CN103517717B - 增强细胞介导的免疫的方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了一种在患有疾病，如癌症或感染，的个体中增强细胞介导的免疫的方法，包括给予所述个体GOLPH2的抑制剂。例如，抑制GOLPH2以增加IL‑12的内源性产生。

Description

增强细胞介导的免疫的方法

交叉引用美国相关专利申请

本申请要求2011年2月16日提交的申请号为61/443,569的美国临时专利申请的优先权，其整体内容具体地并入本文。

发明背景

癌症是一种严重的疾病和一大杀手。尽管近年来对某些癌症的诊断和治疗已经取得了进展，但是仍需要对其诊断和治疗进行改进。类似地，尽管在过去的10-30年中病毒和细菌感染的治疗已有所改善，但是仍需要能够显著提高存活率和/或缩短感染持续时间的新的方法和组合物。

刺激患者自身免疫系统的组合物和方法可能有助于治疗多种疾病，包括癌症以及细菌和病毒感染。一些研究表明在动物模型中IL-12可能能够活化宿主针对多种肿瘤的免疫器官（参见，Trinchieri&Scott(Curr Top Microbiol Immunol 238,57-78(1999);Rook等，Blood 94,902-8.(1999);Rook等，Ann N Y Acad Sci 941,177-84.(2001))。

用于调节免疫系统的其它方法可用在多种病症和疾病的治疗方案中。

发明概述

本申请提供了一种通过给予GOLPH2的抑制剂增强哺乳动物的细胞介导的免疫的方法。此类抑制剂能够通过多种方式增强哺乳动物的细胞介导的免疫，包括：例如，通过增加白介素-12和/或干扰素-γ的内源性产生。因此，用于抑制GOLPH2的方法和组合物可用在癌症和病原体感染的免疫治疗中，其得益于细胞介导的免疫应答可以控制、改善和消除病症，并且对病症或病症的复发进行长期保护。可以通过抑制GOLPH2治疗的病症和疾病包括：例如，肝癌、前列腺癌、肺癌、睾丸癌、胰腺癌和B-细胞癌，以及多种传染性疾病，如HIV/AIDS和肝炎。

附图说明

图1A-B表示BDSF^IL-12的活性及其同GOLPH2的关联。图1A表明树突状细胞分泌一种因子，该因子抑制活化的T细胞分泌干扰素-γ。将该因子称为BDSF^IL-12。使用CD4⁺T细胞MACS分离试剂盒从C57BL/6小鼠的脾脏中分离T淋巴细胞，将其在RPMI培养基（15%FBS，20ng/mlmIL-2）中培养4天。然后将T细胞铺板，1ml，1x10⁶个细胞/孔，在存在或不存在骨髓树突状细胞培养基上清（500μl）的条件下使用5μg/ml刀豆蛋白A（ConA）刺激24小时。特别地，将这些T细胞等分进行四种处理中的一种。第1种处理方式：将树突状细胞培养基上清加入T细胞中，其中树突状细胞是静息的，未被刺激。第2种处理方式：将树突状细胞培养基上清加入T细胞中，其中树突状细胞经脂多糖（LPS）刺激。第3种处理方式：将树突状细胞培养基上清加入T细胞中，其中树突状细胞使用2E2上清（含有BDSF^IL-12）培养。第4种处理方式：将树突状细胞培养基上清加入T细胞中，其中树突状细胞使用2E2上清（含有BDSF^IL-12）培养并且经脂多糖（LPS）刺激。图1B显示了无细胞培养基上清的SDS-PAGE分离图，该无细胞培养基上清来自静息的和经LPS刺激的RAMOS细胞和2E2细胞，将所检测的主要蛋白条带称为BDSF^IL-12（分子量>50kDa）。BDSF^IL-12的初步特征表现出下述生化性质：耐热；对蛋白酶和脂肪酶不敏感；通过无血清培养转化的B细胞生产；分子量分离显示BDSF^IL-12>50kDa。在进一步鉴定时，将来自静息和经LPS刺激的RAMOS细胞的无细胞培养基上清（第1-2道）在无胎牛血清培养基中培养24小时，而将2E2的无细胞培养基上清（第3道）煮沸30min，再用胰酶（50ng/ml）处理30分钟，通过SDS-PAGE凝胶分离。将来自静息和经LPS刺激的RAMOS细胞上清的较下方条带，如图1B中下面的箭头所示，切下并进行质谱分析。选择来自RAMOS的样品而非2E2的样品进行最终分析的原因在于：其对具有较高BDSF^IL-12活性的经刺激样品和具有较低或不具有活性的未经刺激样品之间具有可比性。在经LPS刺激的RAMOS上清中鉴定出可能与BDSF^IL-12对应的两种蛋白，其与对照样品（静息的RAMOS上清）相比具有明显较高的评分：一种较多和一种较少，高尔基体磷蛋白2（GOLPH2；主要产物）和Roquin（次要产物）的占比分别为7%和1%。

图2A-F显示FACS分析检测到的在不同细胞类型中GOLPH2的细胞位置不同，并且说明GOLPH2分泌至不同培养细胞系的上清中。图2A-E表明在静息（图2A）和经LPS活化（图2B）的原代人外周血B淋巴细胞中GOLPH2在细胞内和细胞表面大量表达。但是，在人肝细胞癌细胞系HepG2中，在细胞内表达的GOLPH2比在细胞表面表达的更多（图2C）。在RAW264.7细胞（小鼠巨噬细胞）中，GOLPH2完全在细胞内表达，加入LPS，对GOLPH2表达的水平和位置即使有影响，也是非常的小（图2D）。图2F显示了源于RAMOS细胞（静息和经LPS活化，分别在第2-3道）、2E2细胞（第4道）、HepG2细胞（人肝细胞癌（HCC），第5道）、B16细胞（小鼠黑色素瘤，第6道）、4T1细胞（小鼠乳腺癌，第7道）和RAW264.7细胞（小鼠巨噬细胞，第8道）的细胞培养基上清的Western印迹。将由组氨酸标记的表达载体表达的重组人GOLPH2作为阳性对照（第9道）。除非另有说明，否则分析静息细胞。

图3A-D为用于说明BDSF^IL-12/GOLPH2某些活性的图。图3A是说明由活化的T细胞分泌的干扰素-γ分泌情况的图，该T细胞暴露于不同细胞类型的细胞培养基的上清。使用表达带有组氨酸标签的人GOLPH2或无关核蛋白SREBP2的载体瞬时转染人胚肾293（HEK293）细胞。转染四十八小时后，收集无细胞培养基上清，以与上述图1A所述的相同方式加入到树突状细胞和T细胞的共培养物中。柱a：源于未经刺激的HEK细胞的细胞培养基上清；柱b；源于经LPS刺激的细胞的细胞培养基上清；柱c：经SREBP转染的细胞的细胞培养基上清；柱d：经GOLPH2转染的细胞的细胞培养基上清；和柱e：2E2细胞的细胞培养基上清。柱状图下面的小方框表示在使用SREBP2（柱c）或GOLPH2（柱d）对细胞进行重组转染后，使用带有组氨酸标签的单克隆抗体检测的HEK293细胞上清的Western印迹图。如图所示，GOLPH2表达并分泌至用于获得柱d所示结果的上清中，但未进入SREBP-转染的细胞的上清中（用于获得柱c所示的结果）。图3B为显示GOLPH2的表达增加使IL-12-p35的表达减少的图。在RAW264.7细胞中将人IL-12p35启动子-荧光素酶报告子构建体（参见，Kim等，Immunity 21,643-53(2004)）与表达人GOLPH2的效应器构建体或者对照空载体（pCDNA3）一同使用，效应器/报告子（E:R）的摩尔比为1:1、2:1和4:1。数据以相对启动子活性表示，即IFN-γ与LPS刺激的高于未刺激活性部分的比值。图3C显示GOLPH2减少由IL-12p35启动子而非由IL-12p40启动子驱动的表达。使用FLAGged空表达载体（FLAG），或者表达人GOLPH2或SREBP2的FLAGged载体瞬时转染HEK293细胞。转染四十八小时后，收集无细胞培养基上清，并将0.5ml加入到1.5ml经人IL-12p35-或IL-12p40-受体构建体转染6小时的RAW264.7细胞中。然后，再使用IFN-γ和LPS进一步刺激RAW264.7细胞7小时，随后收集进行荧光素酶活性检测，设置三复管。数据以平均值加标准偏差表示。图3D显示源于凋亡细胞（AC）和经LPS刺激的RAMOS细胞的上清减少由IL-12p35启动子而非由IL-12p40启动子驱动的表达。除了将凋亡细胞（AC）或RAMOS培养基上清加入RAW264.7细胞以外，进行与上文图3C所述的相同类型的报告子检测。

图4A-B显示当GOLPH2被抗-GOLPH2抗体抑制或因GOLPH2在氨基酸位点52或54突变而被抑制时，由IL-12p35启动子驱动的表达增加。图4A显示了在不存在和存在抗-GOLPH2抗体时由IL-12p35启动子驱动的表达。在转染的RAW264.7细胞中，2E2上清（含有BDSF^IL-12活性）抑制由IFN-γ和LPS诱导的p35-启动子驱动的转录。通过加入抗-GOLPH2多克隆抗体（其量在0-2μg/ml间变化）强烈地和特异性地抑制此类表达。该抗-GOLPH2多克隆抗体为来自Santa Cruz Biotechnologies（Santa Cruz,CA）的GP73（N-19）。同种型匹配的对照IgG抗体不抑制IL-12p35-启动子驱动的转录。图4B显示了突变的GOLPH2不抑制IL-12p35-启动子驱动的转录。IL-12p35报告子构建体与对照载体（pCR3.1），或者野生型GOLPH2（WT）-表达、分泌突变R52A-表达、分泌突变R54A-表达和Roquin-表达载体共转染入RAW264.7细胞，效应器与报告子的摩尔比（E:R）为0.2:1。测定经IFN-γ和LPS刺激细胞的荧光素酶活性。使用较低的E:R比值（1:0.2）以使得能理想地检测GOLPH2和Roquin之间的相互（协同）作用。当使用更高量时，与WT GOLPH2相比R52A和R54A的效力弱很多（数据未列出）。

图5A-B显示了对IL-12p35启动子内BDSF^IL-12-应答元件的鉴定。图5A显示了不同的人IL-12p35启动子序列，以及当用荧光素酶表达检测对其进行检测时，由那些启动子驱动的表达水平。含有野生型和跨核苷酸位置-1082至+61的突变IL-12p35启动子序列的核酸片段分别地与编码荧光素酶的核酸连接。野生型IL-12p35启动子片段（a）包括在核苷酸位置+13至+19的TGCCGCG序列。3’缺失的IL-12p35启动子片段（b）仅含有跨核苷酸位置-1082至-4的区域。三个突变IL-12p35启动子片段（c-e）具有特异性的碱基取代突变：XXCCGCG(c)、TGXXGCG(d)和TGCCXXG(e)。将启动子-报告子构建体转染至RAW264.7细胞，在存在或不存在源于2E2细胞的上清（含有BDSF^IL-12）的条件下进行共培养。使用LPS刺激细胞7小时，测定细胞裂解物的荧光素酶活性。如图所示，上清中存在的BDSF^IL-12抑制由野生型IL-12p35启动子驱动的表达，但是当启动子片段的核苷酸位置+13至+19缺失（a与b比较），或者在位置+17和+18突变为TGCCXXG（e）（a与e比较）时这种抑制丧失。图5B是Western印迹结果，其表明在所培养细胞的上清中存在的BDSF^IL-12导致GC-结合蛋白活化（磷酸化）。将RAW264.7细胞培养并暴露于培养基（Med），或凋亡Jurkat细胞（AC），或含有或不含IFNγ和LPS的源于2E2细胞的上清（BDSF^IL-12）。将核提取物与抗-GC-结合蛋白抗体免疫共沉淀（Kim等，Immunity21,643-53(2004)），随后用抗-磷酸-酪氨酸mAb（pY99）进行印记。上部：磷酸化-GC-BP；下部：总GC-BP（～80kDa）。如图所示，BDSF^IL-12刺激GC-结合蛋白的酪氨酸磷酸化。

图6A-B显示了在表达（野生型小鼠）和不表达（IgM敲除B^-/-小鼠）BDSF^IL-12的动物中，B16黑色素瘤的生长和免疫应答情况。图6A显示了在WT和IgM敲除（B^-/-）小鼠中B16黑色素瘤的生长情况。对小鼠（每组五只）皮下注射10⁶个肿瘤细胞以接种肿瘤。通过使用游标卡尺定期测量肿瘤直径以监测肿瘤的生长情况。图6B显示了在野生型和IgM敲除B^-/-脾细胞和/或肿瘤细胞中多种T细胞因子的表达水平。收集接种肿瘤小鼠（每组五只）的脾脏。将来自这些小鼠的脾细胞和肿瘤细胞（8:1）培养7天。通过ELISA分析源于这些培养物的上清中的细胞因子水平。如图所示，源于IgM敲除B^-/-小鼠的细胞中IL-10、INF-γ、p40和IL-12的表达水平升高。

图7是说明GOLPH2如何抑制IL-12产生和T细胞活化的示意图。在专门的抗原呈递细胞（树突状细胞（DC）和巨噬细胞）中通过先天免疫途径，如Toll样受体（TLR）-介导的信号和通过获得性免疫信号，如CD40L（#1），刺激IL-12基因的转录。这些活化NF-κB和IL-12p35的基因转录（#3）。活化的B淋巴细胞（#4）和恶性B细胞（#5）产生GOLPH2，其与DC（#6）上假定的受体（GOLPH2-R）结合并诱导GC-BP酪氨酸磷酸化（#7）。磷酸化的GC-BP转位至核（#8）并通过在ACRE与p35启动子区域的近端结合从而阻断IL-12的产生（Kim等，Immunity 21,643-53(2004)）（#9）。IL-12（#10）的缺乏导致阻断天然T（Th0）细胞（#11）的T_H1分化和活化，其限制了针对细胞内病原体和恶性肿瘤的细胞介导的免疫应答。在巨噬细胞中也诱导GC-BP磷酸化，该巨噬细胞通过磷脂酰丝氨酸受体（#12）与具有外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）的凋亡细胞（AC）相接触。

发明详述

如本申请所述，高尔基体磷蛋白2（GOLPH2），最初因其是抑制IL-12的B细胞来源的可溶性因子，所以被称为BDSF^IL-12，其是一种由B细胞产生的可溶性因子，其令人惊讶地通过抑制IL-12来作用于树突状细胞并调节T-细胞介导的免疫，IL-12是高效的T_H1细胞激活剂。GOLPH2对T细胞活性的调节作用具有重要的临床意义。T_H1细胞因子对细胞毒性T-细胞的活化是抗病毒和抗肿瘤免疫的重要组成部分。在初始和侵袭阶段，病毒和肿瘤细胞常常采用复杂和精细的策略逃避免疫攻击。在多种疾病中T_H1/T_H2平衡被破坏，该疾病包括HIV/AIDS、自身免疫性疾病和恶性肿瘤。B细胞在调节这种微妙平衡中发挥的作用在很大程度上未得到充分的认识。如本申请所述，BDSF^IL-12/GOLPH2由活化的和恶性B细胞产生，其提供了一种调节和刺激细胞免疫的方法，该方法用于抗肿瘤、抗病毒和抗微生物治疗。

在下面的叙述中，涉及的多种实施方式和附图构成了本发明的一部分，其以说明方式描述和显示。这些实施方式进行了详细描述以使得本领域技术人员能够实施本发明，应当理解的是可以采用其它实施方式并且在不脱离本发明范围的前提下可以对其进行合乎逻辑的改变。因此，下文所述的示例性实施方式不具有限制性意义。

高尔基体磷蛋白2

GOLPH2是此前功能未知的高尔基体磷蛋白。其也被称为高尔基体膜蛋白1（Golm1）、GP73和BDSF^IL-12。本发明人独立地鉴定了一种由B细胞分泌的可溶性因子，并发现该因子通过树突状细胞抑制IL-12的产生（图1A）。将这种B-细胞来源的可溶性因子称为BDSF^IL-12。随后的实验证明了BDSF^IL-12是GOLPH2。

发明人通过实验鉴定了可溶性、分泌性BDSF^IL-12的若干活性：

(i)BDSF^IL-12对胰酶和热（例如，煮沸）具有较高的抗性；

(ii)BDSF^IL-12选择性抑制IL-12分泌，但对TNF-α、IL-10,、IL-6和TGF-β的分泌没有影响；

(iii)以不依赖于TGF-β、IL-10、TNF-α和前列腺素E2的方式，BDSF^IL-12通过活化单核细胞和骨髓来源的树突状细胞抑制IL-12分泌；

(iv)BDSF^IL-12对其它树突状细胞的性质，如CD11c、CD80、CD86和MHC II的表面表达几乎没有影响；

(v)BDSF^IL-12，以其可溶性、细胞外形式，活化转录因子与IL-12p35启动子结合——当转录因子结合时抑制IL-12p35的转录；以及

(vi)即使B细胞未被HIV感染，但原代B细胞与HIV-1-感染的T细胞共培养也产生BDSF^IL-12。这些结果表明在HIV-感染患者中常见的T_H1受损至少部分是由过度活化的B淋巴细胞产生的BDSF^IL-12所致。

