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：32)。

在优选的实施方式中，siRNA核酸序列是5′-r(CCUCUGAUGUACGGUUGCA)d(TT)-3′(SEQ ID NO：33)。在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA核酸序列包括序列5′-r(CCUCUGAUGUACGGUUGCA)d(TT)-3′(SEQ ID NO：33)。

在本发明的另一优选实施方式中，Wnt 16的siRNA包含5′-r(UGCAACCGUACAUCAGAGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：32)和5′-r(CCUCUGAUGUACGGUUGCA)d(TT)-3′(SEQ ID NO：33)之间形成的双链形式。

在另一优选的实施方式中，Wnt 2的siRNA分子包括与SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31或32所示的核酸序列具有至少90％同源性，优选95％、99％或100％同源性的序列。不用进行过多的试验，运用本发明的揭示，应理解可设计调节Wnt 16表达的Wnt 16的其它siRNA并将其施用于本发明的方法中。

siRNA也可包含一个或多个核苷酸的改变。这种改变可包括将非核苷酸材料加入例如19-25个核苷酸RNA的末端或内部(该RNA的一个或多个核苷酸处)。在优选实施方式中，RNA分子含有3′-羟基。本发明RNA分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，包括非天然产生的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。双链寡核苷酸可含有修饰的主链，例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其它修饰主链，或可包含非天然核苷间连接。siRNA的其它修饰(如掺入2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，和反转的脱氧碱基(deoxyabasic)残基)可参见公开的美国申请公开号20040019001和美国专利号6.673,611(纳入作参考)。综上所述，所有上述改变的RNA都称为修饰的siRNA。

优选地，RNAi能将Wnt 16在细胞中的表达降低至少10％、20％、30％或40％，更优选至少50％、60％或70％，最优选至少75％、80％、90％、95％或更多。

可通过本领域已知的方法将siRNA引入细胞，包括例如：显微注射、电穿孔或转染含有可转录出siRNA的核酸的载体。或者，可直接以能够结合于Wnt 16mRNA转录物的形式将Wnt 16的siRNA引入细胞。为了增加持续时间和膜穿透性，可将siRNA与脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、lipofectin试剂(lipofectine)或其衍生物混合或用它们对siRNA进行修饰。优选的是胆固醇偶联的Wnt 16的siRNA(参见Song等，Nature Med.9：347-351(2003))。

F.用于本发明方法中的抗-Wnt 16抗体

在本发明的另一优选实施方式中，用于本发明方法的试剂是在本文中全面描述的抗-Wnt16抗体。该抗-Wnt 16抗体可为本文中全面描述的多克隆、单克隆抗-Wnt 16抗体或抗-Wnt 16Fab。优选在本发明的方法中使用抗-Wnt 16单克隆抗体。同样优选的是抗-Wnt 16Fab。尤为优选的是人抗-Wnt 16单克隆抗体或人抗Wnt 16Fab。

IV.WNT信号转导抑制剂的鉴别

还可将Wnt 16蛋白(或表达它们的细胞)或Wnt信号转导途径的成员(例如dvl)用于药物筛选试验中以鉴别抑制Wnt信号转导的试剂。本发明由此提供了用于筛选抑制癌症的组合物的新方法。

可设计用于Wnt 16信号转导的试验对Wnt 16信号途径中的任何部分进行检测和/或定量。可测定例如试剂影响胞内β-连环蛋白水平或诱导靶细胞凋亡的能力。本文中描述了适用于这些目的的试验方法。

试验可包括经设计用于测定抑制剂与Wnt 16配体、Frizzled蛋白受体或Wnt16信号转导级联反应的其它成员(如dvl)的结合活性的试验。这些试验尤其可用于鉴定能调节Wnt 16活性的试剂。基本上可在这种试验中测试任何试剂。这些试剂包括但不限于：天然或合成多肽、抗体、天然或合成的小有机分子、核酸等。

如上文所述，分泌型Frizzled相关蛋白(sFRP)家族通过与Frizzled受体竞争结合分泌的Wnt配体而作为Wnt 16信号转导的可溶性内源调节剂起作用。因而，在有些形式中，待测试剂是基于Frizzled蛋白受体的天然配体(如Wnt配体或sFRP)。

任何检测Wnt 16信号转导的测试法均满足高通量筛选。高通量测试法、结合测试法和报道基因测试法是同样熟知的。因此，例如，美国专利5,559,410公开了蛋白质的高通量筛选方法，美国专利5,585,639公开了筛选核酸结合的高通量方法(即阵列)，而美国专利5,576,220和5,541,061公开了筛选配体/抗体结合的高通量方法。

除此之外，可购得高通量筛选系统(例如可见Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等等)。这些系统通常实现包括全部样品和试剂的移液、液体分配、定时孵育以及最终在适于测试法的探测器中对微平板读数在内的整个程序的自动化操作。这些可配置的系统提供了高通量和快速启动以及高度的适应性和定制化。这些系统的制造商提供了多种高通量系统的详细方案。因而，例如，Zymark Corp.提供了描述用于检测基因转录调控、配体结合等等的筛选系统的技术公报。

可用于本发明的其它测试法是那些为检测癌细胞的肿瘤表型而设计的方法。这些测试法包括软琼脂上的细胞生长；锚着依赖性；生长的接触抑制及密度限制；细胞增殖；细胞死亡(凋亡)；细胞转化；生长因子或血清依赖性；肿瘤特异标志水平；重组基质胶的侵入力；体内肿瘤生长和转移；经历转移的细胞中mRNA和蛋白质表达以及癌细胞的其它特征。

待测试剂抑制细胞生长的能力也可以通过将待测试剂导入动物疾病模型并评估体内癌细胞生长进行评估。例如，可以将人肿瘤细胞导入如“裸鼠”等免疫受损的动物。将待测试剂(例如小分子或抗体)施给动物并将肿瘤细胞形成肿瘤的能力(通过在动物中形成的肿瘤的数量和/或大小进行评估)与没有接触该试剂的对照动物中的肿瘤生长进行比较。

A.基因表达的抑制剂

本发明的一个方面，Wnt信号途径的抑制剂(例如Dvl抑制剂)可以包括抑制所述途径中靶蛋白表达的核酸分子。可以使用常规的基于病毒或非病毒基因转移方法向哺乳动物细胞或目标组织导入核酸，其编码工程改造的多肽(例如该蛋白的显性阴性形式)，或核酸(例如诸如siRNA或反义RNA等靶蛋白表达的抑制剂)。非病毒载体转运系统包括DNA质粒、裸核酸以及与如脂质体等与转运载体复合的核酸。病毒载体转运系统包括DNA和RNA病毒，它们在转运到细胞中后具有游离的或整合的基因组。至于基因治疗过程的综述，参见Anderson，Science256：808-813(1992)；Nabel&Feigner，TIBTECH 11：211-217(1993)；Mitani和Caskey，TIBTECH11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11：167-175(1993)；Miller，Nature 357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36(1995)；Kremer和Perricaudet，British MedicalBulletin 51(1)：31-44(1995)；Doerfler和Bohm主编的《微生物学和免疫学现有主题》(Current Topics in Microbiology andImmunology)一书中Haddada等所著章节(1995)以及Yuetal，Gene Therapy 1：13-26(1994)。

在有些实施方式中，施用小分子干扰RNA。在哺乳动物细胞中，长双链RNA(＞30核苷酸)的引入经常引起有效的抗病毒反应，表现为蛋白质合成的非特异性抑制和RNA的降解。RNA干扰现象在例如Bass，Nature 411：428-29(2001)；Elbahir等，Nature 411：494-98(2001)；以及Fire等，Nature 391：806-11(1998)中进行了描述和讨论，其中也探讨了制备干扰RNA的方法。siRNA抑制剂小于100个碱基对，通常30bp或更短，并通过本领域已知的手段制备。本发明示范性siRNA可以具有多达29个核苷酸、25个核苷酸、22个核苷酸、21个核苷酸、20个核苷酸、15个核苷酸、10个核苷酸、5个核苷酸或在其附近或在其之间的任何整数个核苷酸。

