CN116622712A - 用于敲除t细胞中的trac和b2m的试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于CAR‑T疗法的T细胞中的TRAC和B2M双重敲除。具体而言，本发明涉及具有较高敲除效率的靶向TRAC和B2M的sgRNA序列及其使用方法。更具体地，本发明提供一种sgRNA套组，其包含：核苷酸序列如序列3、6、9、12、14、15、16、18和19任一所示的靶向B2M基因的sgRNA，和核苷酸序列如序列37和41任一所示的靶向TRAC基因的sgRNA。另一方面，本发明提供一种生成TRAC/B2M双阴性T细胞的方法，其包括：使用本发明的sgRNA套组处理T细胞，使得其中的B2M基因和TRAC基因被敲除。

Description

用于敲除T细胞中的TRAC和B2M的试剂和方法
技术领域
本发明涉及T细胞中的TRAC和B2M双重敲除。具体而言，本发明涉及具有较高敲除效率的靶向TRAC和B2M的sgRNA序列及其使用方法。
背景技术
截至2021年6月，全球范围内已经上市了五款CAR-T产品，这五款产品都属于自体CAR-T疗法，其制备需要采集癌症患者的外周血，分离T细胞，进行基因改造，体外培养后对患者进行回输，属于“量身定制”的个体化治疗方式。自体CAR-T治疗正在彻底改变癌症治疗的方式和方法，但也存在着一些明显的局限性。首先自体CAR-T生产周期较长，患者需要较长的等待时间，有些患者可能错过最佳的治疗窗口。其次，自体CAR-T产品的质量一致性相对较差。患者T细胞状态不一致会影响产品的效能，部分患者面临制备失败的风险，因此并非所有适应症患者都可以接受治疗，总体来说每次制备的细胞数量和质量一致性得不到充分的保证。另外，自体CAR-T制备受到起始原料的限制，很难进行二次制备和治疗。最后，自体CAR-T物流复杂，规模效率相对低下，这种个体化治疗导致成本高昂。
同种异体CAR-T，又称通用型CAR-T（UCAR-T）、即用型CAR-T，是指从健康志愿者体内提取分离T细胞，进行相关改造，制备成CAR-T细胞，使其既能规避移植后的免疫排斥反应，又能发挥既定的抗癌作用。可以一次性制备、储存大量的CAR-T细胞，当有患者需要CAR-T细胞的时候，可以达到“随取随用”的目的。与自体CAR-T相比，异体CAR-T能够从库存按需交付产品，更快的治疗时间能够使更多的患者接受治疗并获得潜在的有益结果，同时根据需要可进行多次给药。其次，异体CAR-T由于采用统一的来自健康志愿者的PBMC，细胞活力和状态更好，质量一致性较好，具有更加可预测的安全性和功效，可以治疗所有适合的患者。最后，异体CAR-T一次生产即可治疗大批的患者，扩大生产规模可以进一步降低成本，降低药物价格。
异体CAR-T具有的以上优势使其成为CAR-T细胞治疗领域未来的主要趋势。根据Nature杂志统计，血液恶性肿瘤药物最受关注的5个适应症依次是复发难治性NHL（DLBCL、FL、MCL和CLL）和MM。如果CAR-T疗法在实体瘤方面取得重要突破，将使更多患者受益。异体CAR-T的成功研发，将使CAR-T细胞免疫治疗成为癌症患者随时能够使用，并且能够用得起的药物，获得巨大的临床和市场应用价值。
异体CAR-T最大的科学障碍在于“移植物抗宿主病(GVHD)”和“宿主抗移植物病(HVGD)”。体内的T细胞通过TCR识别抗原呈递细胞表面HLA分子结合的抗原肽，从而杀伤异源细胞。GVHD是由于移植后异体供者移植物中的T淋巴细胞，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击。HVGD在移植领域指受者对供者组织器官产生的排斥反应，主要是由于在移植物中识别了非自身的HLA分子。对于异体CAR-T来说，即宿主T细胞杀伤供者的T细胞。
HVGD与GVHD相关基因包含TCR、HLA分子相关基因。这些基因同时敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GVHD)，因此可以称为“通用型T细胞”。例如，单个TRAC基因是编码TCRα链的基因与编码TCRβ的两个TRBC基因形成完整的有功能的TCR复合物。敲除TRAC是可以致使TCR失活，而B2M为MHCI相关基因。这两个基因同时敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起HVGD与GVHD。
T细胞受体（T cell receptor, TCR）是T细胞表面的特异性受体，负责识别由主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）所呈递的抗原。T细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。95%的T细胞的受体由α亚基（TCRα链-TRAC基因编码）和β亚基（TCRβ链-TRBC基因编码）构成。在T细胞中，T细胞受体（TCR，包含α链和β链）、CD3复合物（包括CD3γ、CD3δ和2个CD3ε链）以及2个ζ链共同形成T细胞受体复合体（又称为TCR-CD3复合物），形成完整的细胞表面抗原受体，行使功能。
主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC），又称主要组织相容性复合基因，呈高度多态性，其编码产物（主要组织相容性抗原）是抗原提呈和T细胞活化分子，与免疫应答及免疫调节密切相关，也是引起快而强的排斥反应的抗原；其中，人类的MHC糖蛋白，又称为人类白血球抗原（human leukocyte antigen，简称HLA）。MHC基因家族分为三个亚群，分别编码三类分子：MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子。第一类主要组织相容性复合体（MHC I类分子）由一个跨越细胞膜的α链和一个连在这个链上的、细胞外的β2微球蛋白组成。整个分子由四个区组成，其中，三个区位于α链上（α1-α3），β2微球蛋白组成第四个区。在人类中，第一类MHC又称第一型人类白细胞抗原分子，在几乎所有有核细胞表面均有分布。这些分子又可以细分为HLA-A、HLA-B和HLA-C。“β2微球蛋白(B2M)”是细胞表面人白细胞抗原(HLA)的β链（轻链）部分。敲除B2M基因，细胞不表达β2微球蛋白，在细胞表面则不能形成MHC I类分子。