在本申请通篇描述了BDSF^IL-12（GOLPH2）的其它性质。

为进一步表征BDSF^IL-12，使用胰酶处理经LPS刺激的RAMOS（B淋巴瘤）细胞的培养基上清，煮沸10分钟，并使用SDS-PAGE凝胶分离含有可溶性蛋白的上清液（图1B）。将图1B的第1道和第2道中上方箭头指示的条带切下并进行质谱分析。经鉴定，在经LPS刺激的RAMOS上清中存在GOLPH2和若干其它蛋白，但其在未经刺激的RAMOS上清中不存在，未经刺激的RAMOS上清不具有IL-12抑制活性。随后的功能分析排除了其它蛋白，仅有GOLPH2具有BDSF-样活性。因而，发明人确定BDSF^IL12因子是GOLPH2。

BDSF^IL12/GOLPH2在多种组织的正常上皮细胞中广泛地表达，特别是在肠、前列腺、肾脏、肺和在中枢神经系统内。

在稳态条件下，GOLPH2是明显具有良性功能的完整的顺式高尔基体膜蛋白。但是，如本文所述，其循环出顺式高尔基体到达核内体和细胞表面，成为抑制免疫功能的可溶性因子。GOLPH2的核内转运导致前蛋白转化酶furin-介导的裂解，结果使其释放至细胞间隙。其以可溶性形式存在于血清中是人干细胞癌（HCC）的生物标志物。

73kDa的GOLPH2蛋白由位于人染色体9q21.33（小鼠染色体13）上的基因GOLM1编码，其最初通过来自患有成年巨细胞肝炎（一种推测为由病毒引起的罕见肝炎）的患者肝脏组织的cDNA文库差示筛选克隆得到（Kladney等，Gene 249,53-65(2000)）。在分泌蛋白发现创制（secreted protein discovery initiative）（SPDI）中独立地鉴定出GOLPH2，SPDI是一项由计算机工具辅助的在酵母细胞中利用生物信号序列捕获来鉴定新型人分泌和跨膜蛋白的大规模尝试。

GOLPH2基因在黑猩猩、犬、牛、小鼠和斑马鱼中是保守的。与GOLPH2最接近的人类同源物是癌症敏感性候选基因4（CASC4）蛋白（Swiss-Prot Q6P4E1），其是一种单通道II型膜蛋白，其表达水平的增加与HER-2/neu原癌基因的过表达相关。

已获得多种GOLPH2蛋白和核酸的GOLPH2序列，例如在由美国国家生物技术信息中心（见网站www.ncbi.nlm.nih.gov/）维护的序列数据库中。GOLPH2蛋白及其片段或抗原片段用于制备GOLPH2功能的抑制剂。人GOLPH2氨基酸序列的一个例子为登录号CAG33482.1（GI:48146519），见下述SEQ ID NO:1。

1 MGLGNGRRSM KSPPLVLAAL VACIIVLGFN YWIASSRSVD

41 LQTRIMELEG RVRRAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL

81 DKIQSSHNFQ LESVNKLYQD EKAVLVNNIT TGERLIRVLQ

121 DQLKTLQRNY GRLQQDVLQF QKNQTNLERK FSYDLSQCIN

161 QMKEVKEQCE ERIEEVTKKG NEAVASRDLS ENNDQRQQLQ

201 ALSEPQPRLQ AAGLPHTEVP QGKGNVLGNS KSQTPAPSSE

241 VVLDSKRRVE KEETNEIQVV NEEPQRDRLP QEPGREQVVE

281 DRPVGGRGFG GAGELGQTPQ VQAALSVSQE NPEMEGPERD

321 QLVIPDGQEE EQEAAGEGRN QQKLRGEDDY NMDENEAESE

361 TDKQAALAGN DRNIDVFNVE DQKRDTINLL DQREKRNHTL

将该400个氨基酸的GOLPH2蛋白在位置53后面的两个精氨酸之间裂解以产生能够由细胞分泌的可溶性形式的GOLPH2。因此SEQ ID NO:1 GOLPH2蛋白的可溶性形式具有下述序列（SEQ ID NO:2）。

54 RAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL

81 DKIQSSHNFQ LESVNKLYQD EKAVLVNNIT TGERLIRVLQ

121 DQLKTLQRNY GRLQQDVLQF QKNQTNLERK FSYDLSQCIN

161 QMKEVKEQCE ERIEEVTKKG NEAVASRDLS ENNDQRQQLQ

201 ALSEPQPRLQ AAGLPHTEVP QGKGNVLGNS KSQTPAPSSE

241 VVLDSKRRVE KEETNEIQVV NEEPQRDRLP QEPGREQVVE

281 DRPVGGRGFG GAGELGQTPQ VQAALSVSQE NPEMEGPERD

321 QLVIPDGQEE EQEAAGEGRN QQKLRGEDDY NMDENEAESE

361 TDKQAALAGN DRNIDVFNVE DQKRDTINLL DQREKRNHTL

GOLPH2蛋白具有跨膜区，该跨膜区包括跨氨基酸位置12-34的区域，并具有下述氨基酸序列（SEQ ID NO:3）：SPPLVLAALVACIIVLGFNYWIA。无N-末端区域包括此跨膜区的GOLPH2蛋白具有下述序列（SEQ ID NO:4）。

35 SSRSVD

41 LQTRIMELEG RVRRAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL

81 DKIQSSHNFQ LESVNKLYQD EKAVLVNNIT TGERLIRVLQ

121 DQLKTLQRNY GRLQQDVLQF QKNQTNLERK FSYDLSQCIN

161 QMKEVKEQCE ERIEEVTKKG NEAVASRDLS ENNDQRQQLQ

201 ALSEPQPRLQ AAGLPHTEVP QGKGNVLGNS KSQTPAPSSE

241 VVLDSKRRVE KEETNEIQVV NEEPQRDRLP QEPGREQVVE

281 DRPVGGRGFG GAGELGQTPQ VQAALSVSQE NPEMEGPERD

321 QLVIPDGQEE EQEAAGEGRN QQKLRGEDDY NMDENEAESE

361 TDKQAALAGN DRNIDVFNVE DQKRDTINLL DQREKRNHTL

GOLPH2蛋白具有卷曲螺旋结构域，其包括跨SEQ ID NO:1序列的氨基酸位置35-203的序列。该序列如下述SEQ ID NO:5所示。

35 SSRSVD

41 LQTRIMELEG RVRRAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL

81 DKIQSSHNFQ LESVNKLYQD EKAVLVNNIT TGERLIRVLQ

121 DQLKTLQRNY GRLQQDVLQF QKNQTNLERK FSYDLSQCIN

161 QMKEVKEQCE ERIEEVTKKG NEAVASRDLS ENNDQRQQLQ

201 ALS

在裂解和分泌后，GOLPH2卷曲螺旋结构域将在N-末端截短，并且将具有下述序列（SEQ ID NO:6）。

54 RAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL

81 DKIQSSHNFQ LESVNKLYQD EKAVLVNNIT TGERLIRVLQ

121 DQLKTLQRNY GRLQQDVLQF QKNQTNLERK FSYDLSQCIN

161 QMKEVKEQCE ERIEEVTKKG NEAVASRDLS ENNDQRQQLQ

201 ALS

这些和其它GOLPH2蛋白片段可用于制备GOLPH2抑制剂。例如，具有氨基酸54-90的GOLPH2蛋白片段可以具有此类作用。该GOLPH2蛋白片段具有下述序列（SEQ ID NO:7）。

54 RAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL DKIQSSHNFQ

识别SEQ ID NO:7 GOLPH2蛋白片段的家兔抗-GOLPH2多克隆抗体（GP73（N-19））是GOLPH2的有效抑制剂。

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸91-130的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:8）。

91 LESVNKLYQD EKAVLVNNIT TGERLIRVLQ DQLKTLQRNY

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸131-170的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:9）。

131 GRLQQDVLQF QKNQTNLERK FSYDLSQCIN QMKEVKEQCE

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸171-210的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:10）。

171 ERIEEVTKKG NEAVASRDLS ENNDQRQQLQ ALSEPQPRLQ

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸211-250的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:11）。

211 AAGLPHTEVP QGKGNVLGNS KSQTPAPSSE VVLDSKRRVE

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸251-290的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:12）。

251 KEETNEIQVV NEEPQRDRLP QEPGREQVVE DRPVGGRGFG

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸291-330的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:13）。

291 GAGELGQTPQ VQAALSVSQE NPEMEGPERD QLVIPDGQEE

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸331-370的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:14）。

331 EQEAAGEGRN QQKLRGEDDY NMDENEAESE TDKQAALAGN

可以用于制备GOLPH2抑制剂的另一种GOLPH2蛋白片段包括，例如具有氨基酸371-400的GOLPH2，其具有下述序列（SEQ ID NO:15）。

371 DRNIDVFNVE DQKRDTINLL DQREKRNHTL

编码上述GOLPH2蛋白（SEQ ID NO:1-15）的核酸序列可以是登录号为CR457201.1（GI:48146518），如下述核酸SEQ ID NO:16所示。

1 ATGGGCTTGG GAAACGGGCG TCGCAGCATG AAGTCGCCGC

41 CCCTCGTGCT GGCCGCCCTG GTGGCCTGCA TCATCGTCTT

81 GGGCTTCAAC TACTGGATTG CGAGCTCCCG GAGCGTGGAC

121 CTCCAGACAC GGATCATGGA GCTGGAAGGC AGGGTCCGCA

161 GGGCGGCTGC AGAGAGAGGC GCCGTGGAGC TGAAGAAGAA

201 CGAGTTCCAG GGAGAGCTGG AGAAGCAGCG GGAGCAGCTT

241 GACAAAATCC AGTCCAGCCA CAACTTCCAG CTGGAGAGCG

281 TCAACAAGCT GTACCAGGAC GAAAAGGCGG TTTTGGTGAA

321 TAACATCACC ACAGGTGAGA GGCTCATCCG AGTGCTGCAA

361 GACCAGTTAA AGACCCTGCA GAGGAATTAC GGCAGGCTGC

401 AGCAGGATGT CCTCCAGTTT CAGAAGAACC AGACCAACCT

441 GGAGAGGAAG TTCTCCTACG ACCTGAGCCA GTGCATCAAT

481 CAGATGAAGG AGGTGAAGGA ACAGTGTGAG GAGCGAATAG

521 AAGAGGTCAC CAAAAAGGGG AATGAAGCTG TAGCTTCCAG

561 AGACCTGAGT GAAAACAACG ACCAGAGACA GCAGCTCCAA

601 GCCCTCAGTG AGCCTCAGCC CAGGCTGCAG GCAGCAGGCC

641 TGCCACACAC AGAGGTGCCA CAAGGGAAGG GAAACGTGCT

681 TGGTAACAGC AAGTCCCAGA CACCAGCCCC CAGTTCCGAA

721 GTGGTTTTGG ATTCAAAGAG ACGAGTTGAG AAAGAGGAAA

761 CCAATGAGAT CCAGGTGGTG AATGAGGAGC CTCAGAGGGA

801 CAGGCTGCCG CAGGAGCCAG GCCGGGAGCA GGTGGTGGAA

841 GACAGACCTG TAGGTGGAAG AGGCTTCGGG GGAGCCGGAG

881 AACTGGGCCA GACCCCACAG GTGCAGGCTG CCCTGTCAGT

921 GAGCCAGGAA AATCCAGAGA TGGAGGGCCC TGAGCGAGAC

961 CAGCTTGTCA TCCCCGACGG ACAGGAGGAG GAGCAGGAAG

1001 CTGCCGGGGA AGGGAGAAAC CAGCAGAAAC TGAGAGGAGA

1041 AGATGACTAC AACATGGATG AAAATGAAGC AGAATCTGAG

1081 ACAGACAAGC AAGCAGCCCT GGCAGGGAAT GACAGAAACA

1121 TAGATGTTTT TAATGTTGAA GATCAGAAAA GAGACACCAT

1161 AAATTTACTT GATCAGCGTG AAAAGCGGAA TCATACACTT

1201 TAA

人GOLPH2氨基酸序列的另一个例子可以是登录号CAG33482.1（GI:48146519），如下述SEQ ID NO:17所示。

1 MMGLGNGRRS MKSPPLVLAA LVACIIVLGF NYWIASSRSV

41 DLQTRIMELE GRVRRAAAER GAVELKKNEF QGELEKQREQ

81 LDKIQSSHNF QLESVNKLYQ DEKAVLVNNI TTGERLIRVL

121 QDQLKTLQRN YGRLQQDVLQ FQKNQTNLER KFSYDLSQCI

161 NQMKEVKEQC EERIEEVTKK GNEAVASRDL SENNDQRQQL

201 QALSEPQPRL QAAGLPHTEV PQGKGNVLGN SKSQTPAPSS

241 EVVLDSKRQV EKEETNEIQV VNEEPQRDRL PQEPGREQVV

281 EDRPVGGRGF GGAGELGQTP QVQAALSVSQ ENPEMEGPER

301 DQLVIPDGQE EEQEAAGEGR NQQKLRGEDD YNMDENEAES

361 ETDKQAALAG NDRNIDVFNV EDQKRDTINL LDQREKRNHT

401 L

将该401个氨基酸的GOLPH2蛋白在位置54后面的两个精氨酸之间裂解以产生与序列SEQ ID NO:2相同的可溶性GOLPH2蛋白。

上述GOLPH2 SEQ ID NO:17序列的核酸序列可以是登录号AY358593.1（GI:37182307），如下述核酸SEQ ID NO:18所示。

1 GCTCGAGGCC GGCGGCGGCG GGAGAGCGAC CCGGGCGGCC

41 TCGTAGCGGG GCCCCGGATC CCCGAGTGGC GGCCGGAGCC

81 TCGAAAAGAG ATTCTCAGCG CTGATTTTGA GATGATGGGC

121 TTGGGAAACG GGCGTCGCAG CATGAAGTCG CCGCCCCTCG

161 TGCTGGCCGC CCTGGTGGCC TGCATCATCG TCTTGGGCTT

201 CAACTACTGG ATTGCGAGCT CCCGGAGCGT GGACCTCCAG

241 ACACGGATCA TGGAGCTGGA AGGCAGGGTC CGCAGGGCGG

281 CTGCAGAGAG AGGCGCCGTG GAGCTGAAGA AGAACGAGTT

321 CCAGGGAGAG CTGGAGAAGC AGCGGGAGCA GCTTGACAAA

361 ATCCAGTCCA GCCACAACTT CCAGCTGGAG AGCGTCAACA

401 AGCTGTACCA GGACGAAAAG GCGGTTTTGG TGAATAACAT

441 CACCACAGGT GAGAGGCTCA TCCGAGTGCT GCAAGACCAG

481 TTAAAGACCC TGCAGAGGAA TTACGGCAGG CTGCAGCAGG

521 ATGTCCTCCA GTTTCAGAAG AACCAGACCA ACCTGGAGAG

561 GAAGTTCTCC TACGACCTGA GCCAGTGCAT CAATCAGATG

601 AAGGAGGTGA AGGAACAGTG TGAGGAGCGA ATAGAAGAGG

641 TCACCAAAAA GGGGAATGAA GCTGTAGCTT CCAGAGACCT

681 GAGTGAAAAC AACGACCAGA GACAGCAGCT CCAAGCCCTC

721 AGTGAGCCTC AGCCCAGGCT GCAGGCAGCA GGCCTGCCAC

761 ACACAGAGGT GCCACAAGGG AAGGGAAACG TGCTTGGTAA

801 CAGCAAGTCC CAGACACCAG CCCCCAGTTC CGAAGTGGTT

841 TTGGATTCAA AGAGACAAGT TGAGAAAGAG GAAACCAATG

881 AGATCCAGGT GGTGAATGAG GAGCCTCAGA GGGACAGGCT

921 GCCGCAGGAG CCAGGCCGGG AGCAGGTGGT GGAAGACAGA

961 CCTGTAGGTG GAAGAGGCTT CGGGGGAGCC GGAGAACTGG

1001 GCCAGACCCC ACAGGTGCAG GCTGCCCTGT CAGTGAGCCA

1041 GGAAAATCCA GAGATGGAGG GCCCTGAGCG AGACCAGCTT

1081 GTCATCCCCG ACGGACAGGA GGAGGAGCAG GAAGCTGCCG

1121 GGGAAGGGAG AAACCAGCAG AAACTGAGAG GAGAAGATGA

1161 CTACAACATG GATGAAAATG AAGCAGAATC TGAGACAGAC

1201 AAGCAAGCAG CCCTGGCAGG GAATGACAGA AACATAGATG

1241 TTTTTAATGT TGAAGATCAG AAAAGAGACA CCATAAATTT

1281 ACTTGATCAG CGTGAAAAGC GGAATCATAC ACTCTGAATT

1321 GAACTGGAAT CACATATTTC ACAACAGGGC CGAAGAGATG

1361 ACTATAAAAT GTTCATGAGG GACTGAATAC TGAAAACTGT

1401 GAAATGTACT AAATAAAATG TACATCTGA

结构分析揭示，GOLPH2在跨膜区后完全是螺旋的，具有两个长度为150至200个残基的预计连续的螺旋区。这种显著的螺旋性质可以解释其对蛋白酶的抗性，因为蛋白水解需要伸展的结构如β-股或不规则卷曲构象。GOLPH2极其简单的二级结构还可以解释其耐热性，因为该蛋白可能具有非常高的变性温度或可能易于在冷却后重新折叠。