V.药物组合物

如上所述，可用Wnt 16表达抑制剂和本发明试剂治疗与Wnt 16信号转导相关的疾病，例如与Wnt 16信号转导相关的癌症。用以给药的组合物通常包含溶于药学上可接受的载体(优选是水性载体)的本文详述的试剂。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐溶液等等。这些溶液是无菌的，通常不含有不需要的物质。可采用常规的已知灭菌技术对这些组合物进行灭菌。这些组合物可以包含药学上可接受的、接近生理条件所需的辅助试剂，诸如pH调节和缓冲试剂、毒性调节试剂等等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。这些剂型中活性试剂的浓度可以变化很大，并且按照选择的给药模式和患者需求，主要在液体体积、粘性、体重等基础上选择。

因而，用于静脉内给药的典型药物组合物应是每位患者每天大约0.1到10毫克。每位患者每天可以给予0.1到大约100毫克的剂量，尤其是当对隔离位置给药而不进入血流(诸如对体腔或器官内腔给药)的情况下。在局部用药中可以使用更高的剂量。对于精通本领域的人员而言，制备非经肠道给药的组合物的实际方法是已知的或显而易见的，并且在如《雷明顿制药科学》第15版(Remington′sPharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania(1980))等出版物上有更详细的描述。

取决于给药方法，所述药物组合物可以用多种单位剂型给药。例如，适于口服给药的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸、胶囊以及锭剂。需要认识到，当通过口服给予抗体时应对其进行保护以免遭消化。这通常通过将所述分子与组合物复合使其抗酸性和酶水解，或通过将所述分子包装在适当的抵抗性载体(如脂质体或保护屏障)中实现。保护试剂免受消化的方法是本领域内熟知的。

可为治疗性或预防性治疗施用含本发明抑制剂和/或试剂的组合物(例如抗体)。在治疗性应用中，对遭受疾病(例如乳腺癌)折磨的患者施用组合物，其量足以治疗或至少部分阻止疾病及其并发症。足以实现这一目的的量被定义为“治疗有效量”。这一应用的有效量取决于疾病的严重性以及患者的总体健康状况。取决于患者需要和耐受的剂量和频率，组合物可以一次或多次给药。在任何情况下，所述组合物应当提供充分量的本发明的试剂以对患者进行有效治疗。能够防止或延缓患者中癌症发展的抑制剂量称为“预防有效量”。预防性治疗所需要的特定剂量取决于医疗条件以及患者病史、需要防止的特定癌症、以及如年龄、体重、性别、给药途径、有效性等其它因素。这样的预防性治疗可以用于，例如先前得过癌症的患者以防止癌症的再次发生，或被怀疑具有发展癌症的重要可能性的患者。

出于本发明目的，“患者”或“对象”包括人和其它动物，尤其是哺乳动物。这样，所述方法可以用于人类治疗和兽医学应用。在优选的实施方式中，患者是哺乳动物、优选是灵长类动物，并且在最优选的实施方式中患者是人。

可将其它已知的癌症治疗方法与本发明的方法组合使用。例如，Wnt信号转导的抑制剂也可以用于使其它癌症治疗剂(如5FU、长春碱、放射菌素D、顺铂、氨甲叶酸等等)靶向细胞或使细胞敏化。在其它实施方式中，本发明的方法可以与放疗等一起使用。

在有些情况下，所述抗体所属亚型为当与跨膜蛋白复合时激活血清补体并由此介导细胞毒性或抗原依赖的细胞毒性(ADCC)的亚型。这样，可通过给予患者抗癌细胞表面的Frizzled蛋白的抗体来治疗癌症。抗体标记可以激活辅助毒素、聚集毒素有效荷载或以其它方式提供局部消融细胞的方法。在这些实施方式中，所述抗体与效应物部分偶联。效应物部分可以是任何数量的分子，包括诸如放射性标记或荧光标记的标记部分，或可以是治疗性部分，如细胞毒剂。

A.Wnt 16多肽作为疫苗的用途

除了给予Wnt 16信号转导抑制剂之外，Wnt 16蛋白或其免疫原性片段可以作为疫苗组合物给药以激活HTL、CTL以及抗内源蛋白的抗体反应。这样的疫苗组合物可以包括，例如，脂化的肽(参见例如Vitiello等，(1995)J.Clin.Invest.95：341-349)、包裹入聚(D，L-丙交脂-乙交脂，″PLG″)微球的肽组合物(参见，例如，Eldridge等，(1991)Molec.Immunol.28：287-294；Alonso等(1994)Vaccine12：299-306；Jones等(1995)Vaccine 13：675-681)、包含在免疫激活复合体(ISCOM)中的肽组合物(参见，例如，Takahashi等(1990)Nature 344：873-875；Hu等(1998)Clin.Exp.Immunol.113：235-243)、多抗原肽系统(MAP；参见例如Tarn(1988)Proc.Nat′lAcad.Set USA 85：5409-5413；Tam(1996)J.Immunol.Methods 196：17-32))、病毒转运载体(Kaufmann主编的《疫苗发展概念》(Conceptsin Vaccine Development de Gruyter，1996)中379页Perkus等所著的内容；Chakrabarti等(1986)Nature 320：535-537；Hu等(1986)Nature 320：537-540；Kieny等(1986)AIDS Bio/Technology 4：790-795；Top等(1971)J.Infect.Dis.124：148-154；Chanda等(1990)Virology 175：535-547)、病毒或合成来源的颗粒(参见，例如Kofler等(1996)J.Immunol.Methods 192：25-35；Eldridge等(1993)Sem.HematoL 30：16-24；Falo等(1995)Nature Med.7：649-653)。

疫苗组合物经常包含佐剂。许多佐剂包含设计来用于保护抗原免受快速分解代谢的试剂，诸如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答激活剂，诸如脂质A、短小棒状杆菌(Bortadella pertussis)或结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的蛋白。某些佐剂可通过商业获得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；默克佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；氢氧化铝胶体或磷酸铝等铝盐；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不可溶悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解微球；单磷酰基脂质A和quil A。诸如GM-CSF、白介素2、7、12及其它类似生长因子的细胞因子也可以用作佐剂。

疫苗可以以核酸组合物的形式给药，其中给予患者编码Wnt多肽的DNA或RNA或其片段。参见例如Wolff等(1990)Science 247：1465-1468；美国专利5,580,859、5,589,466、5,804,566、5,739,118、5,736,524、5,679,647；以及WO98/04720。基于DNA的转运技术的实例包括“裸DNA”、促进(布比卡因、聚合体、肽-介导的)转运、阳离子脂质复合物以及颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的转运(参见例如美国专利5,922,687)。

使用基因作为DNA疫苗的方法是熟知的，并包括将所需的基因或其部分置于可调控的启动子或组织特异性启动子控制之下使之在患者体内表达。用作DNA疫苗的基因可以编码全长Wnt 16蛋白，或可以编码所述蛋白的一部分。