现有的同种异体CAR-T工艺制备规模小，无法满足市场需求。在大规模的细胞分选、大体积的T细胞培养、磁珠去除等方面存在较大缺陷，阻碍了同种异体CAR-T的工业化生产进度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服异体CAR-T引起的GVHD和HVGD问题。
本发明的技术方案是提供高敲除效率的针对TRAC（TCRα链）和B2M（HLA中β-2-微球蛋白）的sgRNA及其使用方法。
为了克服异体CAR-T可能引起的免疫排斥反应，我们采用基因编辑的方法，通过CRISPR/Cas9敲除T细胞中的TRAC及B2M基因，使得T细胞表面无法形成TCR复合物及HLA分子，从而避免异体CAR-T会引起的GVHD和HVGD排斥反应。
我们通过筛选高敲除效率的sgRNA，获得高纯度的TRAC/B2M双阴性细胞，提高双阴性细胞的分选效率，为终产品双阴性细胞纯度奠定良好基础。同时，改进细胞分选的方法和工艺，实现从大批量的PBMC中分选T细胞以及从大量基因编辑后的T细胞中分选TRAC/B2M双阴性细胞。同时，通过中间步骤分选双阴性T细胞，分选后继续培养，降低细胞分选的难度和成本。
第一方面，本发明涉及一种sgRNA，其靶向B2M基因，其核苷酸序列如序列1-21任一所示，特别是如序列3、6、9、12、14、15、16、18和19任一所示，尤其是如序列18所示。
第二方面，本发明涉及一种sgRNA，其靶向TRAC基因，其核苷酸序列如序列22-41任一所示，特别是如序列37和41任一所示，尤其是如序列37所示。
第三方面，本发明涉及一种sgRNA套组，其包含一种或多种本发明第一方面的sgRNA和一种或多种本发明第二方面的sgRNA。在一个实施方案中，所述sgRNA套组包含核苷酸序列如序列18所示的本发明第一方面的sgRNA和核苷酸序列如序列37所示的本发明第二方面的sgRNA。
第四方面，本发明涉及一种生成TRAC/B2M双阴性T细胞（特别是TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞）的方法，其包括：使用本发明的sgRNA套组处理T细胞，使得其中的B2M基因和TRAC基因敲除。在一个实施方案中，使用sgRNA套组处理T细胞通过RNP复合物电转Cas9蛋白和所述sgRNA套组来进行。在一个实施方案中，每100μL电转体系含2.5~9μg每种sgRNA、5~10μg Cas9和5.0E+06~2.0E+07个T细胞。在一个实施方案中，每100μL电转体系含5μg每种sgRNA、10μg Cas9和5.0E+06~2.0E+07个T细胞，例如5.0E+06、7.5E+06、1.0E+07个、1.25E+07、1.5E+07、1.75E+07、或2.0E+07个T细胞。在一个实施方案中，通过电转、慢病毒或AAV导入靶向B2M基因的sgRNA、靶向TRAC基因的sgRNA或sgRNA套组。在一个实施方案中，通过电转、慢病毒或AAV导入Cas9。在一个实施方案中，导入sgRNA套组的方式与导入Cas9的方式相同。在一个实施方案中，导入sgRNA套组的方式与导入Cas9的方式不同。在一个实施方案中，导入靶向B2M基因的sgRNA的方式与导入靶向TRAC基因的sgRNA的方式相同。在一个实施方案中，导入靶向B2M基因的sgRNA的方式与导入靶向TRAC基因的gRNA的方式不同。在一个实施方案中，在用sgRNA套组处理T细胞之前或之后，使用编码CAR多肽的核酸处理T细胞，使得CAR多肽在T细胞表面表达。在一个实施方案中，使用编码CAR多肽的核酸处理T细胞通过慢病毒感染来进行。在一个实施方案中，在用sgRNA套组处理T细胞之后，分选和/或扩充TRAC/B2M双阴性细胞。在一个实施方案中，在用sgRNA套组处理T细胞之后，在分选TRAC/B2M双阴性细胞之后扩充TRAC/B2M双阴性细胞。在一个实施方案中，在用sgRNA套组处理T细胞之后，在扩充之后分选TRAC/B2M双阴性细胞。在一个实施方案中，所述CAR靶向CD19。在一个实施方案中，所述CAR靶向IL-13Ra2。在一个实施方案中，所述CAR靶向BCMA。在一个实施方案中，CAR包含抗原（例如CD19、IL-13Ra2或BCMA）结合区（例如scFv）、铰链区（例如来自CD8、CD28、IgG1或IgG4）、跨膜区（例如来自CD28、CD8、CD4或ICOS）、一个或多个胞内共刺激域（例如来自CD28、4-1BB、ICOS、CD27或OX40）和胞内信号域（例如来自CD3ξ）。在一个实施方案中，靶向CD19的CAR由序列42编码。在一个实施方案中，靶向IL-13Ra2的CAR由序列43编码。在一个实施方案中，靶向BCMA的CAR由序列44编码。
第五方面，本发明涉及通过本发明的方法获得的TRAC/B2M双阴性T细胞，特别是TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞。
第六方面，本发明涉及一种组合物，其包含通过本发明的方法获得的TRAC/B2M双阴性T细胞，特别是TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞。