研究发现在患有肝病，特别是肝细胞癌（HCC）的患者血清中具有高水平的GOLPH2（Li&Fan,Hepatology50,1682(2009);Marrero等，J Hepatol43,1007-12(2005)）。与最常用的癌症血清标志物α-甲胎蛋白相比，GOLPH2的血清水平针对早期HCC似乎更加敏感（Marrero等，J Hepatol43,1007-12(2005)）。在HCC中GOLPH2被岩藻糖基化，在血清中其岩藻糖基化的部分甚至是更好的疾病标志物（Block等，Proc Natl Acad Sci U S A 102,779-84(2005)）。在具有HCV 1b基因型感染背景发展成HCC的患者中检测到GOLPH2的血清水平升高最为显著（Riener等，Hepatology49,1602-9(2009)）。在肺癌患者中GOLPH2的血清水平也显著升高（Zhang等，Clin Biochem43,983-91(2010)）。GOLPH2还被描述为用于诊断前列腺癌的非常好的辅助组织生物标志物（Kristiansen等，Br.J.Cancer 99:939-48(2008)）。

表达C-末端截短GOLPH2的转基因小鼠表现出存活率降低，并具有较强炎性细胞浸润的肝肾病变（Wright等，Int J Clin Exp Pathol2,34-47(2009)）。这种肾脏病变与在脂蛋白簇（CLU）敲除小鼠中观察到的情况有几分类似（Whelchel等，Invest Ophthalmol VisSci 34,2603-6(1993)），其分泌形式（sCLU）表现为通过后面的C-末端与分泌的GOLPH2发生相互作用（Li&Fan,Hepatology50,1682(2009)）。

如本申请所述，GOLPH2具有一个迄今为止未知的和意想不到的功能：通过树突状细胞调节IL-12产生，并且调节IL-12驱动的T_H1活化。本申请所描述的实验证明了GOLPH2的细胞和分子机制，及其影响细胞介导的对肿瘤生长和免疫逃逸的抵抗。本申请进一步证明了，用于抑制GOLPH2的组合物和方法增加IL-12表达，并降低GOLPH2通常表现出的免疫抑制活性。

一种传统的免疫学范式是：B细胞和T细胞之间的相互作用是T细胞辅助B细胞最终分化为免疫球蛋白类别转换的血浆细胞的单向现象。本申请所述的研究对这种理论发起挑战，并且在这一缺失环节定义了特定的分子：GOLPH2，本申请中将其描述为癌症治疗的新靶点。

图7描述了GOLPH2诱导的对IL-12产生的抑制和T细胞活化的预计模型。在专门的抗原呈递细胞（DCs和巨噬细胞）中通过先天免疫途径，如TLR-介导的信号，和通过获得性免疫信号，如CD40L（#1），刺激IL-12基因的转录。这些活化NF-κB和IL-12p35的基因转录（#3）。活化的B淋巴细胞（#4）和恶性B细胞（#5）产生GOLPH2，其与DCs（#6）上假定的受体（GOLPH2-R）结合并诱导GC-BP酪氨酸磷酸化（#7）。磷酸化的GC-BP转位至核（#8）并通过在ACRE与近端的p35启动子区域结合来阻断IL-12的产生（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）（#9）。IL-12（#10）的缺乏导致天然T（Th0）细胞（#11）的活化和T_H1分化的阻断，这限制了针对细胞内病原体和恶性肿瘤的细胞介导的免疫应答。在吞噬细胞中也诱导了GC-BP磷酸化，该吞噬细胞与具有外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）的凋亡细胞（AC）通过磷脂酰丝氨酸受体（#12）接触。

治疗方法

本发明的一个方面是一种在有需要的哺乳动物中增强细胞介导的免疫的方法，其包括给予所述哺乳动物GOLPH2抑制剂，从而在哺乳动物中增强细胞介导的免疫。细胞介导的免疫是一种不涉及抗体但涉及巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK）、抗原-特异性细胞毒性T-淋巴细胞的活性的免疫应答，并且在对抗原的应答中涉及多种细胞因子的释放。

如本申请所述，GOLPH2抑制剂增加哺乳动物IL-12的内源性产生。在某些实施方式中，GOLPH2抑制剂使哺乳动物IL-12的内源性产生增加10%、或20%、或50%、或70%、或100%、或150%、或200%、或300%、或400%、或500%、或700%、或1000%。

GOLPH2抑制剂还能够通过活化T淋巴细胞增加干扰素-γ（IFN-γ）的产生。在某些实施方式中，GOLPH2抑制剂使哺乳动物T淋巴细胞IFN-γ的内源性产生增加10%、或20%、或50%、或70%、或100%、或150%、或200%、或300%、或400%、或500%、或700%、或1000%。

本申请所述的方法和组合物能够用于治疗多种癌症和肿瘤，例如白血病、肉瘤、骨肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、嗜铬细胞瘤、肝细胞癌、卵巢癌、皮肤癌、睾丸癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、头颈部癌、脑癌、食管癌、膀胱癌、肾上腺皮质癌、肺癌、支气管癌、子宫内膜癌、鼻咽癌、宫颈癌或肝癌、以及原发灶不明的癌症。

能够治疗的肝脏疾病的例子包括：那些涉及肝炎病毒和与急性或慢性病毒性肝炎（如乙型肝炎和丙型肝炎）相关的肝脏疾病，或由丙型肝炎引起的肝硬化或肝细胞癌。将乙型肝炎定义为由HBV感染引起的肝炎，将丙型肝炎定义为由HCV感染引起的肝炎。将慢性肝炎定义为肝脏中的炎症持续或几乎持续6个月或以上的临床状况。将肝脏疾病定义为肝脏的炎性病症，该概念可以根据症状的进展情况包括脂肪肝、肝硬化和肝细胞癌。

本申请所述的方法和组合物还能够用于治疗多种微生物感染，包括：例如，细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌和其它微生物。

例如，所治疗的感染可以是致病性细菌导致的感染，如志贺氏菌，伤寒沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，霍乱弧菌，空肠弯曲菌，空肠螺旋杆菌，铜绿假单胞菌，流感嗜血杆菌，百日咳杆菌（百日咳），霍乱弧菌，和大肠杆菌，大肠杆菌包括致泻性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌（EaggEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肾盂肾炎大肠杆菌（UPEC）和新生儿脑膜炎大肠杆菌（NMEC）。可以治疗的其它致病性细菌感染可以由包括炭疽芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、类鼻疽杆菌、伯氏考克斯体、布鲁氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、金黄色葡萄球菌、耐药链球菌、普氏立克次氏体、志贺氏菌、沙门氏菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、空肠弯曲菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的感染引起。

本申请所述的组合物可以治疗或预防多种病毒感染，包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、人免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、长囊水云病毒、水泡性口病毒、病毒性脑炎（如东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒和西部马脑炎病毒）、病毒性出血热（如埃博拉、马尔堡、朱宁、阿根廷和拉沙病毒）、流感病毒和禽流感病毒（有时也被称为鸟流感）。其它可以治疗的病毒感染包括但不限于那些涉及重型天花（痘症）和其它痘病毒、砂粒病毒（包括LCM、朱宁病毒、马丘波病毒、瓜纳里托病毒、拉沙热病毒）、布尼亚病毒（包括汉坦、裂谷热病毒）、黄病毒（包括登革热病毒）、丝状病毒（包括埃博拉病毒和马尔堡病毒）、蜱媒出血热病毒（包括克里米亚-刚果出血热病毒）、蜱媒脑炎病毒、黄热病毒、流感病毒、狂犬病毒、西尼罗河病毒、拉克罗斯病毒、加利福尼亚脑炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、日本脑炎病毒和贾萨努尔森林病毒的感染。

IL-12的抗肿瘤作用

IL-12能够在动物模型中显著活化宿主的免疫系统来对抗多种肿瘤。IL-12的抗肿瘤作用通过活化非抗原特异性的自然杀伤（NK）细胞，MHC I介导的细胞毒性，以及诱导T_H1效应器细胞和活化用于肿瘤特异性消除和长期保护性免疫的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）来介导的。IL-12活化五个重要的免疫效应器细胞[NK、CTL、T辅助细胞（T_H）、淋巴组织诱导（LTi）细胞、树突状细胞（DC）和巨噬细胞]的能力使得肿瘤几乎没有机会逃逸。如上文所述，调节T细胞分化（包括T_H1分化）的信号从B-细胞发出。

多种肿瘤在原位缺乏明显的免疫原性可能是因为肿瘤细胞的特殊性质所致，例如缺乏共刺激分子、下调MHC细胞或产生免疫抑制性因子。这种免疫原性的缺乏还可能是由免疫系统固有的耐受机制所致。IL-12能够显著改善较弱的抗肿瘤免疫应答并提供肿瘤特异性消除和长期保护性免疫。

IL-12活化五个重要的免疫效应器细胞：自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助（T_H）细胞、淋巴组织诱导（LTi）细胞、树突状细胞（DC）和巨噬细胞。这些IL-12活化细胞的综合作用使得肿瘤几乎没有机会逃脱宿主的免疫系统。因而，如果IL-12的产生增强，则能够克服肿瘤细胞的免疫原性缺乏，并且宿主自身的免疫系统就能够消除癌细胞而不需要导致衰弱的化疗。

IL-12用于人T细胞淋巴瘤、B细胞非霍奇金氏淋巴瘤、黑色素瘤和肾癌的人临床应用和在恒河猴SIV-感染模型中的初步结果均支持IL-12具有潜在的抗肿瘤治疗作用。参见，Rook等，Blood94,902-8.(1999)；Rook等，Ann N Y Acad Sci 941,177-84.(2001)；Ansell等，Blood99,67-74(2002)；Mortarini等，Cancer Res60,3559-68.(2000)；Gollob等，ClinCancer Res6,1678-92.(2000)；Lee等，J Clin Oncol19,3836-47.(2001)；Kang等，HumGene Ther12,671-84.(2001)；Gajewski等，Clin Cancer Res7,895s-901s.(2001)；Portielje等，Clin Cancer Res5,3983-9.(1999)；Ansari等，J Virol76,1731-43.(2002)。

在经过不确定重组IL-12的安全性和对导致其不良作用的原因进行密集调查的短暂时期后，最近重新将其用于设计更为合理的癌症治疗，如联合治疗和疫苗佐剂，例如，用于与卵巢癌或原发性腹膜癌相关的腹膜癌（Lenzi等，J Transl Med5,66(2007)）、AIDS-相关的卡波西氏肉瘤（Little等，Blood110,4165-71(2007)）、复发难治性非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏病（Younes等，Clin Cancer Res10,5432-8(2004)）和晚期黑色素瘤（Peterson等，J Clin Oncol21,2342-8(2003)）。

在恶性肿瘤中的T_H1/T_H2失衡

越来越多的临床和实验证据表明，在肿瘤生长中或将要生长时，早期和持续的炎症型应答调节肿瘤生长的多个方面（de Visser等，Nat Rev Cancer6,24-37(2006)）。现在人们认识到持续性的体液免疫应答加剧了肿瘤微环境中先天性免疫细胞的募集和活化，在肿瘤微环境中其调节组织重塑、促血管生成通路和促存活通路，这共同促进了癌症的生长（Andreu等，Cancer Cell17,121-134(2010)）。已知前恶性和恶性组织与免疫细胞功能的改变相关，包括抑制细胞介导的免疫（CMI），与排斥肿瘤失败相关，同时伴随着增强能够促进肿瘤生长和发展的体液免疫。（Dalgleish等，Adv Cancer Res84,231-76(2002)）。无数人和动物模型的研究证明了T_H1和T_H2细胞因子的平衡对多种癌症的发展具有非常重要的影响（Agarwal等，Cancer Immunol Immunother55,734-43(2006)；Kanazawa等，Anticancer Res25,443-9(2005)；Galon等，Science313,1960-4(2006)；Sheu等，J Immunol167,2972-8(2001)）。

T_H1/T_H2失衡可能反映了细胞免疫的显著变化，这在恶性血液病中、在患有急性淋巴细胞白血病（ALL）的儿童和成人中、在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中、在结直肠腺癌中和在卵巢癌发展过程中均是有据可查的。参见，Mori等，Cancer Immunol Immunother50,566-8(2001)；Zhang等，Cancer Immunol Immunother 49,165-72(2000)；Yotnda等，ExpHematol27,1375-83(1999)；de Totero等，Br J Haematol 104,589-99(1999)；Cui等，Cancer Immunol Immunother56,1993-2001(2007)；Kusuda等，Oncol Rep13,1153-8(2005)。

B细胞通过树突状细胞对T细胞应答的调节

一种传统的免疫学范式是B-细胞和T-细胞之间的相互作用是T-细胞辅助B细胞最终分化为免疫球蛋白种类改变的血浆细胞的单向现象。然而，最近的研究表明B细胞对T-细胞的分化和效应器功能具有反向影响。例如，B细胞能够诱导抗原特异性CD8⁺T细胞的直接耐受、通过转化生长因子-β（TGF-β）的产生使得T-细胞无反应力、通过树突状细胞下调IL-12的产生、和通过产生调节性细胞因子影响T_H1/T_H2的分化（Bennett等，J Exp Med188,1977-83(1998)；Eynon&Parker,J Exp Med175,131-8(1992)；Fuchs等，Science 258,1156-9(1992)；Parekh等，J Immunol170,5897-911(2003)；Skok等，J Immunol 163,4284-91(1999)；Mori等，J Exp Med176,381-8(1992)；Harris等，Nat Immunol1,475-82(2000)）。类似地，B细胞能够在T细胞免疫的体内模型中表现出调节功能，包括肿瘤排斥、实验性自身免疫性脑炎（EAE）和类风湿性关节炎（RA）（Qin等，Nat Med4,627-30(1998)；Fillatreau等，Nat Immunol3,944-50(2002)；Mauri等，J Exp Med197,489-501(2003)）。在小鼠中，最近鉴定出具有IL-10依赖性负向T-细胞调节功能的相对罕见的脾脏B细胞亚型，并将其命名为B10细胞（Matsushita等，J Clin Invest118,3420-30(2008)；Watanabe等，J Immunol 184,4801-9(2010)；Yanaba等，Immunity28,639-50(2008)）。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，显示出B10细胞通过抑制树突状细胞作为抗原呈递细胞（APC）的能力，间接调节T细胞介导的自身免疫（Matsushita等，J Immunol185,2240-52(2010)）。B细胞能够抑制树突状细胞接种的能力以防止肿瘤的生长（Watt等，J Immunother 30,323-32(2007)）。B细胞对树突状细胞诱导免疫的抑制作用与同肿瘤抗原相关的I类主要组织相容性分子（MHC）的提呈无关，但与II类MHC表达的B细胞相关。给予B细胞不会改变树突状细胞从注射部位迁移的能力或者削弱树突状细胞-T细胞之间在引流淋巴结内的相互作用。通过CD4⁺、CD25⁺调节的T细胞的耗竭，部分逆转了B细胞的抑制性作用（Watt等，J Immunother 30,323-32(2007)）。因而，B细胞是一种重要的，但是到目前为止被低估了的T细胞介导免疫的调节剂。

针对GOLPH2的抗体

本发明还提供了优选地与GOLPH2蛋白结合的抗体和结合实体。本发明的抗-GOLPH2抗体和结合实体能够与GOLPH2蛋白上的任意表位结合。例如，所述的抗-GOLPH2抗体和结合实体能够与具有SEQ ID NO:1-15和17中任意一个的GOLPH2多肽的任意表位结合。然而，优选地，抗-GOLPH2抗体和结合实体特异性地与以其可溶的、胞外形式的GOLPH2结合。抗体-GOLPH2抗体/结合实体能够结合的GOLPH2多肽序列的例子包括：具有SEQ ID NO:2、4-15中任意一个的GOLPH2多肽。

抗体-GOLPH2抗体和/或结合实体能够结合的GOLPH2表位可以包括具有片段长度，例如约10-20个氨基酸，的任意GOLPH2肽序列。这样，可以从具有SEQ ID NO:1-15和17中任意一个的多肽或其任意类似物引入GOLPH2表位，以产生抗-GOLPH2抗体和/或结合实体。这样，在某些实施方式中，GOLPH2表位可以是截短的多肽，例如从其N-末端和/或C-末端移除任意数量氨基酸的SEQ ID NO:1-15和17中的任意一个。例如，可以使用其N-末端和/或C-末端缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或60个氨基酸的截短的SEQ ID NO:1-15和17多肽作为产生抗-GOLPH2抗体和/或结合实体的表位。在其它实施方式中，所述GOLPH2表位可以是具有一个或多个氨基酸取代的多肽。例如，所述GOLPH2表位可以具有其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或60个氨基酸被其它氨基酸取代的SEQ ID NO:1-15和17序列中的任意一个的多肽。在某些实施方式中，取代的氨基酸具有类似的化学结构或类似的化学性质。

与此类GOLPH2表位特异性结合的抗-GOLPH2抗体和/或结合实体用于抑制分泌的GOLPH2。如本申请所述，当GOLPH2裂解并分泌后，其通过，例如抑制IL-12产生，来抑制免疫应答。然而，给予分泌的GOLPH2的抑制剂能够减轻抑制和刺激免疫应答。