在有些实施方式中，DNA疫苗包括编码佐剂分子和DNA疫苗的基因。这样的佐剂分子包括提高针对DNA疫苗所编码多肽的免疫原性反应的细胞因子。

为了治疗或预防免疫目的，本发明的肽可以用病毒或细菌载体表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，如牛痘病毒(vaccinia)或禽痘病毒(fowlpox)。这一方法包括使用牛痘病毒作为例如表达编码Wnt 16多肽或多肽片段的核苷酸序列的载体。导入宿主之后，重组牛痘病毒表达免疫原性肽，并由此引起免疫应答。例如在美国专利4,722,848中描述了用于免疫方案的牛痘载体和方法。另一种载体是BCG(卡介菌Bacille Calmette Guerin)。在Stover等(1991)Nature351：456-460中描述了BCG载体。多种其它可用于治疗性给药或免疫的载体，例如腺病毒和腺病毒相关的病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)载体、去毒炭疽毒素载体等等会是显而易见的。参见例如Shata等(2000)Mol.Med.Today 6：66-71；Shedlock等(2000)J.Leukoc.Biol.68：793-806；以及Hipp等(2000)In Vivo 14：571-85。

VI.抑制剂和试剂的给药

可以多种治疗方案使用抑制Wnt 16信号转导的试剂(如抗Wnt 16抗体和siRNA)。例如可以以下方法应用该试剂，包括但不限于：胃肠道外(例如静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径)、外用、口服、局部、或透皮给药。这些方法可用于预防性和/或治疗性治疗。

A.非病毒递送方法

编码本发明工程改造多肽的核酸的非病毒递送方法包括脂转染(lipofection)、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸偶合体、裸DNA、人工病毒粒以及用药剂增强的DNA摄取。例如，在美国专利5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述了脂转染，并且可购得脂转染试剂(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner在WO 91/17424和WO 91/16024所述的那些试剂。可以向细胞(离体给药)或靶组织(体内给药)递送。

本领域技术人员熟知包含靶向脂质体(如免疫脂质复合物)的脂质：核酸复合物的制备(参见例如Crystal，Science 270：404-410(1995)；Blaese等，CancerGene Ther.2：291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)；Remy等，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad等，Cancer Res.52：4817-4820(1992)；美国专利4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。

B.病毒递送方法

使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送目标Wnt途径蛋白(如Dvl)的抑制剂是本领域内已知的。递送这样的核酸抑制剂的常规的基于病毒的系统可包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒载体。

在许多基因治疗应用中，希望基因治疗载体以高特异性递送到特定组织类型(例如肺癌组织)中。一般对病毒载体进行改造使之通过表达与病毒外表面上的病毒包膜蛋白融合的配体而具有针对给定的细胞类型的特异性。选择与已知存在于感兴趣细胞类型上的受体具有亲和力的配体。例如，Han等在PNAS92：9141-9151(1995)中报道了可以改造Moloney鼠白血病病毒以表达与gp70融合的人调蛋白(heregulin)，并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。这一原理可以延伸到表达配体融合蛋白的病毒和表达受体的靶细胞的其它配对中。例如，可以改造丝状噬菌体以展示基本上对任何选择的细胞受体都具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如FAB或Fv)。虽然上面的描述主要用于病毒载体，但相同的原理可以用于非病毒载体。可以改造这样的载体，使其包含认为有助于被特定靶细胞摄取的特定摄取序列。

通常，可以通过全身给药(例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部应用(如下所述)向单独患者体内递送基因治疗载体。或者，可将载体递送给离体细胞，如从单独患者取出的细胞。

本领域技术人员熟知用于诊断、研究或基因治疗的离体细胞转染(例如，通过将转染细胞重新输入宿主生物体)。在一些实施方式中，从对象生物体分离细胞，用抑制剂核酸转染并重新输回对象生物体(例如患者)。本领域技术人员熟知适于离体转染的多种细胞类型(参见，例如Freshney等，《动物细胞培养：基础技术手册》(Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique)，第3版，1994)以及其中为说明如何从患者分离并培养细胞所引用的参考文献)。

也可将含治疗性核酸的载体(如逆转录蛋白、腺病毒、脂质体等)直接给予有机体，用于体内细胞转导。或者，可以给予裸DNA。通过通常用于导入分子以与血液或组织细胞最终接触的任何途径给药。本领域技术人员可以获得并且熟知给予这种核酸的适当方法。而且，虽然可用一种以上的途径给予特定组合物，但特定途径常常比其它途径提供更快捷、更有效的反应。

药学上可接受的的载体部分由所给予的特定组合物以及用于给予该组合物的特定方法决定。因此，如下所述，本发明药物组合物存在多种合适剂型(参见例如，《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第17版，1989))。

VII.用于诊断、研究和治疗用途的试剂盒

本发明还提供了可用于检测本文所述Wnt 16核酸或蛋白的试剂盒。而且，提供了包含本文所述组合物的试剂盒，该组合物使得用户可实施本发明的方法。在诊断和研究应用中，这种试剂盒可包括以下试剂中的任一种或全部：检测试剂、缓冲液、Wnt 16特异性或Frizzled蛋白特异性核酸或单克隆或多克隆抗体、杂交探针和/或引物等。治疗性产品可以包括无菌盐水或其它药学上可接受的乳液和悬液基质。

在优选实施方式中，该试剂盒包括含有如本文所述的特殊试剂的试剂，其中该试剂能与Wnt 16蛋白或Wnt 16核酸(如mRNA)结合，干扰Wnt 16信号转导，或抑制Wnt 16蛋白与其它蛋白(如Frizzled蛋白受体)的结合。该试剂盒还可包括用于本发明试剂和组合物的一个或多个容器，以及用于指导使用该试剂抑制过表达Wnt 16的细胞增殖以治疗疾病(如过表达Wnt 16的癌症)、诱导表达Wnt 16的细胞凋亡、检测过表达Wnt 16的癌细胞或实施本文所述任何方法的说明书。

在本发明的优选实施方式中，试剂盒包括SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32或33所示的siRNA。在另一优选实施方式中，试剂盒包括包含SEQ IDNO：26、27、28、29、30、31、32或33所示核酸序列的siRNA。在本发明的另一优选实施方式中，所述试剂盒包含SEQ ID NO：25的约19-25个毗邻核苷酸的siRNA，其中所述siRNA结合Wnt 16mRNA并抑制Wnt 16mRNA的翻译。任选地，该试剂盒还包含用于本发明试剂和组合物的一个或多个容器，以及用于指导使用siRNA抑制过表达Wnt 16的细胞增殖以治疗疾病(如过表达Wnt 16的癌症)、诱导表达Wnt 16的细胞凋亡、检测过表达Wnt 16的癌细胞或实施本文所述任何方法的说明书。该试剂盒还包括对照或非沉默siRNA。

如上所述，本发明的试剂盒可以包括包含实施本发明方法的说明(即使用方案)的指导材料。虽然指导材料一般包括书面或打印材料，但不限于此。能够存储此种说明书并能将它们传递给最终使用者的任何介质都包括在本发明中。这样的介质包括但不限于：电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光介质(例如CD-ROM)等。此种介质可以包括提供此种指导材料的互联网址。

本发明还提供了用于筛选Wnt 16信号转导抑制剂的试剂盒。这种试剂盒可以由易于获得的材料与试剂制备。例如，这样的试剂盒可以包括一种或多种以下材料：Wnt 16多肽或多核苷酸、反应试管以及测试所需Wnt 16信号转导功能(例如β连环蛋白水平)的说明书。

本发明的药物组合物和试剂盒包括本文所述的特定试剂。

虽然为了阐明和理解以说明和举例的方式详细描述了上述发明，但本领域普通技术人员根据本发明内容不难明白，可以对其进行某些改变、更改、修饰和等价物取代，而不必背离本发明构思和范围。结果是，本文所述实施方式涉及各种修饰、改变等，而本发明范围仅由所附权利要求书决定。

虽然本文所述的本发明各部分都含有多个实施方式，但是应理解，除非另有说明，本发明给定部分的各实施方式能够与本发明其它部分的各实施方式一起应用，这些应用各自形成本发明的独特实施方式。