第七方面，本发明涉及一种治疗疾病的方法，其包括：对患者施用通过本发明的方法得到的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗B细胞白血病（例如急性B细胞白血病）的方法，其包括：对患者施用通过本发明的方法得到的靶向CD19的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗胶质瘤（例如胶质母细胞瘤）的方法，其包括：对患者施用通过本发明的方法得到的靶向IL-13Ra2的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗骨髓瘤（例如多发性骨髓瘤）的方法，其包括：对患者施用通过本发明的方法得到的靶向BCMA的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞。
第八方面，本发明涉及通过本发明的方法得到的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞制备药物的用途。
在一个实施方案中，通过本发明的方法得到的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞可用于治疗恶性血液肿瘤、恶性实体肿瘤或自身免疫性疾病，或用于制备相关药物。在一个实施方案中，所述恶性血液肿瘤是白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征或脊髓发育不良。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮或抗合成酶抗体综合征。在一个实施方案中，所述恶性实体瘤是胶质母细胞瘤、肝癌、胃癌、结直肠癌、黑色素瘤或肺癌。
在一个实施方案中，通过本发明的方法得到的靶向CD19的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞可用于治疗B细胞白血病（例如急性B细胞白血病），或用于制备相关药物。在一个实施方案中，通过本发明的方法得到的靶向CD19的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞可用于治疗恶性血液肿瘤或自身免疫性疾病，或用于制备相关药物。在一个实施方案中，所述恶性血液肿瘤是白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征或脊髓发育不良。在一个实施方案中，所述白血病是急性白血病或慢性白血病。在一个实施方案中，所述急性白血病是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病、急性成髓细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、急性粒-单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病或急性红白血病。在一个实施方案中，所述慢性白血病是慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病或慢性淋巴细胞白血病。在一个实施方案中，所述淋巴瘤是霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。在一个实施方案中，所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮或抗合成酶抗体综合征。
在一个实施方案中，通过本发明的方法得到的靶向IL-13Ra2的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞可用于治疗胶质瘤（例如胶质母细胞瘤），或用于制备相关的药物。
在一个实施方案中，通过本发明的方法得到的靶向BCMA的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞可用于治疗骨髓瘤（例如多发性骨髓瘤），或用于制备相关药物。在一个实施方案中，通过本发明的方法得到的靶向BCMA的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞可用于治疗浆细胞白血病、自身免疫性疾病或视神经脊髓炎谱系疾病，或用于制备相关药物。
本发明提供一种试剂盒，其包括一个或多个容器，其中装有分开或任意组合地装有本发明第一方面的sgRNA和本发明第二方面的sgRNA，以及任选的Cas9蛋白。在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括至少一个容器，其中装有Cas9蛋白、本发明第一方面的sgRNA和本发明第二方面的sgRNA。在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括至少一个容器，其中装有本发明第一方面的sgRNA和本发明第二方面的sgRNA。在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括至少两个容器，其中，第一容器装有Cas9蛋白，第二容器装有本发明第一方面的sgRNA和本发明第二方面的sgRNA。在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括至少两个容器，其中，第一容器装有Cas9蛋白和本发明第一方面的sgRNA，第二容器装有Cas9蛋白和本发明第二方面的sgRNA。在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括至少两个容器，其中，第一容器装有本发明第一方面的sgRNA，第二容器装有本发明第二方面的sgRNA。在一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包括至少三个容器，其中，第一容器装有Cas9蛋白，第二容器装有本发明第一方面的sgRNA，第三容器装有本发明第二方面的sgRNA。本发明的试剂盒还可以包括说明书，提供关于使用Cas9蛋白、本发明第一方面的sgRNA和本发明第二方面的sgRNA实施本发明生成TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞的方法的信息。