因此，本发明提供了通过现有程序制备的抗体和结合实体，其能够与GOLPH2，特别是可溶的、分泌的GOLPH2结合。优选抑制GOLPH2的功能并且恢复IL-12表达的抗体。用于治疗目的时，优选人或人源化抗-GOLPH2抗体。因而，抗体或结合实体的结合结构域，例如对GOLPH2具有特异性的抗体的CDR区，可以被转化成或同任意适当的结合实体骨架，包括人抗体骨架，一起使用。

抗体分子属于被称为免疫球蛋白的血浆蛋白家族，其基本构造块，即免疫球蛋白折叠或结构域，在免疫系统和其它生物识别系统的多种分子中以不同形式应用。典型的抗体是由两条相同的免疫球蛋白重链和两条相同的轻链组成的四聚体结构，其分子量约为150,000道尔顿。

抗体的重链和轻链由不同结构域组成。每条轻链具有一个可变结构域（VL）和一个恒定结构域（CL），而每条重链具有一个可变结构域（VH）和三个或四个恒定结构域（CH）。参见，例如Alzari,P.N.,Lascombe,M.-B.&Poljak,R.J.(1988)Three-dimensionalstructure of antibodies.Annu.Rev.Immunol.6,555-580。各结构域由约110个氨基酸残基组成，折叠成由两个β-折叠彼此挤压形成的典型的β-三明治结构，即免疫球蛋白折叠。VH和VL结构域均具有三个互补性决定区（CDR1-3），其为环状或旋转，在所述结构域的一端与β-股连接。轻链和重链的可变区通常与抗原的特异性相关，但是各条链对特异性所发挥的作用不总是相同的。抗体分子已经进化为通过使用六个随机的环（CDRs）与大量分子结合。

依据其重链恒定结构域的氨基酸序列将免疫球蛋白分为不同类型。至少有五（5）种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。可以将其中的某些进一步分成亚型（同种型），例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。与IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类型的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体轻链分成两种明显不同的类型，称为κ和λ。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构型均是公知的。

在抗体可变结构域的上下文中，术语“可变的”指不同抗体可变结构域序列的某些部分存在极大差异的这一事实。可变结构域用于结合和确定各特定抗体针对其特定抗原的特异性。然而，所述可变性并不是在整个抗体的可变结构域平均分布的。相反的是，所述可变性集中在被称为互补性决定区（CDR）的三个片段，也将其称为轻链和重链可变结构域中的超变区。

将可变结构域中高保守性的部分称为框架（FR）区。天然重链和轻链的可变结构域中各包含四个FR区，其主要为β-折叠构型，由三个CDR连接，形成环状连接，在某些情况下形成部分β-折叠结构。各条链的CDRs通过FR区彼此紧邻，并且与其它链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出不同的效应器功能，如参与抗体的抗体依赖性细胞毒作用。

因而，本发明中考虑使用的抗体可以是多种形式中的任意一种，包括整个免疫球蛋白，抗体片段，如Fv、Fab，和类似片段，包括可变结构域互补性决定区（CDR）的单链抗体等形式，这些均落入如本申请所使用的术语“抗体”的范围。本发明考虑的抗体、多克隆或单克隆抗体特异性的任意用途，不限于识别并与特定GLOPH2多肽或其衍生物发生免疫反应的抗体。

而且，抗体的结合区或CDR可以位于任意适合的结合实体多肽的骨架内。在优选的实施方式中，在本申请所述方法的上下文中，抗体、结合实体或其片段对使用其治疗的哺乳动物不具有免疫原性。而且，优选对GOLPH2及其变体和衍生物具有免疫特异性的抗体、结合实体或其片段。

术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，其分别具有一个单独的抗原结合位点，和残余的Fc片段。因而，Fab片段具有一条完整的轻链和一条重链的一部分。经胃蛋白酶处理后产生F(ab′)₂片段，其具有能够交联抗原的两个抗原结合片段，和称为pFc′片段的残余片段。Fab'片段是将经胃蛋白酶消化的抗体还原后获得，其由完整的轻链和重链的一部分组成。每个抗体分子获得两个Fab'片段。Fab′片段与Fab片段不同，其在重链CH1结构域的羧基末端存在几个附加的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。

Fv是含有完整的抗原识别和结合位点的最小的抗体片段。该区域由一个重链和一个轻链可变结构域以紧密的、非共价结合形式形成的二聚体（V_H-V_L二聚体）组成。在这种构型中，各可变结构域的三个CDR相互作用以限定V_H-V_L二聚体表面的抗原结合位点。总的来说，六个CDR使抗原与抗体特异性地结合。然而，尽管单一的可变结构域（或仅包含对抗原具有特异性的三个CDR的半Fv）也具有识别和结合抗原的能力，但是与整个结合位点相比其亲和性较低。如本申请所使用的，抗体的“功能性片段”指Fv、F(ab)和F(ab′)₂片段。

其它的片段可以包括双体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。单链抗体是含有轻链可变区、重链可变区的基因工程化分子，其通过适宜的多肽连接子连接成基因融合的单链分子。这种单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，所述Fv多肽在VH和VL结构域之间还包括多肽连接子，其能够使sFv形成供抗原结合的所需结构。sFv的综述参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,N.Y.,pp.269-315(1994)。

术语“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包括在同一多肽链上（VH-VL）上，与轻链可变结构域（VL）连接的重链可变结构域（VH）。因为使用的连接子太短，以至于在同一条链的两个结构域之间无法配对，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。对双体更为详细的描述参见例如EP 404,097；WO93/11161，和Hollinger等，Proc.Natl.Acad Sci.USA90:6444-6448(1993)。

因此，本发明涉及的抗体片段不是全长抗体。然而，这种抗体片段与全长抗体相比能够具有类似的或改进的免疫学性质。此类抗体片段可以同约4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、9个氨基酸、约12个氨基酸、约15个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸或更多一样小。

一般而言，本发明的抗体片段或结合实体可以具有任意尺寸上限，只要其同与GOLPH2多肽特异性结合的抗体相比，具有类似的或改善的免疫学性质即可。例如，如果所述的抗体片段与轻链抗体亚基相关，则较小的结合实体和轻链抗体片段能够具有小于约200个氨基酸、小于约175个氨基酸、小于约150个氨基酸、或者小于约120个氨基酸。然而，如果所述的抗体片段与重链抗体亚基相关，则较大的结合实体和重链抗体片段能够具有小于约425个氨基酸、小于约400个氨基酸、小于约375个氨基酸、小于约350个氨基酸、小于约325个氨基酸、或者小于约300个的氨基酸。

针对GOLPH2的抗体能够由任意现有程序制备。多克隆抗体的制备方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，Green等，Production of Polyclonal Antisera,in:Immunochemical Protocols(Manson,ed.),第1-5页(Humana Press)；Coligan等，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits,Rats Mice and Hamsters,in:Current Protocols in Immunology，2.4.1章(1992)，其通过引用并入本文。

本发明还可以包括单克隆抗体。如本申请所使用的，术语“单克隆抗体”指从基本上具有同一性的抗体群体获得的抗体。换言之，各抗体包含的群体是相同的，除了在某些抗体中可能存在少量偶发性的天然产生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一的抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其具有特异性以外，优势还在于单克隆在其通过杂交瘤培养物合成，无其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上具有同一性的抗体群体获得的抗体，不能将其解释为需要通过任何特定方法生产抗体。

本申请中的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体，其重链和/或轻链的一部分与来自特定种属或者属于特定类型或亚类的抗体的相应序列相同或具有同源性，而所述链的其余部分与来自其它种属或者属于另一种抗体类型或亚类的抗体的相应序列相同或具有同源性。还可以使用此类抗体的片段，只要其表现出所需的生物活性即可。参见美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad Sci.81,6851-55(1984)。在某些实施方式中，抗-GOLPH2抗体的重链和/或轻链恒定区是人序列。在不同实施方式中，抗-GOLPH2抗体的重链和/或轻链恒定区是不会在哺乳动物，如人类患者，中引起免疫原性反应的序列。

单克隆抗体的制备方法是常规的，可以使用任意现有程序制备此类单克隆抗体。参见，例如，Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975)；Coligan等，第2.5.1-2.6.7章；和Harlow等：Antibodies:A Laboratory Manual,第726页(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，其通过引用并入本文。可以采用多种已建立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。此类分离技术包括使用蛋白-A琼脂糖亲和层析、体积排阻色谱和离子交换色谱。参见，例如Coligan等，第2.7.1-2.7.12章和第2.9.1-2.9.3章；Barnes等，Purificationof Immunoglobulin G(IgG):Methods in Molecular Biology,Vol.10，第79-104页(Humana Press(1992)。

在体外和体内操纵抗体的方法是本领域技术人员公知的。例如，本发明中使用的单克隆抗体可以由上文所述的杂交瘤方法制备或者可以由重组体的方法制备，例如，如美国专利号4,816,567中所述。本发明中使用的单克隆抗体还可以采用Clackson等，Nature352:624-628(1991)，以及Marks等，J.Mol Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离得到。

抗体片段的制备方法也是本领域公知的（参见，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,(1988)，其通过引用并入本文）。本发明中的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或者在适宜的宿主中表达编码抗体片段的核酸制备。可以通过使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体的常规方法获得抗体片段。例如可以通过使用胃蛋白酶酶解抗体以提供被描述为F(ab’)₂的5S片段来生产抗体片段。可以使用巯基还原剂进一步裂解该片段，并且任选地使用针对二硫键裂解得到的巯基的保护基团，以生产3.5S Fab’单价片段。或者，使用胃蛋白酶解直接产生两个单价Fab’片段和一个Fc片段。在例如美国专利号4,036,945和4,331,647中描述了这些方法，本文中包含了所述参考文献。因此，这些专利整体通过引用并入本文。

还可以使用裂解抗体的其它方法，如将重链分离以形成单价轻链-重链片段，将片段进一步裂解，或者使用其它酶学、化学、或基因技术，只要所述片段能够与完整抗体所识别的抗原结合即可。例如，Fv片段包含V_H和V_L链的结合。该结合可以是非共价的或者可以通过分子间二硫键或使用化学试剂，如戊二醛交联，将所述可变链连接。优选地，所述Fv片段包含通过肽连接子连接的V_H和V_L链。通过构建结构基因制备这些单链抗原结合蛋白（sFv），该结构基因包含由寡核苷酸连接的编码V_H和V_L结构域的DNA序列。将结构基因插入表达载体，随后将所述表达载体引入宿主细胞，如大肠杆菌。该重组宿主细胞合成由连接子肽将两个V结构域桥连的单一多肽链。在例如Whitlow等，Methods:aCompanion to Methods in Enzymology,Vol.2,第97页(1991)；Bird等，Science242:423-426(1988)；Ladner等，美国专利号4,946,778；和Pack等，Bio/Technology11:1271-77(1993)中描述了生产sFv的方法。

抗体片段的另一种形式是编码单一互补性决定区（CDR）的肽。CDR肽（“最小的识别单元”）通常与抗原的识别和结合相关。可以通过克隆或构建编码所关注抗体CDR的基因获得CDR肽。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备此类基因。参见，例如Larrick等，METHODS:A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.2,第106页(1991)。

本发明涉及非人（例如，鼠源性）抗体的人和人源化形式。此类人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段（如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或者其它抗体的抗原结合序列），其含有最少的来自非人免疫球蛋白的序列。在大多数情况下，人源化抗体是受体互补性决定区（CDR）的残基被非人种属（供体抗体），如具有所需特异性、亲和性和相容性的小鼠、大鼠或家兔，的CDR残基取代的人免疫球蛋白（受体抗体）。

在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所取代。此外，人源化抗体可以包括不属于受体抗体，也不属于插入CDR或框架序列的残基。进行这些修饰以进一步完善和优化抗体的性能。一般而言，人源化抗体将基本上包括全部的至少一个，通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的与那些非人免疫球蛋白对应的CDR区，以及全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有的那些序列。优先地，人源化的抗体还包括通常为人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分。详情参见：Jones等，Nature321,522-525(1986)；Reichmann等，Nature332,323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2,593-596(1992)；Holmes等，J.Immunol.,158:2192-2201(1997)和Vaswani等，Annals Allergy,Asthma&Immunol.,81:105-115(1998)。

尽管标准程序可以生产抗体，但是，在某些实施方式中，抗体的尺寸、抗体的多链结构和抗体中存在的六个结合环的复杂性均可能构成对改进和大量生产抗体的障碍。因此，本发明进一步涉及使用结合实体，其包括能够识别并与GOLPH2多肽结合的多肽。

多种蛋白可以作为蛋白支架，针对GOLPH2的结合结构域能够与其连接，从而形成适宜的结合实体。结合结构域与GOLPH2结合或与其相互作用，而所述蛋白支架仅支持和稳定结合结构域，从而使它们能够结合。可以使用多种蛋白支架。例如，可以使用噬菌体衣壳蛋白。参见综述Clackson&Wells,Trends Biotechnol.12:173-184(1994)。噬菌体衣壳蛋白已用于作为展示随机肽序列的支架，该随机肽包括牛胰蛋白酶抑制剂（Roberts等，PNAS89:2429-2433(1992)）、人生长激素（Lowman等，Biochemistry30:10832-10838(1991)、Venturini等，Protein Peptide Letters1:70-75(1994)）和链球菌属的IgG结合结构域（O′Neil等，Techniques in Protein Chemistry V(Crabb,L,.ed.)第517-524页，AcademicPress,San Diego(1994)）。这些支架均具有一个单链随机环或区域，可以对其进行修饰以引入针对GOLPH2的结合结构域。

研究者还使用小型的74个氨基酸的α-淀粉酶抑制剂Tendamistat作为在丝状噬菌体M13上的提呈支架。McConnell,S.J.,&Hoess,R.H.,J.Mol.Biol.250:460-470(1995)。Tendamistat是一种来自唐德链霉菌的β-折叠蛋白。其具有的多种性质使其成为用于结合肽的引人注目的支架，那些性质包括其较小的尺寸、稳定性和高分辨率NMR和X-射线结构数据的可用性。Tendamistat的整体拓扑学结构域与免疫球蛋白结构域类似，具有通过一系列环连接的两个β-折叠。与免疫球蛋白的结构域不同的是，Tendamistat的β-折叠通过两个而非一个二硫键连接在一起，这就解释了为何该蛋白具有相当强的稳定性。Tendamistat的环与免疫球蛋白的CDR环具有相似的功能，并且通过体外的诱变作用能够很容易地将其随机化。Tendamistat来自于唐德链霉菌并且可以在人体内作为抗原。因此，优选地，在体外使用包括Tendamistat的结合实体。

还使用III型纤连蛋白结构域作为能够连接结合实体的蛋白支架。III型纤连蛋白是免疫球蛋白超家族中较大亚家族（Fn3家族或s-型Ig家族）的一部分。例如，在美国专利申请公开号20020019517中提供了使用此类III型纤连蛋白结构域作为结合实体（例如，CDR肽）的蛋白支架的序列、载体和克隆程序。亦参见，Bork,P.&Doolittle,R.F.(1992)Proposed acquisition of an animal protein domain bybacteria.Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,8990-8994；Jones,E.Y.(1993)Theimmunoglobulin superfamily Curr.Opinion Struct.Biol.3,846-852；Bork,P.,Hom,L.&Sander,C.(1994)The immunoglobulin fold.Structural classification,sequencepatterns and common core.J.Mol.Biol.242,309-320；Campbell,I.D.&Spitzfaden,C.(1994)Building proteins with fibronectin type III modules Structure2,233-337；Harpez,Y.&Chothia,C.(1994)。

在免疫系统中，从大型文库（亲和度成熟）中选择并扩增特异性抗体。可以通过诱变作用，模拟在免疫细胞中使用的组合技术，并产生结合实体的组合文库。因此，还可以通过展示型技术产生变体结合实体、抗体片段和抗体。这种展示型技术包括，例如，噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其它技术。可以用本领域可用的技术来产生结合实体的文库、用于筛选那些文库，并且可以对所选的结合实体进行附加成熟，如亲和度成熟。Wright和Harris，如上文所述，Hanes和Plucthau PNAS USA94:4937-4942(1997)（核糖体展示），Parmley和Smith Gene73:305-318(1988)（噬菌体展示），Scott TIBS17:241-245(1992),Cwirla等，PNAS USA87:6378-6382(1990)，Russel等，Nucl.Acids Research21:1081-1085(1993)，Hoganboom等，Immunol.Reviews130:43-68(1992)，Chiswell和McCafferty TIBTECH10:80-84(1992)，以及美国专利号5,733,743。

因此，本发明还提供了优化突变抗体、CDR或结合结构域的亲和性、选择性、结合强度和/或其它所需性质的方法。突变的结合结构域指所选的结合结构域（例如，CDR）的氨基酸序列变体。一般而言，突变的结合结构域中的一个或多个氨基酸残基与对照结合结构域中存在不同。此类突变的抗体必然与对照氨基酸序列的序列同一性或相似性小于100%。一般而言，突变的结合结构域与对照结合结构域的氨基酸序列具有至少75%的氨基酸序列同一性或相似性。优选地，突变结合结构域与对照结合结构域的氨基酸序列具有至少80%，更优选地至少85%、甚至更有选地至少90%、和最优选地至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。