进一步通过以下实施例说明本发明，以下实施例仅为说明性，不旨在以任何方式限制本发明的定义和范围。

VIII.实施例

实施例1：材料和方法

1.细胞系

研究了4种人前B ALL细胞。CCL-119(CCRF-CEM)获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA，美国)，NALM-6和697(ACC-42)获自德意志微生物保藏中心(German Collections ofMicroorganisms and Cell Cultures，DSMZ，Braunschweig，德国)，RCH-ACV由Mignon Loh博士友情提供(儿科学系，加利福尼亚大学，University ofCalifornia，San Francisco，CA，USA)。697和RCH-ACV细胞系(急性成淋巴细胞样白血病)均显示出t(1；19)染色体易位，且具有大量E2a-Pbxl的表达，而NALM-6和CCL-119(急性成淋巴细胞样白血病)则不然，因此将它们作为对照。人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系H460和乳腺癌细胞系MCF7获自美国典型培养物保藏中心。所有细胞均培养于补充有10％胎牛血清、青霉素(100 IU/ml)和链霉素(100mg/ml)的RPMI 1640中。将所有细胞培养于37℃、5％CO₂的湿度培养箱中。

2.RT-PCR

采用RT-PCR进行细胞系中Wnt 16表达的分析。用提取试剂盒(RNeasy袖珍试剂盒，Qiagen，Valencia，CA，USA)从所有细胞系中分离总RNA。通过在分光光度计中测定260nm处的吸光度对RNA进行定量。以试剂盒(含Platinum Taq的Superscript One-Step RT-PCR，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)在GeneAmpPCR体系9700中进行RT-PCR。用于Wnt 16a和Wnt 16b的引物序列如下所示：Wnt16aF：CAGAAAGATGGAAAGGCACC(SEQ ID NO：17)，Wnt 16bF：TGCTCGTGCTGTTCCCCTAC(SEQ ID NO：18)，Wnt 16aR和Wnt 16bR：ATCATGCAGTTCCATCTCTC(SEQ ID NO：19)，这些引物报道于Fear等，Biochem.Biophys Res Comm 278：814-820(2000)。在所有的试验中，将0.2mM各引物和1μg各模板RNA与RT/platinum Taq混合物共同使用。PCR条件是：第1个循环为50℃，30分钟、94℃，2分钟；然后的35个循环为94℃，15秒；57℃，30秒；72℃，1分钟；接下来的1个循环为72℃，7分钟。

3.蛋白质印迹法

采用标准实验方案。抗-Dvl3和抗-存活蛋白抗体得自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz，美国加利福尼亚州)。抗-胱冬酶3抗体来自Oncogene(美国马萨诸塞州坎布里奇)。抗-β-肌动蛋白抗体获自Cell SignalingTechnology，Inc.(Beverly，MA)或Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。抗-β-连环蛋白抗体购自Transduction Laboratories(肯塔基州列克星敦)或(Pharminigen)。抗-细胞色素c抗体来自BD Biosciences(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。为了检测β-连环蛋白和细胞色素c的改变，制备胞浆提取物，用本领域已知的方法进行检测(例如，Wang等，Mol Cell Biol 19(9)：5923-9(1999))。

4.RNA干扰

试验前24小时，将上述ALL细胞系接种到含有培养基但没有抗生素的6孔板中。将购自Ambion(Austin，TX，USA)的一种非沉默siRNA用作对照，同时使用的是购自Qiagen(Valencia，CA，USA)的靶向Wnt 16a的一种siRNA和特异性靶向Wnt 16b的三种siRNA。用于沉默siRNA的序列如下：

Wnt 16a：5′-r(AGAUGGAAAGGCACCCACC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：26)

Wnt 16a：5′-r(GGUGGGUGCCUUUCCAUCU)d(TT)-3′(SEQ ID NO：27)

Wnt 16b1：5′-r(UGGCAUUGCAACCAGAGAG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：28)

Wnt 16bl：5′-r(CUCUCUGGUUGC AAUGCC A)d(TT)-3′(SEQ ID NO：29)

Wnt 16b2：5′-r(GGAAACUGGAUGUGGUUGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：30)

Wnt 16b2：5′-r(CC AACC AC AUCC AGUUUCC)d(TT)-3′(SEQ ID NO：31)

Wnt 16b3：5′-r(UGC AACCGU AC AUC AGAGG)d(TT)-3′(SEQ ID NO：32)

Wnt 16b3：5′-r(CCUCUGAUGU ACGGUUGC A)d(TT)-3′(SEQ ID NO：33)。

我们遵循了由Elbashir等提出(Methods 26：199-213(2002))的试验设计。用Oligofectamine Reagent(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)进行转染。在siRNA转染后、进一步分析前，将培养板在37℃下孵育72-96小时。

5.凋亡分析

在白血病细胞系、肺癌细胞系和其它细胞系中评估所选择的siRNA诱导凋亡的能力。简而言之，转染72小时后，通过胰蛋白酶消化收获细胞，根据生产商说明书进行用于测定细胞表面膜联蛋白-V和碘化丙锭(PI)含量(Apotarget，BioSource International，Camarillo，CA)的处理。采用膜联蛋白-V-PI双染方案，用双色流式细胞术区分三种细胞群：(a)非凋亡细胞：膜联蛋白-V和PI阴性；(b)早期凋亡细胞，磷脂酰丝氨酸外露但细胞膜仍然完整，这种细胞能结合膜联蛋白V-FITC但排斥碘化丙锭；和(c)坏死或晚期凋亡阶段的细胞，被膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭标记。然后立即用流式细胞术分析染色的细胞(FACScan；Decton，Dickinson)。对每一试验，将采用未染色的、仅用膜联蛋白V染色和仅用PI染色的样品作为补偿。

6.抗-Wnt 16抗体

小鼠抗人Wnt 16多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA，USA)，将其用于蛋白质印迹。另一种小鼠抗-Wnt 16单克隆抗体购自BDPharmingen(目录#552595)。

人Fab抗体是以用作抗原的包含人Wnt 16蛋白(如SEQ ID NO：2所示)N末端结构域的1-99氨基酸残基的肽(包括信号肽序列)来定制的，该肽是采用标准方法在大肠杆菌中表达的。然后将纯化的肽用作抗原。采用Design(MorphoSys，Germany)提供的抗体，以

技术制备Fab。产生8种人Fab，命名为582、583、584、585、586、587、588和589。将人抗-Wnt 16Fab用于本文所述的抑制试验。

7.测定人Fab特异性的ELISA

将直接的ELISA用于测定人抗-Wnt 16Fab的特异性。简而言之，用BSA转化的N1-NfkB-His6、泛素和Wnt 16抗原(如SEQ ID NO：2所示的未经处理的人Wnt 16的1-99氨基酸)以10μg/ml在PBS中的浓度用于在4℃下包被培养板12小时。然后，在加入人Fab之前，将培养板在室温下孵育在封闭缓冲液中2小时。该分析中测试成阳性的8种抗-Wnt16 Fab(克隆582-589)中代表性的例子示于图6中。

8.细胞表面抗原结合分析

将待测细胞重新悬浮在100μl含0.5-1μg人抗-Wnt 16Fab的PBS缓冲液中，在冰上孵育30分钟。在数次洗涤步骤之后，将细胞重新悬浮在100μl含1μg二抗的FACS缓冲液中，涡旋混匀并在冰上孵育30分钟。孵育在黑暗中进行。用于FACS的二抗是Alexa Flour 488山羊抗-人IgG(H+L)6。然后将样品置于12×75mm的Falcon管中，用流式细胞计量仪进行分析。结合于RCH-ACV细胞表面的人抗-Wnt 16Fab的代表性实例示于图7中。