附图说明
图1显示靶向TRAC的sgRNA的筛选。通过电转方式在T细胞中导入sgRNA-TRAC和Cas9蛋白复合物，然后于37℃、CO2细胞培养箱中培养96小时，流式法检测敲除效率。
图2显示靶向B2M的sgRNA的筛选。通过电转方式在T细胞中导入sgRNA-B2M和Cas9蛋白混合物，然后于37℃、CO2细胞培养箱中培养96小时，流式法检测敲除效率。
图3显示双基因敲除的验证。通过电转方式在T细胞中导入选定的sgRNA组合和Cas9蛋白复合物，然后于37℃、CO2细胞培养箱中培养96小时，流式法检测敲除效率。
图4显示电转条件优化结果。通过在不同电转密度条件下导入选定的sgRNA和Cas9蛋白复合物，然后于37℃、CO2细胞培养箱中培养96小时，流式法检测敲除效率。
图5显示双阴性细胞的分选结果。显示了UCAR-T的基因编辑效率及分选后双阴性细胞比例。
图6显示双阴性UCAR-T细胞的功能检测。显示了共孵育6小时后，T、CAR-T、双阴性CAR-T细胞对靶抗原阴性细胞（K562）和靶抗原阳性细胞（K562-CD19、Daudi）的杀伤效应。
图7显示双阴性UCAR-T细胞的安全性检测。
图8显示HLA敲除验证。采用同种异体PBMC和辐照后的对照T细胞以及辐照后的UCAR-T进行共培养，检测细胞激活标志分子CD25的表达情况。
图9显示CD3敲除验证。采用对照T细胞以及UCAR-T和辐照后的同种异体PBMC进行共培养，检测细胞激活标志分子CD25的表达情况。
图10显示靶向CD19的UCAR-T细胞显著抑制小鼠肿瘤的生长。使用NCG小鼠进行人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6荷瘤后，注射UCAR-T19细胞及未进行基因敲除的对照CAR-T19细胞，观察肿瘤细胞的清除能力。
图11显示靶向CD19的UCAR-T细胞显著延长荷瘤小鼠的生存期。使用NCG小鼠进行人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6荷瘤后，注射UCAR-T19细胞及未进行基因敲除的对照CAR-T19细胞，监测各组小鼠的生存期。
图12显示UCAR-T可以显著降低小鼠GVHD反应。给予NCG小鼠亚致死性辐照后，分别尾静脉注射生理盐水、B6小鼠的脾脏细胞和骨髓细胞、人源的CAR-T细胞、UCAR-T细胞，观察小鼠临床症状并对各组小鼠进行GVHD的评分。
图13显示UCAR-T可以显著减缓小鼠体重的降低。给予NCG小鼠亚致死性辐照，分别尾静脉注射生理盐水、B6小鼠的脾脏细胞和骨髓细胞、人源的CAR-T细胞、UCAR-T细胞后，观察小鼠称重变化。
图14显示靶向IL-13Ra2的UCAR-T细胞的疗效评价。靶向IL-13Ra2的UCAR-T细胞显著抑制小鼠肿瘤的生长。使用NCG小鼠进行皮下接种U251-LAE，然后进行尾静脉CAR-T及UCAR-T细胞，观察各组小鼠清除肿瘤细胞的能力。
图15显示靶向BCMA的UCAR-T细胞的疗效评价。UCAR-T21能够缓解小鼠的体重下降。
图16显示靶向BCMA的UCAR-T细胞的疗效评价。UCAR-T21能够显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖。
图17显示靶向BCMA的UCAR-T细胞的疗效评价。UCAR-T21能够显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖。
图18显示靶向BCMA的UCAR-T细胞的疗效评价。UCAR-T21细胞能够显著延长荷瘤小鼠的生存时间。
具体实施方式
1、T细胞的分离与激活
从健康志愿者处获得PBMC后可以进行冻存，在进行异体CAR-T制备时进行细胞复苏，采用CD3/CD28磁珠进行T细胞的分离与激活。也可以将新鲜获得的PBMC采用磁珠阴性筛选的方式获得未被激活的T细胞，进行冻存，在进行异体CAR-T制备时进行T细胞的复苏，采用CD3/CD28磁珠进行T细胞的分离和激活。
2、慢病毒感染
T细胞激活后0-3天进行慢病毒感染，通过慢病毒感染的方式将特定基因导入T细胞，慢病毒感染24小时后进行细胞换液。慢病毒表达的基因包括识别特定肿瘤抗原的CAR分子，CAR分子识别的靶点包括但不限于CD19、BCMA、CD22、CD20、ROR1、Igκ、CD30、CD123、CD33、LeY、CD138、PSMA、间皮素、FAP、EGFRvⅢ、CEA、CD171、GD2、GPC3、HER2、IL-13、FLT3、NKG2D、IL-13Rα2。
慢病毒表达的基因还可以包括影响T细胞功能的基因（IL7、IL15等），控制T细胞增殖与存活的自杀开关基因（CD52、icaspase9、EGFR等），影响异体CAR-T细胞在体内存续的基因（CD47、钙黏素、NKG2A、UL18、CD48等）。
慢病毒表达的基因还可以包括靶向特定基因的sgRNA，sgRNA与后续通过其他方式（电转或AAV）导入的Cas9蛋白相结合，对T细胞基因组进行基因编辑，可以在T细胞中进行特定基因的敲除。敲除的基因包括影响T细胞免疫排斥的相关基因（TRAC、TRBC、B2M等）、影响T细胞功能的基因（PD1、TET2、HPK1等）等。
3、基因编辑