例如，可以使用噬菌体展示的亲和度成熟作为产生突变的结合结构域的一种方法。使用噬菌体展示的亲和度成熟指Lowman等，Biochemistry30(45):10832-10838(1991)中描述的过程，亦参见Hawkins等，J.Mol Biol.254:889-896(1992)。尽管未对下述描述进行严格限定，但是可以将该过程简要地描述为：涉及在数个不同位点的若干结合结构域或抗体高变区的突变，其目的为在各位点产生所有可能的氨基酸取代。这样，所产生的结合结构域突变在丝状噬菌体颗粒中作为融合蛋白以单价形式展示。通常将M13基因III的产物进行融合。表达多种突变体的噬菌体可以在对感兴趣的性状，例如结合亲和性或选择性，进行的若干轮的选择中循环使用。将感兴趣的突变体分离和测序。对此类方法的详细描述参见美国专利5,750,373、美国专利6,290,957和Cunningham,B.C.等，EMBO J.13(11),2508-2515(1994)。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了操纵结合实体或抗体多肽或编码它们的核酸的方法，以产生具有识别GOLPH2的改进的结合性质的结合实体、抗体和抗体片段。

那些突变现有结合实体或抗体部分的方法涉及：将编码针对GOLPH2的结合结构域多肽的核酸与编码噬菌体衣壳蛋白的核酸融合，以产生编码融合蛋白的重组核酸，将编码融合蛋白的重组核酸突变，以产生编码突变的融合蛋白的突变的核酸，在噬菌体表面表达突变的融合蛋白，并选择与GOLPH2结合的噬菌体。

相应地，本发明提供了能够识别GOLPH2多肽并与其结合的抗体、抗体片段和结合实体多肽。本发明进一步提供了操纵那些抗体、抗体片段和结合实体多肽，以优化其结合性质或其它所需性质（例如，稳定性、尺寸、易用性）的方法。

抑制性核酸

抑制性核酸是具有长度为三个以上核苷酸的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。抑制性核酸可以包括天然存在的核苷酸；合成的、修饰的、或伪-核苷酸，如硫代磷酸酯；以及具有可检测标记，如³²P、生物素、荧光染料或地高辛的核苷酸。能够减少GOLPH2核酸的表达和/或活性的抑制性核酸可以完全地与GOLPH2核酸（例如，SEQ ID NO:16或18）互补。或者，可以允许在序列之间存在某些变异性。

本发明的抑制性核酸能够在细胞内条件下或严格杂交条件下与GOLPH2核酸杂交。本发明的抑制性核酸与内源性GOLPH2充分地互补，以便在这两种之一或全部的条件下抑制GOLPH2核酸的表达。细胞内条件指在细胞，如哺乳动物细胞，内通常存在的条件，如温度、pH和盐浓度。此类哺乳动物细胞的一个例子是癌细胞（例如，肝癌细胞或骨髓瘤细胞），或者GOLPH2表达或可以表达的任意细胞。

一般地，将严格杂交条件选定为在给定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点（T_m）约低5℃。然而，严格条件包含比所选定序列的热熔点低约1℃至约20℃的温度范围，这取决于本申请根据其它方面所期望的严格程度。抑制性核酸可以抑制GOLPH2核酸的功能，该抑制性核酸包括精确地与GOLPH2编码序列互补的，例如2、3、4或5个，或者更多个连续核苷酸段，各段被不与邻近的编码序列互补的连续核苷酸段所隔开。一般情况下，各连续核苷酸段的长度为至少4、5、6、7或8个，或者更多个核苷酸。非互补插入序列的长度可以为至少1、2、3或4个核苷酸。本领域技术人员能够容易地使用计算得到与有意义核酸杂交的抑制性核酸的熔点，估计抑制特定靶核酸表达耐受的错配度。本发明的抑制性核酸包括例如核酶或反义核酸分子。

反义核酸分子可以是单链或双链的（例如，小干扰RNA（siRNA）），可以以酶依赖性方式或通过空间位阻发挥其功能。以酶依赖性方式发挥其功能的反义分子包括依赖于RNase H活性降解靶mRNA的形式。这些包括单链DNA、RNA和硫代磷酸酯，以及双链RNAi/siRNA系统，其涉及通过有意义-反义链配对识别靶mRNA，随后通过RNA诱导的沉默复合物降解靶mRNA。空间位阻反义，其不依赖于RNase-H，通过与靶mRNA结合并阻碍其它过程的方式，来干扰基因表达或其它mRNA依赖性细胞过程。空间位阻反义包括2′-O烷基化（通常在具有RNase-H依赖性反义的嵌合体中）、肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）和吗啉反义。

例如，小干扰RNA可以用于特异性减少GOLPH2的翻译，以降低GOLPH2多肽的水平。siRNA以序列特异性的方式介导转录后的基因沉默。参见，例如，网站www.ambion.com/techlib/hottopics/rnai/rnai_may2002_print.html（末次检索2006年5月10日）。一旦组成RNA诱导的沉默复合物，siRNA介导同源的内源性mRNA转录本的裂解，该过程通过引导所述复合物至同源的mRNA转录本，然后通过复合物裂解mRNA转录本来完成。siRNA可以与GOLPH2mRNA转录本的任意区域具有同源性。同源性区域的长度可以是30个核苷酸或以下、优选少于25个核苷酸、更有选地长度约为21至23个核苷酸。siRNA通常是双链，可以具有两个核苷酸3’端突起，例如，3’端突起UU二核苷酸。设计siRNA的方法是本领域技术人员所公知的。参见，例如，Elbashir等，Nature411:494-498(2001)；Harborth等，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.13:83-106(2003)。通常，选择以AA起始，在有意义和反义siRNA链均具有3′UU突起且具有约50%G/C含量的靶位点。siRNA可以是化学合成的、由体外转录形成、或由siRNA表达载体或PCR表达盒表达。参见，例如http://www.ambion.com/techlib/ tb/tb_506html（末次检索2006年5月10日）。

当siRNA由表达载体或PCR表达盒表达时，可以将编码siRNA的插入体表达为折叠成siRNA发夹的RNA转录本。这样，所述的RNA转录本可以包括，通过形成发夹环的间隔序列与其反向互补反义siRNA序列连接的有意义siRNA序列，以及在3’末端的U串。发夹环可以是任意适宜的长度，例如长度为3至30个核苷酸，优选地长度为3至23个核苷酸，可以是不同的核苷酸序列，包括AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA。还可以在体内通过裂解直接或通过转基因或病毒间接引入的双链RNA来生产siRNA。在某些生物体内可以发生利用RNA依赖性RNA聚合酶的扩增。

反义抑制性核酸还可以用于特异性减少GOLPH2的表达，例如通过抑制转录和/或翻译。反义抑制性核酸与编码GOLPH2的有意义核酸互补。例如，其可以与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补。其可以与整个编码链或仅与其一部分互补。其还可以与编码GOLPH2的核酸的非编码区的全部或一部分互补。非编码区包括在编码区翼侧的5’和3’区域，例如，5’和3’非翻译序列。通常，反义抑制性核酸的长度为至少六个核苷酸，但是其可以是约8、12、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长。还可以使用更长的抑制性核酸。

可以采用本领域公知的方法制备反义抑制性核酸，例如由编码反义抑制性核酸的表达载体或由表达盒表达。或者，其可以使用天然存在的核苷酸、经修饰的核苷酸或其任意组合通过化学合成制备。在某些实施方式中，所述抑制性核酸可以由经修饰的核苷酸或非磷酸二酯键制备，例如进行设计以增加抑制性核酸的生物稳定性或增加在反义抑制性核酸和有意义核酸之间形成的双螺旋的细胞内稳定性。

天然存在的核苷酸包括核糖或脱氧核糖核苷酸，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。

经修饰的核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-（羧基羟基甲基）尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷（β-D-galactosylqueosine）、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露酰基Q辫苷（β-D-mannosylqueosine）、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5氧乙酸、丁氧基（butoxosine）、伪尿嘧啶、辫苷（queosine）、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-（3-氨基-3-N-2-羧基丙基）尿嘧啶、(acp3)w、和2,6-二氨基嘌呤。

因而，本发明的抑制性核酸可以包括经修饰的核苷酸，以及天然的核苷酸，如核糖和脱氧核糖核苷酸的组合，并且本发明的反义抑制性核苷酸可以是上文所讨论的任意长度，并且其与SEQ ID NO:16和/或18互补。

本发明的抑制剂还可以是小发夹RNA或短发夹RNA（shRNA），其为使紧密的发夹转化为能够用于通过RNA干扰沉默基因表达的RNA序列。shRNA发夹结构通过细胞机制裂解为siRNA，然后其与靶mRNA结合并将其裂解。当shRNA的编码区可操作地与启动子连接时，可以通过编码shRNA的载体将shRNA引入细胞。所选择的启动子使得shRNA可以表达。例如，所述启动子可以是U6启动子，其可用于shRNA的连续表达。例如，载体可以传递至子代细胞，使得基因沉默被遗传。参见，McIntyre G,Fanning G,Design and cloning strategies forconstructing shRNA expression vectors,BMC BIOTECHNOL.6:1(2006)；Paddison等，Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammaliancells,GENES DEV.16(8):948–58(2002)。

本发明的抑制剂还可以是核酶。核酶是具有催化活性，并且能够裂解单链核酸，如具有同源区的mRNA，的RNA分子。参见，例如，Cech,Science236:1532-1539(1987)；Cech,Ann.Rev.Biochem.59:543-568(1990)；Cech,Curr.Opin.Struct.Biol.2:605-609(1992)；Couture和Stinchcomb,Trends Genet.12:510-515(1996)。核酶可以用于催化裂解GOLPH2的mRNA转录本，从而抑制所述mRNA的翻译。参见，例如，Haseloff等，美国专利号5,641,673。可以根据核苷酸序列SEQ ID NO:16和/或18设计对GOLPH2核酸具有特异性的核酶。

在本领域中已开发和描述了设计和构建能够以高度序列特异性的方式裂解反义RNA分子的核酶的方法。参见，例如Haseloff等，Nature 334:585-591(1988)。通过将离散的“杂交”区工程化至核酶，可以将核酶靶向至特定RNA。含有与靶RNA序列互补的杂交区能够使核酶与其靶点特异性杂交。参见，例如Gerlach等，EP 321,201。所述靶序列可以是选自具有SEQ ID NO:16和/或18的核苷酸序列的约5、6、7、8、9、10、12、15、20或50个连续核苷酸的片段。可以使用更长的互补序列以增加针对靶点杂交序列的亲和性。

所述核酶的杂交和裂解区可以是整体联系的；这样，通过互补区与靶RNA杂交后，核酶的催化区能够裂解所述靶点。这样，通过修饰所述核酶的杂交区使其包括与靶GOLPH2核酸互补的序列，可以将现有的核酶修饰为靶向至本发明的GOLPH2核酸。或者，可以使用编码GOLPH2的mRNA从RNA分子池中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化RNA。参见，例如Bartel&Szostak,Science261:1411-1418(1993)。

可溶性GOLPH2抑制剂的鉴定方法

本发明的另一个方面是一种分离可溶性GOLPH2抑制剂的方法。这种方法可以包括：（a）将包含可溶性GOLPH2的细胞培养物与待测物接触；和（b）观察培养基中的细胞是否表达IL-12和/或干扰素γ。当培养基中的细胞表达IL-12和/或干扰素γ时，则所述待测物是可溶性GOLPH2抑制剂。

在某些实施方式中，与含有可溶性GOLPH2但不含待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养基中细胞表达的IL-12增加至少10%，则认为所述待测物是可溶性GOLPH2抑制剂。在其它实施方式中，与含有可溶性GOLPH2但不含待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养基中的细胞表达的IL-12增加至少50%，则认为所述待测物是可溶性GOLPH2抑制剂。在其它实施方式中，与含有可溶性GOLPH2但不含待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养基中的细胞表达的IL-12增加至少两倍，则认为所述待测物是可溶性GOLPH2抑制剂。在其它实施方式中，如果与含有可溶性GOLPH2但不含待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养基中的细胞表达的IL-12增加至少三倍，则认为所述待测物是可溶性GOLPH2抑制剂。

能够用于这种方法的细胞的例子包括活化的单核细胞、T细胞、树突状细胞、B类淋巴母细胞、抗原呈递细胞、恶性B细胞、淋巴瘤细胞及其组合。在某些实施方式中，使用T细胞。在其它实施方式中，使用抗原呈递细胞。在进一步的实施方式中，使用树突状细胞。在某些实施方式中，使用T细胞和树突状细胞的组合。可以通过本领域公知的程序对细胞进行活化。在暴露于待测物和/或可溶性GOLPH2之前，可以使用刀豆蛋白A（ConA）刺激T细胞。

在某些实施方式中，在存在可溶性GOLPH2的情况下当活化的T细胞表达干扰素γ时，待测物是GOLPH2抑制剂。在某些实施方式中，将树突状细胞与T细胞共同培养。例如，当在存在可溶性GOLPH2的情况下检测干扰素γ的表达时，可以使用T细胞和树突状细胞的组合。

在此方法中使用的可溶性GOLPH2可以是纯化的、半纯化的或未经纯化的。在某些实施方式中，使用细胞培养物上清作为可溶性GOLPH2的来源可能是有益的。可溶性GOLPH2由多种细胞系生产，包括各种B细胞和B细胞淋巴瘤细胞系以及肝细胞癌细胞系。例如，可溶性GOLPH2由2E2、U266、NALM-6、REH和RAMOS细胞系生产。可溶性GOLPH2还由人肝细胞癌细胞系，如HepG2，生产。源于任何这些细胞系中的上清均可以作为GOLPH2的来源。

待测物可以是小分子、药物、抗体、抑制性结合实体、抑制性多肽、抑制性核酸、及其组合。

组合物

本发明还涉及含有GOLPH2抑制剂，如抗-GOLPH2抗体或抑制性核酸（例如，在表达盒或表达载体中），的组合物。本发明的组合物可以是药物组合物。在某些实施方式中，所述组合物可以包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的”指与处方中的其它成分具有相容性且对其受体无毒性的载体、稀释剂、赋形剂、和/或盐。

在某些实施方式中，所述抑制剂是与具有序列如SEQ ID NO:1-15、17中任意一个或其组合的GOLPH2蛋白结合的抗体或结合实体。在其它实施方式中，优选地，所述抗-GOLPH2抗体和结合实体特异性地与可溶的、胞外形式的GOLPH2结合。抗-GOLPH2抗体/结合实体能够结合的GOLPH2多肽序列的例子包括，具有SEQ ID NO:2、4-15中任意一个的GOLPH2多肽。在其它实施方式中，所述抑制性核酸是与编码具有序列如SEQ ID NO:16或18的GOLPH2蛋白的核酸结合的核酸。

在某些实施方式中，本发明的治疗剂（例如，GOLPH2抑制剂）以“治疗有效量”给予。此类治疗有效量是足以获得希望的生理作用的量，如治疗状况、疾病、病症等或者减轻状况、疾病、病症等的症状。例如，可以给予治疗剂以治疗状况、疾病或病症，如癌症、病毒感染、细菌感染和/或微生物感染。

为达到希望的作用，可以单剂量或多剂量给予GOLPH2抑制剂或其组合。例如，可以以至少约0.01mg/kg至约500至750mg/kg、至少约0.01mg/kg至约300至500mg/kg、至少约0.1mg/kg至约100至300mg/kg或者至少约1mg/kg至约50至100mg/kg体重的剂量给予GOLPH2抑制剂，但是其它剂量也可以提供有益的结果。给药量将取决于多种因素，包括但不限于所给予的分子、多肽、抗体或核酸，哺乳动物的疾病、体重、身体状况、健康状况、年龄。这些因素能够容易地由临床医师通过本领域公知的动物模型或其它检测系统确定。

本发明中治疗剂（例如，抑制剂）的给药可以是单剂量的、多剂量的、以连续或者间歇性方式的，其取决于，例如受体的身体状况、给药的目的是治疗性的还是预防性的、以及本领域的医师公知的其它因素。本发明的治疗剂和组合物的给药可以是在一段预定时间内基本上连续的或者可以是一系列间隔的剂量。可以采用局部和全身给药。

为制备组合物，合成或以其它方式获得小分子、多肽、核酸、抗体和其它试剂，并在必要或需要时对其进行纯化。可以将这些小分子、多肽、核酸、抗体和其它试剂混悬于药学上可接受的载体中和/或冷冻干燥或者以其它方式稳定。可以将这些试剂调整为适宜浓度，并且任选地与其它试剂组合。单位剂量中所含的给定小分子、多肽、核酸、抗体和/或其它试剂的绝对重量可以在较宽的范围内变化。例如，可以给予约0.01至约2g、或约0.1至约500mg至少一种本发明的小分子、多肽、核酸、或抗体，或者多种小分子、多肽、核酸、和/或抗体。或者，单位剂量可以在约0.01g至约50g、约0.01g至约35g、约0.1g至约25g、约0.5g至约12g、约0.5g至约8g、约0.5g至约4g、或者约0.5g至约2g范围内变化。

本发明治疗剂的每日给药剂量也可以是变化的。此类每日给药剂量可以在，例如约0.1g/天至约50g/天、约0.1g/天至约25g/天、约0.1g/天至约12g/天、约0.5g/天至约8g/天、约0.5g/天至约4g/天、和约0.5g/天至约2g/天的范围内变化。

可以理解的是，在治疗中使用的小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗体的量不仅随着所选择的特定载体的变化而改变，还与给药途径、待治疗状况的性质以及患者的年龄和状况有关。最终，可以由健康保健从业者确定适当的剂量。此外，可以将药物组合物制成独立单位剂型。