9.基因表达阵列

在一些试验中，采用定制的阵列与AmpoLabelling-LPR试剂盒原则(GEArray Q人Wnt信号转导途径基因阵列，SuperArray，Frederick，MD，USA)分析基因表达特征(profiling)，所述定制阵列设计用于表征Wnt信号转导涉及的及其下游的基因表达。简而言之，对所选细胞系中分离的总RNA进行RT反应，然后用生物素-16-dUTP(Roche，Basel，Switzerland)标记cDNA探针，变性，并在含有Wnt特异性阵列的杂交管中杂交过夜。采用CDD相机，以化学发光反应进行检测，将膜在X射线膜上以不同次数多次曝光。用生产商提供的软件将斑点图像转化为数字数据。将表达数据与生产商提供的基因列表进行匹配。代表性的基因表达特征示于图2中。

10.增殖分析

将由Eli Lilly(Indianapolis，IN)提供的

(MTA)以10mg/ml的浓度稀释在灭菌的生理溶液中。将储备液分成等份，储存在-80℃下，每次试验前稀释在培养基中。如前所述地使用抗-Wnt 16抗体。可通过测定四氮鎓(tetrazolium)转化的代谢活性(细胞滴度96孔分析，Promega，Madison，WI)测定细胞增殖。简而言之，在96孔培养板的每孔中接种入5,000个细胞，加入含有递增浓度的两种药物的培养基。在37℃的CO₂培养箱中孵育培养板72小时。然后加入增容/终止溶液，用荧光读板仪在570nm处记录吸光度。将各试验一式三份地至少重复3次。

11.体内肿瘤抑制研究

向5-6周龄的雌性裸小鼠的背部皮下注射体积为约100μl的约1×10⁷个ALL细胞、前B ALL细胞、CLL细胞或H460细胞。当一致形成肿瘤时，可随后给动物腹膜内(i.p.)注射体积约为100μl的单克隆抗-Wnt 16抗体、对照单克隆抗体或PBS缓冲液。优选的单克隆抗-Wnt 16和对照抗体的注射剂量约为250μg。每周各注射两次。优选各组由至少5-10只小鼠组成。每隔一周测定肿瘤大小，用宽(x)和长(y)(x²y/2，其中x＜y)计算肿瘤体积(Sonoda等，Cancer Res 61(13)：4956-60(2001))。

12.统计学分析

所示数据代表平均值(±S.E.M.)。用Excel中的不配对T-检验比较不同处理和细胞系。用双尾Student t-检验进行其它统计学比较(P＜0.01)。

实施例2：Wnt 16和Wnt信号途径在含有t(1；19)易位的白血病细胞系中上调

为了分析Wnt信号途径的激活，进行了基因表达特征分析，在该分析中采用了设计用于表征Wnt信号途径相关基因表达的定制阵列。分析了4种急性类淋巴母细胞白血病细胞系，2种含有t(1；19)易位(697和RCH-ACV)，两种不含易位(CCL-119和NALM-6)。证实了697和RCH-ACV细胞系都过表达Wnt 16，而在对照细胞系CCL-119和NALM-6中均未发现信号。此外，Wnt经典途径中涉及的许多其它基因，例如腺瘤性结肠息肉病(APC)、β-连环蛋白、dishevelled(dvl)-2和Tcf-4是过表达的，暗示了那些细胞中Wnt信号途径的激活(图3A)。CCL-119中的其它Wnt蛋白(Wnt 2和Wnt 6)中显著地过表达，表明了各种Wnt蛋白可在不同白血病亚型中上调，这与Muller-Tidow等的发现(Mol Cell Biol 24：2890-28904(2004))是一致的。

实施例3：白血病细胞系中Wnt 16a和Wnt 16b的表达

为了进一步证实前述的数据，通过蛋白质印迹法和RT-PCR进一步分析Wnt16的表达。首先，通过采用市售的Wnt 16多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnologies)证实了Wnt 16在NALM-6或CCL-119对照细胞系中不表达，在697和RCH-ACV中均高度过表达(图3B)。此外，如Fear等(同前)所示Wnt 16由两种同工型组成，我们通过RT-PCR分析了Wnt 16a和Wnt 16b在同一细胞系中的表达。采用与Fear等(同前)所述相同的那些引物进行RT-PCR，与其它细胞系相比，在含t(1；19)的细胞系中显示出显著的Wnt 16b过表达(图3A)，而在所有4种细胞系中根本未检测到Wnt 16a。此外，如Fear等(同前)所表明，Wnt 16a比Wnt 16b更倾向于被E2A-Pbxl靶向，通过测序分析证实了扩增条带严格对应于Wnt 16b(图3C)。

实施例4：通过siRNA进行的Wnt 16b抑制导致了凋亡

由于Wnt 16b似乎为介导融合蛋白E2A-Pbxl效应的假定靶标，对其控制凋亡和细胞存活的能力进行了研究。根据Elbashir等(Methods 26(2)：199-213(2002))的描述进行了RNA干扰。设计了Wnt 16a和Wnt 16b特异性siRNA。运用了4种siRNA，一种为非沉默siRNA，它是靶向Wnt 16a的siRNA(参见，SEQ ID NOS：26和27)，三种siRNA特异性靶向Wnt 16b(参见，SEQ ID NO：28和29；SEQ ID NO：30和31；以及SEQ ID NO：32和33)。用上述siRNA转染ALL细胞系，在进一步分析前孵育72-96小时。首先通过RT-PCR和蛋白质印迹法证实了Wnt 16b特异性siRNA抑制了Wnt 16b，而Wnt 16a siRNA和对照siRNA则无效(图4A)。然后对凋亡进行评估。膜联蛋白-V和碘化丙锭处理后的流式细胞计量术揭示了用Wnt16b siRNA处理3-5天在表达Wnt 16b的前B ALL细胞系中诱导了凋亡和细胞死亡，而对照则未诱导。所用的三种不同Wnt 16siRNA在各种试验中给出了类似的结果。100nM的Wnt 16b siRNA显著地诱导了凋亡(通常至少为35％-40％)，而Wnt 16a siRNA或非沉默siRNA对照则未诱导凋亡(100nM)(P＜0.01)。用蛋白质印迹分析证实了Wnt 16b siRNA处理(100nM，72小时)后的Wnt 16表达沉默。将非沉默siRNA用作对照(100nM，72小时)。

实施例5：共表达Wnt 16b从siRNA诱导的凋亡中拯救细胞

为了测试共表达Wnt 16b的cDNA是否能从siRNA诱导的凋亡中拯救细胞，我们将Wntl6pcDNA3质粒(获自NHGRI/NIH的YingziYangat博士)转染入细胞。本文所述的Wnt 16 siRNA不能结合该质粒或由其转录的mRNA，这是因为将Wnt 16 siRNA设计为结合Wnt 16 mRNA的3′UTR结构域，而该结构域在Wnt16pcDNA3质粒中并不存在。因此，siRNA仅能使内源的Wnt 16表达沉默。已证实Wnt 16的重新表达可从siRNA诱导的凋亡中拯救细胞(图4B)。

实施例6：Wnt 16沉默后Wnt 16下游效应物的表达

在经典Wnt途径中，Wnt蛋白结合frizzled受体，活化dishevelled蛋白(该蛋白抑制糖元合成酶激酶-3β使β-连环蛋白磷酸化的能力，其中磷酸化的β-连环蛋白可因磷酸化而进入细胞核)以及活化靶基因。因此对Wnt途径下游效应物的表达进行了分析。对细胞系进行的蛋白质印迹分析显示Wnt 16b的抑制导致了含t(1；19)的细胞系中β-连环蛋白、Dvl-2和存活素表达的下降，而在其它细胞系中未观察到影响(图4C)。为了进一步证实这些发现，在用对照(非沉默)siRNA或Wnt 16b siRNA处理的CCL-119和697细胞系中进行了如前所述的Wnt信号转导特异性微阵列分析。首先证实了Wnt 16的特异性抑制作用。其次，显示了该抑制还导致了经典途径关键组分的下调，例如APC、GSK-3、Dvl-2、转录因子(例如Tcf-4和p300)以及其它基因(例如c-myc和细胞周期蛋白D3)的下调(图4D)。

