CN115348870B - 通用型嵌合抗原受体t细胞及其应用 - Google Patents

通用型嵌合抗原受体t细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

一种包括突变体蛋白的细胞，所述突变体蛋白使得所述细胞对影响其活性和/或杀伤功能的抑制剂不敏感。与所述细胞相关的适合于向不特定患者给药的通用型嵌合抗原受体T细胞，以及这些细胞的制备方法和它们在细胞治疗方面的应用。

Description

通用型嵌合抗原受体T细胞及其应用
技术领域
本公开涉及嵌合抗原受体T细胞，尤其是适合于向不特定患者给药的通用型嵌合抗原受体T细胞。本公开还涉及这些嵌合抗原受体T细胞的制备方法和应用。
背景技术
过继性免疫细胞治疗在癌症、自身免疫病和感染性疾病的治疗方面已显示出了巨大的潜力。近些年来，使用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)来进行癌症治疗尤其受到关注。目前CAR-T细胞主要使用患者自身的T细胞制备。这涉及为每个患者分离、修饰和扩增T细胞，整个过程耗时且费用昂贵。此外，对于新生儿、老年人等患者，通常难以获得具有良好质量的T细胞以产生患者所需的特异性CAR-T细胞。
一种可能的解决方案是使用源自健康供体的T细胞产生通用型CAR-T细胞。相比自体CAR-T细胞，通用型CAR-T细胞具备多方面的优势：
(1)通过获得稳定批次的冻存细胞制品，通用CAR-T产品能够极大地缩短患者治疗等待期，为患者提供及时的治疗；
(2)为CAR-T细胞产品提供标准化的制备流程；
(3)有足够的时间对细胞进行多种修饰；
(4)能够实现反复给药；
(5)能够和不同靶点的CAR-T产品进行联用；
(6)通过工业化的生产流程降低CAR-T制备成本等。
因此，通用型CAR-T产品将是未来CAR-T疗法的主要趋势。
然而，通用CAR-T的研发也面临着极大的挑战，最需要解决以下两大问题：
(1)由于异体细胞输注而导致的移植物抗宿主病GvHD；
(2)通用CAR-T在宿主体内被宿主免疫系统快速清除，而无法有效扩增。
目前，第一个难题已基本得到解决。研究人员通过基因编辑技术，敲除αβ-T细胞上编码T细胞表面受体(TCR)的TRAC基因，有效抑制CAR-T细胞通过激活TCR对宿主细胞进行无差别的攻击，从而避免GvHD的发生。
相比之下，第二个问题更难解决。近年来研究者一直在探究如何使通用CAR-T细胞在宿主体内进行有效扩增。目前，主流的解决方案有两种：
(1)通过CD52单抗药物和通用CAR-T联合使用。在应用CD52蛋白的单克隆抗体药Alemtuzumab和化疗药物清淋后，给患者输注TRAC/CD52双敲除的CAR-T细胞进行治疗。该方案中敲除TRAC预防移植物抗宿主病，敲除CD52预防清淋药物对通用CAR-T的清除。目前，全球披露的通用CAR-T临床数据均是采用TRAC/CD52敲除和CD52单抗药物联合的治疗策略。
(2)另一种为了降低宿主排斥移植物反应的策略，是敲除通用CAR-T上的编码β2-微球蛋白的B2M基因。破坏β2-微球蛋白(B2M敲除)可阻止功能性HLA-I类分子在CAR-T细胞表面表达。该方案通过破坏HLA-I类分子，避免了通用CAR-T激活宿主体内的细胞毒T细胞，从而使其获得长期增殖。然而，由于HLA是NK细胞的抑制性配体，它的缺失会激活患者NK细胞对CAR-T细胞进行清除，使其在体内的扩增受限，影响其有效性。
到目前为止，研究者们通过多种方式优化TRAC/B2M基因敲除的CAR-T细胞，但仍存在较高的被宿主免疫清除的可能性。
发明内容
在一方面，本文提供了包括突变体蛋白的细胞，所述突变体蛋白使得所述细胞对影响其活性和/或杀伤功能的抑制剂不敏感。
在一些实施方案中，所述突变体蛋白属于酪氨酸激酶家族成员。
在一些实施方案中，所述突变体蛋白为LCK。
在一些实施方案中，所述LCK蛋白包括T316突变。
在一些实施方案中，所述LCK蛋白包括T316I、T316A或T316M突变。
在一些实施方案中，所述抑制剂为酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼.
在一些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述细胞为干细胞或免疫细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，所述突变体蛋白通过碱基编辑、HDR和/或过表达方式形成。
在一些实施方案中，所述过表达通过慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒和腺病毒转染形成。
在另一方面，本文提供了在细胞的Lck基因中引入T316突变的方法，其包括向所述细胞中引入碱基编辑器。
在一些实施方案中，所述碱基编辑器为ABE或CBE碱基编辑器。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述细胞中引入sgRNA。
在一些实施方案中，所述sgRNA包括SEQ ID NOs：5-8任一个所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CBE碱基编辑器为A3A-CBE3融合蛋白。
在一些实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述细胞为干细胞或免疫细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
在另一方面，本文提供了表达嵌合抗原受体的细胞，其中所述细胞具有杀伤活性或经诱导而具有杀伤活性，并且所述细胞经改造而使得其杀伤活性对细胞活性抑制剂不敏感。
在一些实施方案中，所述细胞活性抑制剂为T细胞活性抑制剂。
在一些实施方案中，所述细胞中至少一种生物活性分子经改造而对所述细胞活性抑制剂不敏感，而所述生物活性分子在正常T细胞中能够被所述细胞活性抑制剂所抑制。
在一些实施方案中，所述生物活性分子在嵌合抗原受体信号转导通路上起作用。
在一些实施方案中，所述生物活性分子为蛋白酶。
在一些实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酪氨酸激酶。
在一些实施方案中，所述蛋白酶为LCK蛋白。
在一些实施方案中，所述Lck蛋白酪氨酸激酶具有T316突变。
在一些实施方案中，所述Lck蛋白酪氨酸激酶具有T316I、T316A或T316M突变。
在一些实施方案中，所述改造通过使用碱基编辑器完成。
在一些实施方案中，所述碱基编辑器为ABE或CBE碱基编辑器。
在一些实施方案中，所述T316I突变通过如下方式获得：向所述细胞中引入碱基编辑器CBE和sgRNA，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID NOs：5-8任一个所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞中的LCK蛋白包括SEQ ID NOs：9-11任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞为T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，所述细胞还经改造以消除或减弱经由其细胞表面TCR而产生的细胞杀伤活性。
在一些实施方案中，所述细胞的TCR相关基因被敲除。
在一些实施方案中，所述细胞的TRAC基因被敲除。
在一些实施方案中，所述细胞的β2m基因被敲除。
在一些实施方案中，所述细胞的CIITA基因被敲除。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
在另一方面，本文提供了上述细胞在制备通用型CAR-T细胞中的应用。
在另一方面，本文提供了制备CAR细胞的方法，其包括对所述CAR细胞进行改造而使其CAR介导的杀伤活性对T细胞活性抑制剂不敏感。
在一些实施方案中，所述CAR细胞的至少一种生物活性分子经改造而对所述T细胞抑制剂不敏感，而所述生物活性分子在正常T细胞中能够被所述T细胞活性抑制剂所抑制。
在一些实施方案中，所述生物活性分子在所述CAR的信号转导通路上起作用。
在一些实施方案中，所述生物活性分子为蛋白酶。
在一些实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酪氨酸激酶。
在一些实施方案中，所述酶为LCK蛋白酪氨酸激酶。
在一些实施方案中，所述LCK蛋白酪氨酸激酶具有T316突变。
在一些实施方案中，所述LCK蛋白酪氨酸激酶具有T316I突变。
在一些实施方案中，所述T316I突变通过如下方式获得：向所述CAR细胞中引入胞嘧啶碱基编辑器和sgRNA，所述sgRNA包括SEQ ID NOs：5-8任一个所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述CAR细胞中的LCK蛋白酪氨酸激酶包括SEQ ID NOs：9-11任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CAR细胞为T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，所述CAR细胞还经改造以消除或减弱经由其细胞表面TCR而产生的细胞杀伤活性。
在一些实施方案中，所述CAR细胞的TCR相关基因被敲除。
在一些实施方案中，所述CAR细胞的TRAC基因被敲除。
在一些实施方案中，所述CAR细胞的β2m基因被敲除。
在一些实施方案中，所述CAR细胞的CIITA基因被敲除。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
在一些实施方案中，在由T细胞或NK细胞制备所述CAR细胞过程中让所述T细胞或NK细胞与所述T细胞活性抑制剂接触。
在一些实施方案中，在进行所述T316I突变时让所述T细胞或NK细胞与所述T细胞活性抑制剂接触；优选地，所述T细胞活性抑制剂的浓度为100nM。
在一些实施方案中，所述CAR的胞内信号结构域包括：
1)来自CD3z分子的信号传导结构域和来自CD28分子的共刺激结构域；以及
2)任选地，i)hIL7和CCL19，或ii)IL2RB和IL7Ra mutant，
其中，优选地，所述来自CD3z分子的信号传导结构域包括SEQ ID NO：48所示氨基酸序列；所述来自CD28分子的共刺激结构域包括SEQ ID NO：46所示氨基酸序列；所述hIL7包括SEQ ID NO：79所示氨基酸序列；所述CCL19包括SEQ ID NO：80所示氨基酸序列；所述IL2RB与所述来自CD28分子的共刺激结构域构成IL2RB-CD3z肽段，所述IL2RB-CD3z肽段包括SEQ ID NO：81所示氨基酸序列；所述IL7Ra mutant包括SEQ ID NO：82所示氨基酸序列。
在另一方面，本文提供了在患者中治疗疾病的方法，其包括以上述细胞联合细胞活性抑制剂向所述患者给药。
在一些实施方案中，所述细胞不是来源于所述患者。
在一些实施方案中，所述细胞为T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞抑制剂为T细胞活性抑制剂。
在一些实施方案中，所述细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述细胞活性抑制剂为LCK蛋白抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤。
在一些实施方案中，所述方法还包括停止所述细胞活性抑制剂的给药，以使所述患者自身的T细胞恢复活性并清除给药的所述细胞；或者增加所述细胞活性抑制剂的给药量，以抑制所述细胞在所述患者体内的杀伤活性。
在另一方面，本文提供了药物试剂盒或药物组合，其包括上述细胞和细胞活性抑制剂。
在一些实施方案中，所述细胞为T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞活性抑制剂为T细胞活性抑制剂。
在一些实施方案中，所述细胞抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
在另一方面，本文提供了上述细胞与细胞活性抑制剂联合在制备抗肿瘤药物中的用途。
在一些实施方案中，所述细胞为T细胞。
在一些实施方案中，所述细胞活性抑制剂为T细胞活性抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
本文提供的细胞以及由其制备的通用CAR-T细胞可用于对不特定患者进行治疗(异体细胞治疗)，克服了现有CAR-T细胞需要源自患者自身所带来的一系列问题。
附图说明
图1为达沙替尼有效抑制宿主T细胞情形下的UCART策略原理示意图。
图2为达沙替尼有效抑制宿主NK细胞情形下的UCART策略原理示意图。
图3为LCK介导TCR信号传导示意图。
图4为达沙替尼和不同的LCK突变结合关系示意图。
图5显示了ABL和LCK激酶的保守性示意图及LCK突变的碱基变化。
图6为LCK-T316突变相关sgRNA设计及分布图。
图7显示了LCK-T316突变相关sgRNA的脱靶和效率预测。
图8为适用于CBE3诱导LCK-T316I突变的sgRNA设计及分布图。
图9显示LCK-T316I能够使anti-BCMA CAR-T细胞耐受达沙替尼对细胞增殖的抑制。
图10显示了单碱基编辑用于人LCKT316I突变的sgRNA设计示意图及具体序列。10A.诱导人LCKT316I突变的sgRNA设计示意图。第一排数字表示LCK编码区的氨基酸序号，第二排代表氨基酸的类型。第三排原始基因序列中大写字母为外显子区域，小写字母为内含子区域。第四排第五排分别示意了与黑色箭头重合的sgRNA的靶向序列，即sgRNA序列以及未被黑色箭头标记的PAM序列。第六排第七排分别代表期望突变后的基因序列和氨基酸序列。红色代表目的突变。10B.设计的sgRNA具体序列。对LCK-sgRNA12和LCK-sgRNA16分别进行长度优化设计，从18nt到21nt范围内共设计的7条sgRNA的具体长度、序列即PAM等信息。
图11显示了不同长度LCK-sgRNA16均能高效诱导LCK-T316I突变。11A.电转编辑96hr后的T细胞，对LCK-T316位点测序峰图结果。18nt、20nt和21nt长度的LCK-sgRNA16在T316位点的胞嘧啶上有50％左右的突变诱导。11B.使用EditR对11A中的峰图进行突变效率的具体分析结果。
图12显示了不同长度LCK-sgRNA12均不能诱导LCK-T316I突变。12A.电转编辑96hr后的T细胞，对LCK-T316位点测序峰图结果。18nt、20nt和21nt长度的LCK-sgRNA12在T316位点的胞嘧啶均不能诱导有效突变。12B.使用EditR对12A中的峰图进行突变效率的具体分析结果。
图13显示了达沙替尼能够有效抑制TCR信号来抑制T细胞的活化。T细胞分别用DMSO、100nM和1000nM达沙替尼处理5小时，后用抗CD3/CD28 DynaBeads激活或不激活24小时，流式检测CD25、CD69(13A)和4-1BB(13B)的表达。
图14显示了LCK-T316I突变使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制。14A，14B.流式示意图展示在不同处理条件和编辑条件下的T细胞的CD25、CD69(14A)和4-1BB(14B)表达情况。第一排无达沙替尼和抗CD3/CD28刺激处理，第二排无达沙替尼但加入抗CD3/CD28刺激处理，第三排100nM达沙替尼预处理7小时后加入抗CD3/CD28刺激处理。MockT为未电转的对照，01组为只电转CBE3蛋白对照，02-05组为CBE3和sgRNA12编辑的无LCK同义突变对照，06-08组为CBE3和sgRNA16编辑的LCK-T316I突变组。14C.不同组T细胞活化标志物表达比例的差异统计，根据14A，14B数据统计。
图15显示了LCK-T316I使抗CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。15A.抗CD19-CAR-T细胞电转72小时后检测LCK编辑效率的测序结果以及EditR分析结果。只有LCK-sgRNA16编辑组能够造成LCK-T316I突变，突变效率在43％。15B.实施例5的实验流程缩略图，用100nM达沙替尼预处理CAR-T细胞12小时，再用靶细胞对CAR-T细胞进行激活，5小时后检测CD107a的释放。15C.流式结果分析的划门策略，分析CD8和CAR双阳性T细胞的CD107a释放。15D.流式结果分析。左列为CAR-T细胞与阴性靶细胞K562共孵育在DMSO和100nM达沙替尼处理下的CD107a释放，右侧为CAR-T细胞与阳性靶细胞Nalm6共孵育在DMSO和100nM达沙替尼处理下的CD107a释放。三排分别为CBE3电转对照组、LCK-sgRNA12编辑组和LCK-sgRNA16编辑组的T细胞。15E.图15D流式结果的统计分析结果。
图16显示了LCK-T316I使抗BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。16A.抗BCMA-CAR-T细胞电转72小时后检测LCK编辑效率的测序结果以及EditR分析结果。只有LCK-sgRNA16编辑组能够造成LCK-T316I突变，突变效率在42％。16B.流式结果分析。左列为CAR-T与阴性靶细胞K562共孵育在DMSO和100nM达沙替尼处理下的CD107a释放，中间为CAR-T与阳性靶细胞U266B1共孵育在DMSO和100nM达沙替尼处理下的CD107a释放，右侧为CAR-T与阳性靶细胞RPMI8226共孵育在DMSO和100nM达沙替尼处理下的CD107a释放。三排分别为CBE3电转对照组、LCK-sgRNA12编辑组和LCK-sgRNA16编辑组的T细胞。16C.图16B流式结果的统计分析结果。
图17显示了LCKT316I突变使CD19/BCMA双特异CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。17A.CD107a流式结果统计数据。每一排代表不同编辑类型的CD19/BCMA双特异性CAR-T在DMSO或100nM达沙替尼处理下，不同类型靶细胞共孵育对其CD107a的释放。17B.对图17A中的CD107a释放比例的柱状图展示。
图18显示了LCK-T316I突变使抗BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR-T杀伤功能的抑制。18A.实施例8的实验流程缩略图，用100nM达沙替尼预处理CAR-T细胞12小时，再用靶细胞和CAR-T细胞共培养24小时后，检测靶细胞荧光素酶的活性来指正CAR-T对靶细胞的杀伤。18B.荧光素酶活性数值检测结果。最左列为只有CAR-T细胞没有靶细胞的荧光素酶基底值，中间和最右列是CAR-T细胞在不同处理下，分别与阴性靶细胞Nalm6共孵育以及和阳性靶细胞RPMI-8226共孵育的数据。18C.对图18B中的数据进行柱状图整理和显著性分析结果。
图19显示了LCK-T316I突变使抗BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR-T杀伤功能的抑制(重复实验)。19A.荧光素酶活性数值检测结果。最左列为只有CAR-T细胞没有靶细胞的荧光素酶基底值，从第二列到第四列分别是CAR-T细胞在不同处理下，与阴性靶细胞K562、Raji以及阳性靶细胞RPMI-8226共孵育的数据。19B.对图19A中的数据进行柱状图整理和显著性分析结果。
图20显示了25nM浓度的达沙替尼在体外能够有效发挥对T细胞活化功能的抑制。20A.不同处理下的T细胞CD25和CD69流式检测表达图。每个处理2个复孔。20B.不同处理下的T细胞CD25和4-1BB流式检测表达图。每个处理2个复孔。
图21显示了达沙替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应。21A.50nM达沙替尼预处理后调整浓度实验。左侧为流式检测的CD107a释放结果。第一排是Sg12编辑的LCK同义突变CD5-UCAR-T细胞，第二排是Sg16编辑的LCK-T316I突变的CD5-UCAR-T细胞。从最左列到最右列分别降低达沙替尼浓度至0、15、25、35和50nM。右侧为CD107a阳性率的柱状统计图。21B.25nM达沙替尼预处理后调整浓度实验。左侧为流式检测的CD107a释放结果。第一排是Sg12编辑的LCK同义突变CD5-UCAR-T细胞，第二排是Sg16编辑的LCK-T316I突变的CD5-UCAR-T细胞。从最左列到最右列分别降低达沙替尼浓度至0、10、15、20和25nM。右侧为CD107a阳性率的柱状统计图。
图22显示了达沙替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应(重复实验)。22A.50nM达沙替尼预处理后调整浓度，流式检测的CD107a释放结果。最左列为未经达沙替尼处理的阳性对照组，从最第二列到最右列分别降低达沙替尼浓度至0、10、20、30、40和50nM。22B.25nM达沙替尼预处理后调整浓度，流式检测的CD107a释放结果。最左列为未经达沙替尼处理的阳性对照组，从最第二列到最右列分别降低达沙替尼浓度至0、10、20、25nM。
图23显示了100nM达沙替尼能有效抑制NK细胞激活过程中的CD107a的转运。流式检测的NK细胞的CD107a释放结果。第一排NK细胞用不同浓度达沙替尼处理，不用K562激活。第二排细胞用不同浓度达沙替尼处理，同时加入K562激活。
图24显示了30nM浓度的达沙替尼在体外能够有效发挥对NK细胞活化功能的抑制。24A.0-50nM达沙替尼梯度处理对NK细胞CD107a释放流式图。从上排最左列到下排最右列的浓度分别为0、10、20、25、30、40和50nM。24B.图24A中的CD107a阳性率的柱状统计图结果。
图25显示了体外达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。25A.不同浓度(0、25和50nM)的达沙替尼预处理后调整浓度，流式检测的NK细胞CD107a释放结果。从最左组到最右组分别降低达沙替尼浓度至0、7.5、12.5、17.5和25nM。25B.图25A中的CD107a阳性率的柱状统计图。结果显示，达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。
图26显示了体外达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应(重复实验)。26A.50nM的达沙替尼预处理后调整浓度，流式检测的NK细胞CD107a释放结果。最左列是不加任何处理的阳性对照，从左第二列到最右列分别降低达沙替尼浓度至0、10、20、30、40和50nM。26B.10nM和25nM的达沙替尼预处理后调整浓度，流式检测的NK细胞CD107a释放结果。最左列是不加任何处理的阳性对照，从左二、三列分别降低浓度至0和10Nm，从左第四列到最右列分别降低达沙替尼浓度至0、10、20和25nM。
图27为CD5-UCART制备参数检测示意图。27A.根据流式细胞分析TRAC基因的敲除效率为99.8％；CD5基因的敲除效率为99.9％。27B.通过检测EGFR转导标记与CD5抗原测得表达CAR的T细胞约为35％。27C.CBE3组为CD5-UCAT细胞对照组，sg12组为针对LCK发生同义突变的CD5-UCAT细胞对照组，对照组均未发生LCKT316I突变；sg16组(Km组)为发生了LCKT316I编辑的效率为79％。
图28显示了LCK-T316I突变的CD5-UCAR-T细胞在与异体T混合的MLR反应中具有扩增优势。28A.MLR反应中不同时间点的CD5-UCAR-T细胞在整体细胞中的占比示意图。28B.MLR反应中不同时间点的异体T细胞在整体细胞中的占比示意图。28C.MLR反应中不同时间点的CAR阳性率的变化示意图。28D.MLR反应中不同时间点的UCART与异体T细胞比例变化示意图。
图29为CD5-UCART制备参数检测示意图。29A.TRAC，CD5基因敲除效率检测。29B.T细胞感染慢病毒后5天，以抗EGFR抗体通过流式细胞术检测CAR阳性率结果。29C.CD5-UCART细胞发生Km编辑的效率检测：对照组未发生Km编辑；sg16(Km)组CD5-UCART细胞中T316I的突变效率为45％。
图30显示了LCK-T316I突变的CD5-UCAR-T细胞在与异体T混合的MLR反应中具有扩增优势。30A.MLR反应中不同时间点的CD5-UCAR-T细胞总量的示意图。30B.MLR反应中不同时间点的CD5-UCAR-T细胞在整体细胞中的占比示意图。30C.MLR反应中不同时间点的异体T(模拟宿主T)细胞总量的示意图。30D.MLR反应中不同时间点的异体T(模拟宿主T)细胞在整体细胞中的占比示意图。30E.MLR反应中不同时间点的表达CAR分子的UCART细胞的比例变化示意图。30F.MLR反应中不同时间点的UCART与模拟宿主T细胞的比例(实时效靶比)变化示意图。
图31显示了Km编辑的UCAR-T细胞耐受达沙替尼对T细胞功能的抑制作用。31A.混合淋巴反应第11天系统中所有细胞的LCK基因突变测序结果。31B.图31A的柱状图显著性分析结果。
图32显示了0-200nM浓度的帕纳替尼处理下的表面标记分子的表达分析结果。32A.Sanger测序检测三组不同编辑类型的T细胞的LCK-T316I区域的突变效率。Sg16-Km组的突变在30％，而对照组基本无突变。32B.实验流程缩略图。32C.对不同编辑类型的T细胞进行不同浓度的帕纳替尼处理，最左列为无帕纳替尼，不激活对照组。从第二列到最右列分别为0、10、50、100和200nM帕纳替尼预处理，并加激活组。APC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子4-1BB，PE标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子CD25。32D.实验同32C，FITC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面分子CD69，PE标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面分子CD25。
图33显示了0-1000nM浓度的帕纳替尼处理下的表面标记分子的表达分析结果。33A.对不同编辑类型的T细胞进行不同浓度的帕纳替尼处理，最左列为无帕纳替尼，不激活对照组。从第二列到最右列分别为0、10、50、200、500和1000nM帕纳替尼预处理，并加激活组。APC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子4-1BB，PE标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子CD25。33B.实验同23C，FITC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面分子CD69，PE标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面分子CD25。
图34显示了200nM浓度的帕纳替尼在体外能够有效发挥对NK细胞活化功能的抑制。34A.0-500nM帕纳替尼浓度梯度处理对NK细胞的CD107a释放流式图。从上排最左列到下排最右列的浓度分别为0、50、200和500nM。34B.图34A中的CD107a阳性率的柱状统计图结果，200nM帕纳替尼能够显著抑制NK细胞被K562激活的CD107a释放。
图35显示了帕纳替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应。35A.0、50和200nM帕纳替尼预处理后调整浓度实验，流式检测的CD107a释放结果。第一、二排是无帕纳替尼孵育组。第三、四排是200nM预处理后，降低帕纳替尼浓度至0、50、100和200nM。第五、六排是500nM预处理后，降低帕纳替尼浓度至0、50、100、200和500nM。35B.0、50和200nM帕纳替尼预处理后调整浓度实验，35A中数据的CD107a阳性率的柱状统计图。结果显示，帕纳替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应。
图36显示了体外帕纳替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。36A.不同浓度(0、50、100和200nM)的帕纳替尼预处理后调整浓度，流式检测的NK细胞CD107a释放结果。从最左组到最右组分别降低达沙替尼浓度至0、50、100和200nM。36B.图36A的CD107a阳性率的柱状统计图。结果显示，帕纳替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。
图37显示了帕纳替尼作为通用CAR-T治疗的联用药物和开关的可能性。37A.200nM的帕纳替尼预处理过夜后，不同浓度(0、50、100和200nM)的帕纳替尼处理下的CD19-UCART与靶细胞共孵育4小时后，流式检测的CD19-UCART细胞CD107a释放结果。37B.500nM的帕纳替尼预处理过夜后，不同浓度(0、100、200和300nM)的帕纳替尼处理下的CD19-UCART与靶细胞共孵育4小时后，流式检测的CD19-UCART细胞CD107a释放结果。
图38显示了LCK-T316I突变的B2M缺陷型CD19-UCAR-T细胞在与异体CD3缺失的PBMC混合的MLR反应中具有扩增优势。38A.制备的UCART细胞B2M、TRAC敲除效率以及CAR阳性检测示意图。38B.体外混合淋巴反应实验中UCART细胞总量随时间变化折线图。38C.体外混合淋巴反应实验中CAR阳性率随时间变化折线图。38D.体外混合淋巴反应实验中CD19阳性细胞占比随时间变化折线图。38E.体外混合淋巴反应实验中不同效靶比下CAR阳性细胞总量随时间变化柱状图。
图39显示了CD19-UCART制备参数以及检测结果。39A.TRAC、B2M、CIITA基因敲除效率检测与细胞感染慢病毒后5天，流式细胞术检测敲除率与CAR阳性率结果。39B.CD19-UCART细胞发生Km编辑的效率检测：对照组未发生Km编辑；sg16(Km)组CD19-UCART细胞中T316I的突变效率为20％。
图40显示了LCK-T316I突变的CD19-UCAR-T细胞在与异体PBMC混合的MLR反应中具有扩增优势。40A.MLR反应中不同时间点的CD19-UCAR-T细胞总量的示意图。40B.MLR反应中不同时间点的CD19-UCAR-T细胞在整体细胞中的占比示意图。40C.MLR反应中不同时间点的异体T(模拟宿主T)细胞总量的示意图。40D.MLR反应中不同时间点的异体NK(模拟宿主NK)细胞在整体细胞中的细胞总量示意图。40E.MLR反应中不同时间点的表达CAR分子的细胞总量示意图。40F.MLR反应中不同时间点的表达CAR分子的细胞在整体细胞中的占比示意图。
图41显示了CD19-UCART制备工艺参数优化的检测结果。41A.TRAC，B2M基因敲除效率检测。41B.细胞感染慢病毒后5天，流式细胞术检测CAR阳性率结果。41C.CD19-UCART细胞发生Km编辑的效率检测：实验组T316I的突变效率明显高于对照组。Eff.of Km：Km突变的效率。
图42显示了携带第三信号元件的CAR的构建和结果。42A.含有各种第三信号结构的CD19-UCART的质粒的结构示意图。42B.通过检测TRAC和B2M的表达来显示电转敲除的效率。42C.通过CD19-antigen和CAR结构上Anti-CD19的scFv结合来检测UCART细胞的CAR+比例。
图43显示了反复抗原刺激流程和结果。43A.反复抗原刺激实验操作流程示意图。43B-C.实验I中含有各种第三信号结构的CD19-UCART在M1培养条件(CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子)(43B)和M2培养条件(CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2)(43C)与经过丝裂霉素C预处理后的Raji细胞按效靶比2：1共培养。根据流式和细胞计数得出每一次的CAR+细胞量进而得出CAR+细胞的扩增倍数。43D-E.实验II中含有各种第三信号结构的CD19-UCART在M1培养条件(CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子)(43D)和M2培养条件(CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2)(43E)与经过丝裂霉素C预处理后的Raji细胞按效靶比2：1共培养。根据流式和细胞计数得出每一次的CAR+细胞量进而得出CAR+细胞的扩增倍数。
图44显示了携带第三信号结构的CART的功能检测结果。44A.实验I中含有各种第三信号结构的CD19-UCART在M1培养条件(CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子)和M2培养条件(CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2)下经过反复抗原刺激后的剩余CD19-UCART与Raji-luc细胞按1：1共培养进行luciferase杀伤实验。测得共培养后luciferase的发光度计算杀伤Raji-luc的比例并绘制柱状图。44B-C.实验II中含有各种第三信号结构的CD19-UCART在M1培养条件(CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子)和M2培养条件(CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2)下经过反复抗原刺激后的剩余CD19-UCART与Raji-luc细胞按2：1和0.5：1共培养进行luciferase杀伤实验。测得共培养后luciferase的发光度计算杀伤Raji-luc的比例并绘制折线图。44D.实验II中含有各种第三信号结构的CD19-UCART在M1培养条件(CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子)和M2培养条件(CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2)下经过反复抗原刺激后的剩余CD19-UCART与Raji，CCRF细胞按1：1和0.2：1共培养进行107a释放测定。测得共培养后107a流式结果计算UCART细胞释放107a的比例并绘制折线图。
图45显示了携带第三信号结构的CART的细胞因子分泌结果。45A.实验I中含有各种第三信号结构的CD19-UCART在M1培养条件(CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子)和M2培养条件(CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2)下经过反复抗原刺激后的培养基上清测定IL2的浓度。45B-D.实验II中含有各种第三信号结构的CD19-UCART在M1培养条件(CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子)和M2培养条件(CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2)下经过反复抗原刺激后的培养基上清测定IL2(45B)，IFN-gamma(45C)和TNF-alpha(45D)的浓度。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
“嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)”在本文指一种工程化的膜蛋白受体分子，其可将期望的特异性赋予免疫效应细胞，例如与特定肿瘤抗原结合的能力。嵌合抗原受体通常由胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域构成。在一些情形下，抗原结合结构域为一段scFv序列，负责识别和结合特定的抗原。胞内信号结构域通常包括免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，例如来源于CD3z分子的信号传导结构域，负责激活免疫效应细胞，产生杀伤作用。另外，嵌合抗原受体还可在氨基端包括负责新生蛋白在细胞内定位的信号肽，以及在抗原结合结构域和跨膜结构域之间包括铰链区。除了信号传导结构域，胞内信号结构域还可包括来源于例如4-1BB或CD28分子的共刺激结构域。
“双特异性嵌合抗原受体”旨在表示该分子在胞外抗原结合结构域中包括至少两个不同的抗原结合部位，它们分别识别和结合靶细胞上不同的抗原分子。例如，在本文实施例中就提到同时靶向CD19和BCMA的双特异性嵌合抗原受体。
“CAR细胞”在本文指在细胞表面表达CAR分子的细胞。在多数情况下，该细胞为免疫细胞，例如T细胞，或NK细胞。相应地，本文中将表达CAR的T细胞称为“CAR-T”或“CAR-T细胞”。另外，本文在提及CAR-T细胞时，除非另有说明，不仅指直接经CAR修饰的细胞，还指这些细胞在体外或体内增殖后产生的子细胞。
“通用CAR-T细胞(UCAR-T)”在本文指这种细胞不限于输入特定患者体内的CAR-T细胞。在现有技术中，为了防止GvHD以及宿主对移植物的排斥反应，通常是从患者体内收集细胞(如T细胞)并进行CAR修饰后输回到患者体内。这种方法不仅耗时昂贵，而且在有些情况下无法获得足够数量的患者T细胞来进行CAR修饰。与此相反，这里的通用CAR-T细胞指其适合于异体移植，同一批CAR-T细胞可用于不同的患者，并且这些通用CAR-T细胞通常并非源自于这些患者。
本发明至少部分地基于发明人发现的新的通用CAR-T制备方法和使用策略。
为了制备通用CAR-T细胞(UCAR-T)，在我们的通用CAR-T细胞的设计中，试图寻找到一种简单易行的处理方案，该方案具备以下两个关键点：
(1)在该方案下，宿主T细胞和NK细胞的激活和杀伤活性被有效抑制，不会攻击异体的通用CAR-T细胞；
(2)在该方案下，通用CAR-T的活化、杀伤及扩增等功能没有受到影响。
为了抑制宿主T细胞和NK细胞的杀伤活性，可以使用对二者均有抑制活性的抑制剂，或者使用对二者分别具有抑制活性的抑制剂，例如使用小分子抑制剂或者抑制性抗体分子，这些抑制剂可以导致T细胞和/或NK细胞减少或者不影响它们的数量。在此情况下，为了实现第(2)点，可对CAR-T细胞进行改造，使其对这些抑制剂不敏感(尤其是使得CAR信号转导通路可抵抗这些抑制剂的抑制作用)，即在这些抑制剂存在下，这些CAR-T细胞仍然可以存活、被靶细胞激活并且具有靶细胞杀伤活性(即使总体上杀伤活性有所降低)。有多种方式可以用来对CAR-T细胞进行这样的改造，包括但不限于，向CAR-T细胞中引入基因突变，突变后的基因产物(如蛋白或酶)对这些抑制剂不敏感并且具有未突变基因产物的功能；向CAR-T细胞中引入外源基因，这些外源基因在CAR-T细胞中表达产生的蛋白或酶不受这些抑制剂的影响并且可替换这些抑制剂的靶分子在细胞内起作用；向CAR-T细胞中引入这些抑制剂的结合物(如能够与这些抑制剂结合的外源蛋白，如内抗体)，以便中和这些抑制剂；在CAR-T细胞中过表达这些抑制剂的靶分子(如蛋白酶)，以便抵消这些抑制剂的影响，等等。
向细胞中引入基因突变的方法在本领域是已知的，包括但不限于，DNA同源重组、借助核酸内切酶(如ZFN和TALEN)进行特定位点剪切、基于CRISPR的基因编辑技术、以及各种碱基编辑器(如CBE、ABE以及它们的各种改进变体等)。
向细胞中引入外源基因的方法在本领域是已知的，包括但不限于，电穿孔、基因枪、显微注射、脂质体导入、病毒转导(例如，使用逆转录病毒、慢病毒，各种改进的病毒载体，例如腺病毒和腺相关病毒载体等)。
让细胞过表达某些蛋白或酶的方法例如可包括采用增加其编码基因的拷贝数、增强其编码基因的启动子功能等。
在细胞内引入突变、外源基因、或过表达可以是短期的或瞬时的，也可以是永久性的(例如突变基因或外源基因整合到宿主细胞染色体上)。引入可采用DNA或RNA形式，例如通过慢病毒转导使得外源基因可在宿主细胞内长期表达，或者通过引入mRNA使得宿主细胞可短期表达某些外源蛋白或酶。
本文所用的“突变体蛋白”指相对于野生型，其在氨基酸序列上有改动，或者相对于正常细胞的表达水平，其表达水平有变化，例如表达水平升高(或称为过表达)。
本领域技术人员应理解，上述改造可以在将原始细胞修饰为CAR-T细胞之前进行，同时进行，或者之后进行。例如，可将T细胞进行上述改造，使其对T细胞和NK细胞抑制剂不敏感，培养并制备T细胞库，之后根据各种治疗需要再进行CAR修饰，以获得针对各种不同治疗目的(如不同癌症)的通用CAR-T细胞。
这里的“原始细胞”指进行或准备进行CAR修饰的对象细胞，例如干细胞、各个发育阶段的免疫细胞、T细胞、NK细胞等。考虑到本申请的目的之一是制备通用型CAR-T细胞，这些细胞在来源上与准备治疗的患者无关，因此，这些原始细胞的来源基本上可不受限制，例如可来自血库，健康志愿者等。
在一些实施方案中，上述抑制剂为酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，这些酪氨酸激酶在CAR信号转导通路上其作用。在一些实施方案中，这些酪氨酸激酶在TCR信号转导通路和CAR信号转导通路上同时起作用。在一些具体实施方案中，该酪氨酸激酶为LCK激酶。在一些具体实施方案中，该酪氨酸激酶为LCK激酶，该抑制剂为达沙替尼(Dasatinib，DS)和/或帕纳替尼(Ponatinib，PN)。
在一个具体实施方案中，对LCK激酶的改造涉及其T316位点的突变，例如T316I、T316M、T316A以及其他突变，只要该突变使得突变后的产物对上述抑制剂(如达沙替尼和帕纳替尼)不敏感，但同时具有突变前的蛋白酶功能即可。优选地，该突变为T316I。
就该T316I突变而言，本公开提供了一种巧妙的方法来实现该突变。该方法涉及采用与sgRNA配合使用的胞嘧啶碱基编辑器，它们在Lck基因上实现了碱基对C·G至T·A的转变。该碱基对转变在其表达产物LCK中产生T316I突变，同时胞嘧啶碱基编辑器也导致该目标突变位点附近的某些其他碱基对C·G的转变，但这些其他转变正好均为同义突变，不在LCK中产生氨基酸改变。本领域技术人员应理解，尽管本文中在具体实施例中描述了优选的形成T316I突变的技术方案，但并不排斥其他类似方式也可形成T316位点的突变。例如，可在本文具体技术方案的启示下，采用基因编辑技术在T316位点形成其他突变，或者改变sgRNA的具体序列(包括长度改变、靶序列变动)，甚至采用这些或其他方式在产物LCK中产生多个突变(包括T316位点)，只要形成的产物LCK能保持其原有功能并且对上述抑制剂不敏感，则这些改动均应包括在本发明的范围内。
为了防止CAR-T细胞对宿主正常细胞(非靶细胞)的攻击，即GvHD，可考虑对CAR-T细胞上的TCR相关基因进行改造，使其TCR失去或降低活性，例如，通过基因编辑或其他方式敲除编码TCR受体α链的TRAC基因，和/或编码TCR受体β链的TRBC基因。
进一步地，为防止少数宿主T细胞或NK细胞对CAR-T细胞的攻击，可考虑降低或避免CAR-T分子上的HLA-I类分子的表达，例如通过敲除编码β2微球蛋白的B2M基因。