这样，包含小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗体的一种或多种适宜的单位剂型可以通过多种途径给予，包括胃肠外（包括皮下、静脉、肌内和腹腔）、口服、直肠、皮肤、透皮、胸腔、肺内和鼻内（呼吸）途径。还可以将小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗体制成缓释剂型（例如，使用微囊，参见WO 94/07529和美国专利号4,962,091）。所述制剂在适当的情况下可以以离散的单位剂型形式存在，并且可以采用药物领域公知的任意方法制备。此类方法可以包括将所述治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、精细粉碎的固体载体或其组合进行混合的步骤，然后如有必要将所述产品引入所需递送系统中或在所需递送系统中定形。

可以将本发明的组合物制成多种形式，包括水溶液、混悬液、片剂、硬胶囊或软胶囊、以及脂质体和其它缓释剂型，如定形聚合物凝胶。然而，给予小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗体通常涉及蛋白、核酸和/或抗体以水性溶液或持续释放载体的形式通过胃肠外或局部给药。

这样，有时当小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗体以口服剂型给药时，通常将口服剂型制成使得小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗体经过胃后在肠内释放。在美国专利号6,306,434中对此类剂型进行了描述，其通过引用并入本申请。

液体药物组合物可以是多种形式，例如水性或油性混悬液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂、在使用前用水或其它适宜溶剂复溶的干粉。此类液体药物组合物可以含有常规的添加剂，如混悬剂、乳化剂、非水溶剂（可以包括食用油）或防腐剂。

可以将小分子、GOLPH2多肽、抑制性核酸和/或抗-GOLPH2抗体制成胃肠外给药的剂型（例如，注射，如推注或连续输注），并且其可以以单位剂型的形式置于安瓿、预充式注射器、小体积输液容器中或置于加入防腐剂的多剂量容器中。药物组合物可以采取这样的形式，如在油性或水性溶剂中的混悬剂、溶液或乳剂，并且可以含有配制剂，如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。适宜的载体包括盐溶液和本领域常规使用的其它材料。

所述组合物还可以含有其它成分，如化疗剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗微生物剂和/或防腐剂。可以使用的附加治疗剂的例子包括但不限于：烷化剂，如氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲类、乙撑亚胺和三氮烯类；抗代谢物，如叶酸拮抗剂、嘌呤类似物、嘧啶类似物；抗生素，如蒽环类、博莱霉素、丝裂霉素、放线菌素和普卡霉素；酶，如L-天冬酰胺酶；法呢基蛋白转移酶抑制剂；激素类药物，如糖皮质激素、雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、孕激素、和促黄体激素释放激素拮抗剂、醋酸奥曲肽；微管干扰剂，如海鞘素或其类似物和衍生物；微管稳定剂如紫杉醇（泰素）、多西紫杉醇（泰索帝）、和埃博霉素A-F或者其类似物或衍生物；植物来源的产品，如长春花生物碱、表鬼臼毒素、紫杉烷类；和拓扑异构酶抑制剂；异戊烯基蛋白转移酶抑制剂；和杂项试剂如羟基脲、甲基苄肼、米托坦、六甲蜜胺、铂配位复合物，如顺铂和卡铂；以及作为抗癌和细胞毒剂使用的其它试剂，如生物反应调节剂、生长因子；免疫调节剂，和单克隆抗体。本发明的化合物还可以与放疗联用。

下述的非限制性例子对本发明研发的一些方面进行了说明。

实施例

通过下述实施例对本发明的说明书进行了进一步说明，不应将其解释为任何方式的限制。所有引用的参考文献的内容（包括本申请全文中引用的参考文献、已授权的专利、公开的专利申请）在此明确地通过引用并入本申请。

实施例1：作用于DC的由B细胞产生的新型可溶性因子的鉴定

本实施例描述了由B细胞产生的可溶性因子的鉴定，该可溶性因子在树突状细胞中直接调节白介素12的产生，并在间接调节T细胞细胞因子，如干扰素γ（IFNγ），的产生中起了作用。最初将这种因子称为BDSF^IL12；随后的实验证实了BDSF^IL12为GOLPH2。在对B细胞调节T细胞介导的免疫的作用机制进行研究的过程中，从人和小鼠的LPS或促细胞分裂剂活化的原代B淋巴细胞中鉴定出了一种可溶性的活性产物。这种可溶性的因子还在被测试的若干B淋巴瘤细胞系中自发产生，该细胞系包括2E2、U266、NALM-6、REH和RAMOS细胞系（数据未列出）。最初将这种新型的因子命名为B细胞来源的抑制IL-12的可溶性因子BDSF^IL-12。

方法

实验显示2E2细胞向上清中分泌一种分子量为约80Kda的因子（图1B），将其称为BDSF^IL-12。2E2细胞系是CL-01的亚克隆，一种人单克隆Burkett淋巴瘤细胞系。2E2细胞表达表面IgM和IgD，其为爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）阳性，在使用CD40配体、IL-4和IL-10诱导后，这些细胞转化成全部七个下游的同种型（Cerutti等，J Immunol160,2145-57(1998)）。进行下述实验以表征2E2细胞分泌的这种因子。

使用CD4⁺T细胞MACS分离试剂盒从C57BL/6小鼠的脾脏中分离T淋巴细胞，并在RPMI培养基（15%FBS，20ng/ml mIL-2）中培养4天。然后将细胞以1ml，1x10⁶个细胞/孔铺板，在存在或不存在源自骨髓树突状细胞培养基上清（500μl）的条件下，使用5μg/ml的刀豆蛋白A（ConA）刺激24小时。

树突状细胞来自C57BL/6小鼠的骨髓，将其在添加了20ng/ml mIL-4和40ng/mlmGM-CSF的20%的L细胞条件培养基中培养4天。将树突状细胞接种于2ml加入了BDSF^IL-12（1ml2E2上清）和/或脂多糖（LPS）（1ug/ml）的培养基中培养6小时。作为对照，在一些2ml分装的树突状细胞中不加入BDSF^IL-12（2E2上清）和LPS。孵育6小时后，将树突状细胞的培养基上清转移至上文所述的T细胞培养物中。使用ELISA测定IFN-γ的产生情况。

BDSF^IL-12通过活化T淋巴细胞强烈抑制IFN-γ的产生，但是其是通过间接地调节树突状细胞的性质发挥该作用。如图1A所示，未经刺激的树突状细胞不会产生可检测的IFN-γ（柱1），而经过LPS刺激的树突状细胞分泌～20pg/ml的IFN-γ（柱2）。经BDSF^IL-12处理但未经LPS刺激的树突状细胞产生很少的IFN-γ（柱3）。经BDSF^IL-12处理并经LPS刺激的树突状细胞（柱4）产生的IFN-γ略多于经LPS刺激但未经BDSF^IL-12处理的树突状细胞（柱2）。未经刺激的T细胞产生很少的IFN-γ（柱5和6），但是当加入经LPS刺激的树突状细胞上清后，其分泌大量的IFN-γ（柱7）。当加入经LPS刺激的树突状细胞上清后未经刺激的T细胞产生IFN-γ的量（柱7）甚至高于经LPS刺激的树突状细胞产生IFN-γ的量（柱2），表明树突状细胞产生了可刺激静息的T细胞而产生IFN-γ的可溶性因子。

当将经过BDSF^IL-12处理、LPS刺激的树突状细胞的上清加入静息的T细胞后（柱9），其IFN-γ的分泌情况基本上与在经过BDSF^IL-12处理和LPS刺激的树突状细胞中观察到的结果相似（柱4）。经ConA刺激的T细胞产生～40pg/mlIFN-γ（柱10）。

然而，将经LPS刺激的树突状细胞上清加入经ConA刺激的T细胞后，导致IFN-γ的分泌显著增加（柱12），其远高于经LPS刺激的树突状细胞（柱2）和经ConA刺激的T细胞（柱10）产生的IFN-γ之和，表明树突状细胞可能产生了额外的T-细胞刺激因子。如果树突状细胞未经过刺激（柱11），或者经LPS刺激但也经过BDSF^IL-12处理（柱14），则不存在该因子。重要的是，当使用BDSF^IL-12和经LPS刺激的树突状细胞上清（柱14）处理经ConA刺激的T细胞时，IFN-γ的产生水平降至经LPS刺激的树突状细胞与经ConA刺激的T细胞之和（柱2与柱10之和），表明BDSF^IL-12对T细胞没有直接影响。相反的是，其通过影响树突状细胞产生T细胞刺激活性的能力来起作用。该结论得到了IFN-γ产生水平（柱13）的支持，其中未经刺激但经过BDSF^IL-12处理的树突状细胞上清不会抑制ConA刺激的T细胞基线IFN-γ的产生（柱10）。

通过生物化学和蛋白质组学方法辅以质谱分析，利用BDSF^IL-12多种独特的性质，发明人鉴定发现BDSF^IL-12是来自LPS刺激的RAMOS细胞（B淋巴瘤）的高尔基体磷蛋白2（GOLPH2）（图1B）。

实验证明BDSF^IL-12表现出下述性质：

（i）其能够以不依赖于TGF-β、IL-10、TNF-α和前列腺素E2的方式通过活化的单核细胞和骨髓来源的树突状细胞选择性抑制IL-12分泌，而不抑制TNF-α、IL-10、IL-6和TGF-β的分泌。TGF-β、IL-10、TNF-α和前列腺素E2是公知的IL-12合成抑制剂（Ma&Trinchieri,AdvImmunol79,55-92(2001)）。

（ii）BDSF^IL-12对其它树突状细胞的性质，如CD11c、CD80、CD86和MHC II的表面表达几乎没有影响。

（iii）有趣的是，原代B细胞与经HIV-1感染的T细胞共培养产生BDSF^IL-12但其本身没有出现明显的病毒感染的证据。这表明在HIV感染患者中常见的T_H1损伤至少部分是由过度活化的B淋巴细胞产生的BDSF^IL-12所致。

实施例2：GOLPH2由多种应激和转化的细胞类型所分泌

在多种细胞类型中对GOLPH2的蛋白表达进行评估，以便更好地确定其生理作用。如图2所示，FACS分析表明GOLPH2的细胞定位随细胞类型的变化而改变，并且SDS聚丙烯酰胺分离显示GOLPH2分泌至若干不同的培养细胞系上清中。

用于FACS和western印迹分析的抗-GOLPH2抗体来自Epitomics,Burlingame,CA（目录号：3261-1，图2A）和Abcam Inc.,Cambridge,MA（目录号ab22209；图2B）。采用western印迹分析对下述细胞类型进行了检测：RAMOS细胞（静息的和LPS活化的B淋巴瘤细胞，分别在第2-3道）、2E2细胞（第4道）、HepG2细胞（人肝细胞癌（HCC），第5道）、B16细胞（小鼠黑色素瘤，第6道）、4T1细胞（小鼠乳腺癌，第7道）和RAW264.7细胞（小鼠巨噬细胞，第8道）。将由组氨酸标记的表达载体表达的重组人GOLPH2作为阳性对照（第9道）。

FACS分析显示GOLPH2在静息和LPS活化的原代人外周血B淋巴细胞的细胞内和细胞表面上大量表达（图2A）。但是，在人肝细胞癌细胞系HepG2中，GOLPH2在细胞内的表达多于其在细胞表面的表达。在RAW264.7细胞（小鼠巨噬细胞中），GOLPH2似乎完全在细胞内表达，加入LPS，即使有影响，对GOLPH2表达的水平和位置的影响也非常小。

对细胞培养基上清的Western印迹分析显示，人和小鼠来源的多种造血和上皮来源的癌细胞类型产生不同量的分泌型GOLPH2。图2F中的western印迹显示来自2E2细胞（人单克隆Burkett淋巴瘤细胞，第4道）、HepG2细胞（人肝细胞癌（HCC），第5道）、B16细胞（小鼠黑色素瘤，第6道）、4T1细胞（小鼠乳腺癌，第7道）和RAW264.7细胞（小鼠巨噬细胞，第8道）的培养基上清产生较大量的可溶性GOLPH2。B淋巴瘤的细胞培养基上清中含有与抗-GOLPH2抗体反应的蛋白。静息的RAMOS B淋巴瘤细胞产生明显较少的可溶性GOLPH2（图2B，第2道），而经过LPS刺激的RAMOS B淋巴瘤细胞产生更多的可溶性GOLPH2（图2F，第3道）。

实施例3：在多种细胞中人GOLPH2表达的作用

本实施例说明了GOLPH2抑制IL-12p35的转录和T细胞IFN-γ的产生。

方法

使用表达组氨酸标记的人GOLPH2或无关核蛋白SREBP2的载体瞬时转染HEK293细胞。转染四十八小时后，收集无细胞培养基上清，如实施例1所述将上清加入树突状细胞和T细胞的共培养物中。使用ELISA测定IFN-γ的产生情况。结果如图3A所述并在下文中更加详细的描述。

为确定GOLPH2是否直接或间接地与IL-12发生相互作用，使用了人IL-12p35启动子-荧光素酶报告子构建体（参见，Kim等，mmunity21,643-53(2004)）。将人IL-12p35启动子-荧光素酶报告子构建体与下述效应器构建体之一共同转染至RAW264.7细胞：表达人GOLPH2的GOLPH2表达载体和对照空载体（pCDNA3）。所使用的效应器/报告子（E:R）的摩尔比为1:1、2:1和4:1。使用IFN-γ（16小时）和LPS（7小时）刺激转染细胞，然后收集并测定全细胞裂解物的荧光素酶活性。图3B中的数据以相对启动子活性表示，即IFN-γ/LPS-刺激活性与未经刺激活性的比值。

使用FLAGged空表达载体（FLAG）、或者表达人GOLPH2或无关基因

SREBP2的FLAGged载体对HEK293细胞进行瞬时转染。转染四十八小时后，收集无细胞培养基上清，并将0.5ml上清加入1.5ml经人IL-12p35报告子构建体或人IL-12p40报告子构建体转染的RAW264.7细胞中。将所述细胞孵育6小时。然后使用IFN-γ和LPS刺激RAW264.7细胞7小时，随后收集并进行荧光素酶活性检测，设置三复管。图3C中的数据以平均值加标准偏差表示。

进行另一项实验以检测不同细胞上清中的可溶性因子是否能够作为IL-12p35和/或IL-12p40表达的抑制剂。使用上文所述的，在RAW264.7细胞中进行的报告子检测所使用的人IL-12p35报告子构建体和人IL-12p40报告子构建体，只是还在RAW264.7细胞中加入凋亡细胞（AC）或经LPS刺激的RAMOS细胞培养基上清。将所述细胞孵育6小时。然后使用IFN-γ和LPS刺激RAW264.7细胞7小时，随后收集并进行荧光素酶活性检测，设置三复管。图3D中的数据以平均值加标准偏差表示。

结果：

当在HEK293细胞中异源性表达时，尽管作用不强，但是加入促细胞分裂剂活化的小鼠脾脏T细胞的培养基上清中的重组人GOLPH2（rGOLPH2）以与BDSF^IL-12类似的方式抑制IFN-γ的产生（图3A，柱d和e）。rGOLPH2以全长分子表达，但是其它细胞机制可以使其裂解和分泌。

与以相同方法表达和使用的无关蛋白-甾醇应答元件结合蛋白2（SREBP2）相比，rGOLPH2-表达HEK293细胞上清的抑制具有特异性，其对T细胞的IFN-γ产生没有任何影响（图3A，柱c）。

当通过共转染在RAW264.7巨噬细胞系中过表达时，GOLPH2能够剂量依赖性的抑制IL-12p35基因转录（图3B）。当加入RAW264.7细胞后，来自重组表达GOLPH2的HEK293细胞的培养基上清强烈地和选择性地抑制IL-12p35而非p40的转录（分别见图3C的上图和下图）。这明确地确证了GOLPH2能够作为一种可溶性因子，像BDSF^IL-12，选择性地作用于IL-12p35基因转录。在GOLPH2转染HEK293细胞的上清抑制IL-12p35的转录活性，对胰酶和煮沸具有较好的耐受性，其与独特的BDSF^IL-12活性相同。

值得注意的是，与含有BDSF^IL-12的2E2上清的作用效果一致，含有GOLPH2的上清对T细胞-IFN-γ的产生没有抑制作用，提示在上清中存在GOLPH2以外的其它因子。这种观点得到了所观察到的结果的支持，尽管GOLPH2选择性抑制p35转录，但是在LPS活化的RAMOS中BDSF^IL-12对p35和p40的转录均具有抑制作用（图3D）。

实施例4：阻断细胞外GOLPH2逆转对IL-12p35转录的抑制

该实施例说明了抑制细胞外BDSF^IL-12/GOLPH2增强IL-12p35的表达。IL-12具有两个亚基：p35亚基和p40亚基。如本申请所述，BDSF^IL-12/GOLPH2抑制IL-12p35亚基的转录。

方法

家兔抗-GOLPH2多克隆抗体GP73（N-19）来自Santa Cruz Biotechnologies(SantaCruz,CA)，将其作为同型匹配的对照IgG抗体。这些抗-GOLPH2抗体识别具有氨基酸54-90的GOLPH2蛋白片段，该片段具有下述序列（SEQ ID NO:7）。