因此，为了测定凋亡效应是否与Wnt 16b信号转导有关，已显示在Wnt 16bsiRNA处理之后，Dvl-3、细胞质β-连环蛋白和存活素的表达水平下调。在用siRNA Wnt 16b处理的前B ALL细胞中，还发现β-连环蛋白-TCF所靶向的基因，c-Myc和纤维结合蛋白也发生下调。

实施例7：抗人Wnt 16b单克隆抗体的开发

针对来自序列表中所示和本文中进一步描述的人Wnt 16b的多肽产生Wnt16抗体。针对SEQ ID NO：2所示的全长Wnt 16以及针对包含SEQ ID NO：2所示的1-99氨基酸残基的肽产生抗-Wnt 16b抗体。获得了人抗Wnt 16抗体Fabl(克隆#582)、Fab2(克隆#583)、Fab3(克隆#584)、Fab4(克隆#585)、Fab5(克隆#586)、Fab6(克隆#587)、Fab7(克隆#588)和Fab8(克隆#599)。然后测试这些抗-Wnt 16抗体在过表达Wnt 16b的细胞系中的特异性、生物活性、诱导凋亡的能力。采用蛋白质印迹法和流式细胞计量术验证了抗-Wnt 16抗体对表达Wnt 16b的细胞的结合。

实施例8：抗-Wnt 16抗体产生的Wnt 16抑制作用诱导白血病细胞的凋亡

使用抗-Wnt 16单克隆抗体(BD Pharmingen；目录#552595)进行697和RCH-ACV细胞系以及对照细胞系NALM-6的凋亡评估。在抗体处理后，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙锭(PI)对白血病细胞系进行染色。如图5所示，抗-Wnt 16抗体在RCH-ACV细胞系中诱导了凋亡，而在NALM-6细胞系中则没有引起可观察到的效果。在697细胞系中也类似地诱导了凋亡。此外，还分析了如果重现表达Wnt 16b，是否可从抗-Wnt 16抗体诱导的凋亡中拯救出RCH-ACV细胞(详见实施例5)。Wnt 16的重现表达可从该单克隆抗体诱导的凋亡中拯救细胞(图5)。

为了进一步证实和开拓上述的发现，定制了人抗-Wnt 16b抗体。将截短的Wnt 16蛋白(SEQ ID NO：2的1-99氨基酸残基)用作抗原来产生如前文所充分描述的多种人Fab。对Fab抗体的特异性进行了评估，显示了在RCH-ACV(图7)和697细胞(数据未示出)中对Wnt 16的高亲和力。分别用浓度为1μg/ml和5μg/ml的抗-Wnt 16 Fab抗体以及对照mAb处理697细胞、RCH-ACV细胞和CCL-119对照细胞。3-5天后进行凋亡分析。进行了4个独立的试验。Wnt 16Fab诱导凋亡的范围与Wnt 16siRNA在含t(1；19)的细胞中的范围相同，而在对照细胞系中则没有引起可观察到的效果(图8)。此外，通过蛋白质印迹分析验证了Wnt 16抑制诱导了β-连环蛋白、Dvl-2和存活素表达的下降(图8B)。

已发现小鼠抗Wnt 16单克隆抗体和人抗-Wnt 16Fab抗体均能导致RCH-ACV细胞中显著的凋亡性细胞死亡，而它们在对照白血病细胞系NALM-6和CCL-119中则造成最小的影响(图5、8)。

实施例9：抗-Wnt 16b抗体诱导的凋亡效应与Wnt 16b蛋白状态相关

在对抗Wnt 16b抗体处理敏感的白血病细胞系中观察到了高水平的Wnt16b表达。然而，在对抗体处理不敏感的对照白血病细胞系CCL-119中仅检测到最少的Wnt 16b表达。此外，Wnt 16b在多种癌细胞系中过表达，这些癌细胞系包括：肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、NSCLC、结肠癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤和非小细胞肺癌组织。

实施例10：抗-Wnt16b抗体诱导的凋亡与Dvl-3、细胞质β-连环蛋白和存活 素的下调相关

已显示Wnt信号转导可通过Dvl激活β-连环蛋白/Tcf介导的转录。Wnt信号转导还可使细胞质β-连环蛋白稳定化。因此，测定了抗-Wnt 16b抗体诱导的凋亡是否依赖于Dvl和细胞质β-连环蛋白的脱稳定化。已发现在所测试的癌细胞(例如RCH-ACV细胞系)中，用抗-Wnt 16b抗体处理后Dvl和细胞质β-连环蛋白水平显著下调。反之，在经抗-Wnt 16b抗体处理后的对照细胞系中，均未发现Dvl和细胞质β-连环蛋白水平的变化。

实施例11：Wnt 16siRNA诱导的凋亡与Smac/Diablo和细胞色素c从线粒体 中释放到cCtosol以及JNK的活化相关

为了进一步阐明抗-Wnt 16抗体在人癌细胞中诱导凋亡的机制，检测了凋亡途径中的其它组分。在凋亡中，Smac/Diablo(具有低pI的半胱天冬酶/直接IAP结合蛋白的第二线粒体衍生的激活物)行使排除IAP介导的半胱天冬酶抑制的功能(Du等，Cell 102(1)：33-42(2000)；Verhagen等，Cell 102(1)：43-53(2000))。凋亡的刺激造成Smac/Diablo与细胞色素c一起从线粒体内膜间隙释放到细胞质中。细胞色素c直接激活Apaf-1和半胱天冬酶-9，而Smac/Diablo与多种IAP相互作用以排除由IAP介导的对引发因子和效应子半胱天冬酶的抑制(Chai等，Nature 406(6798)：855-62(2000)；Srinivasula等，J Biol Chem 275(46)：36152-7(2000))。

与前述的结果一致，癌细胞中的半胱天冬酶-3活性提高，但在正常细胞中不提高，用抗-Wnt 16抗体处理后，发现癌细胞细胞质中的Smac/Diablo和细胞色素c水平均提高，但在正常细胞的细胞质中则不提高。这些结果表明Smac/Diablo和细胞色素c似乎分别通过存活素和/或其它IAP介导的抑制的去除以及半胱天冬酶的直接活化而参与到抗-Wnt 16抗体诱导的凋亡中。

讨论

如上文所提及，人们对于Wnt配体在人癌症发生中的作用所知甚少。本文报道的数据证明Wnt 16信号转导在人癌细胞中起到主要原因的作用，因此Wnt16代表了癌症治疗中的治疗靶标。

上文中的数据证明Wnt 16b siRNA在人癌细胞中诱导了凋亡。此外，我们的数据还表明该抗肿瘤效果是由Wnt信号途径的阻断引起的。在人前B ALL细胞中，由Wnt 16b siRNA诱导的凋亡性细胞死亡不仅与Wnt 16b mRNA的表达相关，还与Dvl和细胞质β-连环蛋白的蛋白质表达下降一致。

t(1；19)染色体易位导致了融合产物E2A-Pbxl的产生。E2A-Pbxl含有E2a的强转活结构域，以及Pbxl的DNA结合同源结构域。活化的癌蛋白E2a-Pbxl在体外诱导了多种细胞类型的转化，在转基因小鼠中诱导了成淋巴细胞性淋巴瘤(Kamps等，Genes Dev 5：358-368(1991))。最近，采用微阵列获得了表达特征，鉴别t(1；19)(E2A-Pbxl)为儿童ALL6种预测亚型中的一种。已知E2A-Pbxl可在裸鼠中诱导肿瘤形成(Kamps等(同前))、分别在胸腺细胞和骨髓样细胞中促进T细胞淋巴瘤和髓细胞性白血病(Kamps等，Oncogene 12：19-30(1996))。然而，仍不明了E2A-Pbxl产生前Bcell ALL的机制(Aspland等，Oncogene 20：5708-5717(2001))。