本文提供的通用CAR-T细胞可与细胞活性抑制剂联合进行患者(如癌症患者)治疗。如上文已阐述的，这些细胞活性抑制剂可以有多种类别，只要其可以在宿主(CAR-T细胞的接受者)体内使得其免疫系统不导致输入的CAR-T细胞的靶细胞杀伤活性丧失即可。通常，这些抑制剂可使得宿主免疫系统(例如T细胞，尤其是CD8+T细胞)不对CAR-T细胞杀伤。这种情况下，输入的CAR-T细胞可被其靶细胞激活并发挥杀伤作用，同时，也可在宿主体内增殖，发挥长效作用。优选地，这些抑制剂仅抑制宿主免疫系统的功能而不导致其功能的破坏。这种情况下，在清除抑制剂或不继续施用抑制剂时，宿主的免疫系统可尽快恢复其原有功能。
因此，在一些实施方案中，可以将这些抑制剂作为通用CAR-T细胞是否继续发挥其功能的分子开关使用。例如，可在向患者输入通用CAR-T细胞之前以抑制剂向患者给药，以抑制或减弱其免疫系统(尤其是T细胞)对即将输入的通用CAR-T细胞的杀伤活性，接着向患者输入通用CAR-T细胞，随后可视情况继续定期以抑制剂(与之前的抑制剂相同或不同)向患者给药，以维持患者体内的抑制剂浓度达到继续抑制患者免疫系统功能的水平。由于这些输入的通用CAR-T细胞经过改造而对上述抑制剂具有抗性，它们可识别并杀灭其靶细胞(如癌细胞)。待达到预期治疗效果(如肿瘤消退或消失)后，停止抑制剂给药，让患者自身免疫系统恢复功能，并清除体内的通用CAR-T细胞。在这个过程中，可定期检测患者体内通用CAR-T的含量和活性水平以及疾病状况，来判断是否需要再次输入通用CAR-T细胞。将这些抑制剂作为分子开关使用，还有益于用药安全。如果出现患者不能耐受通用CAR-T细胞治疗的情况，可随时停止抑制剂使用以便清除这些通用CAR-T细胞，以避免严重的不良反应。另外，还可通过增大抑制剂的浓度(例如在以帕纳替尼作为抑制剂时，可将其浓度从200nM提高至500nM)，使得可以耐受一定剂量抑制剂的抑制作用的上述通用CAR-T细胞变得不再能耐受抑制剂作用，继而不能继续增殖和/或具有靶细胞杀伤活性。因此，通过停止抑制剂的使用或增加抑制剂的浓度均可以作为分子开关来控制通用CAR-T细胞在体内的杀伤活性。
如下文实施例所阐述的，对于将达沙替尼作为抑制剂的情况，可以以这样的剂量给药以抑制或减弱患者免疫系统功能，即使得达沙替尼在患者体内的浓度不低于10nM、或不低于25nM，或不低于30nM，或不低于50nM，或不低于100nM。对于将帕纳替尼作为抑制剂的情况，可以以这样的剂量给药，即使得帕纳替尼在患者体内的浓度不低于100nM，或不低于200nM，或不低于300nM。
本文提供的通用CAR-T细胞还可以与其他癌症治疗剂联合使用，即在以所述抑制剂和通用CAR-T细胞向患者给药期间、之前或之后用其他癌症治疗剂向该患者给药。这些其他的癌症治疗剂可包括化疗药物、放疗药物、其他的生物治疗剂如抗体治疗剂或细胞治疗剂。
这里所用的“患者”指治疗对象，可以包括任何哺乳动物，例如猫、狗、羊、牛、小鼠、大鼠、兔、人、非人灵长类，等等。另外，患者可以是已患有疾病、有患某种疾病的风险、或者已经过治疗的任何个体。相应地，本文提供的通用型CAR-T的制备方法和治疗方法可用于人和非人哺乳动物，例如可以在将本文提供的通用CAR-T细胞首先在动物模型中验证其安全性和有效性，之后再用于人类临床研究和治疗。
在一个具体实施方案中，我们设计了以下通用CAR-T治疗策略(以下以达沙替尼作为T细胞活性抑制剂为例进行说明)：(1)将达沙替尼和通用CAR-T联用，通过达沙替尼抑制宿主T细胞和NK细胞活性，避免其杀伤通用CAR-T；(2)由于达沙替尼也能够抑制通用CAR-T活性，因此设计改造通用CAR-T使其对达沙替尼耐受；(3)通用CAR-T的改造使用CRSIPR-Cas9相关的胞嘧啶碱基编辑器(CBE3)，对其Lck基因进行点突变，造成LCK蛋白T316I突变；(4)突变后的UCAR-T T316I细胞能够显示出对达沙替尼药物的耐受。因此在达沙替尼处理下，宿主的T细胞和NK细胞被抑制，不会清除异体细胞，而UCAR-T能够行使正常的杀瘤功能，正常扩增；(5)本策略中除了编辑Lck基因外，仍需要对CAR-T细胞的TRAC基因，以避免GvHD。
在达沙替尼有效抑制宿主T细胞活性情形下，通用CAR-T的策略机制如图1所示。这一策略基于达沙替尼能够对宿主T细胞进行有效的清除而设计，主要考虑的是宿主T细胞对UCAR-T的清除。因此为了不考虑宿主NK细胞对UCAR-T清除的可能性，我们没有敲除HLA-I类分子，直接避免了因HLA-I类分子敲除而造成的宿主NK细胞激活。
如图1所示，最左侧一列显示了正常情况下回输宿主后的UCAR-T细胞在体内被宿主T细胞清除而难以扩增的原因。宿主T细胞的TCR识别到UCAR-T细胞表面的HLA-I类和II分子错配，主要是细胞毒CD8阳性T细胞识别HLA-I类分子的错配，宿主T细胞的胞内酪氨酸激酶LCK自磷酸化后，磷酸化TCR和CD3胞内段ITAMS信号，从而激活T细胞，对UCAR-T进行清除。中间一列显示的是达沙替尼联用后，其通过抑制宿主T细胞的LCK自磷酸化，抑制宿主T细胞TCR活化。而对通用CAR-T细胞而言，达沙替尼也通过抑制LCK自磷酸化，抑制CAR分子的磷酸化和激活，导致通用CAR-T无法被肿瘤细胞有效激活而扩增。最右侧一列显示了对通用CAR-T进行LCK的单碱基突变，使LCKm抵挡达沙替尼的结合，产生药物耐受。那么，在联合达沙替尼治疗下，编辑后的LCKm UCAR-T细胞够正常被肿瘤细胞激活并进行有效扩增。
在达沙替尼有效抑制宿主NK细胞情形下，通用CAR-T的策略机制如图2所示。这一策略基于达沙替尼能够对宿主NK细胞进行有效的清除而设计，主要考虑的是宿主NK细胞对UCAR-T的清除。因此为了不考虑宿主T细胞(主要是CD8阳性的细胞毒T细胞)对UCAR-T的杀伤，我们直接通过B2M基因的敲除，使UCAR-T不表达HLA-I类分子，直接避免了因HLA-I类分子错配而造成的宿主T细胞激活。
如图2，最左侧一列显示了正常情况下回输宿主后的UCAR-T细胞在体内被NK细胞清除的原理。由于HLA-I类分子是NK抑制性受体的主要配体，B2M的敲除会使得NK抑制性受体无法识别到配体，LCK自磷酸化而激活NK，介导对UCAR-T的杀伤。中间一列显示，当达沙替尼加入后，抑制了宿主NK和UCAR-T的活性，宿主NK不清除UCAR-T细胞，同时UCAR-T细胞也不具备杀伤肿瘤的功能。最右侧一列显示，当UCAR-T发生LCKT316I突变后，UCAR-T显示出对达沙替尼结合的抵抗，因此在有达沙替尼处理的情况下，宿主NK细胞活性被抑制，而编辑后的LCKm UCAR-T细胞够正常被肿瘤细胞激活并进行有效扩增。
LCK在T细胞信号转导中功能
LCK是Src家族激酶的一员，一般结合于T细胞的CD4、CD8共受体分子的胞内区域，介导T细胞受体分子胞内段ITAMS的磷酸化。因此，LCK是TCR信号转导的最上游的酪氨酸蛋白激酶，介导T细胞接受抗原刺激后的第一信号的传递。
如图3所示，当T细胞接受到抗原递呈细胞的抗原-MHC分子复合物的刺激后，结合在共受体胞内段的LCK蛋白发生自磷酸化，变成活化的磷酸化LCK状态，进而对TCR和CD3分子胞内段的ITAMS进行磷酸化。同时磷酸化的SH2结构域招募ZAP70，LCK进一步磷酸化ZAP70，激活下有MEK/ERK通路，参与T细胞的激活。因此，LCK是T细胞的激活通路中最上游且至关重要的一环。
达沙替尼对T细胞功能的抑制
到目前为止，达沙替尼对T细胞功能的抑制已经是受到认可的事件。2008年的两篇文献分别对达沙替尼如何抑制T细胞功能做了详细的阐述【1,2】。Stephen Blake等人报道达沙替尼作为Src/ABL激酶的抑制剂能够有效抑制正常的人T淋巴细胞在体外的诸多功能，包括达沙替尼能够通过结合LCK来有效阻断TCR信号的转导，抑制T细胞的激活、细胞因子分泌以及体外增殖，但不会影响T细胞的活率【1】。Andrew E.Schade等人报道了相似的实验结果，认为达沙替尼通过抑制LCK磷酸化，抑制了TCR介导的信号转导、细胞增殖、细胞因子分泌以及体内的细胞反应。但这种抑制是可逆的，当撤掉达沙替尼，T细胞的功能能够回复【2】。
达沙替尼对CAR-T细胞功能的抑制
既然达沙替尼能够通用抑制LCK磷酸化来抑制TCR的功能，那CAR-T的信号转导是否会受到达沙替尼的抑制？2019年，有两篇文献分别对达沙替尼如何抑制CAR-T细胞功能做了详细的阐述【3,4】。Evan W.Weber等人报道了达沙替尼是潜在的、快速的、可逆的CAR-T细胞功能抑制剂，能够抑制CAR-T细胞的增殖、细胞因子分泌和体内肿瘤杀伤活性【3】。KatrinMestermann等人报道了达沙替尼能够和LCK结合，抑制CD3z的磷酸化和ZAP70的磷酸化，因此达沙替尼能够抑制CAR分子结构中CD28_CD3z或4-1BB_CD3z的激活来抑制CAR分子功能。并且达沙替尼会诱导CD8+和CD4+CAR-T的功能静息状态，能够持续几天不影响T细胞活率。数据表明达沙替尼能够在体内和体外，抑制CAR-T细胞分泌细胞因子和增殖，并且这种抑制是可逆的【4】。
达沙替尼对NK细胞功能的抑制
达沙替尼除了对T细胞和CAR-T细胞有抑制的功能外，也能够抑制人原代NK细胞的脱颗粒和细胞因子释放【5】。
LCK突变与达沙替尼耐受的关系
有文献表明，LCK-T316M突变能够展示出对达沙替尼的耐受【6】，其原理是T316位点是LCK激酶的关键看门氨基酸，T316M的突变使得LCK结构发生了很大的变化。如图4所示，当316位点为T时，达沙替尼能够结合到LCK的ATP结合区域，抑制LCK的自磷酸化，而当316位点突变为M时，达沙替尼被阻挡在门外，无法与LCK-T316M的结合。
作为靶向ABL激酶的小分子抑制剂，达沙替尼有很多类似物，如Imatinib和nilotinib等。其中，研究最多的是ABL的突变和Imatinib耐受的关系。最常见的能够造成Imatinib耐受的ABL突变有T315I，T315A等【7,8,9】。我们发现，ABL激酶和LCK激酶之间的激活结构域是十分相似的，如图5所示，ABL-T315和LCK-T316前后的氨基酸序列高度保守，因此，我们推测LCK-T316I和LCK-T316A可能对达沙替尼也存在耐受。因此后续的LCK突变我们可以从T316M/A/I这三个方向进行设计。
在T细胞上诱导LCK突变的设计方案
CRISPR-Cas9作为目前做常用的基因编辑工具之一，能够在单链靶向RNA的介导下，对基因组实现特异、高效地切割。因此，CRISPR-Cas9相关的基因编辑非常适用于对LCK-T316点突变的诱导。我们设计了以下两套CRISPR相关的技术方案，能够实现T细胞上对LCK-T316位点的突变。
基于CRISPR-Cas9介导的同源重组修复诱导LCK-T316M/I/A突变的策略
CRISPR-Cas9介导的同源重组修复是实现碱基/氨基酸点突变的非常有效的技术手段。其原理是Cas9蛋白和sgRNA形成RNP后，能够被sgRNA靶向到基因组特定位置，在PAM序列前3-4nt的位置进行切割，诱导双链DNA破裂。此时，携带LCK-T316位点突变的同源重组的引入，能够使得细胞以模板序列进行修复，从而获得内源性的LCK-T316突变的细胞。这一同源重组的模板可以是双链DNA，也可以是单链DNA。而在点突变诱导体系中，单链DNA模板介导同源重组的效率最高。
因此，我们最初对LCK-T316位点附近100bp长度设计了适用于Cas9体系的16条sgRNA。如图6所示，在T316附近只有sg8、9、12三个sgRNA的切割位点距离突变位点7-12nt，其他sgRNA的切割位点距离突变位点太远，同源重组的效率会明显下降，因此我们选择了sg8、9和12这三条sgRNA评估其切割效率和脱靶情况。三条sgRNA的具体序列见SEQ ID NOs：16、17和18，其对应的ssDNA诱导T316I突变的序列见SEQ ID NOs：19-21，对应的ssDNA诱导T316M突变的序列见SEQ ID NO：22-24，对应的ssDNA诱导T316A突变的序列见SEQ ID NOs:25-27。
脱靶情况如图7所示，sg8、9和12的MM2分别有3、2和3个。MM2的数量表示，全基因组上有多少个位点，与该sgRNA有且仅有2个错配。一般情况下，发生MM0、MM1和MM2时，需要特别注意这一sgRNA的脱靶。因此，我们仔细查看了sg8、9和12的脱靶位点，发现sg8极可能脱靶到HCK和PDGFRB基因的外显子区域，sg9极可能脱靶到HCK和FYN基因的外显子区域，sg12极可能脱靶到DDR2基因的外显子区域。而在这些脱靶发生的情况下，Cas9蛋白能够对脱靶区域进行切割，进而敲除相关基因，造成很大的脱靶风险。因此，尽管这一方案能够诱导T316向M/I/A等多种氨基酸方向的突变，我们最终没有选择该方案。
其中LCK-T316I蛋白序列见SEQ ID NO:9，LCK-T316A蛋白序列见SEQ ID NO:10,LCK-T316M蛋白序列见SEQ ID NO:11。
另一种通过CRISPR-Cas9介导的同源重组诱导LCK-T316M/I/A突变的方法，是通过两条sgRNA切割加单链ssDNA模板进行修复。通过sgRNA1(SEQ ID NO：14)搭配sgRNA11(SEQID NO：15)，或sgRNA1搭配sgRNA12(SEQ ID NO：18)，也能够实现T316I/M/A突变的诱导。其中，sgRNA1搭配sgRNA11所需的T316I/M/A突变ssDNA模板序列分别见SEQ ID NOs：28-30，sgRNA搭配sgRNA12所需的T316I/M/A突变ssDNA模板序列分别见SEQ ID NOs：31-33。
基于CRISPR-Cas9的胞嘧啶碱基编辑器CBE3诱导LCK-T316I突变的策略
另一种能够诱导LCK-T316突变的工具是基于CRISPR-Cas9技术的胞嘧啶碱基编辑器。CBE3(胞嘧啶碱基编辑器3)的原理是将Cas9n蛋白和诱导胞嘧啶脱氨的蛋白APOBEC-3A融合表达(A3A-CBE3)，在Cas9n切割靶向位点单链时，诱导胞嘧啶脱氨，发生突变。Cas9n是对Cas9蛋白的RuvC1结构域进行D10A突变，使之成为Cas9-nickase蛋白(Cas9n)，只保留了HNH结构域的酶活性。Cas9n不会造成DNA双链断裂，只能够切割基因组上与sgRNA互补结合的DNA单链，从而诱导碱基错配修复(BER)。而此时APOBEC-3A能够诱导另一条DNA单链上的胞嘧啶发生脱氨，形成尿嘧啶，在UGI蛋白存在下，最终促使胞嘧啶向胸腺嘧啶的突变(C->T突变)。
发明人克隆了大肠杆菌表达体系的A3A-CBE3基因，通过大肠杆菌纯化表达出有功能的A3A-CBE3蛋白，其蛋白序列见SEQ ID NO：34。
如图8所示，我们从LCK-T316位点附近的sgRNA中搜索到两条符合胞嘧啶碱基编辑的sgRNA—sg12和sg16。当对T316(ACT)进行碱基编辑时，其第二位密码子胞嘧啶(C)定向突变为胸腺嘧啶(T)，能够诱导I316(ATT)的形成。
与Cas9介导的同源重组方案相比，这一体系的优势在于：(1)由于在CBE3系统中使用的是Cas9n蛋白，不会对基因组进行双链DNA切割，因此由于sgRNA脱靶在这套系统中造成的风险是极低的；(2)不需要模板ssDNA，直接电转CBE3蛋白和sgRNA形成的RNP即可实现基因编辑；(3)最关键的是，虽然目前CBE3碱基编辑还不能精确到sgRNA覆盖范围内的单个碱基的定点靶向，但在LCK-T316位点附近，sgRNA覆盖下的除T316位点以外的任意一个胞嘧啶的突变均不会造成氨基酸突变，即CBE3策略只会造成T316I的单个氨基酸突变。
这一策略仍需有两个问题有待需要验证：
(1)设计出的sg12和sg16两条sgRNA能够高效诱导LCK-T316I突变；
(2)LCK-T316I突变能否造成其对达沙替尼的耐受。
基于此，如表1所示，我们优化了sg12和sg16的长度，共设计了7条sgRNA用于后续突变的诱导和功能的验证。
表1LCK-T316I突变sg12和sg16序列表
Figure GDA0004233591050000211
发明人也设计LCK-sg16-19nt(TCACTGAATACATGGAGAA，SEQ ID NO:7)作为LCK-T316I突变的sgRNA，但没有进行实验验证，理论推导19nt长度的sgRNA和18nt、20nt以及21nt有类似或相同的功能。
除此之外，发明人也设计了saCas9诱导碱基编辑的可用的适用的sa-sgRNA，共有两条，分别LCK-saCas9-sgRNA1和sgRNA2，序列见SEQ ID NOs：12和13。
sgRNA对LCK-T316I突变诱导的功能验证
sgRNA16能够高效诱导LCK-T316I突变
我们从冻存的PBMC中分离CD3阳性T细胞，CD3/CD28 DynaBeads激活48hr后用于电转CBE3蛋白和sgRNA的RNP复合物，编辑后96hr抽提T细胞基因组，通过PCR和Sanger测序检测LCK基因编辑效率。
如下文实施例中具体描述的，只电转CBE3蛋白组的T细胞，其基因组Lck基因区域没有发生任何碱基突变，而不同长度的LCK-sgRNA16和CBE3蛋白形成的RNP均能够造成T316I的突变，突变效率约在50％。同时，T316位点前四个胞嘧啶也发生了C->T的突变，但均不会造成氨基酸的改变。因此，在T细胞中，这三条不同长度的LCK-sgRNA16均能够高效诱导LCK-T316I突变。为了减少sgRNA脱靶对编辑的影响，我们偏向于用21nt的sgRNA16进行后续实验。
sgRNA12不能诱导LCK-T316I突变
与上述基因编辑实验相同，我们也检测了sgRNA12对T细胞LCK-T316突变的诱导效率。与对照组CBE3相比，不同长度的LCK-sgRNA12对T316位点上的胞嘧啶基本没有任何编辑，对T316位点前的四个胞嘧啶能够诱导50％左右的C->T突变，但仍不能造成氨基酸的任何变化。因此，LCK-sgRNA12不能有效诱导LCK-T316I突变，但可以作为sgRNA16的阴性对照，因此我们选择了21nt的LCK-sgRNA16作为后续实验的对照。
LCK-T316I突变与达沙替尼抑制T/CAR-T信号激活的关系验证预实验验证达沙替 尼功能，确定达沙替尼能够高效抑制T细胞TCR的激活以及NK细胞的CD107a转运
为了验证达沙替尼对T细胞TCR信号激活的抑制，我们预先用达沙替尼或DMSO处理T细胞5小时，后用CD3/CD28 DynaBeads激活T细胞24小时，后用流式检测活化分子CD25，CD69和4-1BB的表达。结果显示，DMSO对照组在磁珠激活24小时后，活化分子CD25显著上调，同时CD69阳性或4-1BB阳性的细胞显著分群。而100nM/1000nM达沙替尼处理后，再用CD3/CD28激活也完全没有CD69/4-1BB阳性的活化细胞群，提示100nM达沙替尼已经能够有效抑制TCR信号的激活。
紧接着，我们为了验证达沙替尼对NK细胞激活的抑制，将人PBMC中分离的NK细胞于体外进行培养扩增。用不同浓度的达沙替尼处理24hr，一组不激活，另一组在检测CD107a之前用激活NK的靶细胞K562刺激5小时，后统一检测NK细胞的CD107a转运。结果显示，未激活组的NK细胞，用达沙替尼处理后，基底CD107a转运量也降低到2％的基线。而加入K562靶细胞激活后，未处理组的CD107a转运在64.5％，而处理组降低到2％的基线，提示100nM达沙替尼已足够抑制NK细胞的CD107a转运，抑制NK细胞激活。
LCK-T316I能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制
为了验证LCK-T316I突变对达沙替尼功能的耐受，我们对经LCK编辑的T细胞进行如下实验。对各组编辑细胞以及MockT细胞分别设置三组不同的处理：第一组不加达沙替尼，不用CD3/CD28磁珠激活；第二组不加达沙替尼，但用CD3/CD28磁珠进行TCR激活24小时；第三组预先用100nM达沙替尼预处理5小时，后加入CD3/CD28磁珠进行TCR激活24hr，观察基因编辑对达沙替尼抑制TCR激活的影响。
结果显示，在对照组中，加100nM达沙替尼组的CD25/CD69阳性细胞比例显著低于活化组，说明达沙替尼抑制CD3/CD28对TCR的活化。同时，在sg16编辑组中，加达沙替尼组中仍有高比例的CD25/CD69阳性细胞，以4-1BB作为活化标志物时，也能得到一样的结果。因此，sg16编辑后的一部分细胞在达沙替尼处理后，仍可以被激活为CD69/4-1BB阳性，证明其能够耐受达沙替尼对T细胞活化的抑制。
我们进一步对对照组、sg12编辑组和sg16编辑组的CD25、CD69以及4-1BB单阳性细胞比例进行统计，发现在sg16编辑组中，加达沙替尼和CD3/CD28磁珠处理下，三个活化标志物的表达比例比对照组和sg12编辑组显著的升高。进一步提示，sg16编辑组的T细胞(～50％ LCK-T316I)，显示出对达沙替尼的耐受，能够被CD3/CD28活化。
LCK-T316I使anti-CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制
为了验证LCK-T316I突变不仅能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR激活的抑制，还能够使CAR-T细胞耐受达沙替尼对其CAR激活过程中的CD107a转运的抑制，我们设计了如下实验。首先，我们对anti-CD19 CAR-T进行CBE3蛋白、CBE3+sg12以及CBE3+sg16三组不同的编辑处理，编辑后72hr稳定后，我们对各组CAR-T细胞进行12小时100nM达沙替尼的预处理，后续加入不同的靶细胞加以刺激，活化CAR信号，介导CAR-T杀伤靶细胞中CD107a的释放。在检测前5小时，加入monensin和CD107a抗体，5小时后，再进行CD8和CAR阳性的染色，用于检测CD8阳性CAR阳性细胞的CD107a的转运的富集。
这里使用的抗CD19-CAR分子的序列和后续实施例使用的序列均是一样的，具体序列见SEQ ID NOs：35-56。这一CAR分子的整体结构是一个二代CAR分子，由抗CD19的scFv(SEQ ID NOs：35-38)，加一段连接区域(SEQ ID NOs：39-40)，加CD8ahinge区域(SEQ IDNOs：41-42)，加CD8a跨膜结构域(SEQ ID NOs：43-44)，加CD28胞内结构域(SEQ ID NOs：45-46)，加CD3z胞内信号结构域(SEQ ID NOs：47-48)，加T2A序列(SEQ ID NOs：49-50)，加CSF2RA信号(SEQ ID NOs：51-52)，加tEGFR信号(SEQ ID NOs：53-54)组成。最终的抗CD19-CD28z-CAR的总序列见SEQ ID NOs：55-56。
结果显示，无论anti-CD19-CAR-T细胞编辑与否，在DMSO对照组中，阴性靶细胞K562无法激活CAR-T进行有效的CD107a转运，而阳性靶细胞Nalm6能充分激活CAR-T释放CD107a，阳性率在70％以上。而在100nM达沙替尼处理下，阴性对照组K562几乎没有任何CD107a的转运富集，而在阳性靶细胞Nalm6刺激下，只有sg16-LCK-T316I编辑组显示出50％阳性的CD107a转运，提示LCK-T316I突变确实能够使anti-CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制，并且这种耐受具备显著性差异。
LCK-T316I使anti-BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制
为了验证除了anti-CD19 CAR-T之外，LCK-T316I突变能够使其他CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制，我们对anti-BCMA CAR-T进行了LCK的三组编辑—CBE3、CBE3+LCK-sg12以及CBE3+LCK-sg16，实验流程和上文所述完全一致。用以刺激anti-BCMACAR-T的靶细胞有三组，分别是K562阴性靶细胞、U266-B1阳性靶细胞以及RPMI-8226阳性靶细胞三种。结果显示，在DMSO处理对照组中，三组编辑的anti-BCMA CAR-T在阳性靶细胞的刺激下均有较高水平的CD107a转运，而在100nM达沙替尼处理下，只有LCK-T316I突变组(CBE3+sg16组)显示出对达沙替尼的耐受，在两种阳性靶细胞激活下，分别有39.6％和44.7％阳性的CD107a释放。同时，这种程度的CD107a释放与其他编辑对照组之间存在显著性差异，提示LCK-T316I突变能够使anti-BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。
LCK-T316I使anti-CD19/BCMA双靶点UCAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑 制
此外，与上文实验基本一致，我们进一步在anti-CD19和BCMA的双靶点UCAR-T细胞中(敲除了TRAC)，验证了LCK-T316I突变对该种CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。结果显示，正常情况下，阴性靶细胞K562对双UCAR-T基本不激活，U266和Raji两种阳性靶细胞能够激活双UCAR-T。在100nM达沙替尼处理下，只有sg16编辑组能够展示出对达沙替尼抑制靶细胞激活下CD107a的转运的耐受，和前述结果完全符合。
LCK-T316I突变与达沙替尼抑制CAR-T杀伤功能的关系验证
LCK-T316I使anti-BCMA CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR-T杀伤功能的抑制
上文提到，LCK-T316I的突变能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制，同时也能够使CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR活化的抑制和CD107a转运的抑制。我们想进一步探究这种耐受能否在T细胞功能上有所体现，因此设计了以下实验探究LCK-T316I突变与达沙替尼抑制CAR-T杀伤功能之间的关系。
我们对anti-BCMA CAR-T进行CBE3蛋白、CBE3+sg12以及CBE3+sg16三组不同的编辑处理，编辑72hr稳定后，我们对各组CAR-T细胞进行12小时100nM达沙替尼的预处理，后续和不同的荧光素酶阳性的靶细胞(luciferase+)以效靶比1：1共孵育24小时，孵育结束后，通过检测荧光素酶的活性来评估CAR-T细胞对靶细胞的杀伤，luciferase数值越低，代表存活的靶细胞越少，CAR-T杀伤越强。结果显示，在DMSO对照组中，anti-BCMA CAR-T能够造成RPMI-8226阳性靶细胞的luciferase值降低，而不会影响阴性靶细胞Nalm6的luciferase值，证明anti-BCMA CAR-T的杀伤活性正常。在100nM达沙替尼处理下，阳性靶细胞RPMI-8226刺激下，CBE3和CBE3+sg12-LCK未编辑组中的luciferase值比DMSO组显著升高，证明在达沙替尼处理下，anti-BCMA CAR-T的杀伤功能受到了显著抑制。而CBE+sg16-LCK编辑组中的luciferase值显著低于CBE3和CBE3+sg12-LCK未编辑组，证明LCK-T316I突变后的anti-BCMA CAR-T对达沙替尼的CART杀伤活性抑制功能产生了耐受。
此外，我们重复编辑了另一批anti-BCMA CAR-T细胞，也得到了和上述实验一致的结果。在本次重复中，我们使用了另外两种阴性靶细胞，K562-luciferase和Raji-luciferase。Luciferase结果显示，在DMSO对照组中，编辑后的所有的anti-BCMA CAR-T细胞均不会杀伤K562和Raji两组阴性靶细胞，而会靶向RPMI-8226阳性靶细胞，其luciferase值基本降低到基线，提示anti-BCMA CAR-T具备正常的特异的杀伤功能。随后，在100nM达沙替尼处理下，阳性靶细胞组中的CBE3和CBE3+sg12组仍能检测到较高luciferase值，提示CAR-T的杀伤功能仍收到抑制。而CBE3+sg16-LCK-T316I编辑组的luciferase值显著降低，再次论证了LCK-T316I突变对达沙替尼的CAR-T杀伤抑制功能的耐受。
这里使用的以及后续实施例使用的抗BCMA-CAR-T细胞的CAR分子序列均是一样的，具体序列见SEQ ID NOs：77-78。
LCK-T316I突变与达沙替尼抑制T/CAR-T细胞增殖的关系验证
LCK-T316I使anti-BCMA CAR-T细胞耐受达沙替尼对细胞增殖的抑制
既然LCK-T316I能够对达沙替尼的TCR/CAR活化抑制和CAR-T细胞杀伤等功能产生耐受，那么我们想进一步探究文献报道中达沙替尼对T/CAR-T体外增殖的抑制功能，在LCK-T316I突变的CAR-T细胞中，是否能被抵抗。因此我们设计了以下验证CAR-T体外增殖的实验。首先对anti-BCMA CAR-T细胞进行CBE3、CBE3+sg12和CBE3+sg16三种编辑，编辑稳定72hr后，按照效靶比10：1加入靶细胞U266每3天进行一次刺激，同时每三天检测一次细胞总数和CAR阳性率。实验过程中用DMSO和100nM的达沙替尼分成两组处理。如图9，结果显示，虽然DMSO组的CAR-T细胞并没有很好的扩增，但在达沙替尼处理组，在Day12显示出了CBE3+sg16和其他两组的CAR阳性率的差异，同时整组细胞的细胞总数也是最多的。初步提示LCK-T316I能够使anti-BCMA CAR-T细胞耐受达沙替尼对细胞增殖的抑制。
初步简要的数据总结
我们找到了对LCK-T316I进行定点突变的方法，即胞嘧啶碱基编辑器CBE3配合LCK-sgRNA16，通过电转实现高效的T细胞LCK-T316I突变；
LCK-T316I突变能够抵抗达沙替尼在T细胞上的诸多功能：
达沙替尼能够高效抑制CD3/CD28对TCR信号的活化；
达沙替尼能够高效抑制靶细胞对CAR-T细胞的激活；
LCKT316I使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制；
LCKT316I使CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR活化的抑制；
LCKT316I使anti-CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制；
LCKT316I使anti-BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制；
LCKT316I使anti-CD19/BCMA双靶点CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制；
LCKT316I使CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR-T杀伤功能的抑制；
LCKT316I使CAR-T细胞耐受达沙替尼对细胞增殖的抑制。
另外，我们进一步研究发现：
25nM浓度的达沙替尼在体外能有效抑制T细胞的活化；
体外达沙替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应，而具有LCKT316I突变的CD5-UCART可耐受这种抑制；
达沙替尼能够有效抑制NK细胞的激活；
30nM浓度的达沙替尼在体外能有效抑制NK细胞的活化；
体外达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应；
LCKT316I突变和达沙替尼联用策略使CD5-UCART在5比1的效靶比的体外混合淋巴细胞反应中具扩增和存续优势；
LCKT316I突变和达沙替尼联用策略使CD5-UCART在50～100比1的效靶比体外混合淋巴细胞反应中具扩增和存续优势；
200nM浓度的帕纳替尼(PN)在体外能有效抑制T细胞的活化，而LCKT316I突变能够耐受这种抑制；
200nM浓度的帕纳替尼在体外能有效抑制NK细胞的活化；
体外帕纳替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应；
体外帕纳替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应；
验证帕纳替尼作为本专利通用CAR-T治疗的联用药物和开关的可能性；
证明了本发明策略中，B2M敲除的通用CAR-T细胞能抵抗NK细胞的杀伤。
最终，通过对通用CAR-T进行LCK-T316I编辑，搭配达沙替尼/帕纳替尼处理后，抑制宿主T和NK的活化和杀伤功能，使得LCKT316I的UCAR-T能够不被宿主的免疫系统清除，并且具备正常的杀瘤功能，在体内能够有效扩增，发挥功能。
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：方法和材料
方法
1.1 CD3+T细胞的分选和激活
复苏冻存的健康供体PBMC共1.0×108个细胞每管，快速融化后重悬于8mL预热的Rinsing buffer中，取少量细胞悬液进行细胞计数。将PBMC悬液以400g，升速设置8，降速设置8(后用↑8↓8代指)，离心10分钟。离心结束后，弃上清，加入20ul/107的CD3微珠，混匀后放入4℃冰箱孵育20分钟，期间每10分钟轻弹管壁数次避免细胞沉淀。孵育结束后，加入Rinsing buffer润洗1遍后离心(400g 10min↑8↓8)，再用500μl Rinsing buffer重悬细胞。同时将LS分选柱放置在美天旎磁力分选架上，用2ml Rinsing buffer润洗润洗1遍后，加入500μl的细胞悬液，待细胞悬液滴尽后反复2次加入2ml Rinsing buffer于LS柱上。用5mLRinsing buffer将目的细胞从LS柱上冲出并收集，做适当稀释后对目的细胞进行计数，取约1×105个细胞以流式细胞术确定分选的T细胞的纯度。随后将细胞悬液300g离心10分钟，用新鲜T细胞培养基将细胞密度调整至1×106，以10ul/106个细胞的浓度加入抗-CD3/-CD28抗体磁珠激活，按每孔4mL，种入到12孔板中，放入37℃，CO2培养箱中进行培养。
1.2 T细胞CAR阳性慢病毒转导
CD3阳性的T细胞用抗CD3/CD28磁珠激活24-48小时后，进行病毒转导。对细胞悬液进行活率检测和细胞计数。300g离心10分钟收集细胞，调整细胞密度为1×106/mL，于24孔板中每孔1mL体积，加入慢病毒，调整MOI为3，加入800ng/uL PolyBrene和1ug/uL DEAE助转。混匀后，37℃培养箱中继续培养。24小时后，300g离心10分钟离心去除病毒，培养T细胞。
1.3 T细胞基因敲除
以TRAC和CD5敲除为例：T细胞用抗CD3/抗-CD28抗体磁珠激活24小时后将磁珠去除，并对细胞进行计数并确认细胞活率，取若干份2×106/份细胞悬液于离心管中，100g离心10分钟。离心后完全去除培养基，并用Lonza电穿孔缓冲液进行重悬。与此同时，制备用于每份的35pmol Cas9蛋白+75pmol TRAC-sgRNA；35pmol Cas9蛋白+60pmol CD5-sgRNA的RNP复合物分别于室温孵育15分钟。随后将细胞悬液与RNP复合物混匀后加入Lonza 16孔电转杯中，放入4D-NucleofectorTMX单元以EH-115程序进行电穿孔。向电转杯中加入80ul/孔预加培养基于37度孵育15分钟，后转入48孔板以500uL T细胞完全培养基继续培养。
1.4 LCK-T316I基因编辑(Km编辑引入)
取T细胞，每组2×106/份细胞悬液于离心管中，100g离心10分钟。离心后完全去除培养基，并用Lonza电穿孔缓冲液重悬。与此同时，制备针对上述组别的RNP复合物(每份)：①60pmol CBE3蛋白；②60pmol CBE3蛋白+100pmol K-sgRNA12；③60pmol CBE3蛋白+100pmol K-sgRNA16的RNP复合物分别于室温孵育15分钟。随后将细胞悬液与RNP复合物混匀后加入Lonza 16孔电转杯中，放入4D-NucleofectorTMX单元以EH-115程序进行电穿孔。向电转杯中加入80ul预加培养基于37度孵育15分钟，后转入48孔板以500uL T细胞完全培养基继续培养。
1.5基因敲除效率检测
以TRAC和CD5敲除为例：在对T细胞进行电转敲除TRAC和CD5基因后72小时，以流式细胞术检测TRAC、CD5基因敲除效率。具体步骤为：取约2×105个细胞做细胞于1.5mL离心管中，用PBS+2％胎牛血清缓冲液洗2遍，完全弃去上清，用100μL缓冲液重悬细胞后加入PE-抗-人-TRAC和APC-抗-人-CD5抗体各1μL，混匀后4℃避光孵育30分钟，加入缓冲液洗一遍后上机检测。
1.6 CAR阳性率检测
T细胞感染慢病毒后5天，以流式细胞术检测CAR阳性率。具体步骤为：取两份约1×105个细胞做细胞于1.5mL离心管中，用PBS+2％胎牛血清缓冲液洗2遍，完全弃去上清。一份用100μl缓冲液重悬细胞后加入FITC标记的-人-靶点抗原蛋白5μl，另一份用100μl缓冲液重悬细胞后加入APC-抗-人-EGFR(转导标记)抗体1μL(如果有EGFR表达)，混匀后4℃避光孵育30分钟，加入缓冲液洗一遍后上机检测。
1.7LCK-T316I基因编辑的编辑效率检测
对T细胞或CAR-T细胞进行Km编辑72小时后检测T316I突变率。取各组约1×105个细胞进行基因组DNA的抽提，以其基因组DNA为模板，利用PCR扩增出覆盖Km区域并包含上下游各约200bp序列的DNA片段。利用Sanger法测序获得碱基序列图谱。在EditR网页版中上传Sanger测序的.ab1格式的文件并输入20bp的sgRNA序列，点击DataQC和Predict Editing观看分析结果，并通过Download Report下载。
所用到的主要试剂材料列在表2中。
表2主要试剂材料
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实施例2：利用单碱基编辑器A3A-CBE3，在T细胞中高效诱导人LCKT316I突变(简称Km)
发明人利用基于CRISPR-Cas9技术的单碱基胞嘧啶编辑器A3A-CBE3[10]，对人LCK蛋白诱导T316I突变，即人LCK蛋白的第316位氨基酸从苏氨酸(T)突变成异亮氨酸(I)，简称Km。
A3A-CBE3蛋白是APOBEC3A和Cas9-D10A突变的切口酶融合蛋白，能够被特定序列的sgRNA靶向到基因组特定位置，介导sgRNA靶向范围内的胞嘧啶向胸腺嘧啶的突变，从而实现碱基编辑和蛋白突变。Cas9-D10A是对Cas9蛋白的RuvC1结构域进行D10A突变，使之成为Cas9-nickase切口酶蛋白(Cas9n)，只保留了HNH结构域的酶活性，从而使得Cas9n不会造成DNA双链断裂，只能够切割基因组上与sgRNA互补结合的DNA单链，从而诱导碱基错配修复(BER)。而此时APOBEC3能够诱导另一条DNA单链上的胞嘧啶发生脱氨，形成尿嘧啶，在UGI蛋白存在下，最终促使胞嘧啶向胸腺嘧啶的突变(C->T突变)。
发明人对诱导LCKT316I突变的sgRNA进行了设计。
如图10A所示，发明人通过分析编码LCK蛋白的基因序列，在LCK-T316位点附近对符合T316位点胞嘧啶碱基编辑特点的sgRNA进行了设计，最终有两条sgRNA能够符合单碱基编辑的要求——LCK-sgRNA12和LCK-sgRNA16。当对T316(ACT)进行碱基编辑时，其第二位密码子胞嘧啶(C)定向突变为胸腺嘧啶(T)，能够诱导I316(ATT)的形成。同时，发明人改良了sgRNA的长度以期提高其诱导突变的效率，设计了18nt到21nt长度不等的sgRNA，如图10B所示。
发明人验证sgRNA对LCKT316I突变诱导的功能和效率，LCK-sgRNA16能够高效诱导LCK-T316I突变，LCK-sgRNA12则不能诱导LCK-T316I突变。
发明人从冻存的人PBMC中分离CD3阳性T细胞，分选阳性率在95％以上。利用抗-CD3/CD28的DynaBeads磁珠刺激激活分选出的CD3阳性T细胞48小时后用于突变诱导。将A3A-CBE3蛋白和不同长度的LCK-sgRNA16在体外共孵育形成RNP复合物后，通过LONZANucleofector-4D电转仪和P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit试剂盒进行激活的T细胞电转，电转程序为EH-115。电转后继续培养96小时，抽提T细胞基因组，通过PCR和Sanger测序检测lck基因编辑的效率。
如图11A所示，没有加入sgRNA只电转了A3A-CBE3蛋白组的T细胞，其基因组lck基因区域没有发生任何碱基突变(每个测序位点均是单一峰图)，而不同长度的LCK-sgRNA16和A3A-CBE3蛋白形成的RNP均能够造成T316I的突变(T316位点的胞嘧啶C的蓝色测序峰上出现红色的代表胸腺嘧啶T的测序峰，形成套峰)，根据套峰的峰值分析，突变效率约在50％左右。同时，T316位点前四个胞嘧啶也发生了C->T的突变，但由于这四个胞嘧啶均处于氨基酸的第三位简并密码子的位置上，因此除T316位点突变的胞嘧啶外的主要突变均不会造成氨基酸的改变。
如图11B所示，发明人通过EditR[11]分析测序结果，统计18nt、20nt以及21nt长度的sgRNA诱导下，LCK主要突变位点的胞嘧啶的突变频率，结果显示不同长度的sgRNA对T316位点的胞嘧啶突变诱导效率基本一致，均在50％左右。因此，在激活的T细胞中，这三条不同长度的LCK-sgRNA16均能够高效诱导LCK-T316I突变。为了减少sgRNA脱靶对编辑的影响，我们用21nt的sgRNA16进行后续实验。
发明人验证LCK-sgRNA12不能诱导LCK-T316I突变。
与上述基因编辑实验相同，发明人也检测了LCK-sgRNA12对T细胞LCK-T316突变的诱导效率。如图12所示，与对照组只电转了A3A-CBE3蛋白的测序结果相比，不同长度的LCK-sgRNA12对T316位点上的胞嘧啶基本没有任何编辑，对T316位点前的四个胞嘧啶能够诱导50％左右的C->T突变，但仍不能造成氨基酸的任何变化。因此，LCK-sgRNA12不能有效诱导LCK-T316I突变，但可以作为sgRNA16的阴性对照，因此我们选择了21nt的LCK-sgRNA12作为后续实验的对照，保证和LCK-sgRNA16-21nt的长度一致。
实施例3：验证达沙替尼能够有效抑制TCR信号来抑制T细胞的活化
达沙替尼(Dasatinib)作为Src/ABL激酶的抑制剂能够有效抑制正常的人T淋巴细胞在体外的诸多功能，包括达沙替尼能够通过结合LCK来有效阻断TCR信号的转导，抑制T细胞的激活、细胞因子分泌以及体外增殖，但不会影响T细胞的活率[1]，并且已知达沙替尼通过抑制LCK磷酸化，抑制了TCR介导的信号转导、细胞增殖、细胞因子分泌以及体内的细胞反应。但这种抑制是可逆的，当撤掉达沙替尼，T细胞的功能能够恢复[2]。同时，达沙替尼也是潜在的、快速的、可逆的CAR-T细胞功能抑制剂，能够抑制CAR-T细胞的增殖、细胞因子分泌和体内肿瘤杀伤活性[3]，能够在体内和体外，抑制CAR-T细胞分泌细胞因子和增殖，并且这种抑制是可逆的[4]。
发明人为了验证LCKT316I突变能够使得通用CART细胞抵抗达沙替尼对T细胞活化的抑制，首先重复了达沙替尼能够有效抑制TCR信号来抑制T细胞的活化。
发明人预先用达沙替尼或DMSO处理T细胞5小时，后用抗CD3/CD28的DynaBeads磁珠激活T细胞24小时，随后用流式检测活化分子CD25、CD69和4-1BB的表达。如图13所示，DMSO对照组在磁珠激活24小时后，活化分子CD25和CD69双阳性细胞显著上调，从2.85％升高到38.9％(图13A上)，而用100nM或1000nM达沙替尼处理5小时后，再用磁珠激活24小时也无法上调CD25和CD69双阳性细胞比例(图13A中、下)。同样地，DMSO对照组在磁珠激活24小时后，活化分子CD25和4-1BB双阳性细胞也显著上调，从1.11％升高到35.9％(图13B上)，而用100nM或1000nM达沙替尼处理5小时后，再用磁珠激活24小时也无法上调CD25和4-1BB双阳性细胞比例(图13B中、下)。这些数据提示达沙替尼能够抑制TCR信号的激活，并且100nM浓度已经足够起到抑制作用。