54 RAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL DKIQSSHNFQ

将含有与荧光素酶编码区可操作地连接的IL-12p35启动子的IL-12p35报告子构建体转染至RAW264.7细胞。为检测GOLPH2的表达对来自该IL-12p35启动子表达水平的影响，将包括对照载体（pCR3.1）、野生型GOLPH2（WT）-表达载体、GOLPH2分泌突变体R52A-表达载体、GOLPH2分泌突变体R54A-表达载体、或Roquin-表达载体的效应器构建体与IL-12p35报告子构建体共转染至RAW264.7细胞。效应器构建体与报告子构建体（E:R）的摩尔比为0.2:1。使用较低的E:R比值（1:0.2）以使得GOLPH2和Roquin之间的相互（协同）作用被最佳检测。当使用更高量时，与野生型GOLPH2相比R52A和R54A GOLPH2突变体的效力弱很多（数据未列出）。使用IFN-γ和LPS对RAW264.7细胞进行刺激后，测定所述细胞的荧光素酶活性。

结果

将含有IL-12p35报告子构建体的RAW264.7细胞暴露于IFNγ和LPS后，p35启动子的活性被极大地刺激（图4A，柱1，标记M）。当存在含有可溶性BDSF^IL-12的2E2上清时，IL-12p35启动子的活性被完全抑制（柱2，标记0），表明在上清中存在的一种因子（BDSF^IL-12）是IL-12p35转录的抑制剂。然而，当存在抗-GOLPH2抗体时（柱5-6），这种抑制被极大地逆转。当使用对照抗体时，未观察到这种抑制的逆转（柱3-4）。这些数据表明BDSF^IL-12是IL-12p35转录的抑制剂。

抗-GOLPH2抗体中和BDSF^IL-12的抑制性活性这一事实（图4A）也支持这个结论，即BDSF^IL-12和GOLPH2具有明显的序列同一性，通过质谱对这一结论进行了进一步的验证。这样，在本公开的大部分内容中将BDSF^IL-12称为GOLPH2。

进一步的中和抗体实验确定了IL-10和TGF-β似乎未参与IL-12p35转录的抑制（数据未列出），提示存在一种其它的、未经鉴定的因子，其相互作用、应答、和/或传递由可溶性GOLPH2提供的信号。RAW264.7和2E2细胞分泌大量的可溶性GOLPH2（图2F）。然而，在RAW264.7细胞中的GOLPH2的抗体介导的中和反应对p35的转录几乎没有影响（数据未列出），其与当存在2E2上清时，抗-GOLPH2抗体对p35转录的作用（图4A）相反。这些均表明在2E2上清中可能存在第二种参与GOLPH2的抑制性活性的因子。的确，初步数据表明源自LPS活化RAMOS细胞上清的经质谱鉴定的蛋白中存在第二种命中（Roquin），其可能是GOLPH2的第二种因子和/或辅因子，因为当将Roquin表达载体与GOLPH2共转染时，Roquin增强了GOLPH2对p35转录的抑制性活性（图4B）。Roquin的增强作用依赖于GOLPH2的分泌，因为GOLPH2的两个分泌突变体R52A和R54A（Puri,Traffic3,641-53(2002)）无法协同促成在野生型GOLPH2-Roquin中观察到的增强的抑制性活性（图4B）。

在针对自身免疫性调节子对小鼠的基因组进行的系统性筛选中首次发现了Roquin，其从小鼠品系sanroque中分离获得，该品系的小鼠患有因单隐性缺陷导致的严重自身免疫性疾病，该单隐性缺陷在于此前未知的抑制针对其自身抗体应答的机制。Sanroque突变作用于成熟的T细胞中，导致形成过多的滤泡辅助T细胞和生发中心。所述突变破坏了ICOS的抑制子，ICOS为滤泡T细胞必需的共刺激受体。Sanroque小鼠无法抑制糖尿病引起的T细胞，并产生高滴度的自身抗体和与狼疮相符的病理表现（Vinuesa等，Nature435,452-8(2005)）。致病性突变M199R位于此前功能未知的基因roquin（Rc3h1），其为编码高度保守的环形泛素连接酶蛋白家族成员。Roquin蛋白的特征为在RNA结合蛋白中存在一个CCCH锌-指，并且定位于参与调节ICOS信使RNA的翻译和稳定的细胞质RNA颗粒中（Yu等，Nature450,299-303(2007)）。

Roquin的M199R突变体无法与GOLPH2协同抑制IL-12p35的转录（数据未列出），其进一步支持了在GOLPH2和Roquin之间存在功能性相互作用的这一结论。

实施例5：GOLPH2通过活化GC结合蛋白抑制IL-12的表达

该实施例显示了GOLPH2抑制p35转录与GC结合蛋白靶向和吞噬细胞吞噬凋亡细胞针对相同的启动子元件。该启动子元件被称为“凋亡细胞应答元件（ACRE）”，其为IL-12p35启动子+13和+19之间的残基，具有序列TGCCGCG。

方法

将含有野生型和跨核苷酸位置-1082至+61的突变体IL-12p35启动子序列的核酸片段分别与编码荧光素酶的核酸连接。野生型IL-12p35启动子片段（a）包括位于核苷酸位置+13至+19的TGCCGCG序列。IL-12p35启动子的3’缺失片段（b）仅含有跨核苷酸位置-1082至-4的区域。三个突变体IL-12p35启动子片段（c-e）具有特定的碱基取代突变：XXCCGCG(c)、TGXXGCG(d)和TGCCXXG(e)。将所述启动子-报告子构建体转染至RAW264.7细胞，并且在存在或缺乏2E2细胞上清（含有BDSF ^IL-12）的条件下共培养。使用LPS刺激细胞7小时，测定细胞裂解物的荧光素酶活性。结果见图5A。

培养RAW264.7细胞并将其暴露于培养基（Med）、或凋亡的Jurkat细胞（AC）、或者含有或不含IFNγ和LPS的2E2细胞上清（BDSF ^IL-12）。使用抗-GC-结合蛋白抗体（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）将核提取物免疫沉淀，随后使用抗-磷酸-酪氨酸mAb（pY99）进行印迹检测。如此前所述，使用星孢菌素处理以产生凋亡细胞（AC）（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）。

结果

图5A显示了BDSF^IL-12主要通过DNA模体TGCCGCG选择性地抑制IL-12的IL-12p35亚基的转录，DNA模体为IL-12p35启动子+13和+19之间的残基。该DNA模体是“凋亡细胞应答元件（ACRE）”，其由本发明人在此前的研究中首次描述（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）。ACRE序列与锌指核蛋白和GC-结合蛋白结合，GC-结合蛋白可能是其活性和/或表达被BDSF^IL-12活化的因子。在凋亡细胞（ACs）的吞噬作用过程中，一种新型的信号通路通过外翻的磷脂酰丝氨酸（PS）被活化，导致GC-结合蛋白（GC-BP）的酪氨酸磷酸化，其与ACRE位点的IL-12p35启动子直接结合，从而阻断转录（Kim等，2004）。

图5B显示了在培养细胞的上清中存在BDSF ^IL-12导致被称为GC-结合蛋白的约80kDa蛋白的活化（磷酸化）。图5B中的上部显示了使用对磷酸化的GC-BP具有反应性的抗体作为探针的，来自多种细胞类型的蛋白的western印迹。图5B的下部显示了使用对所有GC-BP具有反应性的抗体作为探针的，来自多种细胞类型的蛋白的western印迹。如图所示，BDSF ^IL-12刺激GC-结合蛋白的酪氨酸磷酸化。

因此，BDSF^IL-12与凋亡细胞类似（Kim等2004）是一种高效的通过酪氨酸磷酸化的GC-BP激活剂（第4和8道，图5B）。这样，可溶性BDSF^IL-12可以在ACRE位点通过活化GC-BP抑制IL-12p35启动子的表达，例如通过刺激GC-BP磷酸化，然后活化的、磷酸化形式的GC-BP结合至IL-12p35启动子的ACRE位点并抑制其表达。

然而，BDSF^IL-12和凋亡细胞使用不同的细胞外机制抑制IL-12的表达。凋亡细胞是通过细胞间接触依赖性的方式发挥该作用（Kim等，2004），但是BDSF^IL-12是一种可溶性因子，其在细胞外发挥活性。而且，当与凋亡细胞接触后，吞噬细胞不产生BDSF^IL-12（数据未列出）。

这些数据表明BDSF^IL-12/GOLPH2是一种GC-结合蛋白的激活剂，其作用机制不同于凋亡细胞活化GC-结合蛋白。GC-结合蛋白是一种抑制性转录因子，其能够显著降低包括TGCCGCG序列模体的启动子的表达，，其抑制剂活性被BDSF^IL-12/GOLPH2所活化。

实施例6：在携带B16黑色素瘤的B-细胞缺陷小鼠中具有增强的T_H1应答

该实施例显示了在B细胞-缺陷（IgM敲除）小鼠中IL-12和IFN-γ的产生显著增加，并且在这种B细胞-缺陷（IgM敲除）小鼠中的肿瘤生长明显不及在野生型小鼠中的肿瘤生长。因而，B细胞的存在能够抑制抗肿瘤活性。

方法

皮下注射给予野生型和B细胞-缺陷（IgM敲除）小鼠（每组五只）10⁶个肿瘤细胞以种植肿瘤。通过使用游标卡尺定期测定肿瘤直径来监测肿瘤的生长情况。收集接种肿瘤的野生型和B细胞-缺陷（IgM敲除）小鼠（每组五只）的脾脏，将脾细胞与肿瘤细胞（8:1）共培养7天。使用ELISA分析这些培养物上清中的细胞因子水平。

结果

分析野生型（WT）和B细胞-缺陷（IgM敲除）小鼠（均为C57BL背景）中B16黑色素瘤的生长情况。如图6A所示，在B细胞-缺陷宿主中的肿瘤生长明显受到抑制，尽管不及此前Shah等（Int J Cancer117,574-86(2005)）报道的显著。对离体脾细胞-肿瘤共培养物的上清进行检测的结果显示，在IgM^-/-小鼠中B16黑色素瘤的生长被削弱与IL-12和IFN-γ的产生显著增加相关（图6B）。

因此，B细胞-产生的GOLPH2可以抑制抗-黑色素瘤T细胞的应答。

上述实施例证明了B细胞产生的BDSF^IL-12/GOLPH2抑制IL-12的表达。因而，BDSF^{IL -12}/GOLPH2可能在抑制针对肿瘤的免疫应答中发挥作用，例如，通过抑制IL-12的表达。

实施例7：重组GOLPH2的活性

该预计性的实施例描述了确证和进一步表征仅GOLPH2的细胞外活性就能够抑制IL-12表达的实验。将纯化的重组人GOLPH2（rGOLPH2）加入到原代人树突状细胞（DCs）中，随后使用LPS刺激以诱导IL-12的产生。绘制剂量应答曲线以寻找rGOLPH2的最佳剂量及其活性持续时间。为实现这一目的，制备过表达带有组氨酸标签的人GOLPH2的稳定的HEK293细胞系以用于培养基规模的纯化（图2B）。

实施例8：GOLPH2诱导GC-BP在体内与ACRE的结合

该预计性的实施例使用此前已描述过的程序（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）通过染色质免疫沉淀法（ChIP）进一步确证了活化的GC-BP在体内与ACRE序列上的p35基因座结合。使用rGOLPH2处理原代人树突状细胞。

实施例9：RNAi介导的GC-BP基因表达沉默中和或减弱GOLPH2的活性

该预计性的实施例描述了设计为检测是否GC-BP表达的沉默阻断GOLPH2活性的实验，并确证了GC-BP是介导GOLPH2抑制p35转录的重要核因子。

发明人已经发现通过在体外使用若干GC-BP特异性siRNA序列的RNAi可能会下调GC-BP⁶⁷。已在小鼠巨噬细胞的瞬时转染中对这些质粒DNA形式的构建体进行了检测。已发现序列#3，5’-ACCUCUUGUGGCUUUGCUAdTdT-3’（SEQ ID NO:19）最有效地敲减GC-BP的表达（>85%）（Kim等，Immunity21,643-53(2004)）。

将使用慢病毒载体引入和表达上文所述的特异性siRNA序列#3，以便在原代树突状细胞中评估下调的GC-BP的表达对GOLPH2活性的作用。在RNA聚合酶III的作用下通过慢病毒载体引入短双链siRNA模板寡核苷酸。这种递送系统通常导致>80%的骨髓来源细胞的转基因为阳性，转基因在移植了使用转导的富集干细胞/祖细胞的长期小鼠嵌合体中进行，该浓缩慢病毒标记基因例如如增强的绿色荧光蛋白（eGFP）（Rivella&Sadelain,Curr OpinMol Ther4,505-14(2002).）。

实施例10：鉴定GOLPH2抑制剂

该预计性的实施例描述了鉴定GOLPH2抑制剂的实验。

发明人此前的工作已经确定了GC-BP被一种有待鉴定的蛋白酪氨酸激酶（PTK）所活化（Kim等，Immunity21,643-53(2004)），并且GC-BP可能对GOLPH2作用于p35基因的转录起重要作用（图5）。将采用一组广泛的受体和非受体型PTKs的156种PTK抑制剂（EMDChemicals Inc.Gibbstown,NJ）用于鉴定对GC-BP通过酪氨酸磷酸化的活化起重要作用的特定酶。所述特异性抑制剂还应逆转GOLPH2的活性。作为对照，将对PTK抑制剂本身进行检测，以确定在不存在GC-BP的条件下其是否通过树突状细胞影响IL-12的产生。

考虑到BDSF^IL-12对GC-BP具有较强的活化作用（酪氨酸磷酸化），在暴露于rGOLPH2后，在原代人DCs中GC-BP的结合预计将增加（图5B）。还预计在经LPS刺激的原代人DCs中，GC-BP表达的敲减将通过这一途径挽救存在rGOLPH2的情况下IL-12的产生。为了将表达RNAi序列的细胞数量最大化，将采用流式细胞术针对GFP的表达进行分选，以富集已转导的树突状细胞。

GOLPH2可能参与了翻译后的蛋白修饰、分泌性蛋白的转运、细胞信号调控、或高尔基体器官功能的维持。发明人在此前使用GOLPH2的两种分泌突变体R52A和R54A获得的数据（Puri等，Traffic3,641-53(2002)）还表明GOLPH2可能具有细胞内功能（图4B）。GOLPH2的这些潜在的细胞内性质可以解释GOLPH2在树突状细胞内如何调控IL-12的基因表达。将对这些性质与细胞外性质平行地进行进一步研究，以进一步阐明GOLPH2的正常和病理活性。

实施例11：GOLPH2-结合蛋白的鉴定

在该预计性实施例中，将进行实验以鉴定GOLPH2受体（GOLPH2-R）。数据显示对IL-12p35转录抑制的GOLPH2释放至细胞外间隙。GOLPH2在树突状细胞中显示其作用的一个可能途径为通过与其膜受体之间的相互作用转导信号，从而导致IL-12p35转录和IL-12产生的抑制。GOLPH2受体（GOLPH2-R）的鉴定将在分子水平阐明GOLPH2调节DC功能的过程。

实施例12：rGOLPH2与树突状细胞的结合

在该预计性实施例中，检测rGOLPH2与细胞的结合。

使用来自Pierce的EZ-连接NHS-PEG-生物素试剂（PEG4和PEG12）将人rGOLPH2生物素化。在4℃下，将渐增浓度生物素化的rGOLPH2与混悬于含葡萄糖的Krebs Ringer磷酸盐缓冲液（KRPG）中的10⁶个人DCs孵育1小时，随后使用冰冷的PBS缓冲液充分洗涤以除去过量的未结合的rGOLPH2。通过加入与可检测荧光团偶联的卵蛋白测定结合情况。将在加入或不加入100倍过量的非生物素化rGOLPH2的条件下测定作为时间函数的特异性结合。最大特异性结合对生物素化rGOLPH2浓度的曲线将揭示结合是否是饱和的。为测定结合的可逆性，首先将树突状细胞与固定量的生物素化rGOLPH2孵育，随后加入渐增浓度的非生物素化rGOLPH2。在存在非生物素化rGOLPH2的条件下，细胞相关的荧光出现剂量依赖性降低说明结合是可逆的。rGOLPH2与树突状细胞可逆的和可饱和的结合支持存在rGOLPH2受体，我们将会去鉴定结合部分。

实施例13：将GOLPH2拉下后，通过蛋白质组学分析鉴定GOLPH2结合蛋白

在该预计性实施例中，描述了拉下实验以鉴定与GOLPH2结合的蛋白。

为防止出现来自GOLPH2/靶点相互作用与拉下使用的识别位点之间的干扰，使用组氨酸（His）标签标记rGOLPH2。然后，制备大量人树突状细胞的裂解物。加入混合蛋白酶抑制剂（Roche）以防止在裂解过程中出现蛋白降解。实施拉下实验，将His标记的rGOLPH2与Ni-NTA固相亲和纯化柱共同孵育，使用PBS充分洗涤柱子以除去未结合的rGOLPH2。然后将树突状细胞裂解物通过rGOLPH2-结合Ni-NTA柱。先使用裂解缓冲液再使用溶于PBS中的20mM亚咪二唑（immidizole）充分洗涤。使用0.2-0.5M梯度的亚咪二唑（immidizole）洗脱。在SDS-凝胶上分离所有的洗脱成分，使用考马斯亮蓝染色目测检查。切下凝胶条带，进行基于肽谱的MALDI-TOF以确定蛋白水解片段的质量。