Wnt 16b在这一白血病亚类中具有最高的重要性。已证实了Wnt信号转导在造血作用中的作用。首先，已报道某些Wnt蛋白刺激造血祖细胞的增殖(Austin等，Blood 89：3624-3635(1997)；Van Den Berg等，Blood 92：3189-3202(1998))。其次，Reya等显示Wnt蛋白通过活化LEF-I促进前-B细胞的有丝分裂(Reya等，Immunity 13：15-24(2000))。Wnt 16的特殊功能是由Mc Whirter等首先发表的，他提出Wnt 16可能对前B ALL中t(1；19)的发展起到作用(Mc Whirte等，Proc NatlAcad Sd USA 96：11464-11469(1999))。Ross等报道了采用定制诊断微阵列进行研究，将表达E2A-Pbxl的白血病中的平均信号值与其它白血病相比，Wnt 16发生了改变达569-2547倍的显著的Wnt 16过表达(Ross等，Blood 102：2951-2959(2003))。Wnt 16在慢性淋巴细胞性白血病中也是过表达的(Lu等，Proc NatlAcad Sci USA 101：3118-3123(2004))。还提出了E2a-Pbxl的其它假定靶标。Fu等，首先分析了成纤维细胞中由E2a-Pbxl诱导的基因，并鉴别了一些组织特异性的发育调控基因(Fu等，Mol cell Biol 17：1503-1512(1997))。在人含t(1；19)的前-B细胞ALL中，报道了EB-1的过表达可干扰增殖或分化(Fu等，Oncogene18：4920-4929(1999))。最近，Smith等证明了E2a-Pbxl诱导促进了Bmi-1的表达，Bmi-1是一种淋巴样癌基因，其产物可发挥INK4A-ARF肿瘤抑制子基因座转录抑制物的功能(Smith等，Mol cell 12：393-400(2003))。基于微阵列数据，Downing还提出将C-Mer用作可检测的潜在靶标，这是因为C-Mer过表达且具有引起转化的能力(Carroll等，Hematology(Am Soc Hematol Educ Prgm)：02-131(2003))。这些假定靶基因各自的作用以及它们可能发生的相互作用在很大程度上仍然是未知的，确保了为了确定哪种或哪些可代表有关临床靶标的进一步研究的进行。

本文的数据首次证明了Wnt 16在白血病发生中的重要功能。Fear等运用硅生物信息学基因预测技术(in silico bioinformatic gene prediction technique)鉴别了两种Wnt 16同工型，它们称为Wnt 16a和Wnt 16b(Fear等，Biochem BiophysRes Comm 278：814-820(2000))。两种Wnt 16同工型共有4个外显子中的3个，仅在它们的5′-UTR和第一外显子的组成上有差别。虽然它们具有高度同源性，但两种同工型在人组织中显示出差异明显的表达模式：Wnt 16a仅在胰腺中表达，而Wnt 16b的表达更为广泛。Wnt 16a和Wnt 16b在肿瘤发生中的特殊功能先前是未知的。McWhirter等证明了ALL中通过E2A-Pbxl的Wnt 16上调。有趣的是，在它们的出版物中，Wnt 16基因与Wnt 16b 100％同源。自相矛盾的是，Fear等报道了Wnt 16a的启动子包含针对癌基因结构域转录因子E2A-Pbxl的3个共有结合位点。我们通过用于两种同工型的特异性引物和DNA测序在此确证在ALL细胞系中Wnt 16b(而不是Wnt 16a)过表达，并且它是E2A-Pbxl的靶标。正如其它Wnt蛋白(例如Wnt 2、Wnt 5或Wnt 7)，我们表明了相同Wnt 16蛋白的这两种同工型具有不同的作用，这就增加了Wnt信号转导范例的复杂性(Lustig和Behrens，JCancer Res Clin Oncol 129：199-221(2003)).

通过frizzled受体和dishevelled蛋白，Wnt信号转导激活了两条不同的途径：经典途径(即β-连环蛋白途径)和JNK途径。Dishevelled蛋白具有三个肝毒保守的结构域：DIX、PDZ和DEP。其中，DIX和PDZ结构域是经典信号途径中必需的，而DEP结构域在JNK途径的激活中十分重要。

已表明JNK的激活在凋亡的起始中起到关键的作用(Wang等，Mol CellBiol 19(9)：5923-9(1999))。最近，Chen等已证明了Wnt 1通过活化β-连环蛋白和TCF转录抑制凋亡(Chen等，J Cell Biol 152(1)：87-96(2001))。在该研究中，在抗-Wnt 16抗体处理后，同时观察到了β-连环蛋白的过表达和JNK活性的提高，这表明由抗-Wnt 16抗体诱导的凋亡都涉及到经典途径和JNK途径。此外，Dvl在正常间皮细胞系中的过表达可下调JNK活性，通过使用芹菜配基封闭CK-2活性的Dvl抑制提高了JNK活性。最可能的是，JNK在抗-Wnt 16抗体处理后的活化是通过Dvl进行的。

我们在此使用了两种不同的技术来抑制Wnt 16：采用siRNA的沉默和抗体抑制。两种方法得出相同的观察结果：Wnt 16的抑制通过经典Wnt途径诱导了凋亡。这就表明由Wnt 16介导的异常Wnt信号转导对凋亡的失败(这是高侵入性恶性肿瘤的标记)起到作用。上述发现提高了Wnt信号转导在癌发生中的重要性，并将我们早先在实体瘤中的发现扩展到了造血恶性肿瘤中。提供了对显示t(1；19)易位的白血病亚型中Wnt 16所起作用的新见解。本文所述的发现(尤其是抗-Wnt 16抗体抑制Wnt 16表达的效力)支持了对在该疾病中靶向Wnt 16的治疗兴趣。

上述发现表明Wnt 16抗体不仅可在过表达Wnt 16蛋白的癌细胞中直接诱导凋亡，还可通过将正常凋亡机制填补回这些肿瘤细胞中而释放可能的药物抗性。在肿瘤细胞中药物抗性基础最有可能是凋亡的瓦解。存活素(它是一种凋亡抑制剂)的过表达在大多数人类癌症中是共有的特征。已显示靶向存活素可提高肿瘤细胞对细胞毒性药物的敏感性(Grossman等，Proc Natl Acad Sd USA98(2)：635-40(2001))。并且，已显示反义存活素足以导致人间皮瘤细胞的凋亡。此外，也已报道了反义存活素与化疗间的协调效果。

本文中显示了抗-Wnt 16抗体处理显著降低了存活素蛋白表达水平。一起使用时，Wnt 16抗体能加强并协同强化人癌细胞的标准化疗效果。

Wnt信号转导或Frizzled受体的其它拮抗剂也应该可以通过dishevelled诱导凋亡。例如，sFRP通过与Frizzled受体竞争结合分泌型Wnt配体发挥Wnt信号途径的可溶性调节剂的功能(Melkonyan等，Proc Natl Acad Sd USA 94(25)：13636-41(1997))。具体而言，sFRP可通过结合该蛋白、阻断其接近细胞表面信号转导受体的通道来拮抗Wnt的功能，或者它们可通过促进将配体递呈到Frizzled受体来增强Wnt活性(Uthoff等，Mol Carcinog 31(1)：56-62(2001))。Frizzled受体拮抗剂(例如对胞外结构域特异的抗体，或对胞内结构域特异的小分子)应可在过表达Wnt/frizzled蛋白的人癌细胞中诱导凋亡。