实施例4：LCKT316I突变使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制
为了验证LCK-T316I突变对达沙替尼功能的耐受，发明人对实施例2中制备所得的不同sgRNA长度编辑LCK的T细胞进行了实验验证。对各组电转的T细胞以及未做电转的MockT细胞分别设置三组不同的处理：如图14A所示，第一组处理不用达沙替尼处理且不用CD3/CD28磁珠激活(图14A，第一排)；第二组不用达沙替尼处理，但用抗CD3/CD28磁珠进行TCR激活24小时(图14A，第二排)；第三组预先用100nM达沙替尼处理5小时，随后加入抗CD3/CD28磁珠进行TCR激活24hr(图14A，第三排)，最终通过流式检测CD25、CD69和4-1BB等T细胞活化信号的表达，验证LCK-T316I突变能够耐受达沙替尼对T细胞活化的抑制。
本实施例中对T细胞进行了如下的编辑和分组：MockT组是未经电转的T细胞，01CBE3组是只电转了CBE3蛋白的T细胞；02-05组分别是电转了CBE3蛋白和不同长度LCK-sgRNA12形成的RNP的T细胞，因为sgRNA不会造成LCK蛋白的任何氨基酸突变，可以作为LCK编辑的阴性对照；06-08组分别是电转了CBE3蛋白和不同长度LCK-sgRNA16形成的RNP的T细胞，这些T细胞发生了LCK-T316I突变，突变效率在50％左右，数据见实施例2的图11。
发明人证明LCK-T316I突变能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制。
如图14所示，在不加达沙替尼处理且无抗CD3/CD28磁珠激活T细胞的条件下(图14A，图14B，第一排)，所有检测的T细胞均没有CD69(图14A)和4-1BB(图14B)活化分子的表达。当加入抗CD3/CD28磁珠激活T细胞时(图14A，图14B，第二排)，CD25、CD69和4-1BB的表达在各组细胞中均显著上升，证明无论LCK编辑与否，T细胞均能被抗CD3/CD28磁珠有效激活，转导TCR信号。当用100nM达沙替尼预处理7小时后，再用抗CD3/CD28磁珠对T细胞进行激活(图14A，图14B，第三排)，此时除了LCK-T316I编辑组的T细胞外(06-08组)，其余LCK未发生编辑的细胞(MockT、01-05组)其CD25、CD69和4-1BB活化分子的表达和第一排未激活组一致，提示100nM达沙替尼能够完全抑制TCR信号激活以及由于T细胞活化导致的CD69和4-1BB的表达升高。而发生了LCK-T316I突变的T细胞(06-08组)在100nM达沙替尼处理下，仍然能够被抗CD3/CD28刺激激活、转导TCR信号，呈现出CD25、CD69和4-1BB等活化分子的显著上升的表达(图14A，14B，第三排06-08组)，进一步证明LCK-T316I突变能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制。
发明人进一步对数据进行统计，将MockT和01-CBE3组设置为空白对照组，将02-05组设置为sgRNA12编辑组(同义突变组)，将06-08组设置为sgRNA16编辑组(LCK-T316I突变组)，统计在三种处理条件下，分别表达CD25、CD69和4-1BB的阳性细胞比例。如图14C所示，在sgRNA16编辑组中，加达沙替尼和抗CD3/CD28磁珠处理下，三个活化标志物的表达比例比对照组和sgRNA12编辑组显著的升高。进一步提示，sgRNA16编辑组的T细胞(～50％ LCK-T316I突变)显示出对达沙替尼抑制T细胞活化功能的耐受，LCK-T316I突变的T细胞仍能够被激活。
此外，虽然相比于不加达沙替尼处理，直接被抗CD3/CD28磁珠激活的sgRNA16组细胞而言，达沙替尼处理组的活化分子的表达显著降低(20％-50％左右，图14C)。这是由于sgRNA16编辑组的效率在50％左右，并不能做到100％的编辑造成的，部分发生了LCK-T316I突变的T细胞在达沙替尼的处理下显示出耐受，而另外没有被编辑的细胞仍然不能有效活化，最终导致了活化比例的下降。这些数据很好地说明了LCK-T316I突变对达沙替尼抑制T细胞活化功能的耐受现象。
实施例5：LCKT316I突变使抗CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制
基于发明人已经验证LCK-T316I突变能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制，为了验证LCK-T316I突变不仅能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR激活的抑制，还能够使CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR激活过程中的CD107a转运的抑制，发明人设计开展了如下实验，证明LCK-T316I突变使抗CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。
首先，发明人对已制备的抗CD19 CAR-T进行电转编辑，分别电转CBE3蛋白、CBE3和LCK-sgRNA12的RNP复合物以及CBE3和LCK-sgRNA16的RNP复合物，实现三组不同的编辑处理，编辑72小时后，检测突变效率，其中LCK-T316I突变达到43％左右(图15A)。如图15B所示方案，发明人对各组CAR-T细胞进行12个小时100nM达沙替尼的预处理，后续用不同的靶细胞(表达CD19抗原的阳性靶细胞Nalm6以及不表达CD19抗原的阴性靶细胞K562)和抗CD19-CAR-T细胞共孵育，刺激活化CAR信号，介导CAR-T杀伤靶细胞和CAR-T积累CD107a。在检测前5小时，加入莫能霉素(monensin)和CD107a抗体，5小时后进行CD8和CAR阳性的染色，用于检测CD8阳性CAR阳性细胞的CD107a的转运的富集。
通过分析流式实验数据，如图15C所示划门策略中，从CD8和CAR双阳性细胞中分析CD107a的转运富集。结果发现无论抗CD19-CAR-T细胞编辑与否，在DMSO处理对照组中，阴性靶细胞K562无法激活CAR-T进行有效的CD107a转运(图15D左起第一列)，而阳性靶细胞Nalm6能充分激活CAR-T释放CD107a，阳性率在70％以上(图15D左起第三列)。在100nM达沙替尼处理组中，阴性对照组K562几乎没有任何CD107a的转运富集(图15D左起第二列)，而在阳性靶细胞Nalm6刺激下，只有LCK-sgRNA16编辑组(LCK-T316I突变比例43％)的CAR-T细胞显示出50％阳性的CD107a转运(图15D左起第四列)，提示LCK-T316I突变确实能够使抗CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。
发明人对上述实验的两次重复进行了统计分析，结果如图15E所示，阳性靶细胞Nalm6能够激活所有抗CD19-CAR-T细胞释放CD107a，加入100nM达沙替尼处理后，CBE3对照组和LCK-sgRNA12同义突变组的CD107a释放显著降低，而LCK-sgRNA16-T316I突变组的CD107a释放仍在较高水平，与对照组形成显著性差异。这一现象说明达沙替尼不仅能够抑制T细胞中TCR信号的活化，还可以抑制CAR-T细胞中CAR信号的活化，同时LCK-T316I突变能够抵抗达沙替尼对CAR-T细胞CAR信号活化的抑制作用。
实施例6：LCKT316I突变使抗BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制
在实施例5中，发明人已经证明LCK-T316I突变使抗CD19-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制，为了加强这一结论，在本实施例中，发明人验证了在BCMA靶点的CAR-T中仍能观察到LCK-T316I突变使BCMA-CAR-T细胞抵抗达沙替尼对CD107a转运的抑制。
首先，发明人对已制备的抗BCMACAR-T进行电转编辑，分别电转CBE3蛋白、CBE3和LCK-sgRNA12的RNP复合物以及CBE3和LCK-sgRNA16的RNP复合物，实现三组不同的编辑处理，编辑72小时后，检测突变效率，其中LCK-T316I突变达到42％左右(图16A)。发明人对各组CAR-T细胞进行12个小时100nM达沙替尼的预处理，后续用不同的靶细胞(表达BCMA抗原的阳性靶细胞U266B1和RPMI-8226以及不表达BCMA抗原的阴性靶细胞K562)和抗BCMA-CAR-T细胞共孵育，刺激活化CAR信号，介导CAR-T杀伤靶细胞和CAR-T积累CD107a。在检测前5小时，加入莫能霉素和CD107a抗体，5小时后进行CD8和CAR阳性的染色，用于检测CD8阳性CAR阳性细胞的CD107a的转运的富集。
通过分析流式实验数据，从CD8和CAR双阳性细胞中分析CD107a的转运富集。结果如图16B所示，无论抗BCMA-CAR-T细胞编辑与否，在DMSO处理对照组中，阴性靶细胞K562无法激活CAR-T进行有效的CD107a转运(图16B左起第一列)，而阳性靶细胞U266B1和RMPI-8228均能充分激活CAR-T释放CD107a，阳性率在68％以上(图16B左起第三和第五列)。在100nM达沙替尼处理组中，阴性对照组K562几乎没有任何CD107a的转运富集(图16B左起第二列)，而在阳性靶细胞U266B1或RMPI-8226的刺激下，只有LCK-sgRNA16编辑组(LCK-T316I突变比例42％)的CAR-T细胞显示出39.6％和44.7％阳性的CD107a转运(图16B左起第四和第六列)，提示LCK-T316I突变确实能够使抗BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。
发明人对上述实验的两次重复进行了统计分析，结果如图16C所示，阳性靶细胞U266B1和RMPI-8228能够激活所有抗BCMA-CAR-T细胞释放CD107a，加入100nM达沙替尼处理后，CBE3对照组和LCK-sgRNA12同义突变组的CD107a释放显著降低，而LCK-sgRNA16-T316I突变组的CD107a释放仍在较高水平，与对照组形成显著性差异。这一结果进一步论证了LCK-T316I突变能够抵抗达沙替尼对CAR-T细胞CAR信号活化的抑制作用。
实施例7：LCKT316I突变使抗CD19/BCMA双靶点UCAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转 运的抑制
在实施例5和实施例6中，发明人已经证明LCK-T316I突变使抗CD19-CAR-T细胞和抗BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制，为了加强这一结论，在本实施例中，发明人进一步验证了在CD19和BCMA双特异性CAR-T细胞中仍能观察到LCK-T316I抵抗达沙替尼对CD107a转运的抑制。
发明人对已制备的CD19/BCMA双靶点CAR-T进行电转编辑，分别电转CBE3蛋白、CBE3和LCK-sgRNA12的RNP复合物(18nt和21nt)以及CBE3和LCK-sgRNA16的RNP复合物(18nt和21nt)，实现三组不同的编辑处理。发明人对各组CAR-T细胞进行12个小时100nM达沙替尼的预处理，后续用不同的靶细胞和抗BCMA-CAR-T细胞共孵育，验证不同靶细胞对CAR信号的激活和CD107a的释放。这些靶细胞包括U266B1(BCMA阳性)、Raji(CD19阳性)、K562(阴性对照)、异体T细胞(阴性对照)以及空白的Buffer对照(阴性对照)。在检测前5小时，加入莫能霉素和CD107a抗体，5小时后进行CD8和CAR阳性的染色，用于检测CD8阳性CAR阳性细胞的CD107a的转运的富集。
结果如图17A所示，通过分析流式实验数据，从CD8和CAR双阳性细胞中分析CD107a的转运富集。没有被编辑的CD19/BCMA双特异CAR-T细胞在DMSO处理下能够有效被U266B1和Raji细胞激活，CD107a表达在74.5％和54.5％阳性，而无法被K562、宿主T以及Buffer激活(图17A，第一排)。在100nM达沙替尼处理下，未发生LCK-T316I编辑的CAR-T细胞(图17A，第二排到第五排)不能够被U266B1和Raij这两种阳性靶细胞激活而释放CD107a，只有发生了LCK-T316I突变的CAR-T细胞(图17A，第六和第七排)能够抵抗达沙替尼对CAR信号激活的抑制，而被U266B1和Raji激活释放CD107a，达到50％阳性以上的比例。图17B是对17A数据的柱状图展示。这些数据提示LCK-T316I突变能够使CD19/BCMA双特异的CAR-T细胞耐受达沙替尼对CD107a转运的抑制。
实施例8：LCKT316I突变使抗BCMA-CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR-T杀伤功能的抑制
前述实施例4证明LCK-T316I的突变能够使T细胞耐受达沙替尼对TCR活化的抑制，实施例5-7证明LCK-T316I突变能够使CAR-T细胞耐受达沙替尼对CAR活化的抑制和CD107a转运的抑制。为了进一步证明LCK-T316I突变能够使CAR-T细胞抵抗达沙替尼抑制CAR-T杀伤的功能，发明人在抗BCMACAR-T细胞上开展了如下实验。
发明人实验证明LCK-T316I突变后的抗BCMACAR-T对达沙替尼的CAR-T杀伤活性抑制功能产生了耐受。
发明人使用实施例6中的编辑的抗BCMACAR-T细胞进行实验，其中LCK-T316I突变效率在42％(图16A)。如图18A所示，发明人对各组CAR-T细胞进行12小时100nM达沙替尼预处理，后续和不同的荧光素酶阳性的靶细胞(luciferase+)以效靶比1：1共孵育24小时，每组进行两个重复。孵育结束后，通过检测荧光素酶的活性来评估CAR-T细胞对靶细胞的杀伤，luciferase数值越低，代表存活的靶细胞越少，CAR-T杀伤越强。
结果如图18B、18C所示，在DMSO对照组中，无论LCK-T316发生编辑与否，抗BCMACAR-T均能够造成RPMI-8226阳性靶细胞的luciferase值显著降低，而不会影响阴性靶细胞Nalm6的luciferase值，证明抗BCMA CAR-T细胞具有正常杀伤靶细胞的功能。在100nM达沙替尼处理下，阳性靶细胞RPMI-8226刺激后，CBE3蛋白对照组和LCK未编辑组中(CBE3+sg12)的luciferase值比DMSO组显著升高，证明在达沙替尼处理下，抗BCMA CAR-T的杀伤功能受到了显著抑制。而LCK-T316I突变的CAR-T细胞中(CBE+sg16)的luciferase值显著低于另外两组，证明LCK-T316I突变后的抗BCMA CAR-T对达沙替尼的CART杀伤活性抑制功能产生了耐受。
发明人重复实验证明LCK-T316I突变后的抗BCMA CAR-T对达沙替尼的CART杀伤活性抑制功能产生了耐受。
发明人对上述LCK编辑和不编辑的抗BCMA CAR-T细胞进行了重复杀伤实验验证。实验流程和此实施例中的图18A一致。对各组CAR-T细胞进行12小时100nM达沙替尼预处理，后续和不同的荧光素酶阳性的靶细胞以效靶比1：1共孵育24小时，每组进行两个重复。孵育结束后，通过检测荧光素酶的活性来评估CAR-T细胞对靶细胞的杀伤，荧光素酶数值越低，代表存活的靶细胞越少，CAR-T杀伤越强。
结果如图19A、19B所示，在DMSO对照组中，无论LCK-T316发生编辑与否，抗BCMACAR-T均能够造成RPMI-8226阳性靶细胞的luciferase值显著降低，而不会影响阴性靶细胞K562和Nalm6的luciferase值，证明抗BCMACAR-T细胞具有正常杀伤靶细胞的功能。在100nM达沙替尼处理下，阳性靶细胞RPMI-8226刺激后，CBE3蛋白对照组和LCK未编辑组中(CBE3+sg12)的luciferase值比DMSO组显著升高，证明在达沙替尼处理下，抗BCMA CAR-T的杀伤功能受到了显著抑制。而LCK-T316I突变的CAR-T细胞中(CBE+sg16)的luciferase值显著低于另外两组。此外，虽然阴性靶细胞K562在100nM达沙替尼处理下对LCK-T316I编辑的CAR-T细胞有部分激活，但阴性靶细胞Raji没有激活抗BCMA-CART细胞，是较好的阴性的对照。这些数据再次证明LCK-T316I突变后的抗BCMA CAR-T对达沙替尼的CART杀伤活性抑制功能产生了耐受。
实施例9：25nM浓度的达沙替尼在体外能有效抑制T细胞的活化
在上述实施例中发明人证明了100nM浓度下的达沙替尼能够有效抑制TCR和CAR信号的激活，即在此浓度下，正常T细胞和CAR-T细胞的激活被抑制。此时，LCK-T316I突变能够使得T细胞耐受达沙替尼对其激活的抑制，即发生了LCK-T316I突变的UCAR-T细胞能够在100nM浓度的达沙替尼环境中，保留了被靶细胞激活并杀伤靶细胞的能力。
基于此，本专利提出的实现通用CAR-T的策略是利用达沙替尼对患者进行预处理，抑制宿主T细胞的活化功能，后回输LCK-T316I突变的UCAR-T细胞。在这一情形下，宿主T细胞由于被达沙替尼抑制了TCR的活化，导致其无法清除UCAR-T细胞；同时UCAR-T由于携带LCK-T316I突变，能够抵抗达沙替尼对CAR信号活化的抑制，靶向恶性肿瘤细胞介导肿瘤的清除。
发明人在实施例3中已经证明，100nM达沙替尼已经足以抑制T细胞TCR信号的活化。为了进一步探索达沙替尼对T细胞活化抑制的浓度阈值进而指导临床用药，发明人进一步对达沙替尼更低的浓度进行探索。
发明人从人外周血中分离出CD3阳性的T细胞，分成十一份进行处理，每份1e5个细胞。其中1份不用达沙替尼处理，也不加入抗CD3/CD28 DynaBeads激活TCR，作为初始的对照组；另外10份细胞用不同浓度的达沙替尼预处理4小时，设置了从0nM到50nM区间内的十个浓度，随后加入抗CD3/CD28 DynaBeads激活TCR信号，激活过夜。第二天检测CD25、CD69和4-1BB活化信号的表达，已检测TCR信号激活的情况。每组实验均设置了两个重复。
如图20A所示，不用达沙替尼处理的T细胞被抗CD3/CD28磁珠激活后，有60.7％比例的CD25/CD69双阳性细胞呈活化状态(图20A第一排第二列)，证明抗CD3/CD28磁珠能够有效活化这批T细胞。在按梯度加入10-50nM浓度的达沙替尼处理下，抗CD3/CD28磁珠对TCR信号的激活逐渐减弱(图20A第一排第三列到第六列，第二排第一列到第五列)。从10nM到20nM达沙替尼处理区间，CD25和CD69双阳性细胞比例从60.7％逐渐降低到8.75％，呈现出明显的剂量依赖效应。而当达沙替尼浓度在25nM时，CD25和CD69双阳性细胞比例显著降低到1.06％，当浓度继续升高到50nM后，双阳性细胞比例基本都维持在1％以下。
同时，如图20B所示，以CD25和4-1BB作为活化的T细胞的指征，得到和图11A一致的结论。在按梯度加入10-50nM浓度的达沙替尼处理下，抗CD3/CD28磁珠对TCR信号的激活逐渐减弱(图20B第一排第三列到第六列，第二排第一列到第五列)。从10nM到20nM达沙替尼处理区间，CD25和4-1BB双阳性细胞比例从31.0％逐渐降低到2.09％，呈现出明显的剂量依赖效应。而当达沙替尼浓度在25nM时，CD25和CD69双阳性细胞比例显著降低到0.26％，当浓度继续升高到50nM后，双阳性细胞比例基本都维持在1％以下。
以上数据证明25nM浓度的达沙替尼在体外能够有效发挥对T细胞活化功能的抑制。基本可以指导在临床用药上需要达到抑制TCR信号活化的达沙替尼的最低体内浓度在25nM，推测体内达沙替尼浓度在25nM以上时，能够抑制宿主T细胞的激活。
实施例10：达沙替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应
在实施例9中，发明人证明25nM浓度的达沙替尼在体外能够有效发挥对T细胞活化功能的抑制，以此来指导体内用药浓度。根据已有的达沙替尼药动药代数据[12]，发明人发现相比于其他的酪氨酸激酶抑制剂而言，达沙替尼在体内的半衰期极短，3-4小时。同时针对不同进程的CML和ALL患者，达沙替尼的给药剂量是每天100mg或140mg，或者一天两次给药，剂量减半。因此，在体内达沙替尼的代谢较快，且极为可能存在给药间隔中几小时的时间其浓度低于25nM。为了充分考虑体内达沙替尼浓度波动的因素，发明人设计了体外达沙替尼动态浓度实验，检测动态浓度变化下其对T细胞活化功能的抑制是否仍然有效。
本实施例中使用了CD5和TRAC双敲除的CD5-UCAR-T细胞，同时通过CBE3+LCK-sgRNA16或CBE3+sgRNA12对其进行编辑，实现LCK-T316I突变和对照的UCAR-T细胞的制备。随后，分别用50nM或25nM浓度处理过夜。次日降低达沙替尼的浓度，如图21A，50nM预处理过夜后调整浓度分别到0、15、25、35和50nM。如图21B，25nM预处理过夜后调整浓度分别到0、10、15、20和25nM。同时用Jurkat细胞作为阳性靶细胞激活，按照效靶比1：1共孵育，同时加入CD107a和莫能霉素。共孵育4小时后，检测CD8和CAR双阳性细胞中的CD107a释放。
结果显示，发生LCK同义突变的sg12对照组CD5-UCART细胞在50nM达沙替尼预处理后降低浓度至0nM，其被Jurkat靶细胞激活4小时产生了12％阳性的CD107a释放(图21A第一排第一列)，当浓度降低到15、25、35、50nM后，均没有CD107a的释放(图21A第一排第二到第五列)，证明50nM预处理后改变达沙替尼浓度到15nM已足以在4小时内抑制UCAR-T细胞的活化。另外，发生了LCK-T316I突变的sg16编辑组CD5-UCART细胞在50nM达沙替尼预处理后降低浓度至0nM，其被Jurkat靶细胞激活4小时产生了16％阳性的CD107a释放(图21A第二排第一列)，当浓度降低到15、25、35、50nM后，仍有较高水平的CD107a的释放(图21A第二排第二到第五列)，证明LCK-T316I突变能够耐受达沙替尼对CAR信号的抑制。
与50nM达沙替尼预处理实验结果一致，发明人证明在25nM达沙替尼预处理后，调整其浓度到10nM已经足够抑制对照组CD5-UCAR-T细胞被靶细胞激活而释放CD107a(图21B第一排第一、二列)，而发生了LCK-T316I突变的sg16编辑组CD5-UCART细胞在降低达沙替尼浓度后，仍有较高水平的CD107a释放(图21B第二排第二到第五列)，再次证明LCK-T316I突变能够耐受达沙替尼对CAR信号的抑制。
上述实验证明达沙替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应。达沙替尼在体外动态浓度变化下，从50nM降低到15nM或从25nM降低到10nM均能够对T细胞活化功能产生抑制，同时LCK-T316I突变能够对这种抑制产生抵抗。
为了重复验证达沙替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应，发明人对上述实验进行了重复。对CD5-CAR-T细胞用50nM或25nM达沙替尼预处理过夜，次日将药物浓度调整降低，并与阳性或阴性靶细胞共孵育，同时加入莫能霉素阻断剂和CD107a抗体，共孵育4小时后，检测CD8/CAR双阳性细胞的CD107a释放。
如图22A所示，CD5-CART细胞在无达沙替尼环境下被Jurkat激活有23.6％的CD107a阳性的细胞(图22A第一排第一列)，在50nM达沙替尼预处理后降低浓度至0nM，其被Jurkat靶细胞激活4小时产生了12.1％阳性的CD107a释放(图22A第一排第二列)，当浓度降低到10、20、30、40和50nM后，均没有显著的CD107a的释放(图13A第一排第三到第七列)，证明50nM预处理后改变达沙替尼浓度到10nM-20nM已足以在4小时内抑制CAR-T细胞的活化。同时，CD5敲除的CCRF细胞作为阴性靶细胞和Buffer阴性对照组均无法有效激活CD5-CAR-T细胞释放CD107a(图22A，第二排和第三排)。
如图22B所示，与50nM达沙替尼预处理实验结果一致，发明人证明25nM达沙替尼预处理后，调整其浓度到10nM已经足够抑制CD5-CAR-T细胞被阳性Jurkat靶细胞激活而释放CD107a(图22B第一排第三列)。
总结上述两个实验，基本证明达沙替尼对T细胞活化功能的抑制存在延续效应。达沙替尼在体外动态浓度变化下，从50nM降低到10-15nM或从25nM降低到10nM均能够对T细胞活化功能产生抑制，同时LCK-T316I突变能够对这种抑制产生抵抗。
这里使用的抗CD5-CAR分子的序列和后续实施例中使用的序列均是一样的，是一个单域抗体序列相关的CAR分子，具体序列见SEQ ID NOs：57-76。这一CAR的整体结构是一个二代CAR分子，由抗CD5的两个单域重链(SEQ ID NOs：57-60)，加一段连接区域(SEQ IDNOs：61-62)，加CD8a区域(SEQ ID NOs：63-64)，加CD28胞内结构域(SEQ ID NOs：65-66)，加CD3z胞内信号结构域(SEQ ID NOs：67-68)，加T2A序列(SEQ ID NOs：69-70)，加CSF2RA信号(SEQ ID NOs：71-72)，加tEGFR信号(SEQ ID NOs：73-74)组成。最终的抗CD19-CD28z-CAR信号的总序列见SEQ ID NOs：75-76。
实施例11：验证达沙替尼能够有效抑制NK细胞的激活
达沙替尼除了对T细胞和CAR-T细胞的激活有抑制功能外，也能够抑制人原代NK细胞的脱颗粒和细胞因子释放[5]。而被有功能的宿主T和NK细胞清除正是UCAR-T在宿主体内难以扩增的主要原因，因此在该发明中，达沙替尼在UCAR-T治疗中的处理，不仅能够通过抑制宿主T细胞的激活，也能够通过抑制宿主NK细胞的活化，增强UCAR-T细胞在宿主中的存续。
发明人首先验证了达沙替尼能够有效抑制NK细胞的活化。
发明人使用美天旎人NK分选磁珠从人外周血中分离NK细胞，并用达科为NK培养基对其于体外进行培养扩增，第八天能够获得95％以上的CD56表达阳性的NK细胞群体。取出这部分NK细胞，分别用0nM、100nM和200nM的达沙替尼处理24小时，随后分成两组，其中一组不做任何激活，另一组用MHC-I类分子缺陷的K562细胞刺激5小时，随后共同检测NK细胞的CD107a释放。
如图23所示，未激活组的NK细胞，不用达沙替尼处理时，CD107a的转运在11.4％(第一排第三列)，当用达沙替尼处理后，基底CD107a转运量降低到2％的基线(第一排第一、二列)。当加入K562靶细胞激活NK细胞后，未处理组的CD107a转运被激活到64.5％(第二排第三列)，而达沙替尼处理组的CD107a转运量降低到2％的基线(第二排第一、二列)，提示100nM达沙替尼已足够抑制NK细胞的CD107a转运，抑制NK细胞激活。
实施例12：30nM浓度的达沙替尼在体外能有效抑制NK细胞的活化
在上述实施例中发明人证明了100nM浓度下的达沙替尼能够有效抑制NK细胞的活化。为了进一步探索达沙替尼对NK细胞活化抑制的浓度阈值进而指导临床用药，发明人进一步对达沙替尼更低的浓度进行探索。
发明人从人PBMC中分离出NK细胞，再用NK培养基培养分化获得纯度高于95％的CD56阳性的NK细胞。分别用0-50nM范围内的七个浓度进行了达沙替尼对NK激活阈值的探索，分别是0、10、20、25、30、40和50nM，处理过夜。次日用NK培养基重悬，并加入K562激活，以淋巴细胞激活剂作为激活的阳性对照，也保留一部分不被K562激活的NK细胞，各组设置两个重复。在激活的同时加入CD107a抗体和莫能霉素，共孵育6小时后，流式检测CD56阳性的NK细胞的CD107a释放。
如图24A所示，在不加达沙替尼处理下，加入淋巴细胞激活剂的NK细胞其CD107a转运量在80％以上(图24A上排第一列)，K562对NK细胞的激活也达到76％以上(图24上排第三列)。随着达沙替尼浓度的升高，NK细胞受到K562激活而表达CD107a的比例逐渐降低。当达沙替尼浓度到达30nM时，K562基本无法激活NK细胞促使其释放CD107a(图24A下排第二列)，证明30nM浓度的达沙替尼在体外能够有效发挥对NK细胞活化功能的抑制。如图24B，发明人对上述实验数据进行柱状图的显著性分析，基本确定相比于更低的达沙替尼浓度，30nM的浓度能够显著抑制NK细胞的活化。
以上数据基本可以指导在临床用药上需要达到抑制NK细胞的达沙替尼的最低体内浓度(30nM)，推测体内达沙替尼浓度在30nM以上时，能够抑制宿主NK细胞的激活。
实施例13：体外达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应
在实施例12中，发明人证明30nM浓度的达沙替尼在体外能够有效发挥对NK细胞活化功能的抑制，以此来指导体内用药浓度。在实施例10中已提到，相比于其他的酪氨酸激酶抑制剂而言，达沙替尼在体内的半衰期极短，其在体内的代谢较快，且极为可能存在给药间隔中几小时的时间其浓度低于30nM[12]。为了充分考虑体内达沙替尼浓度波动的因素，发明人设计了体外达沙替尼动态浓度实验，检测动态浓度变化下其对NK细胞活化功能的抑制是否仍然有效。
发明人从人PBMC中分离出NK细胞，再用NK培养基培养分化获得纯度高于95％的CD56阳性的NK细胞。分别做三种预处理(1)不加达沙替尼预处理；(2)加25nM达沙替尼预处理；(3)加50nM达沙替尼预处理，培养过夜。次日降低达沙替尼的浓度，分别调整浓度分别到0、7.5、12.5、17.5和25nM。同时用K562细胞作为阳性靶细胞激活NK细胞，按照效靶比1：1共孵育，同时加入CD107a和莫能霉素。每组设置两个重复。共孵育5小时后，检测CD56阳性的NK细胞中的CD107a释放。
如图25A所示，三种不同浓度的达沙替尼预处理后，再降低浓度到0nM时，NK细胞能够显著被K562激活，CD107a的释放均在58％以上(图25第二列)。当降低浓度到7.5nM时，25nM和50nM达沙替尼预处理组的NK细胞基本无法被K562激活，CD107a的释放均低于1％(图25第四列)。当次日改变浓度到12.5、17.5和25nM时，25nM和50nM达沙替尼预处理组的NK细胞更加无法被K562激活，CD107a的释放均低于1％(图25第六、八和十列)。
如图25B，发明人对上述实验数据进行柱状图的显著性分析，进一步阐明NK细胞在25nM或50nM达沙替尼预处理后降低浓度至7.5nM继续处理4小时，无法有效被K562细胞活化，而没有预处理的细胞直接用7.5nM达沙替尼处理4小时，仍有4.4％左右的细胞被活化，两者存在显著性差异。因此，上述实验证明达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。达沙替尼在体外动态浓度变化下，从25nM或50nM预处理后降低到7.5nM已基本抑制NK细胞的活化。
上述实验证明达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。达沙替尼在体外动态浓度变化下，从25nM或50nM预处理后降低到7.5nM已能够对NK细胞活化功能产生抑制。
为了重复验证达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应，发明人对上述实验进行了重复。对NK细胞用50nM、25nM以及10nM达沙替尼预处理过夜，次日将药物浓度调整降低，并与阳性K562或阴性Buffer共孵育，同时加入莫能霉素阻断剂和CD107a抗体，共孵育4小时后，检测CD56阳性的NK细胞的CD107a释放。
如图26A所示，NK细胞在无达沙替尼环境下被K562激活有61.5％的CD107a阳性的细胞(图26A第一排第一列)，在50nM达沙替尼预处理后降低浓度至0nM，其被K562靶细胞激活4小时产生了39.7％阳性的CD107a释放(图26A第一排第二列)，当浓度降低到10、20、30、40和50nM后，均没有显著的CD107a的释放(图26A第一排第三到第七列)，证明50nM预处理后改变达沙替尼浓度到10nM已足以在4小时内抑制NK细胞的激活。同时，Buffer阴性对照组无法有效激活NK细胞释放CD107a(图17A第二排)。
如图26B所示，与50nM达沙替尼预处理实验结果一致，发明人证明10nM和25nM达沙替尼预处理后，调整其浓度到10nM也已经足够抑制NK细胞被阳性K562靶细胞激活而释放CD107a(图26B第一排第三、五列)。此次实验中10nM基本完全抑制NK的活化。
总结上述两个实验，基本证明达沙替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。达沙替尼在体外动态浓度变化下，从50nM降低到10nM或从25nM降低到10nM均能够对NK细胞活化功能产生抑制。
实施例14：LCKT316I突变和达沙替尼联用策略使CD5-UCART在5比1的效靶比的体外 混合淋巴细胞反应中具扩增和存续优势
利用已制备出的足够数量的CD5-UCART和BCMA-UCART进行体外混合淋巴细胞反应，以此模拟体内LCK-T316I-UCART(后简称Km-UCART)与达沙替尼联用是否能够在宿主T环境下获得生存空间甚至增殖优势。
本发明涉及敲除TRAC基因来制备通用型CAR-T细胞。鉴于CD5抗原表达在慢性B淋巴细胞白血病细胞上，以下实施方案中所涉及的通用型CAR-T细胞靶向CD5。但已知所有外周血T细胞及极小部分B细胞上亦会表达CD5，靶向CD5的UCART细胞将会对自体或异体T细胞进行识别杀伤。因此本发明利用基因编辑技术将CD5基因与TRAC基因同时在T细胞中敲除以制备CD5-UCART细胞。
以较小数量从健康供体制备得到了CD5-UCART细胞，在此批制得的细胞样品中，发明人通过流式细胞术手段测得TRAC基因的敲除效率>90％；CD5基因的敲除效率>99％；通过检测EGFR转导标记测得表达CAR的T细胞约为35％。发明人对以上构建成功的可用于体外测试的CD5-UCART细胞进行进一步的基因编辑，此次基因编辑使用CBE3碱基编辑器旨在造成CD5-UCART细胞上LCK位点的T316I突变：CBE3组为CD5-UCAT细胞对照组；sg12组为针对LCK发生同义突变的CD5-UCAT细胞对照组；sg16组(Km组)为发生了LCK-T316I编辑的CD5-UCAT细胞实验组。
本发明意图对UCART细胞进行LCK-T316I以构建出耐受达沙替尼抑制作用的UCART，那么在达沙替尼存在的宿主T细胞环境中，宿主T细胞因未接受过耐受达沙替尼抑制作用的基因工程改造而杀伤功能被(几乎)完全抑制，此时本发明中的UCART便能从原本由宿主T细胞介导的免疫排斥反应中获得解脱而保持正常的增殖速率。
发明人使用混合淋巴细胞反应(MLR)模型来评估Km-CD5-UCART细胞在抵抗体外T细胞介导的免疫排斥反应的能力及清除同种异体T细胞(因未有经过内源CD5基因的敲除，宿主T细胞亦是CD5-UCART细胞的靶细胞)的能力。
所述方法包括以下步骤：
(1)CD3+T细胞的分选和激活；
(2)CRISPR-Cas9与sgRNA介导的TRAC、CD5基因敲除；
(3)慢病毒感染TRAC/CD5敲除的T细胞；
(4)TRAC、CD5基因敲除效率检测：结果如图27A所示，TRAC基因的敲除效率>90％，CD5基因的敲除效率>99％；
(5)CAR阳性率检测：T细胞感染慢病毒后5天，以流式细胞术检测CAR阳性率，结果如图27B所示，用两种不同的标志物测得表达CAR的T细胞的比例约为35％～40％。届时，发明人认为已获得了可用于体外测试的CD5-UCART细胞；
(6)CBE3与sgRNA介导的LCK基因的T316I编辑(Km)；
(7)CD5-UCART细胞发生Km编辑的效率检测：结果如图27C所示，CBE3组与sg12组均未发生Km编辑；sg16(Km)组CD5-UCART细胞中T316I的突变效率为79％，即理论上有79％的CD5-UCART细胞能够对达沙替尼的抑制作用产生耐受；
(8)体外实验中模拟宿主T细胞的获得：发明人为了测试Km-CD5-UCART在异体T细胞环境下的功能，另需获得与制备Km-CD5-UCART所涉及的供体的HLA-ABC蛋白相异的供体来源的T细胞作为异体宿主T细胞。此次新鲜分选出的异体宿主T细胞未以抗-CD3/-CD28抗体磁珠激活，并以100nM达沙替尼预处理，即在测定开始前将达沙替尼加入T细胞完全培养基中。如此处理旨在模拟对患者使用Km-UCART作为治疗药物前需对患者施以达沙替尼药物预处理以抑制宿主T细胞介导的效应功能；
(9)利用混合淋巴细胞反应检验Km-CD5-UCART细胞在宿主T细胞环境中的存活情况：此次混合淋巴细胞反应旨在检验Km-CD5-UCART细胞在抵抗体外T细胞介导的免疫排斥反应的能力及清除同种异体T细胞的能力，因而发明人将Km-CD5-UCART视作理论上的效应细胞，异体的宿主T细胞作为靶细胞。
此次混合淋巴细胞反应中的效应细胞分为3组：(1)CBE3组为CD5-UCAT细胞对照组；(2)sg12组为针对LCK发生同义突变的CD5-UCAT细胞对照组；(3)sg16组(Km组)为发生了LCKT316I编辑的CD5-UCAT细胞实验组。此次混合淋巴细胞反应中的靶细胞仅使用同一供体来源的同种异体T细胞。在MLR测定开始前将达沙替尼加入T细胞完全培养基中，即对模拟宿主T细胞(靶细胞)与CD5-UCART细胞(效应细胞)分别进行达沙替尼预处理12小时。
本实施例以1：5效靶比开展，此处需要说明的是发明人以表达CAR分子的CD5-UCART(此实施例中CAR阳性率为35％)细胞的绝对数量比上模拟宿主T细胞的绝对数量定义效靶比。将3组效应细胞依8.09×104、5.20×104、1.26×104个细胞数分别各铺两孔于平底96孔板中(100μl体积)，靶细胞分别铺1.42×105、9.10×104、2.20×104个细胞数(100μL体积)与效应细胞混合，每孔总体积200uL，均以T细胞完全培养基培养。现有3组效应细胞与靶细胞的混合孔各两孔，其中一孔做实验孔添加100nM达沙替尼，另一孔为对照孔添加相同体积的DMSO(因此实施例中达沙替尼药物溶剂为DMSO)。将孔板置于37℃培养箱培养。
此次测试，发明人预测sg16组效应细胞在达沙替尼处理组可展现出优于其他组的生长优势。因而发明人需要在混合淋巴细胞反应过程中收集以下数据：不同时间点的细胞计数；不同时间点的效应细胞与靶细胞的比例与绝对数量；效应细胞的CAR阳性率。
为了获得上述数据，发明人分别于共培养的第2天，第10天(铺板当天定为第0天)从每孔中取部分细胞进行细胞计数，所取出的细胞需确定其所占当前每孔总细胞的比例，通过此比例与取出细胞的计数结果计算出当前每孔的细胞绝对数量。取出的细胞还需用于流式细胞分析以确定效应细胞、靶细胞的比例及效应细胞的CAR阳性率。
发明人将每一时间点的细胞计数结果与流式细胞分析结果综合起来计算出所关注的指标，图28A展示了UCAR-T在MLR总体系中的百分比关系。MLR反应中，DMSO组的UCART细胞均能够对宿主T细胞产生杀伤，在测试的第10天，宿主T细胞均降低到5％以下；100nM达沙替尼处理下，对照组的UCAR-T对宿主T细胞的杀伤均受到抑制，宿主T增殖明显，只有Km编辑后的UCAR-T能够抵抗达沙替尼的抑制，回复到正常情况下的UCAR-T杀伤功能。
对于宿主-T在总体系中的变化情况，如图28B所示，DMSO组的UCAR-T均能够对宿主T细胞产生杀伤，D10的宿主T细胞均降低到5％以下；100nM达沙替尼处理下，对照组的UCAR-T对宿主T细胞的杀伤均受到抑制，宿主T细胞增殖明显，只有Km编辑后的UCAR-T能够抵抗达沙替尼的抑制，回复到正常情况下的UCAR-T杀伤功能。
同时，如图28C所示，各组的CAR阳性率均随着MLR天数的增多，逐渐上升到70％，但并未呈现出组间差异，此次测试中，发明人认为的功能组分，即CAR阳性细胞并未因Km编辑与达沙替尼联用而获得较对照组更快的富集。在此测试中，实时效靶比有利于反映体系中的效应组分与模拟宿主T细胞之间的动态关系，如图28D所示，达沙替尼处理下的Km-CD5-UCART组呈现出效靶比的持续升高，反之其他对照组并无此现象。因此，发明人证实，达沙替尼能够抑制CD5-UCART对宿主T细胞的清除，而KT316I突变能够有效回复UCAR-T的功能。
实施例15：LCKT316I突变和达沙替尼联用策略使CD5-UCART在50～100比1的效靶比 体外混合淋巴细胞反应中具扩增和存续优势
此实施例为对实施例14的补充与优化，在更极端的异体T数量下，旨在通过混合淋巴细胞反应(MLR)模型来评估Km-CD5-UCART细胞在抵抗体外T细胞介导的免疫排斥反应的能力及清除同种异体T细胞的能力。
所述方法包括以下步骤：
(1)CD3+T细胞的分选；
(2)对未经激活的T细胞进行TRAC、CD5基因敲除，LCK基因的T316I编辑(Km)；
(3)电穿孔后激活T细胞；
(4)慢病毒感染T细胞；
(5)TRAC，CD5基因敲除效率，结果如图29A所示，TRAC基因的敲除效率>95％，CD5基因的敲除效率>99.5％。
(6)CAR阳性率检测，结果如图29B所示，约为30％；
(7)Km编辑效率检测，结果如图29C所示，Ctrl组未发生Km编辑；Km组CD5-UCART细胞中T316I的突变效率为45％。届时，发明人认为已获得了可用于体外测试的Km-CD5-UCART细胞；
(8)体外实验中模拟宿主T细胞的获得：发明人为了测试Km-CD5-UCART在宿主T细胞环境下的功能，另需获得与制备Km-CD5-UCART所涉及的供体的HLA-ABC蛋白相异的供体来源的T细胞作为宿主T细胞。此批T细胞的获得参见本实施例中的步骤(1)，其细胞纯度亦经过流式细胞术的检验。此次新鲜分选出的宿主T细胞未以抗-CD3/-CD28抗体磁珠激活，并以100nM达沙替尼预处理，即在测定开始前将达沙替尼加入T细胞完全培养基中。如此处理旨在模拟对患者使用Km-UCART作为治疗药物前需对患者施以达沙替尼药物预处理以抑制宿主T细胞介导的效应功能。
(9)利用混合淋巴细胞反应检验Km-CD5-UCART细胞在宿主T细胞环境中的存活情况：此次混合淋巴细胞反应旨在检验Km-CD5-UCART细胞在抵抗体外T细胞介导的免疫排斥反应的能力及清除同种宿主T细胞的能力，因而发明人将Km-CD5-UCART视作理论上的效应细胞，宿主的宿主T细胞作为靶细胞。
此次混合淋巴细胞反应中的效应细胞分为2组：(1)Ctrl组为针对LCK发生同义突变的CD5-UCAT细胞对照组；(2)Km组为发生了LCKT316I编辑的CD5-UCAT细胞实验组。此次混合淋巴细胞反应中的靶细胞仅使用同一供体来源的同种宿主T细胞。在MLR测定开始前将达沙替尼加入T细胞完全培养基中，即对模拟宿主T细胞(靶细胞)与CD5-UCART细胞(效应细胞)分别进行达沙替尼预处理24小时。
本实施例计划以1：50～100效靶比开展。将2组效应细胞以2.5×105个细胞数分别各铺6孔于平底96孔板中(250μl体积)，靶细胞分别铺1.5×106个细胞数(250μl体积)与效应细胞混合，每孔总体积500ul，均以T细胞完全培养基培养。现有2组效应细胞与靶细胞的混合孔各6孔，分别给予3种处理，每种处理设置2个技术重复：处理一为DMSO，处理二为25nM达沙替尼，处理三为50nM达沙替尼。将孔板置于37℃培养箱培养。每隔两天补充培养体系中的达沙替尼与DMSO。
此次测试，发明人预测Km组效应细胞在达沙替尼处理组可展现出优于其他组的生长优势，且基于上述实施例中已经得到的数据，发明人推测予以50nM达沙替尼处理的Km组较25nM达沙替尼处理的Km组的效应细胞更具生长优势，即Km-CD5-UCART在达沙替尼处理下所获得的生长优势存在对达沙替尼的剂量依赖效应。为了验证以上假设，发明人需要在混合淋巴细胞反应过程中收集以下数据：不同时间点的细胞计数；不同时间点的效应细胞与靶细胞的比例与绝对数量；效应细胞的CAR阳性率。
为了获得上述数据，发明人分别于共培养的第2、5、8、11、13日(铺板当天定为第0天)从每孔中取部分细胞进行细胞计数，所取出的细胞需确定其所占当前每孔总细胞的比例，通过此比例与取出细胞的计数结果计算出当前每孔的细胞绝对数量。取出的细胞还需用于流式细胞分析以确定效应细胞、靶细胞的比例及效应细胞的CAR阳性率。