在鉴定分离的GOLPH2-结合蛋白的上述分析中，可以将细胞质与膜GOLPH2结合蛋白相分离。将仅对具有一个或多个跨膜区的那些进行进一步针对作为推定的GOLPH2受体潜在候选物的表征。

实施例14：通过拉下鉴定GOLPH2-结合膜蛋白

该实施例描述了一种与实施例13中所描述的方法平行的，用于缩小前述实施例中产生的候选物列表，并且在拉下实验前纯化膜蛋白的方法。

首先，在室温下将10⁸个THP1细胞与溶于Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液pH7.4中的膜-不透过性生物素化试剂-ulfo-NHS-LC-LC-生物素（Pierce,Inc.）孵育30分钟。通过加入甘氨酸使其终浓度为20mM来终止反应。在全量制备前，进行较小规模的试验性生物素化，以发现产生最有效标记的条件（细胞密度、孵育时间和温度、生物素化试剂的浓度）。将通过在SDS-PAGE中分辨标记的THP1细胞和通过使用针对生物素的Western印迹检测生物素化的蛋白（Sigma Co.）确认标记效能。在表面生物素化后，在含有适量蛋白酶抑制剂混合物（Roche）的RIPA缓冲液中裂解THP1细胞。

将裂解物通过单体卵蛋白琼脂糖柱（Pierce）从而富集裂解物中的膜部分，使用PBS/0.6M NaCl洗涤，用PBS平衡，并使用溶于PBS的4mM生物素洗脱。如果使用His标记的GOLPH2，则洗脱得到的蛋白进行C.1.2b中描述的使用Ni-NTA柱（Qiagen）的拉下检测。柱上样、洗涤和洗脱的条件均依据C.1.2b中的描述。使用SDS-PAGE对洗脱得到的蛋白进行分辨，并使用针对生物素的抗体通过Western印迹对其进行分析。对照包括在初始材料中省去重组GOLPH2，或者使用来自非生物素化THP1的裂解物。对对照和待测洗脱成分的蛋白谱进行比较将有助于鉴定GOLPH2-R的候选物。

实施例15：GOLPH2受体的表征

该预计性实施例描述了对由前述实施例所描述的实验获得的候选GOLPH2受体蛋白进行进一步表征的方法。

将候选GOLPH2受体蛋白分成两组。在可用于候选GOLPH2结合蛋白的抗体的范围内，那些抗体将被检测以确定其在人树突状细胞中是否阻断了GOLPH2诱导的IL-12p35的转录抑制。将对这种阻断进行评估以确定其是否是以剂量依赖性的方式发生的。

如果抗体不能用于候选GOLPH2结合蛋白，则将使用双链抑制性RNA沉默各基因的表达。将对基因沉默的影响进行评估。将不对应于任何已知基因的乱序RNAi寡聚物作为对照。如果膜GOLPH2结合蛋白是一种功能性的GOLPH2-R，则其被沉默将减弱GOLPH2的调节活性。树突状细胞将通过释放更多IL-12加重炎症。

实施例16：使用同源的并具有免疫能力的小鼠肿瘤模型对B细胞介导的通过GOLPH2的抗肿瘤免疫逃逸的免疫学机制的研究

该预计性实施例描述了进一步研究B细胞是如何调控抗肿瘤CTL应答的实验。

将使用IgM^-/-B细胞缺陷小鼠⁷²以评估对原代同源性肿瘤的免疫应答。Kitamura等Nature350,423-6(1991)中对这种小鼠进行了描述。检测的原代同源性肿瘤将包括肿瘤，如MC38结肠癌和B16黑色素瘤（均为C57BL/6背景）。将检测不同试剂通过IL-12的表达和GOLPH2的调节影响肿瘤生长的能力。

在这些B细胞缺陷小鼠中，若干研究显示与野生型对象相比接种后其将出现更强的抗肿瘤（TS/A、MC38、EL4、76-9横纹肌肉瘤和B16）保护性免疫（Qin等，Nat Med 4,627-30(1998)；Perricone等，J Immunother27,273-81(2004)），与在野生型小鼠中的部分应答相比，在联合给予趋化因子和细胞因子治疗后其将完全阻止肺转移（Chapoval等，JImmunol161,6977-84(1998)）。而且，Shah等发现在B细胞缺陷小鼠中增强的肿瘤抗性并非因它们的非B免疫细胞的内在变化所致，因为将WT的脾脏B细胞过继转移至IgM^-/-小鼠会使其肿瘤排斥消除，并导致抗肿瘤T_H1细胞因子和CTL应答减少（Int J Cancer117,574-86(2005)）。涉及BCR-转基因小鼠的研究表明B细胞可以通过抗原非特异性机制抑制抗肿瘤T细胞的应答，因为肿瘤特异性抗体以及同源性T细胞和B细胞之间的相互作用对B细胞（id.）引起的对肿瘤免疫的抑制均不是必要的，这与BDSF^IL-12/GOLPH2能够通过抑制DC-IL-12的产生间接抑制T细胞IFN-γ产生的性质是一致的。值得注意的是，与人类癌症有关，已发现B细胞的浸润与转移性葡萄膜黑色素瘤⁵³和内脏转移性皮肤黑色素瘤相关（Whelchel等，InvestOphthalmol Vis Sci34,2603-6(1993)；Kiss等，Pathol Oncol Res13,21-31(2007)；Hillen等，Cancer Immunol Immunother57,97-106(2008)）。

实施例17：在WT和IgM^-/-小鼠中原代同源性肿瘤的生长

该预计性实施例描述了在可以暴露于不同检测试剂的野生型和B细胞缺陷小鼠中检测肿瘤生长的实验。可以对试剂进行检测以确定其是否出现GOLPH2抑制。

注射给予小鼠B16肿瘤细胞。接种肿瘤后三周内每三天监测一次肿瘤的生长情况。将至第15天仍无瘤状态确定为肿瘤排斥。

B16是一种高侵袭性和弱免疫原性肿瘤。研究表明接种剂量为10⁶个肿瘤细胞时，在第15天未达到完全的肿瘤排斥，但是肿瘤的生长明显减慢（Shah等，Int J Cancer117,574-86(2005)）。为设定基线，将在WT和IgM^-/-小鼠中对两种组织学上不同的同源性肿瘤MC38和B16的生长情况进行比较。

表1

实施例18：抗-GOLPH2抗体可以抑制肿瘤的生长

该预计性实施例描述了说明在野生型小鼠中使用抗-GOLPH2抗体抑制肿瘤生长的实验。

方法

皮下注射给予野生型和IgM^-/-小鼠（每组五只）10⁶个肿瘤细胞（例如，B16或MC38肿瘤细胞）。然后每日一次注射给予小鼠抗-GOLPH2抗体（剂量范围为0.2至2mg/kg）、同种型匹配的对照IgG抗体（对照）或磷酸盐缓冲液（对照）。识别具有氨基酸54-90（SEQ ID NO:7，如下文所示）的GOLPH2蛋白片段的抗-GOLPH2抗体可能特别有效。

54 RAAAERG AVELKKNEFQ GELEKQREQL DKIQSSHNFQ

接种肿瘤后三周内每三天监测一次肿瘤的生长情况。将至第15天仍无瘤状态确定为肿瘤排斥。

结果

给予抗-GOLPH2抗体的小鼠在一段时间内以剂量依赖性的方式表现出大幅减小的肿瘤生长。在野生型和IgM^-/-小鼠中可以观察到肿瘤排斥。因而，抗-GOLPH2抗体可以抑制肿瘤的活性。

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本申请引用或提及的所有专利和出版物均表明与本发明相关的本领域技术人员的水平，每个这样引用的专利或出版物均通过引用特别地并入本文，这与其全部内容单独地通过引用并入本申请或其全部在本申请中阐述的程度是相同的。申请人有权将来自此类引证专利或出版物的任意或全部材料和信息实际纳入本说明书。

本申请中所描述的特定的方法、设备和组合物均为具有代表性的优选实施方式，其为示例性的，并不旨在限定本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书后得到的其它对象、方面和实施方式均将包括在由权利要求的范围所限定的本发明的主旨的范围内。本领域技术人员将易于理解，在不脱离本发明范围和主旨的前提下，可以对本文所披露的发明进行不同的替换和修改。

本申请举例描述的本发明适当地可以在缺少一些元素或限定的条件下实施，本申请所特别披露的并非是必要的。本申请举例描述的方法和程序适当地可以以不同顺序的步骤实施，以及所述的方法和程序不必严格限定为本申请或权利要求中所示的步骤的顺序。

除非上下文另有明示，否则如本申请所使用的和在所附的权利要求中，单数形式的“一个”、“一种”和“这个”包括复数形式。所以，例如，“一个抗体”或“一个核酸”或“一个多肽”包括多个此类抗体、核酸或多肽（例如，抗体、核酸或多肽溶液或者一系列抗体、核酸或多肽制品）等等。除另有明示，否则在本文中，使用术语“或者”指非独占性的，或者例如“A或B”包括“A但不是B”、“B但不是A”、和“A和B”。

在任何情况下均不可以将本专利解释为限定至本申请所披露的特定的实施例或实施方式或特定方法。在任何情况下均不可以将本专利解释为限定至由专利商标局的任何审查员或者任何其它官员或雇员所提出的任何主张，除非此类主张是申请人在意见陈述中已明确表示的，并且是特定的和无条件或保留的。

所使用的术语和表达是用于描述而非限定的术语，并不旨在使用此类术语和表达排除所显示和描述的特征的任何等效物或其部分，但可以认识到在所主张的本发明的范围内可能存在多种改变。因而，将理解尽管本发明已通过优选实施方式和最佳特征特别地公开，但是本领域技术人员能够获得本申请公开的概念的改变和变化，此类改变和变化被认为是在由所附的权利要求和本发明的主张所定义的本发明的范围内。

在本文中已对本发明进行了概括地和一般地描述。落入一般性公开的各较窄的种类和亚类也是本发明的一部分。无论是否所除去的材料特别地在本申请中引用，其均包括通过附加条件或排除限定以便从总体中除去任何主题的发明的一般性描述。此外，当本发明的特征或方面以术语马库什群组描述时，本领域技术人员将理解发明也是对马库什群组中的任意单独的成员或成员的亚群描述的。

根据37 C.F.R.§1.72(b)的规定提供摘要以使得读者能够迅速确定所述技术公开的性质和主旨。将理解所提交的摘要将不用于解释或限定权利要求的范围或含义。

下述本发明的主张旨在描述本发明的一些因素。

本发明的主张：

1.一种在有需要的哺乳动物中增强细胞介导的免疫的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物GOLPH2抑制剂，从而在所述哺乳动物中增强细胞介导的免疫。

2.根据主张1所述的方法，其中所述抑制剂增强IL-12的哺乳动物内源性产生。

3.根据主张1或2所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂增强干扰素-γ的哺乳动物内源性产生。

4.根据主张1-3任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂抑制蛋白与包含TGCCGCG序列的启动子结合。

5.根据主张4所述的方法，其中所述与启动子结合的蛋白是锌指核因子。

6.根据主张4或5所述的方法，其中所述与启动子结合的蛋白是GC结合蛋白。

7.根据主张1-6任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂是抗体。

8.根据主张1-7任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂是与GOLPH2特异性结合的抗体。

9.根据主张1-8任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂是阻断GOLPH2与受体相互作用或结合的抗体。

10.根据主张1-9任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂是单克隆抗体。

11.根据主张1-10任意一项所述的方法，其中所述抑制剂是人抗体。

12.根据主张1-11任意一项所述的方法，其中所述抑制剂是人源化抗体。

13.根据主张1-12任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂是与GOLPH2的表位结合的抗体，所述GOLPH2的表位包括SEQ ID NO:1-15、17或其组合中的任意一个。

14.根据主张1-13任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2的抑制剂是与GOLPH2的表位结合的抗体，其中所述GOLPH2的表位基本上由SEQ ID NO:1-15、17或其组合中的任意一个组成。

15.根据主张1-14任意一项所述的方法，其中所述抑制剂是与分泌形式的GOLPH2结合的抗体。

16.根据主张1-15任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂是与GOLPH2的表位结合的抗体，所述GOLPH2的表位包括SEQ ID NO:2、4-15、17或其组合中的任意一个。

17.根据主张1-16任意一项所述的方法，其中所述GOLPH2抑制剂是与GOLPH2的表位结合的抗体，所述GOLPH2的表位基本上由SEQ ID NO:2、4-15、17或其组合中的任意一个组成。

18.根据主张1-6任意一项所述的方法，其中所述抑制剂是抑制性核酸。

19.根据主张1-6或18任意一项所述的方法，其中所述抑制剂是抑制性核酸，所述抑制性核酸与具有序列的核酸结合，所述序列包含SEQ ID NO:16、18或其组合中任意一个。

20.根据主张1-6、18或19任意一项所述的方法，其中所述抑制剂是抑制性核酸，所述抑制性核酸与具有序列的核酸结合，所述序列基本上由SEQ ID NO:16、18或其组合中任意一个组成的。

21.根据主张1-20任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有癌症。

22.根据主张1-21任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有癌、腺癌或肉瘤。

23.根据主张1-22任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有的癌症选自由肝癌、肺癌、肠癌、肾癌、脑癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、B-细胞癌或其组合组成的组。

24.根据主张1-23任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物存在感染。

25.根据主张1-24任意一项所述的方法，其中所述动物存在病毒感染。

26.根据主张1-25任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物存在细菌感染。

27.根据主张1-26任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物存在HIV或HCV感染。

28.根据主张1-27任意一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

29.一种增加抗体的方法，所述抗体中和可溶性GOLPH2的活性，所述方法包括增加所述抗体，所述抗体针对包括SEQ ID NO:7的肽表位或与其具有至少80%序列同一性的肽表位类似物。

30.根据主张29所述的方法，其中所述肽表位类似物具有一个氨基酸取代、一个增加的氨基酸或一个氨基酸缺失。

31.根据主张29所述的方法，其中所述肽表位类似物具有两个氨基酸取代、两个增加的氨基酸或两个氨基酸缺失。

32.根据主张29所述的方法，其中所述肽表位类似物具有三个氨基酸取代、三个增加的氨基酸或三个氨基酸缺失。

33.根据主张29所述的方法，其中所述肽表位类似物具有四个氨基酸取代、四个增加的氨基酸或四个氨基酸缺失。

34.一种增加抗体的方法，所述抗体中和可溶性GOLPH2的活性，所述方法包括增加所述抗体，所述抗体针对由SEQ ID NO:7组成的肽。

35.根据主张29-34任意一项所述的方法，其中所述抗体由噬菌体抗体文库获得。

36.根据主张29-34任意一项所述的方法，其中所述抗体通过亲和性成熟获得。

37.根据主张29-34任意一项所述的方法，其中将所述肽表位或肽表位类似物给予动物。

38.根据主张29-37任意一项所述的方法，其中所述抗体是人源化的或人抗体。

39.一种分离可溶性GOLPH2抑制剂的方法，所述方法包括：

（a）将包含可溶性GOLPH2的细胞培养物与待测物接触；和

（b）观察培养物中的细胞是否表达IL-12，其中如果培养物中的细胞表达IL-12，则所述待测物是可溶性GOLPH2抑制剂。

40.根据主张39所述的方法，其中所述培养物中的细胞选自树突状细胞、活化的单核细胞、T细胞、癌细胞及其组合。

41.根据主张39或40所述的方法，其中，与由包含可溶性GOLPH2但无待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养物中的细胞表达的IL-12增加至少10%，则所述待测物是可溶性GOLPH2的抑制剂。

42根据主张39-41任意一项所述的方法，其中，与由包含可溶性GOLPH2但无待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养物中的细胞表达的IL-12增加至少50%，则所述待测物是可溶性GOLPH2的抑制剂。

43.根据主张39-42任意一项所述的方法，其中，与由包含可溶性GOLPH2但无待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养物中的细胞表达的IL-12增加至少两倍，则所述待测物是可溶性GOLPH2的抑制剂。

44.根据主张39-43任意一项所述的方法，其中与由包含可溶性GOLPH2但无待测物的细胞培养物组成的对照相比，如果培养物中的细胞表达的IL-12增加至少三倍，则所述待测物是可溶性GOLPH2的抑制剂。

Claims (16)

1.哺乳动物GOLPH2抑制剂在制备一种用于在有需要的存在感染的哺乳动物中增强细胞介导的免疫的药物中的用途，其中所述药物能够给予所述哺乳动物，从而在所述哺乳动物中增强细胞介导的免疫，并且其中所述抑制剂是能够减少GOLPH2核酸的表达的抑制性核酸或与如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列结合的抗体。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂增强哺乳动物内源性产生IL-12。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述GOLPH2抑制剂增强哺乳动物内源性产生干扰素-γ。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述GOLPH2抑制剂是抗体。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述GOLPH2抑制剂是与GOLPH2特异性结合的抗体。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述GOLPH2抑制剂是单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是人抗体。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是人源化抗体。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是抑制性核酸，所述抑制性核酸与包含SEQ ID NO：16、18或其组合的任意一个序列的核酸结合。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述抑制剂是抑制性核酸，所述抑制性核酸与具有由SEQ ID NO：16、18或其组合中的任意一个组成的序列的核酸结合。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物存在病毒感染。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物存在细菌感染。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物存在HIV或HCV感染。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物是人。

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述GOLPH2抑制剂抑制蛋白与包含TGCCGCG序列的启动子的结合。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述与启动子结合的蛋白是GC结合蛋白。