实施例12：抗-Wnt 16抗体在人肺癌细胞中诱导凋亡

本实施例显示本发明的Wnt 16抗体在人肺癌细胞中诱导了凋亡。此外，采用了蛋白质印迹分析证实了Wnt 16在其它癌细胞中的表达。这些试验一般是采用实施例1中所述的材料和方法进行的。

图9显示了小鼠抗-Wnt 16单克隆抗体处理后在人肺癌细胞系H460(肺部腺癌)中诱导的凋亡性细胞死亡。不用抗体(未处理)、用对照IgG抗体(对照Ab；5μg/mL；MOP，Sigma Chemicals)或用抗-Wnt 16单克隆抗体(Wnt 16 Ab；5μg/mL；BD Pharmingen，目录#552595)对H460细胞进行3天的处理。采用流式细胞计量术进行凋亡分析。与分别在未处理或用对照IgG抗体处理的细胞中所观察到的在5.59％和5.86％相比，用小鼠抗-Wnt 16单克隆抗体处理在75.9％细胞中诱导了凋亡。在单独的试验中，将H460细胞与10μg/ml的抗-Wnt 16单克隆抗体共同孵育，获得了以下结果：未用抗体处理的孵育H460细胞中具有5.7％的凋亡细胞；与对照IgG一起孵育H460细胞中具有6％的凋亡细胞；而与小鼠抗-Wnt16单克隆抗体一起孵育的细胞中具有97.5％的凋亡细胞。

在与上文所述类似的试验中，将H460细胞与人抗-Wnt 16抗体——Fab克隆#585的(见上文)一起孵育。图10显示了人肺癌细胞系H460中用人抗-Wnt 16Fab克隆#585处理后，所诱导的凋亡性细胞死亡。用对照IgG抗体(对照Ab；5ug/mL)或人Wnt 16抗体(Wnt 16Ab；5ug/mL；克隆#585)处理H460细胞3天。采用流式细胞计量术对凋亡进行分析。与在用对照IgG抗体处理的细胞中的7.92％相比，用Wnt 16抗体Fab克隆#585处理在37.3％的细胞中诱导了凋亡。

综上所述，这些结果显示抗-Wnt 16单克隆抗体在人癌细胞中诱导了肿瘤特异性的凋亡，这可能是通过经典和JNK途径实现的。

实施例13：Wnt 16蛋白在癌细胞中表达

为了分析Wnt 16在各种癌细胞中的表达，以Wnt 16多克隆抗体进行了蛋白质印迹分析。所测试的癌细胞系包括：白血病细胞系697、NB4和RCH-ACV；结肠癌细胞系SW480；间皮瘤细胞系H28；肺癌细胞系H460、H1703和A549；以及正常间皮细胞系LP9。图11显示了Wnt 16蛋白在各种人癌细胞系中表达，而在LP9细胞中未检测到Wnt 16表达。

实施例14：Wnt 16 mRNA在癌细胞中表达

采用RT-PCR分析了Wnt 16mRNA在非小细胞肺癌和细胞系中的表达。从原发肺癌和正常组织中分离总RNA。进行30-35个循环的RT-PCR，用凝胶电泳进行分析。分析了17个成对的RNA样品得出：17个肿瘤样品中的8个和1个正常样品显示出期望的PCR片段(图12A)。在乳腺癌细胞系MCF7中也显示出mRNA表达(图12B)。

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅仅为了说明，本领域技术人员能够根据它们作出各种修改和改变，这些修改和改变应该包括在本申请的构思和范围以及所附权利要求的范围内。将本文引用的所有发表物、专利和专利申请全文纳入本文作参考用于所有目的。

Claims (47)

1.一种抑制过表达Wnt 16的细胞增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与抑制Wnt 16信号转导的试剂接触的步骤，该试剂的用量足以抑制所述细胞的增殖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是癌细胞。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述癌细胞选自下组：肺癌、间皮瘤、黑色素瘤、结肠癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、淋巴瘤或非小细胞肺癌细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述癌细胞是白血病细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌细胞包含t(1；19)易位。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述白血病细胞是：急性类淋巴母细胞白血病细胞、前B细胞急性类淋巴母细胞白血病细胞或B细胞慢性淋巴细胞性白血病细胞。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述癌细胞是肺癌细胞。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂是siRNA。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂是抗-Wnt 16抗体。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗体特异性结合Wnt 16蛋白。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述Wnt 16蛋白是人Wnt 16b蛋白。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体结合由对应于SEQ ID NO：2所示的人Wnt 16的1-99氨基酸残基的氨基酸序列构成的多肽。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体特异性结合由SEQ ID NO：2所示的人Wnt 16的1-99氨基酸残基构成的多肽。

14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体结合包含以下序列号所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQID NO：16。

15.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体与第二抗-Wnt16抗体竞争结合Wnt 16，其中所述第二抗-Wnt 16抗体特异性结合由SEQ ID NO：2所示的人Wnt 16的1-99氨基酸残基构成的多肽。

16.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体与第二抗-Wnt16抗体竞争结合Wnt 16，其中所述第二抗-Wnt 16抗体特异性结合包含以下序列号所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。

17.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是多克隆抗体。

18.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是单克隆抗体。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是小鼠单克隆抗体。

20.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是嵌合抗体。

21.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是人源化抗体。

22.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是人Fab。

23.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是全长人抗体。

24.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是重组产生的。

25.如权利要求1所述的方法，该方法是在体外实施的。

26.如权利要求1所述的方法，该方法实在体内实施的。

27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞是在患者内的，所述接触的步骤是通过给予所述患者所述试剂来进行的。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述试剂是抗-Wnt 16抗体。

29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述试剂是siRNA。

30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，该方法还包括给予所述患者第二治疗剂。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述第二治疗剂是化疗剂。

32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述第二治疗剂是放疗剂。

33.一种诱导过表达Wnt 16的细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与抑制Wnt 16信号转导的试剂接触的步骤，该试剂的用量足以诱导所述细胞的凋亡。

34.一种治疗与Wnt 16信号转导相关的疾病的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的对象抑制Wnt 16信号转导的试剂，该试剂的用量足以治疗该疾病。

35.一种检测获自患者的生物样品中过表达Wnt 16的细胞的方法，所述方法包括检测所述生物样品中Wnt 16表达水平的步骤。

36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述生物样品是血清样品。

37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述生物样品是血液、唾液、尿液或粪便样品。

38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述检测Wnt 16表达水平的步骤是通过检测Wnt 16mRNA的水平来进行的。

39.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述检测Wnt 16表达水平的步骤是通过检测Wnt 16蛋白的水平来进行的。

40.如权利要求35所述的方法，其特征在于，将Wnt 16表达水平的检测用于预测对治疗方案的反应。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述治疗方案包括给予患者抗-Wnt 16单克隆抗体。

42.一种药物组合物，所述组合物包含抗-Wnt 16抗体和药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。

43.如权利要求42所述的药物组合物，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是多克隆抗体。

44.如权利要求42所述的药物组合物，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体是单克隆抗体。

45.如权利要求42所述的药物组合物，其特征在于，所述抗-Wnt 16抗体进一步与效应物组分结合。

46.如权利要求45所述的药物组合物，其特征在于，所述效应物组分是荧光标记。

47.如权利要求45所述的药物组合物，其特征在于，所述效应物组分是放射性同位素或细胞毒性化学物。

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