此次混合淋巴细胞反应中发明人将每一时间点的细胞计数结果与流式细胞分析结果综合起来计算出所关注的指标。第0天的实际铺板细胞数在铺板后通过细胞计数与流式细胞分析获得，而不以实验设计时欲加细胞量为准。因为加样产生的误差会导致实际铺板量与计划接种的细胞量不一致，其次因为设置了技术重复，对实际接种量进行计数使得结果更易于进行生物学统计分析。测试时效应细胞实际CAR阳性率约为10％，细胞计数结果与流式细胞分析结果综合得到的实际效靶比为1:50～1:100。本次测试结束后，据每一时间点所得到的各项指标，发明人分别对效应细胞的数量动态变化(图30A)，靶细胞的数量动态变化(图30C)以及效应细胞中的CAR阳性率(图30E)进行了详尽地统计学分析。
如图30A数据显示，DMSO处理下，Ctrl-CD5-UCART和Km-CD5-UCART均不能在宿主T细胞的环境中有效扩增，提示宿主T细胞被UCART细胞激活并执行其杀伤效应，使得UCART细胞逐渐被清除。25nM达沙替尼处理下，对照组Ctrl-CD5-UCART增殖受到抑制，而Km-CD5-UCART能够有效扩增，提示宿主T细胞的功能被达沙替尼抑制，且因Km-CD5-UCART耐受达沙替尼的抑制，能够获得正常的增殖并能有效地杀伤宿主T细胞。50nM达沙替尼处理下得到与25nM处理组一致的趋势，截至测试的第11天，到相较于25nM处理，50nM达沙替尼处理下的Km-CD5-UCART获得更明显的持续增殖优势，提示50nM对宿主T细胞的激活抑制更有效，从而更显著降低了Km-CD5-UCART在宿主T细胞环境下的生存压力。
另从效应细胞所占总细胞的比例分析，见图30B，达沙替尼处理下的Km-CD5-UCART培养体系中的占比均随着时间显著升高，而其他组均与之相反，提示Km-CD5-UCART能够耐受达沙替尼对其的激活抑制，在高倍数宿主T细胞环境中仍有效扩增，且50nM达沙替尼处理下组较25nM达沙替尼处理下，Km-CD5-UCART的增殖优势更具持续性。这些数据验证了发明人的假设，即Km-CD5-UCART在达沙替尼处理下所获得的生长优势存在对达沙替尼的剂量依赖效应。
对于宿主T细胞的动态变化，如图30C所示，各组宿主T细胞数量均呈现出动态变化，未显示出不同的组间变化规律。然而从宿主T细胞的占比上分析(图30D)不难发现，截至测试的第11天，达沙替尼处理下Km-CD5-UCART组的宿主T细胞比例持续降低，对照组的宿主T细胞比例却长期保持稳态。发明人分析，由于宿主T细胞未接受过耐受达沙替尼抑制作用的基因工程改造而杀伤功能被(几乎)完全抑制，且Km-CD5-UCART因耐受达沙替尼的抑制作用而成为培养体系中的主要功能组分，可对宿主T细胞进行持续的清除，导致其所占比例不断降低。此结果从另一角度验证了发明人的假设，即Km-CD5-UCART与达沙替尼联用可帮助UCART细胞克服宿主T细胞介导的免疫清除，从而为UCART行使肿瘤杀伤功能提供先决条件。
图30E揭示了UCART细胞中CAR阳性的细胞绝对数量在达沙替尼处理的Km-CD5-UCART组中持续升高，而其在Ctrl-CD5-UCART和DMSO处理组中走势一致且持续走低。提示达沙替尼处理下的Km-CD5-UCART组中主要的功能性群体为CAR阳性细胞，Km编辑与达沙替尼联用用使得CAR阳性细胞获得生存优势且产生富集。CAR阳性率只有在达沙替尼处理组的Km-CD5-UCART中才显著升高，在Ctrl-CD5-UCART和DMSO处理组中，均未出现明显的CAR阳性比例升高。测试的第八天始，所有组CAR阳性细胞比例均开始下降，提示CART细胞的功能耗竭。
发明人认为在此测试中，实时效靶比有利于反映体系中的效应组分与模拟宿主T细胞之间的动态关系，如图30F所示，达沙替尼处理下的Km-CD5-UCART组呈现出效靶比的持续升高，反之其他对照组并无此现象。提示高倍数的异体T细胞环境下(即便以1:50～1:100效靶比起始)，Km-CD5-UCART细胞仍能在与达沙替尼联用之下不断降低其效靶比。此数据的获得令发明人对Km-UCART在体内的有效存续与增殖抱有极大信心。
此外，发明人通过进一步分析D11天混合淋巴反应中各组细胞的基因组序列，对整个反应中D11剩余细胞的LCK-T316区域进行扩增，通过Sanger测序分析留存的细胞的LCK-T316I突变富集水平。结果如图31A所示，无论达沙替尼药物处理与否，未经LCK-T316I编辑的CD5-UCART细胞在MLR反应的D11天仍不会出现任何T316I突变的富集(图31A蓝上六排)。而发生了LCK-T316I突变的CD5-UCART细胞，当MLR反应用DMSO处理时，不会有T316I突变的富集；而当用25nM达沙替尼处理时，T316I发生了23％以上的突变；当浓度进一步升高到50nM时，突变富集的比例上升至43％以上(图31A下六排)，统计数据如图31B所示。这些数据证明，达沙替尼能够抑制异体T(宿主T)细胞的激活，同时Km编辑的UCAR-T细胞耐受达沙替尼的抑制作用。
综上，发明人证实，为了使得UCART免于遭受宿主T细胞介导的免疫排斥反应，对其进行Km编辑后与达沙替尼联合作用的方案是切实可行的。
实施例16：200nM浓度的帕纳替尼(PN)在体外能有效抑制T细胞的活化
前文的实施例基本阐明了该发明的策略和原理，主要有两个核心发明：(1)药物特殊处理：发明人通过将酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼引入通用CAR-T的预处理，达沙替尼抑制宿主T和NK细胞的活化，使得通用CAR-T能够在宿主细胞环境中存续；(2)LCK-T316I突变引入：发明人通过单碱基编辑技术A3A-CBE3系统在通用CAR-T细胞上引入LCK-T316I(Km)突变，使得其耐受达沙替尼对CAR信号转导的抑制。最终，Km编辑的UCAR-T在达沙替尼处理的情形下，能够正常被激活而靶向杀伤肿瘤细胞，也避免了宿主T和NK细胞对其的清除。
该发明中采用的络氨酸激酶抑制剂(TKI)不只有达沙替尼。发明人发现，帕纳替尼也够作为该发明中实现通用CAR-T策略的特殊处理药物。
在帕纳替尼的研究中，发明人首先利用美天旎CD3阳性磁珠分选试剂盒从供者PBMC中获得CD3阳性T细胞，通过流式细胞仪对分选获得的CD3阳性细胞的纯度和效率进行鉴定。然后将分选获得的CD3阳性T细胞分为三组，分别为电转CBE3蛋白的对照组(CBE3)，电转CBE3蛋白和sgRNA12复合物的同义突变对照组(Sg12)以及电转CBE3和sgRNA16复合物的LCK-T316I突变组(Sg16-Km)。发明人利用Lonza电转仪对LCK基因进行单碱基编辑，编辑效率如图32A所示，Sg16-Km组的LCK-T316I突变效率在30％，而另外两组对照细胞不携带此突变(图32A)。
实验流程如图32B所示，发明人将三组编辑后的细胞均分为6小组培养在平底96孔板中，每小组含两个技术重复，每孔含有0.15x 106细胞。对每组编辑后的细胞首先用帕纳替尼预处理2个小时，每组对应的PN的浓度分别为0、10nM、50nM、100nM和200nM(图32B)。两小时后，取适量的抗CD3/CD38 DynaBeads激活各组细胞，同时保留一组0nM帕纳替尼处理下不加磁珠激活的空白对照。后继续培养18个小时。用APC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子4-1BB，用PE标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子CD25，用FITC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子CD69。
流式分析结果显示(图32C,D)，100nM及以下浓度的帕纳替尼处理，不足以抑制正常对照组的T细胞的TCR信号活化，4-1BB和CD69仍有诱导表达，表明100nM及以下浓度的帕纳替尼无法抑制T细胞活化。然而，在200nM帕纳替尼处理下，CBE3和Sg12对照组分别有1.00％和1.85％的细胞表达CD25和4-1BB双阳性分子，而Km组有24.1％的双阳性细胞(图32C)；同时，CBE3和Sg12对照组分别有5.59％和5.31％的细胞表达CD25和CD69双阳性分子，而Km组有17.7％的双阳性细胞(图32D)。综合以上，发明人证实了帕纳替尼对T细胞活化抑制的功能。同时，发明人证明了Km编辑后的T细胞(携带LCK-T316I突变)可以耐受200nM的帕纳替尼对T细胞活化的抑制。因此，通过选择合适浓度(>200nM)的帕纳替尼进行预处理，可以实现对正常TCR信号激活的抑制(抑制宿主T细胞功能)，同时LCK-T316I突变的UCAR-T细胞能够耐受该浓度下帕纳替尼对其激活的抑制。
为了进一步确定帕纳替尼在体外发挥抑制T细胞活化功能、且T316I突变耐受的浓度范围，发明人测试了在更高浓度的帕纳替尼处理下T细胞活化的抑制情况。
发明人使用上述实验中的两组T细胞(CBE3对照组和Km编辑组)进行研究。实验流程和上述实验基本一致(图32B)。将两组编辑后的细胞均分为7小组培养在平底96孔板中，每小组含两个技术重复，每孔含有0.15x 106细胞。对每组编辑后的细胞首先用帕纳替尼预处理2个小时，每组对应的PN的浓度分别为0、10nM、50nM、200nM、500nM和1000nM(图33A，B)。两小时后，取适量的抗CD3/CD38 DynaBeads激活各组细胞，同时保留一组0nM帕纳替尼处理下不加磁珠激活的空白对照。后继续培养18个小时。用APC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子4-1BB，用PE标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子CD25，用FITC标记的鼠源IgG单克隆抗体检测活化的T细胞表面标记分子CD69。
流式分析结果显示(图33A，B)，50nM及以下浓度的帕纳替尼处理，不足以抑制正常对照组的T细胞的TCR信号活化，4-1BB和CD69仍有诱导表达，表明50nM及以下浓度的帕纳替尼无法抑制T细胞活化。然而，和上述实验一致，在200nM帕纳替尼处理下，CBE3对照组几乎没有细胞呈CD25/4-1BB双阳性，而Km组仍有19.71％的细胞表达CD25和4-1BB分子(图33A，第五列)；同时，CBE3对照组几乎没有细胞呈CD25/CD69双阳性，而Km组仍有23.9％的细胞表达CD25和CD69分子(图33B，第五列)，完全得到了和上一个实验一致的结果。
此外，在500nM帕纳替尼处理下，CBE3对照组的T细胞活化完全被抑制，Km编辑组也只有2.42％的CD25和4-1BB双阳性细胞以及6.75％的CD25和CD69双阳性细胞(图33A，B第六列)。提示LCK-T316I突变的T细胞在500nM帕纳替尼处理下，被激活的能力显著减弱，证明Km编辑无法有效耐受500nM帕纳替尼对TCR信号的抑制。在1000nM帕纳替尼处理下，CBE3对照组和Km编辑组的T细胞的活化均完全被抑制(图33A，B第七列)，且细胞数量明显减少，提示1000nM帕纳替尼对T细胞存活有较大影响，且LCK-T316I突变无法有效耐受1000nM帕纳替尼对TCR信号的抑制。
综合以上，发明人认为200nM帕纳替尼已经可以有效抑制T细胞的活化。对LCK-T316I突变的T细胞而言，该突变能够耐受200nM浓度下的帕纳替尼对T细胞活化的抑制，但当帕纳替尼浓度升高到500nM时，这种耐受能力显著降低。500nM的帕纳替尼能够阻断Km编辑的T细胞的TCR信号激活。因此，帕纳替尼能够作为本发明中的通用CAR-T策略的预处理方案，200nM浓度的帕纳替尼功能和达沙替尼一致，抑制宿主T对UCAR-T的杀伤，同时保证LCK-T316I-UCAR-T细胞仍有正常的功能，能够被激活并介导靶向肿瘤细胞的杀伤。当帕纳替尼浓度升高到500nM时，可以作为分子开关，抑制LCK-T316I-UCAR-T细胞的激活。
实施例17：200nM浓度的帕纳替尼在体外能有效抑制NK细胞的活化
在上述实施例中发明人证明了200nM浓度下的帕纳替尼能够有效抑制T细胞的活化。为了进一步探索帕纳替尼对NK细胞活化抑制以及浓度阈值，以确定帕纳替尼对T细胞和NK细胞的激活均有有效抑制以及浓度阈值。
发明人使用了人PBMC中CD3阴性的细胞，包含了5％以上的CD56阳性的NK细胞。发明人分别用0、50nM、200nM和500nM四个浓度的帕纳替尼处理，研究不同浓度对NK激活的影响。流程如下：不同浓度的帕纳替尼预处理处理过夜。次日用NK培养基重悬，并加入K562激活，以淋巴细胞激活剂作为激活的阳性对照，也保留一部分不被K562激活的NK细胞，各组设置两个重复。在激活的同时加入CD107a抗体和莫能霉素，共孵育6小时后，流式检测CD56阳性的NK细胞的CD107a释放。
如图34A所示，在不加帕纳替尼处理下，加入淋巴细胞激活剂的NK细胞其CD107a转运量在96％以上(图34A上排第二列)，K562对NK细胞的激活也达到77％以上(图34上排第三列)。随着帕纳替尼浓度的升高，NK细胞受到K562激活而表达CD107a的比例逐渐降低。当帕纳替尼浓度到达200nM时，K562基本无法激活NK细胞促使其释放CD107a(图34A下排第二列)，证明200nM浓度的帕纳替尼在体外能够有效发挥对NK细胞活化功能的抑制。如图34B，发明人对上述实验数据进行柱状图的显著性分析，基本确定相比于无帕纳替尼处理组，200nM的浓度能够显著抑制NK细胞的活化。
因此，上述数据进一步说明帕纳替尼能够作为本发明中的通用CAR-T策略的预处理方案，200nM浓度的帕纳替尼能够抑制T和NK细胞的激活，避免了宿主T和NK细胞对UCAR-T的杀伤。同时LCK-T316I突变能够使UCAR-T细胞耐受帕纳替尼对T细胞激活的抑制，能够正常被激活并介导靶向肿瘤细胞的杀伤。
实施例18：体外帕纳替尼对T细胞激活的抑制存在延续效应
在实施例16中，发明人证明200nM浓度的帕纳替尼在体外能够有效发挥对T细胞活化功能的抑制，以此来指导体内用药浓度。考虑到帕纳替尼在体内的药物代谢，发明人设计了体外帕纳替尼动态浓度实验，检测动态浓度变化下其对T细胞活化功能的抑制是否仍然有效。
本实施例中使用了已经制备完成的野生型抗BCMA的CAR-T细胞进行实验。分别用0nM、200nM或500nM浓度的帕纳替尼处理过夜，次日降低浓度。图35A，0nM预处理组无需再降低浓度，200nM预处理过夜后调整浓度分别到0、50、100和200nM，500nM预处理过夜后调整浓度分别到0、50、100、200nM和500nM。同时用表达BCMA抗原的RPMI-8226细胞作为阳性靶细胞，在第二天调整浓度时，按照CAR-T细胞和靶细胞效靶比1：1的条件共孵育，且对照是不加靶细胞的空白培养基。同时加入CD107a和莫能霉素。共孵育4小时后，检测CD8和CAR双阳性细胞中的CD107a释放。
结果如图35显示，无帕纳替尼处理组的CAR-T细胞被RMPI-8266靶细胞激活，有40％左右的细胞释放CD107a，证明CAR-T细胞能够有效被阳性靶细胞激活(图35A，第一、二排，上下分别为两个平行复孔)。
当用200nM帕纳替尼预处理后，次日调整浓度到0nM，其CD107a阳性细胞的比例则从40％左右降低到16％左右，证明帕纳替尼对T细胞激活的抑制存在延续效应(图35A，第三、四排，最左列)。当用200nM帕纳替尼预处理后，次日调整浓度至50nM或者更高，其CD107a阳性细胞的比例均下降至和阴性对照组一致，提示当帕纳替尼的浓度从200nM降低至50nM后，已经能够完全抑制T细胞的激活(图35A，第三、四排，后三列)。
当用500nM帕纳替尼预处理后，次日调整浓度到0nM，其CD107a阳性细胞的比例则从40％左右降低到3％左右，再次证明帕纳替尼对T细胞激活的抑制存在延续效应，且预处理的浓度越高，抑制的延续效应越明显(图35A，第五、六排，最左列)。当用500nM帕纳替尼预处理后，次日调整浓度至50nM或者更高，其CD107a阳性细胞的比例均下降至和阴性对照组一致，提示当帕纳替尼的浓度从500nM降低至50nM后，也能够完全抑制T细胞的激活(图35A，第五、六排，后三列)。
如图35B，发明人对上述数据进行了统计行分析，证明相比于无帕纳替尼处理组的细胞，在200nM帕纳替尼预处理后调整浓度至0nM再处理4小时的CAR-T细胞受到靶细胞激活而释放的CD107a阳性率显著降低，且后期浓度调整为50nM或以上的CAR-T细胞在4小时内均无法被靶细胞激活。同时，500nM预处理基本完全抑制了CAR-T细胞被靶细胞的激活。上述数据表明，帕纳替尼对T细胞的活化的抑制存在延续效应，且用药浓度越高，这种延续效应越明显。
实施例19：体外帕纳替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应
在实施例17中，发明人证明200nM浓度的帕纳替尼在体外能够有效发挥对NK细胞活化功能的抑制，以此来指导体内用药浓度。为了充分考虑体内帕替尼浓度波动的因素，发明人设计了体外帕纳替尼动态浓度实验，检测动态浓度变化下其对NK细胞活化功能的抑制是否仍然有效。
发明人从人PBMC中分离出NK细胞，再用NK培养基培养分化获得纯度高于95％的CD56阳性的NK细胞。分别做四种预处理(1)不加帕纳替尼预处理；(2)加50nM帕纳替尼预处理；(3)加100nM帕纳替尼预处理；(4)加200nM帕纳替尼预处理，培养过夜。次日降低帕纳替尼的浓度，分别调整浓度分别到0、50、100和200nM。同时用K562细胞作为阳性靶细胞激活NK细胞，按照效靶比1：1共孵育，同时加入CD107a和莫能霉素。每组设置两个重复。共孵育5小时后，检测CD56阳性的NK细胞中的CD107a释放。
如图36A所示，四种不同浓度的帕纳替尼预处理后，再降低浓度到0nM时，NK细胞能够显著被K562激活，CD107a的释放随着预处理的浓度升高而逐渐降低，最强在58％以上(图36A第一、二排，第二列)，最弱在38％以上(图36A第七、八排，第二列)。证明K562能够激活NK，且帕纳替尼对NK激活的抑制存在延续效应，浓度越高，延续效应越明显。四种不同浓度的帕纳替尼预处理后，次日浓度均调整为0、50、100和200nM四个浓度，能够发现随着次日浓度的升高，K562激活的每一组预处理的释放CD107a的NK细胞比例均逐渐下降。且200nM帕纳替尼预处理后需要维持其浓度才能有效抑制NK的活化。证明帕纳替尼对NK的抑制仍需要维持在较高的浓度水平。
如图36B，发明人对上述实验数据进行柱状图的显著性分析，进一步阐明NK细胞在不同预处理浓度下，后续调整为一致的浓度处理4小时，其被K562激活的能力随着预处理浓度的升高而降低，证明帕纳替尼对NK细胞活化功能的抑制存在延续效应。且帕纳替尼需要维持在200nM才能够有效抑制NK的活化。
实施例20：验证帕纳替尼作为本专利通用CAR-T治疗的联用药物和开关的可能性
在实施例16中，发明人证明200nM浓度的帕纳替尼在体外能够有效发挥对T细胞活化功能的抑制，对LCK-T316I突变的T细胞而言，该突变能够耐受200nM浓度下的帕纳替尼对T细胞活化的抑制，以此来指导体内用药浓度。当帕纳替尼浓度升高到500nM时，帕纳替尼能够阻断Km编辑的T细胞的TCR信号激活。因此可以作为分子开关，抑制LCK-T316I-UCAR-T细胞的激活。在实施例18中，发明人证明在动态浓度变化下帕纳替尼对T细胞的活化的抑制存在延续效应，且用药浓度越高，这种延续效应越明显。但当帕纳替尼浓度升高到500nM时，这种耐受能力显著降低。
为了验证LCK-T316I突变不仅能够使T细胞耐受帕纳替尼对TCR激活的抑制，还能够使CAR-T细胞耐受帕纳替尼对CAR激活过程中的CD107a转运的抑制，同时充分考虑体内帕替尼浓度波动的因素，发明人设计开展了如下实验，证明了LCK-T316I突变的CD19-CAR-T细胞可以耐受200nM浓度下的帕纳替尼对CD107a转运的抑制。但当帕纳替尼浓度升高到500nM时，帕纳替尼也能够阻断LCK-T316I突变的CD19-CAR-T细胞的CD107a转运。因此，LCKT316I突变和帕纳替尼联用可以作为CD19-UCART治疗的开关。
本实施例中，发明人使用了已经制备完成的CD19-UCART和Km编辑的CD19-UCART细胞进行实验。两组细胞分别均用200nM或500nM浓度的帕纳替尼处理过夜(图37A，37B)。次日，200nM预处理过夜组调整浓度分别到0、50、100和200nM，500nM预处理过夜后调整浓度分别到0、100、200nM和300nM。同时用表达CD19抗原的Raji细胞作为阳性靶细胞，按照CD19-UCART细胞和靶细胞效靶比1：1的条件共孵育，且对照是不加靶细胞的空白培养基。同时加入CD107a抗体和莫能霉素。每组做两个技术性重复。共孵育4小时后，检测CD8和CAR双阳性细胞中的CD107a释放。
如图37A所示，当用200nM帕纳替尼预处理过夜，次日调整浓度到0、50、100和200nM，与表达CD19抗原的Raji阳性靶细胞共孵育4小时后，CD19-UCART组的CD107a阳性细胞的比例则从17.2％(CD107a阳性细胞的比例均取自两个技术重复组的均值)降低到0.735％，Km编辑的CD19-UCART组的CD107a阳性细胞的比例则从16.6％降低到5.12％。当帕纳替尼为50nM时，CD19-UCART组的CD107a转运的转运基本被抑制(0.485％)，但Km编辑的CD19-UCART组的CD107a阳性细胞的比例为12.7％。该组实验证明了LCK-T316I突变的CD19-UCART细胞耐受200nM浓度的帕纳替尼对CAR激活过程中的CD107a转运的抑制。且在动态浓度变化下，LCK-T316I突变的CD19-UCART细胞对帕纳替尼在CAR激活过程中的CD107a转运的抑制作用的耐受能力存在延续效应。
如图37B所示，当用500nM帕纳替尼预处理过夜，次日调整浓度到0、100、200和300nM，与表达CD19抗原的Raji阳性靶细胞共孵育4小时后，CD19-UCART组的CD107a阳性细胞的比例则从1.73％降低到0.495％，Km编辑的CD19-UCART组的CD107a阳性细胞的比例则从11.15％降低到1.47％。且在500nM帕纳替尼预处理过夜后的Km编辑的CD19-UCART组，动态浓度变化下，LCK-T316I突变的CD19-UCART细胞依然对帕纳替尼在CAR激活过程中的CD107a转运的抑制作用的耐受能力存在延续效应。尽管用药浓度越高，这种耐受能力越低(在300nM浓度的帕纳替尼处理下，Km编辑的CD19-UCART组的CD107a阳性细胞的比例仅为1.47％)。该组实验证明了LCK-T316I突变的CD19-UCART细胞对500nM浓度的帕纳替尼对CAR激活过程中的CD107a转运的抑制的耐受显著降低。
综合以上，发明人证明了LCK-T316I突变的CD19-UCART细胞耐受200nM浓度的帕纳替尼对CAR激活过程中的CD107a转运的抑制。且在动态浓度变化下，LCK-T316I突变的CD19-UCART细胞对帕纳替尼在CAR激活过程中的CD107a转运的抑制作用的耐受能力存在延续效应。但是，500nM浓度的帕纳替尼预处理基本完全抑制了CD19-UCART细胞被靶细胞的激活，而LCK-T316I突变的CD19-UCART细胞在300nM浓度的帕纳替尼预处理下基也本无法被Raji靶细胞激活。因此，发明人认为200nM浓度的帕纳替尼和LCK-T316I突变可以联用于CD19-UCART的活化，而500nM浓度的帕纳替尼可以关闭LCK-T316I突变的CD19-UCART的活化。
实施例21：LCKT316I突变和达沙替尼联用策略使B2M敲除的CD19-UCART在体外混 合淋巴细胞反应中最具扩增和存续优势
考虑到上述实施例中已经证明，达沙替尼能够有效抑制T细胞和NK细胞的活化，而携带了LCK-T316I突变的CAR-T细胞，则能够有效抵抗达沙替尼对CAR分子活化的抑制，从而正常靶向肿瘤细胞进行激活和杀伤。并且，发明人在实施例14和15中已经证明，未敲除B2M版本的CD5-UCART，在和异体T细胞进行体外混合淋巴反应中，能够有效抵抗异体T细胞对其的杀伤，而获得扩增优势。因此，为了进一步验证B2M敲除版本的UCART能否在和达沙替尼联合用药的基础上，有效抵抗NK细胞对其的清除而获得扩增优势，发明人设计了如下的实验。
发明人通过从PBMC中分离出CD3阳性的T细胞，激活后进行B2M和TRAC基因的敲除，并对其进行抗CD19的CAR分子慢病毒感染(具体序列见SEQ ID Nos:35-56)。如图38A所示，B2M和TRAC双敲除的比例占到74％以上(图38A左列)，CAR阳性率在28.8％(图38A右列)。在激活后第六天，对该细胞进行了LCK-T316I的编辑，编辑效率50％以上。
随后，发明人利用这些制备的抗-CD19 UCART细胞进行了体外混合淋巴反应测试。发明人从与UCAR-T不同供者的新鲜PBMC中去除CD3阳性的T细胞，保留CD3去除后的PBMC(主要含有CD56阳性的NK细胞和CD19阳性的B细胞)和UCART进行混合淋巴反应，效靶比(异体细胞：UCART)设置为20:1，10:1，5:1和2.5:1四个梯度。测试的CD19 UCART细胞有两种类型：LCK编辑组(Km)和LCK未编辑组，分别用DMSO或50nM达沙替尼处理，NK培养基培养，共孵育后的24小时(D1)、48小时(D2)和96小时(D4)进行细胞计数以及流式检测各组分的比例，流式检测的分子包括CD19、CAR分子、TRAC及CD56等。
结果如图38B所示，20:1效靶比下，DMSO处理对照组的UCART细胞均无法有效扩增，提示CD19-UCART被B细胞激活但无法获得扩增优势，主要的原因是B2M敲除后，激活的NK细胞对其进行了快速的清除(红色和紫色线)。用达沙替尼处理的CD19-UCART未编辑组细胞(绿色线)也没有扩增，提示达沙替尼有效抑制CAR分子的活化。只有发生了LCK-T316I编辑的CD19-UCART能够在达沙替尼的处理下，获得迅速的扩增，提示达沙替尼无法抑制LCK-T316I突变的CD19-UCART的激活，且NK细胞活性被抑制，无法有效清除B2M敲除的这类UCART细胞(蓝色线)。
同样地，如图38C，CD19-UCART的CAR阳性率只有在达沙替尼处理的Km-CD19-UCART中才显著提高，在Km未编辑的CD19-UCART和DMSO处理组中，均没有明显的CAR阳性比例升高。
此外，如图38D，DMSO对照组的B细胞均无法存续，提示被CD19-UCART杀伤(红色和紫色线)。达沙替尼处理下，未编辑的CD19-UCART的激活被抑制，无法杀伤B细胞，因此这一组的B细胞一直维持在较高水平(绿色线)。而Km编辑组的CD19-UCART细胞能够有效抵抗达沙替尼的抑制，而杀伤B细胞，造成B细胞的降低(蓝色线)。
最终，如图38E，统计了LCK突变组在50nM达沙替尼处理下，四种不同的效靶比下，LCK-T316I-CD19-CAR-T细胞量的变化。结果提示，每个效靶比下CAR阳性细胞总量均有显著扩增，且基本呈现效靶比越低，扩增越强的趋势。这些结果显示，LCKT316I突变和达沙替尼联用策略能够使B2M敲除的CD19-UCART在NK细胞较多的体外混合淋巴细胞反应中最具扩增和存续优势。
实施例22：LCKT316I突变和达沙替尼联用策略使MHC I类分子(B2M)和MHC-II类分子(CIITA)共同敲除的CD19-UCART在体外混合淋巴细胞反应中最具扩增和存续优势
所述方法包括以下步骤：
(1)T细胞的复苏，激活；
(2)对激活的T细胞进行TRAC、B2M、CIITA基因敲除,LCK基因的T316I编辑(Km)；
(3)慢病毒感染T细胞；
(4)TRAC、B2M、CIITA基因敲除效率，TRAC与B2M双敲效率约为70％，CIITA基因敲除效率50％。为了避开阳性细胞对后续实验的干扰，对细胞进行TRAC、B2M、CIITA阴选，阴选后细胞结果如图39A所示，TRAC基因的敲除效率>97％，B2M基因的敲除效率>97％，CIITA基因的敲除效率>99％。
(5)CAR阳性率检测，结果如图39A所示，>15％；
(6)Km编辑效率检测，结果如图39B所示，Ctrl组未发生Km编辑；Km组CD19-UCART细胞中T316I的突变效率为20％。届时，发明人认为已获得了可用于体外测试的Km-CD19-UCART细胞；
(7)体外实验中模拟宿主体内细胞：发明人为了测试Km-CD19-UCART在宿主T、B、NK细胞环境下的功能，另需获得与制备Km-CD19-UCART所涉及的供体的HLA-ABC蛋白相异的供体来源的T、B、NK细胞作为宿主T、B、NK细胞。此批T、B、NK细胞即为PBMC。
(8)利用混合淋巴细胞反应检验Km-CD19-UCART细胞在宿主T、NK细胞环境中的存活情况：此次混合淋巴细胞反应旨在检验Km-CD19-UCART细胞在抵抗体外T细胞、NK细胞介导的免疫排斥反应的能力，因而发明人将Km-CD19-UCART视作理论上的靶细胞。宿主T细胞、NK细胞作为效应细胞。
此次混合淋巴细胞反应中的靶细胞分为2组：(1)Ctrl组为针对LCK发生同义突变的CD19-UCAT细胞对照组；(2)Km组为发生了LCKT316I编辑的CD19-UCAT细胞实验组。此次混合淋巴细胞反应中的效应细胞仅使用同一供体来源的同种宿主PBMC细胞。
本实施例计划以10：1效靶比开展。将2组靶细胞以1.5×105个CAR阳细胞数分别各铺6孔于平底48孔板中(500μl体积)，效应细胞分别铺1.5×106个细胞数(500μl体积)与效应细胞混合，每孔总体积1000ul，均以T细胞完全培养基培养。现有2组效应细胞与靶细胞的混合孔各6孔，分别给予2种处理，每种处理设置2个技术重复：处理一为DMSO，处理二为50nM达沙替尼。将孔板置于37℃培养箱培养。每隔两天补充培养体系中的达沙替尼与DMSO。
此次测试，发明人预测Km组效应细胞在达沙替尼处理组可展现出优于其他组的生长优势。为了验证以上假设，发明人需要在混合淋巴细胞反应过程中收集以下数据：不同时间点的细胞计数；不同时间点的效应细胞与靶细胞的比例与绝对数量；效应细胞的CAR阳性率。
为了获得上述数据，发明人分别于共培养的第4、9、12、16日(铺板当天定为第0天)从每孔中取部分细胞进行细胞计数，所取出的细胞需确定其所占当前每孔总细胞的比例，通过此比例与取出细胞的计数结果计算出当前每孔的细胞绝对数量。取出的细胞还需用于流式细胞分析以确定效应细胞、靶细胞的比例及效应细胞的CAR阳性率。
此次混合淋巴细胞反应中发明人将每一时间点的细胞计数结果与流式细胞分析结果综合起来计算出所关注的指标。第0天的实际铺板细胞数在铺板后通过细胞计数与流式细胞分析获得，而不以实验设计时欲加细胞量为准。因为加样产生的误差会导致实际铺板量与计划接种的细胞量不一致，其次因为设置了技术重复，对实际接种量进行计数使得结果更易于进行生物学统计分析。测试时效应细胞实际CAR阳性率约为18％(Ctrl组)、25％(Km组)。本次测试结束后，据每一时间点所得到的各项指标，发明人分别对靶细胞的数量动态变化(图40A)，效应细胞的数量动态变化(图40C、40D)以及靶细胞中的CAR阳性率(图40E)进行了详尽地统计学分析。
如图40A、40B数据显示，DMSO处理下，Ctrl-CD19-UCART和Km-CD19-UCART均不能在宿主T细胞、NK细胞的环境中有效扩增，而50nM达沙替尼处理下，对照组Ctrl-CD19-UCART与Km-CD19-UCART能够有效扩增。
对于宿主T细胞NK细胞的动态变化，如图40C、40D所示，DMSO处理下，Ctrl-CD19-UCART和Km-CD19-UCART组宿主T细胞、NK细胞均较DS处理组明显升高。与前面图40A、40B观察到的现象一致，解释了DMSO处理组UCART数量减少的原因为宿主T细胞、NK细胞的活化扩增导致了UCART细胞被清除。
图40E、40F揭示了UCART细胞中CAR阳性的细胞在达沙替尼处理的Km-CD19-UCART组中持续升高，而其在Ctrl-CD19-UCART略有上升，DMSO处理组持续走低。提示达沙替尼处理下的Km-CD19-UCART组中主要的功能性群体为CAR阳性细胞，Km编辑与达沙替尼联用使得 CAR阳性细胞获得生存优势且产生富集。CAR阳性率只有在达沙替尼处理组的Km-CD19-UCART中才显著升高，在Ctrl-CD19-UCART和DMSO处理组中，均未出现明显的CAR阳性比例升高。
实施例23：LCKT316I突变的UCAR-T制备工艺的优化和确认
考虑到上述实施例中制备的LCK-T316I突变的UCAR-T细胞LCK-T316I突变的效率不一，为了在应用过程中保持高效率的LCK-T316I突变，发明人对LCKT316I突变的UCAR-T制备工艺进行了优化，确认了能保证LCK-T316I高突变率的制备方法。
最终我们确认的制备工艺流程如下：
Day0，使用美天旎的Pan T Cell Isolation Kit,human试剂盒对PBMC进行T细胞的分选，将T细胞培养在无细胞因子的培养基中，静息5小时后，使用Celetrix电转仪，进行静息电转，同时使用Cas9蛋白敲除TRAC和B2M基因，并使用CBE3蛋白编辑Km基因，编辑后立刻加入50nM-100nM的达沙替尼进行处理，2小时后，使用美天旎的Human CD2/CD3/CD28激活剂进行T细胞激活，按照体积加入25ul/ml的量，刺激2天；
Day1，无操作，观察培养；
Day2，T细胞激活48hr后，进行慢病毒的转导，采用MOI＝1-3，采用助转剂1％DMSO或100x的lentiboost；
Day3，转毒后24hr进行病毒换液，细胞继续培养；
Day4，无操作，观察培养；
Day6，进行TRAC和B2M双阴性细胞的阴选，使用CD3 microbeads分选TRAC阴性细胞，使用PE-anti-B2M抗体和PE microbeads分选B2M阴性细胞，最终阴选后的细胞进Grex培养；
Day7，无操作，观察培养；
Day8，半换液或补液；
Day9，无操作，观察培养；
Day10/11，进行细胞制剂和冻存。
发明人通过从三个不同供者来源的PBMC中使用PanT试剂盒分离出CD3阳性的T细胞，进行B2M和TRAC基因的敲除，同时对该细胞进行了LCK-T316I的编辑。然后将细胞分成两份，一份加入100nM DS(实验组),另一份加入对应量的DMSO作为对照(对照组)，2小时后实验组与对照组加入T细胞激活剂(CD2/CD3/CD28，25ul/1M/mL)。激活48小时后对其进行抗CD19的CAR分子慢病毒感染，病毒感染24小时后换液，同时去除DS或DMSO。
如图41A所示，在实验组B2M和TRAC双敲除的比例占到50％以上(图41A左列)，对照组B2M和TRAC双敲除的比例不一(图41A右列)，但均低于实验组。从流式图可见导致对照组B2M和TRAC双敲除比例低于实验组的原因为DS抑制了TCR阳性细胞的激活(证明了实施例3的结论)。CAR阳性率大于15％(图41B)。在培养的第八天，对该细胞进行了LCK-T316I的效率检测。加入100nM DS组(蓝色)LCK-T316I显著高于加入对应量的DMSO组(红色)(图41C)。因 此，发明人证实，UCART制备过程中加入100nM达沙替尼能够明显富集出发生了T316I突变的 细胞，从而使得终产品中的突变率升高。
实施例24：LCKT316I突变的UCAR-T携带的第三信号元件的优化和确认
利用已制备出的足够数量的含有不同第三信号结构CD19-UCART和丝裂霉素-C处理过的Raji细胞进行反复抗原刺激反应，以此模拟体内靶细胞反复和UCART细胞接触环境下UCART细胞不断杀伤靶细胞不断扩增的过程。
本发明利用基因编辑技术将TRAC基因与B2M基因同时在T细胞中敲除以制备CD19-UCART细胞。
以较小数量从健康供体制备得到了CD19-UCART细胞，在此批制得的细胞样品中，发明人通过流式细胞术手段测得TRAC基因的敲除效率>90％；通过检测CD19抗原标记测得不同的UCART细胞表达CAR约为10-50％不等。
本发明意图通过反复靶细胞抗原刺激来衡量加入不同第三信号原件的UCAR-T细胞增殖和杀伤功能特性，从而优选携带第三信号元件的LCKT316I突变的UCAR-T。共进行了两次实验，分别以实验I和实验II区别。
所述方法包括以下步骤：
(1)携带不同第三信号元件的质粒和慢病毒构建，质粒示意图如图42A所示；
(2)CD3+T细胞分选；
(3)对未经激活的T细胞进行TRAC、B2M基因敲除,LCK基因的T316I编辑(Km)；
(4)电穿孔后激活细胞；
(5)用构建好的不同慢病毒感染细胞；
(6)TRAC、CD5基因敲除效率结果如图42B所示；
(7)CAR阳性率检测，由于缺乏分子标志物，因此采用CD19抗原结合表达的Anti-CD19的CAR结构来指示CAR+比例，结果如图42C所示；
(8)TRAC/B2M双阴性细胞的富集：发明人为了获得纯度更高的UCART细胞，使用FITC-B2M抗体+FITC microbeads联合CD3+microbeads在LS柱中进行过滤操作从而获得TRAC/B2M为-/-比例>99％的UCART细胞；
(9)体外实验中用于抗原刺激的靶细胞处理：发明人为了测试CD19-UCART在反复抗原刺激下的增殖和杀伤，需要获得能够与CD19-UCART结合的CD19抗原。因此采用丝裂霉素C以1ug/M/ml的浓度处理Raji细胞。如此处理旨在使Raji细胞失去分裂的能力，但是保留其表面抗原特性；
(10)利用反复抗原刺激模拟CD19-UCART细胞在体内反复杀伤肿瘤细胞后的极限增殖情况：此次反复抗原刺激实验旨在比较含有不同第三信号结构CD19-UCART细胞在反复被外界抗原刺激的情况下的极限增殖能力，以及在不断增殖后是否还能保持较强的杀伤肿瘤细胞的能力。因而发明人以每3天一次的刺激频率，使CD19-UCART细胞始终处于激活状态，将其视作CD19-UCART在体内不断清除肿瘤的过程。
本实施例流程如图43A所示，实验I和实验II两次反复刺激实验中的效应细胞均根据不同的第三信号结构分组。在Day-1将用丝裂霉素C(1ug/M/ml)预处理16h的Raji细胞用于当作抗原反复刺激的靶细胞。Day0时在共培养开始前先用10ml PBS清洗预处理的靶细胞3次。按总细胞量为2M取各组CD19-UCART细胞，再根据效靶比2：1将UCART细胞和Raji细胞混合后于3ml培养基中共培养。此后每三天重复上述流程补充一次靶细胞并进行计数和流式测定，整个实验一共使用抗原刺激四次。
本实施例以2：1效靶比开展，此处需要说明的是发明人以表达CAR分子的CD19-UCART细胞的绝对数量比上模拟宿主T细胞的绝对数量定义效靶比。将各组效应细胞以2M细胞数总量分别各铺两孔于平底12孔板中(1.5ml体积)，靶细胞分别铺(效应细胞数*CAR+比例/2)细胞量(1.5ml体积)与效应细胞混合，每孔总体积3ml，效应细胞培养密度为0.67M/ml。每次重复补充靶细胞时均固定效应细胞为2M的总细胞量，若前一次刺激结束后效应细胞不足2M则全部用于下一次铺板。
患者在服用免疫抑制剂时，有一系列的免疫细胞被抑制而分泌细胞因子的能力降低。或者某类清淋预处理的药物也会造成患者巨噬细胞降低，从而细胞因子分泌贫瘠，如依托泊苷。为了比较细胞因子贫瘠环境和细胞因子充足环境下各种含有第三信号的UCART细胞扩增是否有区别。发明人将共培养条件设置为两组，分别为M1和M2。其中M1为CTS基础T细胞培养基不补充任何的细胞因子，M2培养基为CTS基础T细胞培养基+200U/ml的IL2。此外每组效应细胞还在对应的培养基条件下设置了不加靶细胞组以观察其基础增殖情况。
此次测试，发明人预测含有第三信号的UCART细胞增殖能力会强于对照组，但是需要确认具有最好扩增能力的UCART细胞。因而发明人需要在反复抗原刺激实验过程中收集以下数据：不同时间点的细胞计数；不同时间点的效应细胞的CAR阳性率，反复抗原刺激后不同效应细胞的杀伤功能。
为了获得上述数据，发明人分别于共培养的第3天，第6天，第9天，第12天，第15天(铺板当天定为第0天)从每孔中取部分细胞进行细胞计数，所取出的细胞需确定其所占当前每孔总细胞的比例，通过此比例与取出细胞的计数结果计算出当前每孔的细胞绝对数量。取出的细胞还需用于流式细胞分析以确定效应细胞的CAR阳性率。
发明人将每一时间点的细胞计数结果与流式细胞分析结果综合起来计算出所关注的指标，图43B和C展示了实验I中各种不同组的CD19 CAR+细胞在反复刺激过程中的扩增情况。实验I中，无论是M1培养基还是M2培养基中2759相对其他CD19-UCART细胞CAR+富集速度都更快。2661也能在杀伤靶细胞后依然维持较高水平的CAR+率。但是2758组在M1和M2培养条件下CAR+并无明显上升。在图43D和E中实验II中各组含有第三信号的UCART细胞在M1和M2培养基中CAR+细胞扩增均超过对照组，其中2661UCART细胞明显扩增情况最好，并且CAR+富集的倍数也很高，并且在多轮刺激后仍保持强劲的扩增态势。在M1培养基中2759仍具有CAR+细胞的扩增优势，但是在M2培养基中扩增优势不明显。
前述实验已经证明2759和2661在反复抗原刺激之后具有CAR+的扩增优势，为了进一步验证2759和2661在抗原刺激后的细胞是否具有杀伤功能优势，发明人将实验I四轮反复刺激后的效应细胞和Raji-luc细胞按效靶比1：1在T细胞完全培养基中进行共培养，将实验II四轮反复刺激后的效应细胞和Raji-luc细胞按效靶比2：1和0.5：1在T细胞完全培养基中进行共培养后于24h和48h检测其luciferase的发光度，从而判断不同效应细胞对于Raji细胞的杀伤功能。发明人将每一次的luciferase的发光度换算成对应的杀伤细胞比例并于图44A-C中展示了不同效应细胞的杀伤功能。实验I中，24h测量时，在M1培养基条件下1175的杀伤功能明显弱于含有第三信号结构的UCART细胞，在两种培养基条件下，2759相对杀伤功能最强，2661次之。48h测量时各种UCART细胞杀伤比例相差不大。实验II中，M1培养条件下2759相对另外两种UCART细胞有明显的杀伤功能优势，在M2培养基条件下，三种UCART细胞杀伤功能相差不大。
为了进一步验证2759和2661细胞在反复抗原刺激后是否具有杀伤功能的优势，发明人在实验II中将四轮反复抗原刺激后的UCART细胞与不同的靶细胞(表达CD19抗原的阳性靶细胞Raji以及不表达CD19抗原的阴性靶细胞CCRF)和不同组CD19-CAR-T细胞共孵育，刺激活化CAR信号，介导CAR-T杀伤靶细胞和CAR-T积累CD107a。在检测前5小时，加入莫能霉素(1：1000)和CD107a-PEcy7抗体(1：100)，5小时后进行CD8和CAR阳性的染色，用于检测CD8阳性CAR阳性细胞的CD107a的转运的富集，统计后展示于图44D中。各UCART细胞107a释放比例差异不大，M1培养条件下，2661的释放比例相对最高。
前述实验已经证明2759和2661在反复抗原刺激之后具有CAR+的扩增优势和杀伤功能优势，为了进一步验证2759和2661在抗原刺激后的细胞是否具有细胞因子分泌优势，发明人对于前述实验I和实验II结束了四轮反复抗原刺激后的细胞培养上清进行收集并迅速储存于-80℃冰箱中，并在一周内冻融进行细胞因子检测。实验I检测了TNF-alpha，见图45A；实验II检测了IL2、TNF-alpha、IFN-gamma，见图45B-D。因M2培养条件下培养基含有IL2，因此仅检测了TNF-alpha和IFN-gamma。
发明人使用Cisbio公司的human IL2 kit，human TNF-alpha kit，human IFN-gamma kit检测冻融后的细胞因子上清。因IFN-gamma普遍上清浓度过高，因此发明人将细胞因子上清稀释20倍后进行了IFN-gamma的检测。检测过程完全按照说明书流程操作。
可以发现在M1和M2培养环境下，2759的TNF-alpha和IFN-gamma明显具有分泌优势，2661次之。2661，2759，2842的IL2分泌均未超过对照组(1175)。2758在IL2TNF-alphaIFN-gamma分泌上均低于对照组。
综合上述实验结果，发明人证明了部分第三信号结构确实能够促进UCART细胞的扩增能力，并且在大量扩增后仍保留相当程度的杀伤功能。发明人最终选择2661和2759作为进一步改进LCKT316I突变的UCAR-T需要携带的第三信号元件。