通过CRISPR/Cas9基因编辑的方法敲除T细胞表面TCR和HLA的表达，从而解决异体CAR-T在患者体内可能产生的GVHD和HVGD反应。敲除的基因包括TRAC、B2M等。sgRNA的转导可采用电转（电转仪器包括但不限于LONZA 4D-Nucleofector™ System、4D-NucleofectorX Unit、4D-Nucleofector LV Unit、MaxCyte GT、MaxCyte STX），慢病毒、腺病毒或腺相关病毒的方式。Cas9的转导可采用腺病毒或腺相关病毒表达Cas9蛋白，电转Cas9蛋白或电转Cas9 mRNA。在非病毒转染的方式中，Cas9 mRNA为化学合成或RNA聚合酶体外转录，sgRNA为化学合成或RNA聚合酶体外转录。
4、sgRNA的筛选
T细胞表面TRAC和B2M的敲除效率对于异体CAR-T的生产工艺具有很大的影响，敲除效率高，目的细胞多，在双阴性细胞分选步骤中需要去除的细胞就少，能够极大的提高生产效率。为了获得更高敲除效率的sgRNA，我们建立了一套CRISPR/Cas9的筛选评价体系。首先，建立sgRNA设计方法。sgRNA设计方法可以参考网站：https://zlab.bio/guide-design-resources。也可以按照如下步骤进行，在NCBI数据库中找到目的基因的CDS序列（Codingsequence，编码序列），确定基因翻译的外显子，然后将CDS序列输入网站https://crispr.dbcls.jp/，获得潜在的sgRNA序列，然后对潜在sgRNA序列进行初步筛选。筛选原则包括：1、排除GC含量小于等于40%的sgRNA序列，优选GC含量在60%左右的sgRNA序列；2、排除序列中含有TTTT的sgRNA序列；3、潜在的脱靶位点越少越好。经过初步筛选，获得潜在的具有较高切割效率以及较低脱靶概率的sgRNA序列，在体外进行sgRNA的合成。然后对T细胞进行RNP复合物电转，电转5天后，通过流式法检测T细胞表面TCR（TRAC）和HLA（B2M）的敲除效率，最终筛选得到具有高敲除效率的靶向TRAC基因的sgRNA序列和靶向B2M基因的sgRNA序列。
5、双阴性细胞分选
CAR-T细胞经过基因编辑后，继续培养3-25天，培养过程中可加入促进T细胞增殖的细胞因子（IL7、IL10、IL17、IL15等），然后进行双阴性细胞的分选，双阴性细胞指TRAC和B2M均不表达的细胞。双阴性细胞的分选可以采用免疫磁珠进行阴性筛选，使用CD3和/或B2M磁珠结合未进行基因敲除的细胞，获得高纯度高活性的TCR（TRAC）阴性或TRAC/B2M双阴性T细胞。分选后的细胞可以作为终产品进行浓缩，取样质检，冻存。也可以继续培养，培养到一定数目后进行浓缩，取样质检，产品冻存。
异体CAR-T产品的质量标准与自体CAR-T产品类似，包括：pH、渗透压、鉴别、T细胞纯度、感染效率、细胞活率、活细胞数、CAR表达率、剂量、IFN-γ分泌量、无菌、支原体、内毒素和复制型慢病毒等。与自体CAR-T产品不同的是，异体CAR-T产品经过基因编辑和阴性细胞分选。在终产品中，质量标准还包括TCR阴性细胞比例和HLA阴性细胞比例。终产品中，TCR阳性的细胞会攻击受试者的正常细胞，产生免疫排斥反应。终产品中，HLA阳性细胞会被受试者免疫系统清除。行业内认为，TCR阴性细胞比例需要大于97%，此时回输的产品认为是安全的，不会产生免疫排斥反应。HLA阴性细胞比例主要影响产品的有效成分，如果基因编辑效率足够高，可以不进行阴性细胞分选。
目前，行业普遍使用终点法进行双阴性细胞的分选，即经过基因编辑的细胞在培养终点进行TCR（TRAC）阴性或TRAC/B2M双阴性T细胞的分选，此时细胞数目大，分选的难度和成本较高。我们研究表明，在培养过程中进行TCR（TRAC）阴性或TRAC/B2M双阴性T细胞的分选，此时细胞数目较少，能够有效的降低分选难度，降低分选成本，分选后的细胞继续进行培养，TCR（TRAC）阴性或TRAC/B2M双阴性T细胞的比例不会降低，与终点分选方法的细胞纯度质量具有一致性，TCR阴性细胞比例和HLA阴性细胞比例均大于97%。
6、同种异体CAR-T的扩大培养
按照培养体积，在相应的WAVE Bioreactor system中培养分选前或分选后的T细胞。培养系统为WAVE Bioreactor 2/10 system、WAVE Bioreactor 20/50 system、WAVEBioreactor 200 system、WAVE Bioreactor 500/1000 system等。培养系统也可为BIOSTAT® B with RM 200 Rocker或TideCell生物反应器。培养系统也可为Wilson WolfManufacturing公司的G-Rex透气性细胞培养瓶。
实施例
实施例1：针对TRAC和B2M的sgRNA的设计和筛选
T细胞表面TCR和HLA的敲除效率对于UCAR-T的生产工艺具有很大的影响，敲除效率高，目的细胞多，在双阴性细胞分选步骤中需要去除的细胞就少，能够极大的提高生产效率。为了获得更高敲除效率的sgRNA，我们建立了一套CRISPR/Cas9的筛选评价体系（评价标准：流式法检测目的基因可被敲除，电转后48小时细胞活率≥70%，阴性细胞比例≥10%，流式图分团明显）。首先，设计并筛选sgRNA。经过初步筛选，获得潜在的具有较高切割效率以及较低脱靶概率的sgRNA序列（靶向B2M基因的序列1-序列21和靶向TRAC基因的序列22-序列41），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行sgRNA的合成。然后通过RNP复合物电转的方式验证sgRNA的敲除效率。电转后96小时流式法检测敲除效率，流式法检测抗体分别为APC-CD3（Biolegend，300439）和FITC-HLA-ABC（BD，555552）。最终筛选得到具有高敲除效率的靶向B2M基因的sgRNA序列（sgRNA-B2M 3、6、9、12、14、15、16、18、19，分别对应序列3、6、9、12、14、15、16、18、19）（图2）和靶向TRAC基因的sgRNA序列（sgRNA-TRAC 16、20；分别对应序列37、41）（图1）。分别选取sgRNA-TRAC16、sgRNA-TRAC20与sgRNA-B2M14、sgRNA-B2M18交叉组合进行双基因敲除，然后于37℃、CO2细胞培养箱中培养96小时，流式法检测敲除效率，验证双基因同时敲除时，对敲除效率的影响。分组如下：
组1：sgRNA-B2M14 + sgRNA-TRAC16；
组2：sgRNA-B2M18 + sgRNA-TRAC16；
组3：sgRNA-B2M14 + sgRNA-TRAC20；
组4：sgRNA-B2M18 + sgRNA-TRAC20。
实验结果如图3所示，4个sgRNA组合均能够获得较高的基因敲除效率，其中sgRNA-B2M18和sgRNA-TRAC16组合能够获得最高的基因敲除效率。
实施例2：电转条件的优化
T细胞表面TCR和HLA的敲除效率主要受两方面因素的影响，首先是sgRNA-TRAC、sgRNA-B2M的序列，其次为电转条件（即细胞密度和sgRNA/Cas9的用量）。sgRNA-TRAC、sgRNA-B2M的序列筛选见实施例1，电转条件的优化选用sgRNA-B2M18和sgRNA-TRAC16两种sgRNA进行。
实验分组如下：
RNP用量：Cas9 (10 μg，即62.4 pmol)、sgRNA1 (5 μg，即160 pmol)、sgRNA2 (5 μg，即160 pmol)。
注：电转体系为100 μL。
具体实验步骤见实施例5。
实验结果如图4所示，四组均可获得较高的敲除效率，其中细胞密度在7.5~20.0*107个/mL时，双阴细胞比例>80%。因此，确定电转条件：(1) RNP用量：Cas9 (10 μg)、sgRNA1(5 μg)、sgRNA2 (5 μg)，即摩尔比为Cas9:sgRNA1:sgRNA2=0.39:1:1；(2) 细胞密度：7.5~20.0*107个/mL。
实施例3：冻存PBMC复苏及T细胞分选、激活
准备生理盐水及50mL离心管，用于洗复苏后的PBMC。从液氮罐中取出细胞，于37℃水浴锅中轻轻摇晃至冻存细胞呈液态。将复苏后的细胞从水浴锅中拿出，用纸擦拭干净，喷酒精，擦拭干净后放入超净台，加入准备好的40~45mL生理盐水中，400g，室温离心5min。离心结束后，弃上清，加入40~45mL生理盐水，重悬，400g，室温离心5min。离心结束后，弃上清，加入5~10mL X-VIVO（Lonza，04-418Q）培养基，取10µL细胞统计总细胞数目和细胞活率，估算T细胞数目（T细胞数目约为PBMC数目×50%）。按照估算的T细胞数目，取相应体积的CD3/28磁珠（Thermo，40203D）于15mL离心管中，并加入5mL X-VIVO培养基，在磁力架上放置2min，吸掉X-VIVO。再加入3mL X-VIVO，在磁力架上放置2min，吸掉X-VIVO。混匀PBMC悬液，并加入到带有磁珠的15mL离心管中，用1mL X-VIVO将管底洗干净，补加适量X-VIVO培养基。将15mL离心管置于Hula Mixer上混匀30min。然后将15mL离心管置于磁力架上放置5min。吸去培养基，使用适量含IL2的X-VIVO培养基重悬结合磁珠的细胞，取10µL统计细胞数目和细胞活率。于细胞培养瓶中加入适量含IL2的X-VIVO培养基，然后加入结合磁珠的细胞，轻轻混匀，置于5% CO2、37℃细胞培养箱中培养。
实施例4：慢病毒感染T细胞
T细胞培养48小时后，将带有CAR编码序列（例如靶向CD19、IL-13Ra2或BCMA）的慢病毒载体以MOI=0.5加入至T细胞中，然后补加适量X-VIVO培养基至一定细胞浓度，轻轻混匀，置于5% CO2、37℃细胞培养箱中培养。
慢病毒感染24小时后进行细胞换液并接入含有500IU/mL IL-2的X-VIVO培养基的新鲜培养体系中继续培养。
慢病毒感染96小时后取出适量细胞，通过流式法进行CAR表达量的检测。
实施例5：双阴性CAR-T细胞的生成
上述实施例4制备的CAR-T细胞培养72小时后，通过RNP复合物（Cas9+sgRNA）电转制备UCAR-T细胞。通过RNP复合物电转的方式敲除TRAC和B2M基因（使用sgRNA-TRAC16和sgRNA-B2M18）。将X-VIVO+IL2培养基置于37℃培养箱中预热。T细胞收集于15mL离心管，置于磁力架中，放置5min，小心吸取上清到新离心管中，去除磁珠。100g离心10min，使用生理盐水重悬T细胞，取10µL细胞计数，按照使用量，取相应数目的T细胞于15mL离心管中，100g离心10min，去上清。使用电转缓冲液混合Cas9蛋白（5μg）和相关sgRNA（4μg），室温静置15min。使用电转缓冲液重悬T细胞，将T细胞（100μL，2.0E+07个细胞）和RNP复合物孵育液转移至LONZA 4D-Nucleofector™ System电转系统，按照系统设置程序EO148完成电转。电转完成后，使用预热的X-VIVO+IL2培养基重悬细胞，并加入至预先补充X-VIVO+IL2培养基的细胞培养瓶中，轻轻混匀，置于5% CO237℃培养箱中培养。培养4天后，流式法检测基因敲除效率，如图5所示，83.55%的细胞为双阴性细胞，即基因编辑效率为83.55%。使用细胞分选仪分选后检测双阴性细胞比例，如图5所示，99.31%的细胞为双阴性细胞，具有较高的目的细胞纯度。
实施例6：双阴性CAR-T细胞的分选和扩充
取少量基因编辑后的细胞，使用流式法检测基因敲除效率和双阴性细胞比例，计算预分离细胞中双阴性细胞数目。双阴性细胞分选方法如下，收集细胞后，使用PBS重悬，调整细胞浓度为1×107个细胞/100μL（1×108/mL）。细胞必须是单细胞悬液。如有必要，可使用涡旋震荡或移液器吹散细胞，然后再继续操作。加入CD3和B2M阳性选择抗体（生物素标记）。涡旋震荡混合5次。室温放置10-20min。300g离心5min，去上清，洗涤细胞，使用X-VIVO彻底重悬细胞至其原始体积。加入阳性选择磁珠（亲和素标记）。涡旋震荡混合5次。室温放置20分钟。转移至细胞分选仪（美天旎，CliniMACS Plus）配套的分选袋中，按照设定程序进行细胞分选。其中磁珠上结合的细胞为丢弃细胞。收集流穿磁力架的细胞，即不表达CD3和HLA的目的细胞。取少量细胞使用流式法检测双阴性细胞比例，计算双阴性细胞纯度和分选效率。