本文中提到的一些氨基酸或核苷酸序列如下：
SEQ ID NO：1LCK-sgRNA12-21nt靶DNA序列
TCTACATCATCACTGAATACA
SEQ ID NO：2LCK-sgRNA12-20nt靶DNA序列
CTACATCATCACTGAATACA
SEQ ID NO：3LCK-sgRNA12-19nt靶DNA序列
TACATCATCACTGAATACA
SEQ ID NO：4LCK-sgRNA12-18nt靶DNA序列
ACATCATCACTGAATACA
SEQ ID NO：5LCK-sgRNA16-21nt靶DNA序列
CATCACTGAATACATGGAGAA
SEQ ID NO：6LCK-sgRNA16-20nt靶DNA序列
ATCACTGAATACATGGAGAA
SEQ ID NO：7LCK-sgRNA16-19nt靶DNA序列
TCACTGAATACATGGAGAA
SEQ ID NO：8LCK-sgRNA16-18nt靶DNA序列
CACTGAATACATGGAGAA
SEQ ID NO：9LCK-T316I突变蛋白序列
MGCGCSSHPEDDWMENIDVCENCHYPIVPLDGKGTLLIRNGSEVRDPLVTYEGSNPP
ASPLQDNLVIALHSYEPSHDGDLGFEKGEQLRILEQSGEWWKAQSLTTGQEGFIPFNF
VAKANSLEPEPWFFKNLSRKDAERQLLAPGNTHGSFLIRESESTAGSFSLSVRDFDQN
QGEVVKHYKIRNLDNGGFYISPRITFPGLHELVRHYTNASDGLCTRLSRPCQTQKPQK
PWWEDEWEVPRETLKLVERLGAGQFGEVWMGYYNGHTKVAVKSLKQGSMSPDAFL
AEANLMKQLQHQRLVRLYAVVTQEPIYIIIEYMENGSLVDFLKTPSGIKLTINKLLDMA
AQIAEGMAFIEERNYIHRDLRAANILVSDTLSCKIADFGLARLIEDNEYTAREGAKFPI
KWTAPEAINYGTFTIKSDVWSFGILLTEIVTHGRIPYPGMTNPEVIQNLERGYRMVRPDNCPEELYQLMRLCWKERPEDRPTFDYLRSVLEDFFTATEGQYQPQP*
此处*代表蛋白终止
SEQ ID NO：10LCK-T316A突变蛋白序列
MGCGCSSHPEDDWMENIDVCENCHYPIVPLDGKGTLLIRNGSEVRDPLVTYEGSNPP
ASPLQDNLVIALHSYEPSHDGDLGFEKGEQLRILEQSGEWWKAQSLTTGQEGFIPFNF
VAKANSLEPEPWFFKNLSRKDAERQLLAPGNTHGSFLIRESESTAGSFSLSVRDFDQN
QGEVVKHYKIRNLDNGGFYISPRITFPGLHELVRHYTNASDGLCTRLSRPCQTQKPQK
PWWEDEWEVPRETLKLVERLGAGQFGEVWMGYYNGHTKVAVKSLKQGSMSPDAFL
AEANLMKQLQHQRLVRLYAVVTQEPIYIIAEYMENGSLVDFLKTPSGIKLTINKLLDM
AAQIAEGMAFIEERNYIHRDLRAANILVSDTLSCKIADFGLARLIEDNEYTAREGAKFP
IKWTAPEAINYGTFTIKSDVWSFGILLTEIVTHGRIPYPGMTNPEVIQNLERGYRMVRPDNCPEELYQLMRLCWKERPEDRPTFDYLRSVLEDFFTATEGQYQPQP*
此处*代表蛋白终止
SEQ ID NO：11LCK-T316M突变蛋白序列
MGCGCSSHPEDDWMENIDVCENCHYPIVPLDGKGTLLIRNGSEVRDPLVTYEGSNPP
ASPLQDNLVIALHSYEPSHDGDLGFEKGEQLRILEQSGEWWKAQSLTTGQEGFIPFNF
VAKANSLEPEPWFFKNLSRKDAERQLLAPGNTHGSFLIRESESTAGSFSLSVRDFDQN
QGEVVKHYKIRNLDNGGFYISPRITFPGLHELVRHYTNASDGLCTRLSRPCQTQKPQK
PWWEDEWEVPRETLKLVERLGAGQFGEVWMGYYNGHTKVAVKSLKQGSMSPDAFL
AEANLMKQLQHQRLVRLYAVVTQEPIYIIMEYMENGSLVDFLKTPSGIKLTINKLLDM
AAQIAEGMAFIEERNYIHRDLRAANILVSDTLSCKIADFGLARLIEDNEYTAREGAKFP
IKWTAPEAINYGTFTIKSDVWSFGILLTEIVTHGRIPYPGMTNPEVIQNLERGYRMVRPDNCPEELYQLMRLCWKERPEDRPTFDYLRSVLEDFFTATEGQYQPQP*
此处*代表蛋白终止
SEQ ID NO：12LCK-saCas9-sgRNA1靶DNA序列
CTACATCATCACTGAATACATG
SEQ ID NO：13LCK-saCas9-sgRNA2靶DNA序列
ATCACTGAATACATGGAGAATG
SEQ ID NO：14LCK-sgRNA1靶DNA序列
GCTACCCGAGTCGGCTACCA
SEQ ID NO：15LCK-sgRNA11靶DNA序列
GCTCTACGCTGTGGTCACCC
SEQ ID NO：16LCK-sgRNA8靶DNA序列
GTATTCAGTGATGATGTAGA
SEQ ID NO：17LCK-sgRNA9靶DNA序列
TATTCAGTGATGATGTAGAT
SEQ ID NO：18LCK-sgRNA12靶DNA序列
CTACATCATCACTGAATACA
SEQ ID NO：19ssDNA-T316I-for-sgRNA8作为修复模板的DNA序列A*C*G*CCTTCCTGGCCGAGGCCAACCTCATGAAGCAGCTGCAACACCAGCGGCTG GTTCGGCTCTACGCTGTGGTCACCCAGGAGCCCATCTACATCATCattGAATACATGG AGAATGgtgggtgctacccga*g*t*c
此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：20ssDNA-T316I-for-sgRNA9作为修复模板的DNA序列G*A*C*GCCTTCCTGGCCGAGGCCAACCTCATGAAGCAGCTGCAACACCAGCGGCT GGTTCGGCTCTACGCTGTGGTCACCCAGGAGCCCATCTACATCATCattGAATACATG GAGAATGgtgggtgctacccg*a*g*t
此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：21ssDNA-T316I-for-sgRNA12作为修复模板的DNA序列a*a*a*aggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATT CTCCATGTATTCaatGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGT*A*G*A此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：22ssDNA-T316M-for-sgRNA8作为修复模板的DNA序列A*C*G*CCTTCCTGGCCGAGGCCAACCTCATGAAGCAGCTGCAACACCAGCGGCTG GTTCGGCTCTACGCTGTGGTCACCCAGGAGCCCATCTACATCATCatgGAATACATGG AGAATGgtgggtgctacccga*g*t*c
此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：23ssDNA-T316M-for-sgRNA9作为修复模板的DNA序列G*A*C*GCCTTCCTGGCCGAGGCCAACCTCATGAAGCAGCTGCAACACCAGCGGCT GGTTCGGCTCTACGCTGTGGTCACCCAGGAGCCCATCTACATCATCatgGAATACATG GAGAATGgtgggtgctacccg*a*g*t
此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：24ssDNA-T316M-for-sgRNA12作为修复模板的DNA序列a*a*a*aggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATT CTCCATGTATTCcatGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGT*A*G*A此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：25ssDNA-T316A-for-sgRNA8作为修复模板的DNA序列A*C*G*CCTTCCTGGCCGAGGCCAACCTCATGAAGCAGCTGCAACACCAGCGGCTG GTTCGGCTCTACGCTGTGGTCACCCAGGAGCCCATCTACATCATCgccGAATACATG GAGAATGgtgggtgctacccga*g*t*c
此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：26ssDNA-T316A-for-sgRNA9作为修复模板的DNA序列G*A*C*GCCTTCCTGGCCGAGGCCAACCTCATGAAGCAGCTGCAACACCAGCGGCT GGTTCGGCTCTACGCTGTGGTCACCCAGGAGCCCATCTACATCATCgccGAATACAT GGAGAATGgtgggtgctacccg*a*g*t
此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：27ssDNA-T316A-for-sgRNA12作为修复模板的DNA序列a*a*a*aggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATT CTCCATGTATTCcggGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGT*A*G*A此处*代表碱基间的硫代修饰，5’和3’末端各三个
SEQ ID NO：28ssDNA-T316I-for-sgRNA1+sgRNA11作为修复模板的DNA序列aggaaagctcaagaaaccctccttgcttgagctttgggccagaagaaaaggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATTCTCCATGTATTCaatGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGTAGAGCCGAACCAGCCGCTGGTGTTGCAGCTGCTTCATGAGGTTGGCCTCGGCCAGGAAGGCGTCCGGGGACATGCTGCCCTGCTTCAGSEQ ID NO：29ssDNA-T316M-for-sgRNA1+sgRNA11作为修复模板的DNA序列aggaaagctcaagaaaccctccttgcttgagctttgggccagaagaaaaggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATTCTCCATGTATTCcatGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGTAGAGCCGAACCAGCCGCTGGTGTTGCAGCTGCTTCATGAGGTTGGCCTCGGCCAGGAAGGCGTCCGGGGACATGCTGCCCTGCTTCAGSEQ ID NO：30ssDNA-T316A-for-sgRNA1+sgRNA11作为修复模板的DNA序列aggaaagctcaagaaaccctccttgcttgagctttgggccagaagaaaaggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATTCTCCATGTATTCcggGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGTAGAGCCGAACCAGCCGCTGGTGTTGCAGCTGCTTCATGAGGTTGGCCTCGGCCAGGAAGGCGTCCGGGGACATGCTGCCCTGCTTCAGSEQ ID NO：31ssDNA-T316I-for-sgRNA1+sgRNA12作为修复模板的DNA序列aggaaagctcaagaaaccctccttgcttgagctttgggccagaagaaaaggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATTCTCCATGTATTCaatGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGTAGAGCCGAACCAGCCGCTGGTGTTGCAGCTGCTTCATGAGGTTGGCCTCGGCCAGGAASEQ ID NO：32ssDNA-T316M-for-sgRNA1+sgRNA12作为修复模板的DNA序列aggaaagctcaagaaaccctccttgcttgagctttgggccagaagaaaaggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagagcagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATTCTCCATGTATTCcatGATGATGTAGATGGGCTCCTGGGTGACCACAGCGTAGAGCCGAACCAGCCGCTGGTGTTGCAGCTGCTTCATGAGGTTGGCCTCGGCCAGGAA
SEQ ID NO：33ssDNA-T316A-for-sgRNA1+sgRNA12作为修复模板的DNA序列
aggaaagctcaagaaaccctccttgcttgagctttgggccagaagaaaaggtgtatttccaccctctggcagggacagcagggagag
cagtatcccctggtagccgactcgggtagcacccacCATTCTCCATGTATTCcggGATGATGTAGATGGGC
TCCTGGGTGACCACAGCGTAGAGCCGAACCAGCCGCTGGTGTTGCAGCTGCTTCA
TGAGGTTGGCCTCGGCCAGGAA
SEQ ID NO：34Ecoli-A3A-CBE3-protein大肠杆菌纯化的蛋白序列
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHN
QAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFL
QENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQG
CPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGSETPGTSESATPESDKKYSIGLAIGTNS
VGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYT
RRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKY
PTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQT
YNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTP
NFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRV
NTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGG
ASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRR
QEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDK
GASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLS
GEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLL
KIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYT
GWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSG
QGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQK
GQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELD
INRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQ
LLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKY
DENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKK
YPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIR
KRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNS
DKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSF
EKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKY
VNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKV
LSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKVHHHHHHHHHH*
此处*代表蛋白终止
SEQ ID NO：35 CD19-78 VL核酸序列
CAGGCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCTGAAGCCCCCAGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGCTGTAAGCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTATTATGATGATCTGCTCCCCTCAGGGGTCTCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGT
SEQ ID NO：36 CD19-78 VL蛋白序列
QAVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVSWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKVTVLG
SEQ ID NO：37 CD19-78 VH核酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGCGCCTGTCTTACTCTTGGTCTTCTTGGTACTGGGATTTCTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO：38 CD19-78 VH蛋白序列
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLSYSWSSWYWDFWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：39 CD19-Linker1核酸序列
GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCC
SEQ ID NO：40 CD19-Linker1蛋白序列
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：41 CD19-CD8a hinge核酸序列
ACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC
SEQ ID NO：42 CD19-CD8a hinge蛋白序列
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO：43 CD19-CD8a TM核酸序列
ATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGC
SEQ ID NO：44 CD19-CD8a TM蛋白序列
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO：45 CD19-CD28胞内结构域(IC)核酸序列
AGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCAAGACGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGAGACTTCGCCGCCTACCGGTCC
SEQ ID NO：46 CD19-CD28胞内结构域(IC)蛋白序列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO：47 CD19-CD3z胞内信号结构域核酸序列
AGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGAAAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGA
SEQ ID NO：48 CD19-CD3z胞内信号结构域蛋白序列
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO：49 CD19-T2A核酸序列
GAGGGAAGGGGCAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCC
SEQ ID NO：50 CD19-T2A蛋白序列
EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO：51 CD19-CSF2RA signal核酸序列
ATGCTGCTGCTCGTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCT
SEQ ID NO：52 CD19-CSF2RA signal蛋白序列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO：53 CD19-tEGFR核酸序列
CGTAAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACGCCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACATTCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCAAGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATTCGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACATTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTCGGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGTAAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCCCCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCGAATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTACCGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCACTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGGAAGTACG
CCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACGGCTGCACT
GGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTCCATCGCCAC
CGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGCATCGGTTTATT
CATG
SEQ ID NO：54CD19-tEGFR蛋白序列
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDI
LKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLK
EISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPE
GCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNIT
CTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCT
YGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
SEQ ID NO：55CD19-CD28z-CAR核酸序列
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCTCTGCTCCTCCCTCTGGCCCTGCTGCTCCATGCCGC
CAGACCCCAGGCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCTGAAGCCCCCAGGCAG
AGGGTCACCATCTCCTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAATAATGCTGTAA
GCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAAAGGCTCCCAAACTCCTCATCTATTATGATGA
TCTGCTCCCCTCAGGGGTCTCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAG
CCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGC
AGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTCAC
CGTCCTAGGTGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTG
AAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGG
TGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTG
ACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGA
CAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACC
GCCATGTATTACTGTGCGCGCCTGTCTTACTCTTGGTCTTCTTGGTACTGGGATTT
CTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTCGTGCCCGTGTTCCTGCCCG
CCAAACCTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGC
CAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCC
GTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCTCTGG
CCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCA
CCGGAACAGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGAC
CCCAAGACGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCAGA
GACTTCGCCGCCTACCGGTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCCCCTG
CCTACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGG
AAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCCGAGATGGGCGGA
AAGCCCAGACGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGAC
AAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGCGG
CAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTA
CGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAGGATCCGGAGAGGGAAGGGG
CAGCTTATTAACATGTGGCGATGTGGAAGAGAACCCCGGTCCCATGCTGCTGCTC
GTGACCTCTTTACTGTTATGTGAGCTGCCCCACCCCGCTTTTTTACTGATCCCTCGT
AAGGTGTGTAACGGAATCGGCATTGGCGAGTTCAAGGACTCTTTAAGCATCAACG
CCACAAACATCAAGCACTTCAAGAATTGTACCTCCATCAGCGGCGATTTACACAT
TCTCCCCGTGGCTTTTCGTGGCGATTCCTTCACCCACACCCCCCCTCTGGACCCCC
AAGAGCTGGACATTTTAAAAACCGTGAAGGAGATCACCGGCTTTCTGCTGATCCA
AGCTTGGCCCGAGAATCGTACCGACCTCCACGCCTTCGAGAATTTAGAGATTATT
CGTGGAAGGACCAAGCAGCACGGCCAGTTCTCTTTAGCCGTCGTGTCTTTAAACA
TTACCAGCCTCGGTTTAAGGTCTTTAAAGGAGATTAGCGACGGCGACGTGATCAT
CTCCGGCAACAAGAACCTCTGCTACGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTC
GGAACCAGCGGCCAAAAGACCAAGATCATCAGCAATCGTGGAGAGAACTCTTGT
AAGGCCACTGGTCAAGTTTGCCACGCCCTCTGTAGCCCCGAAGGATGTTGGGGCC
CCGAGCCTAGGGACTGTGTTAGCTGCAGAAACGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTG
TGGACAAATGCAATTTACTGGAAGGAGAGCCTAGGGAGTTCGTGGAGAACAGCG
AATGTATCCAGTGCCACCCCGAGTGTTTACCTCAAGCCATGAACATCACTTGTAC
CGGAAGGGGCCCCGATAACTGCATCCAATGCGCCCACTACATCGACGGACCCCA
CTGCGTGAAAACTTGTCCCGCCGGAGTGATGGGAGAGAATAACACTTTAGTGTGG
AAGTACGCCGACGCTGGCCACGTCTGCCATCTGTGCCACCCCAACTGTACCTACG
GCTGCACTGGTCCCGGTTTAGAGGGATGTCCTACCAACGGCCCCAAGATCCCCTC
CATCGCCACCGGAATGGTGGGCGCTCTGTTATTACTGCTGGTGGTGGCTCTGGGC
ATCGGTTTATTCATGTGASEQ ID NO：56CD19-CD28z-CAR蛋白序列
MALPVTALLLPLALLLHAARPQAVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVSWYQ
QLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSL
NGWVFGGGTKVTVLGGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG
YSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWS
SLKASDTAMYYCARLSYSWSSWYWDFWGQGTLVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPT
PAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN
HRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAY
QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA
EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCG
DVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCT
SISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENL
EIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGT
SGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCN
LLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAG
VMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM*
此处*代表蛋白终止
SEQ ID NO：57CD5-Ab20001-61-VH核酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTG
AAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAGCTGGGT
GCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCCTACAAT
GGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGAC
ACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGACACGG
CCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGGTCAAG
GTACTCTGGTGACCGTCTCCTCASEQ ID NO：58CD5-Ab20001-61-VH蛋白序列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNG
DTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTAVYYCARYESMSGQDIWGQGT
LVTVSSSEQ ID NO：59CD5-Ab20001-42-VH核酸序列
GAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGC
GTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCATAGCGCCATGGGTTGGGTT
CGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGCATCTATGCCCGCGGCG
GCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATAACA
GCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTG
TATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTTTCTCAGGATGTTTGGGGT
CAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCASEQ ID NO：60CD5-Ab20001-42-VH蛋白序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGG
YTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVW
GQGTLVTVSSSEQ ID NO：61CD5-Linker1核酸序列
GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCC
SEQ ID NO：62CD5-Linker1蛋白序列
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：63 CD5-CD8a核酸序列
TTTGTGCCTGTATTTCTGCCTGCCAAGCCCACCACAACACCTGCCCCTAGACCACCCACCCCTGCCCCCACCATTGCTTCTCAGCCCCTTAGCTTAAGACCTGAAGCCTGTAGACCTGCTGCTGGGGGGGCTGTGCACACAAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTACTACTACCCCTGCACCTAGGCCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCTCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAACCACAGAAAC
SEQ ID NO：64 CD5-CD8a蛋白序列
FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN
SEQ ID NO：65 CD5-CD28胞内结构域(IC)核酸序列
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
SEQ ID NO：66 CD5-CD28胞内结构域(IC)蛋白序列
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO：67 CD5-CD3z胞内信号结构域核酸序列
AGAGTGAAGTTCAGCAGATCTGCTGATGCCCCTGCCTATCAGCAAGGGCAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGCAGAAGAGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCTGAGATGGGGGGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAGGGGGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCATGATGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTACACATGCAAGCTCTGCCTCCTAGA
SEQ ID NO：68 CD5-CD3z胞内信号结构域蛋白序列
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO：69 CD5-T2A核酸序列
GAAGGAAGGGGCAGCCTACTGACCTGTGGGGATGTGGAGGAGAACCCTGGCCCC
SEQ ID NO：70 CD5-T2A蛋白序列
EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO：71 CD5-CSF2RA signal核酸序列
ATGTTGCTATTAGTAACCAGCCTGCTGCTGTGTGAGCTGCCCCACCCTGCCTTCCTGTTAATCCCA
SEQ ID NO：72 CD5-CSF2RA signal蛋白序列
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP
SEQ ID NO：73 CD5-tEGFR核酸序列
CGAAAGGTATGTAATGGCATTGGCATTGGGGAGTTTAAGGACAGCCTGAGCATCAATGCCACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACAAGCATCAGTGGGGACTTGCACATCCTGCCTGTGGCCTTCAGAGGGGACAGCTTCACCCACACCCCCCCCCTGGACCCCCAAGAGCTGGACATCCTGAAGACAGTGAAGGAGATCACTGGCTTCTTGCTGATCCAAGCCTGGCCTGAGAACAGAACAGACCTGCATGCCTTTGAGAACCTGGAGATCATCAGAGGCAGAACCAAGCAGCATGGGCAGTTCAGCCTGGCTGTGGTGAGCCTGAACATCACAAGCCTGGGCCTGAGAAGCTTAAAGGAGATCTCTGATGGGGATGTGATCATCTCTGGCAACAAGAACCTGTGCTATGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGGCAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGGGAGAACTCCTGTAAGGCCACTGGCCAAGTGTGTCATGCCCTATGCAGCCCTGAGGGGTGCTGGGGCCCTGAGCCTAGAGACTGTGTGAGCTGCAGAAATGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTGTGGACAAGTGCAACCTGCTGGAGGGGGAGCCTAGAGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGTATTCAGTGTCATCCTGAGTGCCTGCCCCAAGCCATGAACATCACCTGCACTGGCAGAGGCCCTGACAACTGCATTCAGTGTGCCCACTACATTGATGGCCCCCACTGTGTGAAGACCTGCCCTGCTGGGGTGATGGGGGAGAACAACACCCTGGTGTGGAAGTATGCTGATGCTGGCCATGTGTGTCACCTGTGCCATCCCAACTGCACCTATGGCTGCACTGGCCCTGGCCTGGAGGGCTGCCCCACCAATGGTCCCAAGATTCCTAGCATTGCCACTGGCATGGTGGGGGCCCTGCTCCTACTTCTGGTGGTTGCCCTGGGCATTGGCCTGTTCATG