可以在培养终点（D21）进行双阴性细胞分选，分选后制备成品。也可以在培养过程中（例如D8-D21）进行细胞分选，分选后，细胞继续培养，在终点（D21）进行成品收集制备。使用终点法进行双阴性细胞分选时，我们检测了培养过程中双阴性细胞比例以及TCR（TRAC）和HLA（B2M）阳性细胞比例变化情况。如表1所示，在细胞培养过程中，双阴性细胞比例从D8的77.36%逐渐上升至D21的88.30%，TCR（TRAC）阳性细胞比例以及HLA（B2M）阳性细胞比例均在培养过程中逐渐下降。在D8进行细胞分选后，使用WAVE Bioreactor system继续培养到D21，双阴性细胞比例始终大于97%（表2）。上述结论证明了培养过程中进行阴性细胞分选的可行性。因为TCR（TRAC）阳性细胞比例以及HLA（B2M）阳性细胞比例在培养过程中是下降的趋势，即TCR（TRAC）阴性细胞以及HLA（B2M）阴性细胞在培养体系中属于增殖优势群体，比例会上升。所以在培养过程中进行阴性细胞分选后，体系中剩余的TCR（TRAC）阳性细胞以及HLA（B2M）阳性细胞比例不会上升，不会导致终产品中TCR（TRAC）阴性细胞以及HLA（B2M）阴性细胞比例低于97%。
表1：未分选细胞培养过程中阳性细胞比例变化
时间 TCR阳性细胞比例（%） B2M阳性细胞比例（%）
D8 16.18 20.30
D10 15.96 19.69
D12 13.57 15.84
D14 12.30 14.92
D19 8.17 11.18
D21 7.70 10.05
表2：细胞分选后培养过程中双阴性细胞比例变化
时间 双阴性细胞比例（%）
D8，分选后 98.17
D10 97.79
D12 97.84
D14 97.94
D19 97.13
D21 98.00
实施例7：UCAR-T体外杀伤作用
如下制备CD19阳性K562细胞（K562-CD19）。将带有CD19编码序列的慢病毒载体以MOI=0.5转染至K562细胞中，慢病毒感染24小时后进行细胞换液，并接入含有10% FBS的1640培养基中继续培养4天。然后流式法检测慢病毒感染效率（即K562-CD19+细胞比例），利用流式分选仪进行多次细胞分选。待K562-CD19+细胞比例稳定至99.0%以上时进行扩大培养，然后进行细胞冻存备用。
取培养到对数生长期的靶细胞K562（国家实验细胞资源共享平台，3111C0001CCC000039）、K562-CD19和Daudi细胞（国家实验细胞资源共享平台，3111C0001CCC000134），400g离心5min收集细胞，用生理盐水将靶细胞洗两遍。利用适量生理盐水重悬上述细胞，加入适量的钙黄绿素-AM（invitrogen，C3100MP），轻轻混匀，然后放入37℃水浴中孵育5~20min。利用适量生理盐水将上述细胞清洗两遍，再利用培养基重悬细胞。细胞计数，将细胞重悬至一定的细胞密度，最后进行靶细胞铺板。
取实施例5培养好的CAR-T或者UCAR-T细胞，400g离心5min收集细胞，利用适量培养基重悬细胞并计数。按照一定的ET比将CAR-T或者UCAR-T细胞进行稀释，然后加入稀释后的CAR-T或者UCAR-T细胞。细胞孵育：轻轻混匀上述细胞，并转移至37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育4~8h。结果检测、计算杀伤效率：
杀伤效率=[(CART-NC)/(PC-NC)]×100%，
其中：CART表示实验组的荧光值，NC表示阴性对照组（仅靶细胞）的荧光值，PC表示阳性对照组（即靶细胞完全裂解）的荧光值。
结果表明，TCR和HLA双阴性CAR-T细胞对CD19阳性靶细胞有特异性杀伤（图6），说明基因编辑对CAR-T细胞的杀伤作用没有影响。
实施例8：PHA对双阴性UCAR-T细胞的影响验证
植物血凝素（Phytohaemagglutinin，PHA）是一种存在于植物中的血液凝集素，多存在于某些豆类中。PHA实际上是两类密切相关的蛋白质，分别称为白血球凝集素（PHA-L）和红血球凝集素（PHA-E）。这些蛋白质导致血球聚集在一起。PHA-E会导致红血球凝集。PHA-L会导致白血球凝集。植物血凝素对细胞代谢有多种影响；它诱导有丝分裂，并影响细胞膜对蛋白质的转运和通透性。植物血凝素能促使淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子，并能提高巨噬细胞的吞噬作用。PHA通过T细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞，使T细胞激活，诱导有丝分裂。当T细胞表面不表达CD3-TCR复合体时，PHA则不能对T细胞产生激活作用。因此，我们使用PHA处理T细胞或者UCAR-T细胞后，通过检测T细胞的激活情况，反映CD3-TCR复合体的敲除情况以及UCAR-T引起免疫刺激的情况。我们使用一定浓度的PHA分别处理T和UCAR-T细胞，于37℃、5% CO2细胞培养箱中24~96小时，然后流式法检测激活标志分子CD25的表达情况（PE Anti-human CD25，Biolegend，356104）。如图7所示，实验结果表明，双阴性T细胞在PHA的处理下，CD25的表达和未加PHA处理的双阴性T细胞相同，显著低于对照T细胞组。
实施例9：同种异体反应