SEQ ID NO：74CD5-tEGFR蛋白序列
RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDI
LKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLK
EISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPE
GCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNIT
CTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCT
YGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
SEQ ID NO：75CD5-VHH-CD28z-CAR核酸序列
ATGGCCCTACCTGTGACAGCCCTACTGTTACCCCTGGCCCTCCTTCTGCATGCTGCT
AGACCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCC
TCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAACTATGCTATCAG
CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCC
TACAATGGTGACACAAAATATGCACAGAGGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCA
CAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAACCTAAGATCTGACGA
CACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGCTACGAATCTATGTCTGGTCAGGATATCTGGGG
TCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCAGGGGGGGGGGGCTCTGGGGGGGGTGGC
TCAGGTGGCGGTGGCTCTGAAGTTCAGCTGCTGGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTC
AGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTACCTTTAGCCAT
AGCGCCATGGGTTGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCA
GCATCTATGCCCGCGGCGGCTATACCTATTATGCAGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTA
CCATTAGCCGTGATAACAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGT
GCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCGCGCGGTTACCATCTGGAATACATGGTT
TCTCAGGATGTTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCATTTGTGCCTGTA
TTTCTGCCTGCCAAGCCCACCACAACACCTGCCCCTAGACCACCCACCCCTGCCCC
CACCATTGCTTCTCAGCCCCTTAGCTTAAGACCTGAAGCCTGTAGACCTGCTGCTG
GGGGGGCTGTGCACACAAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGACATCTACATCTGGGC
CCCCCTGGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACT
GCAACCACAGAAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGA
ACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCA
CCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCTGCTGATGC
CCCTGCCTATCAGCAAGGGCAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGCAGA
AGAGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCTGAGATGGGG
GGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAG
GACAAGATGGCTGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAGGGGGAGAGAAGAAGA
GGCAAGGGCCATGATGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCT
ATGATGCCCTACACATGCAAGCTCTGCCTCCTAGAGGCTCTGGGGAAGGAAGGGG
CAGCCTACTGACCTGTGGGGATGTGGAGGAGAACCCTGGCCCCATGTTGCTATTAG
TAACCAGCCTGCTGCTGTGTGAGCTGCCCCACCCTGCCTTCCTGTTAATCCCACGA
AAGGTATGTAATGGCATTGGCATTGGGGAGTTTAAGGACAGCCTGAGCATCAATGC
CACCAACATCAAGCACTTCAAGAACTGCACAAGCATCAGTGGGGACTTGCACATC
CTGCCTGTGGCCTTCAGAGGGGACAGCTTCACCCACACCCCCCCCCTGGACCCCC
AAGAGCTGGACATCCTGAAGACAGTGAAGGAGATCACTGGCTTCTTGCTGATCCA
AGCCTGGCCTGAGAACAGAACAGACCTGCATGCCTTTGAGAACCTGGAGATCATC
AGAGGCAGAACCAAGCAGCATGGGCAGTTCAGCCTGGCTGTGGTGAGCCTGAAC
ATCACAAGCCTGGGCCTGAGAAGCTTAAAGGAGATCTCTGATGGGGATGTGATCAT
CTCTGGCAACAAGAACCTGTGCTATGCCAACACCATCAACTGGAAGAAGCTGTTT
GGCACCTCTGGGCAGAAGACCAAGATCATCAGCAACAGAGGGGAGAACTCCTGT
AAGGCCACTGGCCAAGTGTGTCATGCCCTATGCAGCCCTGAGGGGTGCTGGGGCC
CTGAGCCTAGAGACTGTGTGAGCTGCAGAAATGTGAGCAGAGGCAGAGAGTGTG
TGGACAAGTGCAACCTGCTGGAGGGGGAGCCTAGAGAGTTTGTGGAGAACTCTG
AGTGTATTCAGTGTCATCCTGAGTGCCTGCCCCAAGCCATGAACATCACCTGCACT
GGCAGAGGCCCTGACAACTGCATTCAGTGTGCCCACTACATTGATGGCCCCCACTG
TGTGAAGACCTGCCCTGCTGGGGTGATGGGGGAGAACAACACCCTGGTGTGGAA
GTATGCTGATGCTGGCCATGTGTGTCACCTGTGCCATCCCAACTGCACCTATGGCTG
CACTGGCCCTGGCCTGGAGGGCTGCCCCACCAATGGTCCCAAGATTCCTAGCATTG
CCACTGGCATGGTGGGGGCCCTGCTCCTACTTCTGGTGGTTGCCCTGGGCATTGGC
CTGTTCATGTGA
SEQ ID NO：76CD5-VHH-CD28z-CAR蛋白序列
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYAISW
VRQAPGQGLEWMGWISAYNGDTKYAQRLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRNLRSDDTA
VYYCARYESMSGQDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPG
GSLRLSCAASGFTFSHSAMGWVRQAPGKGLEWVSSIYARGGYTYYADSVKGRFTISR
DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYHLEYMVSQDVWGQGTLVTVSSFVPVFLP
AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG
VLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSR
VKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEG
LYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRG
SGEGRGSLLTCGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSI
NATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPE
NRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYA
NTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNV
SRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYID
GPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM*
此处*代表蛋白终止
SEQ ID NO：77BCMA-CAR核酸序列
tacccatacgatgttccagattacgctgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatca
cttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcat
ccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaa
gattttgcaacttactactgtcagcaaaaatacgacctcctcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaaggcagcaccagcgg
ctccggcaagcctggctctggcgagggcagcacaaagggacagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcg
gagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaa
ggggctggagtggattgggagtatctcctatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagaca
cgtccaagaaccagttctccctgaagctgagttctgtgaccgccgcagacacggcggtgtactactgcgccagagatcgtggagaca
ccatactagacgtatggggtcagggtacaatggtcaccgtcagctcattcgtgcccgtgttcctgcccgccaaacctaccaccacccct
gcccctagacctcccaccccagccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgcggcccgaagcctgtagacctgctgccggcgga
gccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagcc
tggtgatcaccctgtactgcaaccaccggaacagaagcaagcggagccggctgctgcacagcgactacatgaacatgaccccaaga
cggcctggccccacccggaagcactaccagccttacgcccctcccagagacttcgccgcctaccggtccagagtgaagttcagcag
atccgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtg
ctggacaagcggagaggccgggaccccgagatgggcggaaagcccagacggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaact
gcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgcggcaagggccacgatggcctgt
accagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccagaSEQ ID NO：78BCMA-CAR蛋白序列
YPYDVPDYADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY
AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIKGS
TSGSGKPGSGEGSTKGQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPP
GKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
此处*代表蛋白终止
SEQ ID NO：79 hIL7的氨基酸序列
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
SEQ ID NO：80 CCL19的氨基酸序列
MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS
SEQ ID NO：81 IL2RB-CD3z的氨基酸序列
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAYRHQALPPR
SEQ ID NO：82 IL7RaMut的氨基酸序列
MTILGTTFGMVFSLLQVVSGESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
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tctacatcat cactgaatac a 21
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ctacatcatc actgaataca 20
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tcactgaata catggagaa 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-sgRNA16-18nt 靶DNA序列
<400> 8
cactgaatac atggagaa 18
<210> 9
<211> 509
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-T316I突变蛋白序列
<400> 9
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1 5 10 15
Ile Asp Val Cys Glu Asn Cys His Tyr Pro Ile Val Pro Leu Asp Gly
20 25 30
Lys Gly Thr Leu Leu Ile Arg Asn Gly Ser Glu Val Arg Asp Pro Leu
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50 55 60
Leu Val Ile Ala Leu His Ser Tyr Glu Pro Ser His Asp Gly Asp Leu
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Gly Phe Glu Lys Gly Glu Gln Leu Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu
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Trp Trp Lys Ala Gln Ser Leu Thr Thr Gly Gln Glu Gly Phe Ile Pro
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Phe Asn Phe Val Ala Lys Ala Asn Ser Leu Glu Pro Glu Pro Trp Phe
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Phe Lys Asn Leu Ser Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ala Pro
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Gly Asn Thr His Gly Ser Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Thr Ala
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Gly Ser Phe Ser Leu Ser Val Arg Asp Phe Asp Gln Asn Gln Gly Glu
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Val Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Asn Leu Asp Asn Gly Gly Phe Tyr
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Arg Glu Thr Leu Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Gly Gln Phe
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260 265 270
Lys Ser Leu Lys Gln Gly Ser Met Ser Pro Asp Ala Phe Leu Ala Glu
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305 310 315 320
Asn Gly Ser Leu Val Asp Phe Leu Lys Thr Pro Ser Gly Ile Lys Leu
325 330 335
Thr Ile Asn Lys Leu Leu Asp Met Ala Ala Gln Ile Ala Glu Gly Met
340 345 350
Ala Phe Ile Glu Glu Arg Asn Tyr Ile His Arg Asp Leu Arg Ala Ala
355 360 365
Asn Ile Leu Val Ser Asp Thr Leu Ser Cys Lys Ile Ala Asp Phe Gly
370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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465 470 475 480
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485 490 495
Phe Phe Thr Ala Thr Glu Gly Gln Tyr Gln Pro Gln Pro
500 505
<210> 10
<211> 509
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-T316A突变蛋白序列
<400> 10
Met Gly Cys Gly Cys Ser Ser His Pro Glu Asp Asp Trp Met Glu Asn
1 5 10 15
Ile Asp Val Cys Glu Asn Cys His Tyr Pro Ile Val Pro Leu Asp Gly
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35 40 45
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Gly Phe Glu Lys Gly Glu Gln Leu Arg Ile Leu Glu Gln Ser Gly Glu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Ser Phe Ser Leu Ser Val Arg Asp Phe Asp Gln Asn Gln Gly Glu
165 170 175
Val Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Asn Leu Asp Asn Gly Gly Phe Tyr
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225 230 235 240
Pro Arg Glu Thr Leu Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Gly Gln Phe
245 250 255
Gly Glu Val Trp Met Gly Tyr Tyr Asn Gly His Thr Lys Val Ala Val
260 265 270
Lys Ser Leu Lys Gln Gly Ser Met Ser Pro Asp Ala Phe Leu Ala Glu
275 280 285
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305 310 315 320
Asn Gly Ser Leu Val Asp Phe Leu Lys Thr Pro Ser Gly Ile Lys Leu
325 330 335
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355 360 365
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500 505
<210> 11
<211> 509
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-T316M突变蛋白序列
<400> 11
Met Gly Cys Gly Cys Ser Ser His Pro Glu Asp Asp Trp Met Glu Asn
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Ile Asp Val Cys Glu Asn Cys His Tyr Pro Ile Val Pro Leu Asp Gly
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35 40 45
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Pro Arg Glu Thr Leu Lys Leu Val Glu Arg Leu Gly Ala Gly Gln Phe
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Gly Glu Val Trp Met Gly Tyr Tyr Asn Gly His Thr Lys Val Ala Val
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Lys Ser Leu Lys Gln Gly Ser Met Ser Pro Asp Ala Phe Leu Ala Glu
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Ala Asn Leu Met Lys Gln Leu Gln His Gln Arg Leu Val Arg Leu Tyr
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Asn Gly Ser Leu Val Asp Phe Leu Lys Thr Pro Ser Gly Ile Lys Leu
325 330 335
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340 345 350
Ala Phe Ile Glu Glu Arg Asn Tyr Ile His Arg Asp Leu Arg Ala Ala
355 360 365
Asn Ile Leu Val Ser Asp Thr Leu Ser Cys Lys Ile Ala Asp Phe Gly
370 375 380
Leu Ala Arg Leu Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Glu Gly Ala
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405 410 415
Phe Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Thr Glu
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435 440 445
Val Ile Gln Asn Leu Glu Arg Gly Tyr Arg Met Val Arg Pro Asp Asn
450 455 460
Cys Pro Glu Glu Leu Tyr Gln Leu Met Arg Leu Cys Trp Lys Glu Arg
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500 505
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-saCas9-sgRNA1靶DNA序列
<400> 12
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<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-saCas9-sgRNA2靶DNA序列
<400> 13
atcactgaat acatggagaa tg 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-sgRNA1 靶DNA序列
<400> 14
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<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-sgRNA11 靶DNA序列
<400> 15
gctctacgct gtggtcaccc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-sgRNA8 靶DNA序列
<400> 16
gtattcagtg atgatgtaga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-sgRNA9 靶DNA序列
<400> 17
tattcagtga tgatgtagat 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LCK-sgRNA12 靶DNA序列
<400> 18
ctacatcatc actgaataca 20
<210> 19
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316I-for-sgRNA8 作为修复模板的DNA序列
<400> 19
acgccttcct ggccgaggcc aacctcatga agcagctgca acaccagcgg ctggttcggc 60
tctacgctgt ggtcacccag gagcccatct acatcatcat tgaatacatg gagaatggtg 120
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316I-for-sgRNA9 作为修复模板的DNA序列
<400> 20
gacgccttcc tggccgaggc caacctcatg aagcagctgc aacaccagcg gctggttcgg 60
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316I-for-sgRNA12 作为修复模板的DNA序列
<400> 21
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<210> 22
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316M-for-sgRNA8 作为修复模板的DNA序列
<400> 22
acgccttcct ggccgaggcc aacctcatga agcagctgca acaccagcgg ctggttcggc 60
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<210> 23
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316M-for-sgRNA9 作为修复模板的DNA序列
<400> 23
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gggtgctacc cgagt 135
<210> 24
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316M-for-sgRNA12 作为修复模板的DNA序列
<400> 24
aaaaggtgta tttccaccct ctggcaggga cagcagggag agcagtatcc cctggtagcc 60
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<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316A-for-sgRNA8 作为修复模板的DNA序列
<400> 25
acgccttcct ggccgaggcc aacctcatga agcagctgca acaccagcgg ctggttcggc 60
tctacgctgt ggtcacccag gagcccatct acatcatcgc cgaatacatg gagaatggtg 120
ggtgctaccc gagtc 135
<210> 26
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316A-for-sgRNA9 作为修复模板的DNA序列
<400> 26
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gggtgctacc cgagt 135
<210> 27
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316A-for-sgRNA12 作为修复模板的DNA序列
<400> 27
aaaaggtgta tttccaccct ctggcaggga cagcagggag agcagtatcc cctggtagcc 60
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316I-for-sgRNA1+sgRNA11 作为修复模板的DNA序列
<400> 28
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accctctggc agggacagca gggagagcag tatcccctgg tagccgactc gggtagcacc 120
caccattctc catgtattca atgatgatgt agatgggctc ctgggtgacc acagcgtaga 180
gccgaaccag ccgctggtgt tgcagctgct tcatgaggtt ggcctcggcc aggaaggcgt 240
ccggggacat gctgccctgc ttcag 265
<210> 29
<211> 265
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316M-for-sgRNA1+sgRNA11 作为修复模板的DNA序列
<400> 29
aggaaagctc aagaaaccct ccttgcttga gctttgggcc agaagaaaag gtgtatttcc 60
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ccggggacat gctgccctgc ttcag 265
<210> 30
<211> 265
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316A-for-sgRNA1+sgRNA11 作为修复模板的DNA序列
<400> 30
aggaaagctc aagaaaccct ccttgcttga gctttgggcc agaagaaaag gtgtatttcc 60
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caccattctc catgtattcc gggatgatgt agatgggctc ctgggtgacc acagcgtaga 180
gccgaaccag ccgctggtgt tgcagctgct tcatgaggtt ggcctcggcc aggaaggcgt 240
ccggggacat gctgccctgc ttcag 265
<210> 31
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316I-for-sgRNA1+sgRNA12 作为修复模板的DNA序列
<400> 31
aggaaagctc aagaaaccct ccttgcttga gctttgggcc agaagaaaag gtgtatttcc 60
accctctggc agggacagca gggagagcag tatcccctgg tagccgactc gggtagcacc 120
caccattctc catgtattca atgatgatgt agatgggctc ctgggtgacc acagcgtaga 180
gccgaaccag ccgctggtgt tgcagctgct tcatgaggtt ggcctcggcc aggaa 235
<210> 32
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316M-for-sgRNA1+sgRNA12 作为修复模板的DNA序列
<400> 32
aggaaagctc aagaaaccct ccttgcttga gctttgggcc agaagaaaag gtgtatttcc 60
accctctggc agggacagca gggagagcag tatcccctgg tagccgactc gggtagcacc 120
caccattctc catgtattcc atgatgatgt agatgggctc ctgggtgacc acagcgtaga 180
gccgaaccag ccgctggtgt tgcagctgct tcatgaggtt ggcctcggcc aggaa 235
<210> 33
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ssDNA-T316A-for-sgRNA1+sgRNA12 作为修复模板的DNA序列
<400> 33
aggaaagctc aagaaaccct ccttgcttga gctttgggcc agaagaaaag gtgtatttcc 60
accctctggc agggacagca gggagagcag tatcccctgg tagccgactc gggtagcacc 120
caccattctc catgtattcc gggatgatgt agatgggctc ctgggtgacc acagcgtaga 180
gccgaaccag ccgctggtgt tgcagctgct tcatgaggtt ggcctcggcc aggaa 235
<210> 34
<211> 1690
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 34
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1 5 10 15
Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr
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Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met
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Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala
180 185 190
Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser
195 200 205
Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala
210 215 220
Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys
225 230 235 240
Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser
245 250 255
Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr
260 265 270
Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg
275 280 285
Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met
290 295 300
Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu
305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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450 455 460
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465 470 475 480
Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile
485 490 495
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595 600 605
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610 615 620
Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln
625 630 635 640
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645 650 655
Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly
660 665 670
Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr
675 680 685
Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser
690 695 700
Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys
705 710 715 720
Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn
725 730 735
Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala
740 745 750
Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys
755 760 765
Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys
770 775 780
Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg
785 790 795 800
Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys
805 810 815
Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp
820 825 830
Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu
835 840 845
Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln
850 855 860
Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu
865 870 875 880
Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe
885 890 895
Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His
900 905 910
Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser
915 920 925
Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser
930 935 940
Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu
945 950 955 960
Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu
965 970 975
Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg
980 985 990
Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln
995 1000 1005
Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
1010 1015 1020
Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val
1025 1030 1035
Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp
1040 1045 1050
His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn
1055 1060 1065
Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn
1070 1075 1080
Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg
1085 1090 1095
Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn
1100 1105 1110
Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala
1115 1120 1125
Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
1130 1135 1140
His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
1145 1150 1155
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys
1160 1165 1170
Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys
1175 1180 1185
Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu
1190 1195 1200
Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu
1205 1210 1215
Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg
1220 1225 1230
Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala
1235 1240 1245
Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu
1250 1255 1260
Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu
1265 1270 1275
Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp
1280 1285 1290
Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile
1295 1300 1305
Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser
1310 1315 1320
Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys
1325 1330 1335
Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val
1340 1345 1350
Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser
1355 1360 1365
Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met
1370 1375 1380
Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala
1385 1390 1395
Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro
1400 1405 1410
Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu
1415 1420 1425
Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro
1430 1435 1440
Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys
1445 1450 1455
Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val
1460 1465 1470
Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser
1475 1480 1485
Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys
1490 1495 1500
Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu
1505 1510 1515
Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly
1520 1525 1530
Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys
1535 1540 1545
Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His
1550 1555 1560
Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln
1565 1570 1575
Leu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile
1580 1585 1590
Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu
1595 1600 1605
Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile Gly Asn Lys Pro Glu
1610 1615 1620
Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp Glu
1625 1630 1635
Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp
1640 1645 1650
Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys Met
1655 1660 1665
Leu Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His His His
1670 1675 1680
His His His His His His His
1685 1690
<210> 35
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-78 VL核酸序列
<400> 35
caggctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctgaagccc ccaggcagag ggtcaccatc 60
tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg taagctggta ccagcagctc 120
ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat tatgatgatc tgctcccctc aggggtctct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaaggt caccgtccta ggt 333
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-78 VL蛋白序列
<400> 36
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 37
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-78 VH核酸序列
<400> 37
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gcgcctgtct 300
tactcttggt cttcttggta ctgggatttc tggggtcaag gtactctggt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 38
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-78 VH蛋白序列
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Trp Tyr Trp Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-Linker1 核酸序列
<400> 39
ggtggtggtg gtagcggcgg cggcggctct ggtggtggtg gatcc 45
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-Linker1 蛋白序列
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD8a hinge核酸序列
<400> 41
actactaccc ctgcacctag gcctcccacc ccagccccaa caatcgccag ccagcctctg 60
tctctgcggc ccgaagcctg tagacctgct gccggcggag ccgtgcacac cagaggcctg 120
gacttcgcct gcgac 135
<210> 42
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD8a hinge蛋白序列
<400> 42
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 43
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD8a TM核酸序列
<400> 43
atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtgatc 60
accctgtact gc 72
<210> 44
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD8a TM蛋白序列
<400> 44
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 45
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD28胞内结构域(IC)核酸序列
<400> 45
agaagcaagc ggagccggct gctgcacagc gactacatga acatgacccc aagacggcct 60
ggccccaccc ggaagcacta ccagccttac gcccctccca gagacttcgc cgcctaccgg 120
tcc 123
<210> 46
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD28胞内结构域(IC)蛋白序列
<400> 46
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 47
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD3z胞内信号结构域核酸序列
<400> 47
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
cgggaccccg agatgggcgg aaagcccaga cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
aggcgcggca agggccacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 336
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD3z胞内信号结构域蛋白序列
<400> 48
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 49
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-T2A核酸序列
<400> 49
gagggaaggg gcagcttatt aacatgtggc gatgtggaag agaaccccgg tccc 54
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-T2A蛋白序列
<400> 50
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 51
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CSF2RA signal核酸序列
<400> 51
atgctgctgc tcgtgacctc tttactgtta tgtgagctgc cccaccccgc ttttttactg 60
atccct 66
<210> 52
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CSF2RA signal蛋白序列
<400> 52
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 53
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-tEGFR核酸序列
<400> 53
cgtaaggtgt gtaacggaat cggcattggc gagttcaagg actctttaag catcaacgcc 60
acaaacatca agcacttcaa gaattgtacc tccatcagcg gcgatttaca cattctcccc 120
gtggcttttc gtggcgattc cttcacccac accccccctc tggaccccca agagctggac 180
attttaaaaa ccgtgaagga gatcaccggc tttctgctga tccaagcttg gcccgagaat 240
cgtaccgacc tccacgcctt cgagaattta gagattattc gtggaaggac caagcagcac 300
ggccagttct ctttagccgt cgtgtcttta aacattacca gcctcggttt aaggtcttta 360
aaggagatta gcgacggcga cgtgatcatc tccggcaaca agaacctctg ctacgccaac 420
accatcaact ggaagaagct gttcggaacc agcggccaaa agaccaagat catcagcaat 480
cgtggagaga actcttgtaa ggccactggt caagtttgcc acgccctctg tagccccgaa 540
ggatgttggg gccccgagcc tagggactgt gttagctgca gaaacgtgag cagaggcaga 600
gagtgtgtgg acaaatgcaa tttactggaa ggagagccta gggagttcgt ggagaacagc 660
gaatgtatcc agtgccaccc cgagtgttta cctcaagcca tgaacatcac ttgtaccgga 720
aggggccccg ataactgcat ccaatgcgcc cactacatcg acggacccca ctgcgtgaaa 780
acttgtcccg ccggagtgat gggagagaat aacactttag tgtggaagta cgccgacgct 840
ggccacgtct gccatctgtg ccaccccaac tgtacctacg gctgcactgg tcccggttta 900
gagggatgtc ctaccaacgg ccccaagatc ccctccatcg ccaccggaat ggtgggcgct 960
ctgttattac tgctggtggt ggctctgggc atcggtttat tcatg 1005
<210> 54
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-tEGFR蛋白序列
<400> 54
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 55
<211> 2649
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD28z-CAR核酸序列
<400> 55
atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60
ccccaggctg tgctgactca gccaccctcg gtgtctgaag cccccaggca gagggtcacc 120
atctcctgtt ctggaagcag ctccaacatc ggaaataatg ctgtaagctg gtaccagcag 180
ctcccaggaa aggctcccaa actcctcatc tattatgatg atctgctccc ctcaggggtc 240
tctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 300
cagtctgagg atgaggctga ttattactgt gcagcatggg atgacagcct gaatggttgg 360
gtgttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtggtg gtggtggtag cggcggcggc 420
ggctctggtg gtggtggatc cgaggtgcag ctggtgcagt ctggagcaga ggtgaaaaag 480
cccggggagt ctctgaagat ctcctgtaag ggttctggat acagctttac cagctactgg 540
atcggctggg tgcgccagat gcccgggaaa ggcctggagt ggatggggat catctatcct 600
ggtgactctg ataccagata cagcccgtcc ttccaaggcc aggtcaccat ctcagccgac 660
aagtccatca gcaccgccta cctgcagtgg agcagcctga aggcctcgga caccgccatg 720
tattactgtg cgcgcctgtc ttactcttgg tcttcttggt actgggattt ctggggtcaa 780
ggtactctgg tgaccgtctc ctcattcgtg cccgtgttcc tgcccgccaa acctactact 840
acccctgcac ctaggcctcc caccccagcc ccaacaatcg ccagccagcc tctgtctctg 900
cggcccgaag cctgtagacc tgctgccggc ggagccgtgc acaccagagg cctggacttc 960
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 1020
ctggtgatca ccctgtactg caaccaccgg aacagaagca agcggagccg gctgctgcac 1080
agcgactaca tgaacatgac cccaagacgg cctggcccca cccggaagca ctaccagcct 1140
tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac cggtccagag tgaagttcag cagatccgcc 1200
gacgcccctg cctaccagca gggacagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1260
cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg accccgagat gggcggaaag 1320
cccagacgga agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1380
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc gcggcaaggg ccacgatggc 1440
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gacacctacg acgccctgca catgcaggcc 1500
ctgcccccca gaggatccgg agagggaagg ggcagcttat taacatgtgg cgatgtggaa 1560
gagaaccccg gtcccatgct gctgctcgtg acctctttac tgttatgtga gctgccccac 1620
cccgcttttt tactgatccc tcgtaaggtg tgtaacggaa tcggcattgg cgagttcaag 1680
gactctttaa gcatcaacgc cacaaacatc aagcacttca agaattgtac ctccatcagc 1740
ggcgatttac acattctccc cgtggctttt cgtggcgatt ccttcaccca caccccccct 1800
ctggaccccc aagagctgga cattttaaaa accgtgaagg agatcaccgg ctttctgctg 1860
atccaagctt ggcccgagaa tcgtaccgac ctccacgcct tcgagaattt agagattatt 1920
cgtggaagga ccaagcagca cggccagttc tctttagccg tcgtgtcttt aaacattacc 1980
agcctcggtt taaggtcttt aaaggagatt agcgacggcg acgtgatcat ctccggcaac 2040
aagaacctct gctacgccaa caccatcaac tggaagaagc tgttcggaac cagcggccaa 2100
aagaccaaga tcatcagcaa tcgtggagag aactcttgta aggccactgg tcaagtttgc 2160
cacgccctct gtagccccga aggatgttgg ggccccgagc ctagggactg tgttagctgc 2220
agaaacgtga gcagaggcag agagtgtgtg gacaaatgca atttactgga aggagagcct 2280
agggagttcg tggagaacag cgaatgtatc cagtgccacc ccgagtgttt acctcaagcc 2340
atgaacatca cttgtaccgg aaggggcccc gataactgca tccaatgcgc ccactacatc 2400
gacggacccc actgcgtgaa aacttgtccc gccggagtga tgggagagaa taacacttta 2460
gtgtggaagt acgccgacgc tggccacgtc tgccatctgt gccaccccaa ctgtacctac 2520
ggctgcactg gtcccggttt agagggatgt cctaccaacg gccccaagat cccctccatc 2580
gccaccggaa tggtgggcgc tctgttatta ctgctggtgg tggctctggg catcggttta 2640
ttcatgtga 2649
<210> 56
<211> 882
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD19-CD28z-CAR蛋白序列
<400> 56
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser
20 25 30
Glu Ala Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser
35 40 45
Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala
100 105 110
Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
145 150 155 160
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
165 170 175
Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser
195 200 205
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
210 215 220
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Tyr Ser Trp Ser Ser Trp Tyr Trp Asp
245 250 255
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val
260 265 270
Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
275 280 285
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
290 295 300
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
305 310 315 320
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
325 330 335
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg
340 345 350
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
355 360 365
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
370 375 380
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
385 390 395 400
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
420 425 430
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
435 440 445
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
450 455 460
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
485 490 495
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser
500 505 510
Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu
515 520 525
Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu
530 535 540
Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys
545 550 555 560
Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys
565 570 575
Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly
580 585 590
Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile
595 600 605
Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp
610 615 620
Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile
625 630 635 640
Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser
645 650 655
Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp
660 665 670
Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr
675 680 685
Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile
690 695 700
Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys
705 710 715 720
His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp
725 730 735
Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys
740 745 750
Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu
755 760 765
Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr
770 775 780
Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile
785 790 795 800
Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu
805 810 815
Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His
820 825 830
Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu
835 840 845
Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met
850 855 860
Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu
865 870 875 880
Phe Met
<210> 57
<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-Ab20001-61-VH核酸序列
<400> 57
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc aactatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgcct acaatggtga cacaaaatat 180
gcacagaggc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240
atggagctga ggaacctaag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gcgctacgaa 300
tctatgtctg gtcaggatat ctggggtcaa ggtactctgg tgaccgtctc ctca 354
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-Ab20001-61-VH蛋白序列
<400> 58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Gln Arg Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Glu Ser Met Ser Gly Gln Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-Ab20001-42-VH核酸序列
<400> 59
gaagttcagc tgctggaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttagc catagcgcca tgggttgggt tcgtcaggca 120
cctggtaaag gtctggaatg ggttagcagc atctatgccc gcggcggcta tacctattat 180
gcagatagcg ttaaaggtcg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa taccctgtac 240
ctgcagatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc gcgcggttac 300
catctggaat acatggtttc tcaggatgtt tggggtcaag gtactctggt gaccgtctcc 360
tca 363
<210> 60
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-Ab20001-42-VH蛋白序列
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Ser
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Tyr Ala Arg Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr His Leu Glu Tyr Met Val Ser Gln Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 61
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-Linker1 核酸序列
<400> 61
ggtggtggtg gtagcggcgg cggcggctct ggtggtggtg gatcc 45
<210> 62
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-Linker1 蛋白序列
<400> 62
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 63
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CD8a核酸序列
<400> 63
tttgtgcctg tatttctgcc tgccaagccc accacaacac ctgcccctag accacccacc 60
cctgccccca ccattgcttc tcagcccctt agcttaagac ctgaagcctg tagacctgct 120
gctggggggg ctgtgcacac aagaggcctg gactttgcct gtactactac ccctgcacct 180
aggcctccca ccccagcccc aacaatcgcc agccagcctc tgtctctgcg gcccgaagcc 240
tgtagacctg ctgccggcgg agccgtgcac accagaggcc tggacttcgc ctgcgacatc 300
tacatctggg cccccctggc tggcacctgt ggggtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc 360
ctgtactgca accacagaaa c 381
<210> 64
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CD8a蛋白序列
<400> 64
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
50 55 60
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
65 70 75 80
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
85 90 95
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
100 105 110
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
115 120 125
<210> 65
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CD28胞内结构域(IC)核酸序列
<400> 65
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 66
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CD28胞内结构域(IC)蛋白序列
<400> 66
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 67
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CD3z胞内信号结构域核酸序列
<400> 67
agagtgaagt tcagcagatc tgctgatgcc cctgcctatc agcaagggca gaatcagctg 60
tacaatgagc tgaatctggg cagaagagag gagtatgatg tgctggacaa gagaagaggc 120
agagaccctg agatgggggg caagcctaga agaaagaacc cccaagaggg cctgtataat 180
gagctgcaga aggacaagat ggctgaggcc tactctgaga ttggcatgaa gggggagaga 240
agaagaggca agggccatga tggcctgtac caaggcctga gcacagccac caaggacacc 300
tatgatgccc tacacatgca agctctgcct cctaga 336
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CD3z胞内信号结构域蛋白序列
<400> 68
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 69
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-T2A核酸序列
<400> 69
gaaggaaggg gcagcctact gacctgtggg gatgtggagg agaaccctgg cccc 54
<210> 70
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-T2A蛋白序列
<400> 70
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 71
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CSF2RA signal核酸序列
<400> 71
atgttgctat tagtaaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccctgc cttcctgtta 60
atccca 66
<210> 72
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-CSF2RA signal蛋白序列
<400> 72
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 73
<211> 1005
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-tEGFR核酸序列
<400> 73
cgaaaggtat gtaatggcat tggcattggg gagtttaagg acagcctgag catcaatgcc 60
accaacatca agcacttcaa gaactgcaca agcatcagtg gggacttgca catcctgcct 120
gtggccttca gaggggacag cttcacccac accccccccc tggaccccca agagctggac 180
atcctgaaga cagtgaagga gatcactggc ttcttgctga tccaagcctg gcctgagaac 240
agaacagacc tgcatgcctt tgagaacctg gagatcatca gaggcagaac caagcagcat 300
gggcagttca gcctggctgt ggtgagcctg aacatcacaa gcctgggcct gagaagctta 360
aaggagatct ctgatgggga tgtgatcatc tctggcaaca agaacctgtg ctatgccaac 420
accatcaact ggaagaagct gtttggcacc tctgggcaga agaccaagat catcagcaac 480
agaggggaga actcctgtaa ggccactggc caagtgtgtc atgccctatg cagccctgag 540
gggtgctggg gccctgagcc tagagactgt gtgagctgca gaaatgtgag cagaggcaga 600
gagtgtgtgg acaagtgcaa cctgctggag ggggagccta gagagtttgt ggagaactct 660
gagtgtattc agtgtcatcc tgagtgcctg ccccaagcca tgaacatcac ctgcactggc 720
agaggccctg acaactgcat tcagtgtgcc cactacattg atggccccca ctgtgtgaag 780
acctgccctg ctggggtgat gggggagaac aacaccctgg tgtggaagta tgctgatgct 840
ggccatgtgt gtcacctgtg ccatcccaac tgcacctatg gctgcactgg ccctggcctg 900
gagggctgcc ccaccaatgg tcccaagatt cctagcattg ccactggcat ggtgggggcc 960
ctgctcctac ttctggtggt tgccctgggc attggcctgt tcatg 1005
<210> 74
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-tEGFR蛋白序列
<400> 74
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 75
<211> 2670
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-VHH-CD28z-CAR核酸序列
<400> 75
atggccctac ctgtgacagc cctactgtta cccctggccc tccttctgca tgctgctaga 60
cctcaggtgc agctggtgca gtctggggct gaggtgaaga agcctgggtc ctcggtgaag 120
gtctcctgca aggcttctgg aggcaccttc agcaactatg ctatcagctg ggtgcgacag 180
gcccctggac aagggcttga gtggatggga tggatcagcg cctacaatgg tgacacaaaa 240
tatgcacaga ggctccaggg cagagtcacc atgaccacag acacatccac gagcacagcc 300
tacatggagc tgaggaacct aagatctgac gacacggccg tgtattactg tgcgcgctac 360
gaatctatgt ctggtcagga tatctggggt caaggtactc tggtgaccgt ctcctcaggg 420
ggggggggct ctgggggggg tggctcaggt ggcggtggct ctgaagttca gctgctggaa 480
agcggtggtg gtctggttca gcctggtggt agcctgcgtc tgagctgtgc agcaagcggt 540
tttaccttta gccatagcgc catgggttgg gttcgtcagg cacctggtaa aggtctggaa 600
tgggttagca gcatctatgc ccgcggcggc tatacctatt atgcagatag cgttaaaggt 660
cgttttacca ttagccgtga taacagcaaa aataccctgt acctgcagat gaatagtctg 720
cgtgcagagg ataccgcagt gtattattgt gcgcgcggtt accatctgga atacatggtt 780
tctcaggatg tttggggtca aggtactctg gtgaccgtct cctcatttgt gcctgtattt 840
ctgcctgcca agcccaccac aacacctgcc cctagaccac ccacccctgc ccccaccatt 900
gcttctcagc cccttagctt aagacctgaa gcctgtagac ctgctgctgg gggggctgtg 960
cacacaagag gcctggactt tgcctgtgac atctacatct gggcccccct ggctggcacc 1020
tgtggggtgc tgctgctgag cctggtgatc accctgtact gcaaccacag aaacaggagt 1080
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1140
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1200
gtgaagttca gcagatctgc tgatgcccct gcctatcagc aagggcagaa tcagctgtac 1260
aatgagctga atctgggcag aagagaggag tatgatgtgc tggacaagag aagaggcaga 1320
gaccctgaga tggggggcaa gcctagaaga aagaaccccc aagagggcct gtataatgag 1380
ctgcagaagg acaagatggc tgaggcctac tctgagattg gcatgaaggg ggagagaaga 1440
agaggcaagg gccatgatgg cctgtaccaa ggcctgagca cagccaccaa ggacacctat 1500
gatgccctac acatgcaagc tctgcctcct agaggctctg gggaaggaag gggcagccta 1560
ctgacctgtg gggatgtgga ggagaaccct ggccccatgt tgctattagt aaccagcctg 1620
ctgctgtgtg agctgcccca ccctgccttc ctgttaatcc cacgaaaggt atgtaatggc 1680
attggcattg gggagtttaa ggacagcctg agcatcaatg ccaccaacat caagcacttc 1740
aagaactgca caagcatcag tggggacttg cacatcctgc ctgtggcctt cagaggggac 1800
agcttcaccc acaccccccc cctggacccc caagagctgg acatcctgaa gacagtgaag 1860
gagatcactg gcttcttgct gatccaagcc tggcctgaga acagaacaga cctgcatgcc 1920
tttgagaacc tggagatcat cagaggcaga accaagcagc atgggcagtt cagcctggct 1980
gtggtgagcc tgaacatcac aagcctgggc ctgagaagct taaaggagat ctctgatggg 2040
gatgtgatca tctctggcaa caagaacctg tgctatgcca acaccatcaa ctggaagaag 2100
ctgtttggca cctctgggca gaagaccaag atcatcagca acagagggga gaactcctgt 2160
aaggccactg gccaagtgtg tcatgcccta tgcagccctg aggggtgctg gggccctgag 2220
cctagagact gtgtgagctg cagaaatgtg agcagaggca gagagtgtgt ggacaagtgc 2280
aacctgctgg agggggagcc tagagagttt gtggagaact ctgagtgtat tcagtgtcat 2340
cctgagtgcc tgccccaagc catgaacatc acctgcactg gcagaggccc tgacaactgc 2400
attcagtgtg cccactacat tgatggcccc cactgtgtga agacctgccc tgctggggtg 2460
atgggggaga acaacaccct ggtgtggaag tatgctgatg ctggccatgt gtgtcacctg 2520
tgccatccca actgcaccta tggctgcact ggccctggcc tggagggctg ccccaccaat 2580
ggtcccaaga ttcctagcat tgccactggc atggtggggg ccctgctcct acttctggtg 2640
gttgccctgg gcattggcct gttcatgtga 2670
<210> 76
<211> 889
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CD5-VHH-CD28z-CAR蛋白序列
<400> 76
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly
35 40 45
Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asp Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Ala Gln Arg Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser
85 90 95
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Glu Ser Met Ser Gly Gln Asp Ile
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Ser Ala Met Gly Trp Val Arg
180 185 190
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Ala Arg
195 200 205
Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
210 215 220
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr His Leu
245 250 255
Glu Tyr Met Val Ser Gln Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr
275 280 285
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
290 295 300
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
305 310 315 320
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
325 330 335
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
340 345 350
Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
355 360 365
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
370 375 380
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
385 390 395 400
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
405 410 415
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
435 440 445
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
450 455 460
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
485 490 495
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly
500 505 510
Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
515 520 525
Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu
530 535 540
Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly
545 550 555 560
Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn
565 570 575
Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile
580 585 590
Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu
595 600 605
Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly
610 615 620
Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala
625 630 635 640
Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln
645 650 655
Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg
660 665 670
Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys
675 680 685
Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr
690 695 700
Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys
705 710 715 720
Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys
725 730 735
Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg
740 745 750
Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg
755 760 765
Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu
770 775 780
Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys
785 790 795 800
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
805 810 815
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
820 825 830
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
835 840 845
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile
850 855 860
Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val
865 870 875 880
Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
885
<210> 77
<211> 1464
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BCMA-CAR核酸序列
<400> 77
tacccatacg atgttccaga ttacgctgac atccagatga cccagtctcc atcctccctg 60
tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 120
tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgctgca 180
tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 240
actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcagcaaaaa 300
tacgacctcc tcacttttgg cggagggacc aaggttgaga tcaaaggcag caccagcggc 360
tccggcaagc ctggctctgg cgagggcagc acaaagggac agctgcagct gcaggagtcg 420
ggcccaggac tggtgaagcc ttcggagacc ctgtccctca cctgcactgt ctctggtggc 480
tccatcagca gtagtagtta ctactggggc tggatccgcc agcccccagg gaaggggctg 540
gagtggattg ggagtatctc ctatagtggg agcacctact acaacccgtc cctcaagagt 600
cgagtcacca tatccgtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagttctgtg 660
accgccgcag acacggcggt gtactactgc gccagagatc gtggagacac catactagac 720
gtatggggtc agggtacaat ggtcaccgtc agctcattcg tgcccgtgtt cctgcccgcc 780
aaacctacca ccacccctgc ccctagacct cccaccccag ccccaacaat cgccagccag 840
cctctgtctc tgcggcccga agcctgtaga cctgctgccg gcggagccgt gcacaccaga 900
ggcctggact tcgcctgcga catctacatc tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg 960
ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac tgcaaccacc ggaacagaag caagcggagc 1020
cggctgctgc acagcgacta catgaacatg accccaagac ggcctggccc cacccggaag 1080
cactaccagc cttacgcccc tcccagagac ttcgccgcct accggtccag agtgaagttc 1140
agcagatccg ccgacgcccc tgcctaccag cagggacaga accagctgta caacgagctg 1200
aacctgggca gacgggaaga gtacgacgtg ctggacaagc ggagaggccg ggaccccgag 1260
atgggcggaa agcccagacg gaagaacccc caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa 1320
gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcggag gcgcggcaag 1380
ggccacgatg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta cgacgccctg 1440
cacatgcagg ccctgccccc caga 1464
<210> 78
<211> 488
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> BCMA-CAR蛋白序列
<400> 78
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20 25 30
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys
35 40 45
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
50 55 60
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
65 70 75 80
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
100 105 110
Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
115 120 125
Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
130 135 140
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro
165 170 175
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
195 200 205
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp
225 230 235 240
Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val
245 250 255
Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
275 280 285
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
290 295 300
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
305 310 315 320
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg
325 330 335
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
340 345 350
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
355 360 365
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 79
<211> 177
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hIL7的氨基酸序列
<400> 79
Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe
50 55 60
Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe
65 70 75 80
Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser
85 90 95
Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr
100 105 110
Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu
130 135 140
Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu
145 150 155 160
Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu
165 170 175
His
<210> 80
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CCL19的氨基酸序列
<400> 80
Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser
20 25 30
Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr
35 40 45
Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr
50 55 60
Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg
85 90 95
Ser Ser
<210> 81
<211> 206
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IL2RB-CD3z的氨基酸序列
<400> 81
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val Arg Val
85 90 95
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
100 105 110
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
115 120 125
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
130 135 140
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
145 150 155 160
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
165 170 175
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
180 185 190
Asp Thr Tyr Asp Ala Tyr Arg His Gln Ala Leu Pro Pro Arg
195 200 205
<210> 82
<211> 462
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> IL7RaMut的氨基酸序列
<400> 82
Met Thr Ile Leu Gly Thr Thr Phe Gly Met Val Phe Ser Leu Leu Gln
1 5 10 15
Val Val Ser Gly Glu Ser Gly Tyr Ala Gln Asn Gly Asp Leu Glu Asp
20 25 30
Ala Glu Leu Asp Asp Tyr Ser Phe Ser Cys Tyr Ser Gln Leu Glu Val
35 40 45
Asn Gly Ser Gln His Ser Leu Thr Cys Ala Phe Glu Asp Pro Asp Val
50 55 60
Asn Ile Thr Asn Leu Glu Phe Glu Ile Cys Gly Ala Leu Val Glu Val
65 70 75 80
Lys Cys Leu Asn Phe Arg Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Phe Ile Glu Thr
85 90 95
Lys Lys Phe Leu Leu Ile Gly Lys Ser Asn Ile Cys Val Lys Val Gly
100 105 110
Glu Lys Ser Leu Thr Cys Lys Lys Ile Asp Leu Thr Thr Ile Val Lys
115 120 125
Pro Glu Ala Pro Phe Asp Leu Ser Val Val Tyr Arg Glu Gly Ala Asn
130 135 140
Asp Phe Val Val Thr Phe Asn Thr Ser His Leu Gln Lys Lys Tyr Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Met His Asp Val Ala Tyr Arg Gln Glu Lys Asp Glu Asn
165 170 175
Lys Trp Thr His Val Asn Leu Ser Ser Thr Lys Leu Thr Leu Leu Gln
180 185 190
Arg Lys Leu Gln Pro Ala Ala Met Tyr Glu Ile Lys Val Arg Ser Ile
195 200 205
Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Tyr
210 215 220
Tyr Phe Arg Thr Pro Glu Ile Asn Asn Ser Ser Gly Glu Met Asp Pro
225 230 235 240
Ile Leu Leu Thr Cys Pro Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val
245 250 255
Ala Leu Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys
260 265 270
Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His
275 280 285
Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu
290 295 300
Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg
305 310 315 320
Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu
325 330 335
Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys
340 345 350
Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile
370 375 380
Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser Gly Lys Asn Gly
385 390 395 400
Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser
405 410 415
Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn
420 425 430
Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln
435 440 445
Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
450 455 460

Claims (51)

1.在细胞的Lck基因中引入T316I突变的方法，包括向所述细胞中引入CBE碱基编辑器；
所述方法还包括向所述细胞中引入sgRNA，其中所述sgRNA包括SEQ ID NOs：5-8任一个所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述CBE碱基编辑器为A3A-CBE3融合蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为干细胞或免疫细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
7.表达嵌合抗原受体的细胞，其中所述细胞具有杀伤活性或经诱导而具有杀伤活性，并且所述细胞经改造而使得其杀伤活性对细胞活性抑制剂不敏感，其中所述改造是对LCK蛋白酪氨酸激酶的改造，改造后的LCK蛋白酪氨酸激酶具有T316I突变。
8.如权利要求7所述的细胞，其中所述细胞活性抑制剂为T细胞活性抑制剂。
9.如权利要求7所述的细胞，其中所述改造通过使用碱基编辑器完成。
10.如权利要求9所述的细胞，其中所述碱基编辑器为ABE或CBE碱基编辑器。
11.如权利要求7所述的细胞，其中所述T316I突变通过如下方式获得：向所述细胞中引入碱基编辑器CBE和sgRNA，所述sgRNA的靶序列包括SEQ ID NOs：5-8任一个所示的核苷酸序列。
12.如权利要求7所述的细胞，其中所述细胞中的LCK蛋白包括SEQ ID NOs：9任一个所示的氨基酸序列。
13.如权利要求7-12任一项所述的细胞，其中所述细胞为T细胞或NK细胞。
14.如权利要求13所述的细胞，其中所述细胞还经改造以消除或减弱经由其细胞表面TCR而产生的细胞杀伤活性。
15.如权利要求13所述的细胞，其中所述细胞的TCR相关基因被敲除。
16.如权利要求13所述的细胞，其中所述细胞的TRAC基因被敲除。
17.如权利要求13所述的细胞，其中所述细胞的β2m基因被敲除；以及任选地，所述细胞的CIITA基因被敲除。
18.如权利要求8所述的细胞，其中所述T细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
19.如权利要求8所述的细胞，其中所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
20.如权利要求8所述的细胞，其中所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
21.权利要求7-20任一项的细胞在制备通用型CAR-T细胞中的应用。
22.制备CAR细胞的方法，包括对所述CAR细胞进行改造而使其CAR介导的杀伤活性对T细胞活性抑制剂不敏感，其中所述改造是对LCK蛋白酪氨酸激酶进行改造，改造后的LCK蛋白酪氨酸激酶具有T316I突变。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述T316I突变通过如下方式获得：向所述CAR细胞中引入胞嘧啶碱基编辑器和sgRNA，所述sgRNA包括SEQ ID NOs：5-8任一个所示的核苷酸序列。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述CAR细胞中的LCK蛋白酪氨酸激酶包括SEQ IDNOs：9任一个所示的氨基酸序列。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述CAR细胞为T细胞或NK细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述CAR细胞还经改造以消除或减弱经由其细胞表面TCR而产生的细胞杀伤活性。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述CAR细胞的TCR相关基因被敲除。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述CAR细胞的TRAC基因被敲除。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述CAR细胞的β2m基因被敲除；以及任选地，所述CAR细胞的CIITA基因被敲除。
30.如权利要求22所述的方法，其中所述T细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
31.如权利要求22所述的方法，其中所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
32.如权利要求22所述的方法，其中所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
33.如权利要求25所述的方法，其中在由T细胞或NK细胞制备所述CAR细胞过程中让所述T细胞或NK细胞与所述T细胞活性抑制剂接触。
34.如权利要求25所述的方法，其中在进行所述T316I突变时让所述T细胞或NK细胞与所述T细胞活性抑制剂接触。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述T细胞活性抑制剂的浓度为100nM。
36.如权利要求7-20任一项所述的细胞，其中所述CAR的胞内信号结构域包括：
来自CD3z分子的信号传导结构域和来自CD28分子的共刺激结构域；以及
2)任选地，i)hIL7和CCL19，或ii)IL2RB和IL7Ra mutant其中，所述hIL7包括SEQ IDNO：79所示氨基酸序列；所述CCL19包括SEQ ID NO：80所示氨基酸序列；所述IL2RB与所述来自CD28分子的共刺激结构域构成IL2RB-CD3z肽段，所述IL2RB-CD3z肽段包括SEQ ID NO：81所示氨基酸序列；所述IL7Ra mutant包括SEQ ID NO：82所示氨基酸序列。
37.如权利要求36所述的细胞，其中所述来自CD3z分子的信号传导结构域包括SEQ IDNO：48所示氨基酸序列，所述来自CD28分子的共刺激结构域包括SEQ ID NO：46所示氨基酸序列。
38.如权利要求21所述的应用或如权利要求22-35任一项所述的方法，其中所述CAR的胞内信号结构域包括：
1)来自CD3z分子的信号传导结构域和来自CD28分子的共刺激结构域；以及
2)任选地，i)hIL7和CCL19，或ii)IL2RB和IL7Ra mutant其中，所述hIL7包括SEQ IDNO：79所示氨基酸序列；所述CCL19包括SEQ ID NO：80所示氨基酸序列；所述IL2RB与所述来自CD28分子的共刺激结构域构成IL2RB-CD3z肽段，所述IL2RB-CD3z肽段包括SEQ ID NO：81所示氨基酸序列；所述IL7Ra mutant包括SEQ ID NO：82所示氨基酸序列。
39.如权利要求38所述的应用或方法，其中所述来自CD3z分子的信号传导结构域包括SEQ ID NO：48所示氨基酸序列，所述来自CD28分子的共刺激结构域包括SEQ ID NO：46所示氨基酸序列。
40.药物试剂盒或药物组合，包括如权利要求7-20任一项所述的细胞和细胞活性抑制剂。
41.如权利要求40所述的药物试剂盒或药物组合，其中所述细胞为T细胞。
42.如权利要求40所述的药物试剂盒或药物组合，其中所述细胞活性抑制剂为T细胞活性抑制剂。
43.如权利要求40所述的药物试剂盒或药物组合，其中所述细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
44.如权利要求42所述的药物试剂盒或药物组合，其中所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
45.如权利要求42所述的药物试剂盒或药物组合，其中所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
46.如权利要求7-20任一项所述的细胞与细胞活性抑制剂联合在制备抗肿瘤药物中的用途。
47.如权利要求46所述的用途，其中所述细胞为T细胞。
48.如权利要求46或47所述的用途，其中所述细胞活性抑制剂为T细胞活性抑制剂。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述T细胞活性抑制剂为蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
50.如权利要求48所述的用途，其中所述T细胞活性抑制剂为LCK蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
51.如权利要求48所述的用途，其中所述T细胞活性抑制剂为达沙替尼和/或帕纳替尼。
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