T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞（PBMC）在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。同时，当我们将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。即单向混合淋巴细胞培养反应。我们通过此方法检测UCAR-T细胞通过基因编辑后，与同种异体PBMC进行共培养时的激活能力。通过检测T细胞的激活情况，反映HLA以及TCR的敲除情况以及UCAR-T引起免疫刺激的情况。
HLA（B2M）敲除验证
将T细胞和双阴性UCAR-T细胞进行辐照，然后分别与同种异体PBMC进行共培养（37℃、5% CO2细胞培养箱中24~96小时），然后流式法检测PBMC表面激活标志分子CD25的表达情况。如图8所示，辐照后的双阴性T细胞和异体PBMC共孵育后，PBMC的激活情况与对照组（仅PBMC）一致，均显著低于T细胞组（未敲除HLA），说明双阴性T细胞中HLA（B2M）敲除后，不会刺激异体PBMC细胞的激活（表3）。
TCR（TRAC）敲除验证
将同种异体PBMC进行辐照，然后分别与T细胞和双阴性UCAR-T细胞进行共培养（37℃、5% CO2细胞培养箱中24~96小时），然后流式法检测T或UCAR-T表面激活标志分子CD25的表达情况。如图9所示，辐照后的异体PBMC和双阴性T细胞共孵育后，并不能激活双阴性T细胞。对照组中，辐照后的异体PBMC和T细胞共孵育后，显著刺激了T细胞的激活。表明双阴性T细胞中TCR（TRAC）的敲除后，不会对异体细胞进行识别（表3）。
同种异体反应实验结果表明，TCR（TRAC）和HLA（B2M）的敲除能够避免双阴性T细胞被异体免疫系统识别并清除，同时避免双阴性T细胞对患者产生免疫排斥。
表3：同种异体反应-激活效率对比
实施例10：靶向CD19的UCAR-T（UCAR-T19）的疗效评价
细胞来源为冻存的志愿者PBMC，复苏后通过CD3/CD28磁珠分选T细胞，并对T细胞进行激活，静置培养后，导入表达靶向CD19的CAR（序列42）分子的慢病毒。培养3天后，去除细胞中的磁珠，使用LONZA 4D-Nucleofector™ System电转系统，进行RNP复合物电转，导入Cas9蛋白和sgRNA（sgRNA-TRAC16和sgRNA-B2M18）。培养3天后，使用磁珠以及CliniMACSPlus临床级细胞分选仪进行细胞分选。分选后，97%的细胞为双阴性T细胞，具有较高的目的细胞纯度。分选后的细胞继续培养，培养到第14天后，获得UCAR-T细胞。将细胞冻存。
使用NCG小鼠（集萃药康，目录号T001475）进行人急性B淋巴细胞白血病细胞Nalm-6（ATCC，目录号CRL-3273）荷瘤（尾静脉注射1.0E+06个细胞/小鼠）后，注射UCAR-T19细胞（尾静脉注射5.0E+06个细胞）及未进行基因敲除的对照CAR-T19细胞。对比UCAR-T19细胞与对照CAR-T19细胞在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果和安全性。实验结果如图10所示，与溶媒对照以及T细胞对照组相比，UCAR-T19细胞能够显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖。同时，其抑瘤效果优于对照CAR-T19细胞。图11所示小鼠生存时间也表明，UCAR-T19细胞能够显著延长荷瘤小鼠的生存时间。
实施例11：UCAR-T的安全性评价
我们给予NCG小鼠亚致死性辐照后，阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组注射B6小鼠（维通利华，目录号219）的脾脏和骨髓细胞，流式法检测外周血小鼠T细胞增殖情况；其他测试组注射人源的CAR-T细胞或UCAR-T细胞（实施例10），流式法检测外周血人T细胞增殖情况。对小鼠进行称重、临床观察是否有GVHD症状并打分（打分标准见下表），以及对生存期进行观察。以此评价基因敲除后的UCAR-T细胞是否会在小鼠体内产生GVHD反应。实验结果如图12所示，阳性对照组（骨髓+脾）的GVHD评分随着时间显著增加，说明小鼠产生了严重的GVHD反应，CAR-T细胞组从第40天开始，GVHD评分也开始增加，说明其体内开始产生GVHD反应。而UCAR-T细胞组和阴性对照组类似，在后期均未产生明显的GVHD反应。图13显示了各组小鼠的体重变化，阳性对照组（骨髓+脾）在GVHD反应发生后，体重显著降低。CAR-T细胞组小鼠体重在后期也有所降低。而UCAR-T细胞组和阴性对照组类似，未发生体重降低的现象。以上实验结果均说明，TRAC和B2M基因敲除后的UCAR-T细胞能够显著的避免GVHD反应的发生。本实验结果初步证明，UCAR-T细胞的异体回输是安全的，不会产生GVHD反应。
表4：GVHD评分表
实施例12：靶向IL-13Ra2的UCAR-T细胞（UCAR-T91）的疗效评价。
为了验证我们的UCAR-T工艺作为一个平台技术，能够应用于不同靶点的CAR-T细胞，我们构建了靶向IL-13Ra2的UCAR-T细胞（构建方法同实施例10，序列43），在荷瘤小鼠模型中评价了UCAR-T细胞的疗效。在NCG小鼠上，以皮下接种方式每只小鼠接种1.0E+06个在U251细胞（国家实验细胞资源共享平台，目录号1101HUM-PUMC000058）基础上构建的过表达荧光素酶、P2A和EGFP的U251-LAE细胞，建立了人胶质母细胞瘤小鼠模型，然后尾静脉注射的方式每只注射5.0E+06个CAR-T或UCAR-T细胞。对小鼠进行称重、临床观察、卡尺量瘤监测肿瘤生长情况，统计生存期，检测血液中CAR-T含量变化，并对肿瘤组织和重要脏器进行病理检测。验证CAR-T及UCAR-T（UCAR-T91）的体内药效及毒理作用。实验结果如图14所示，靶向IL-13Ra2的UCAR-T细胞显著抑制小鼠肿瘤的生长，其肿瘤抑制效果和CAR-T细胞类似。说明，基因编辑并不影响CAR-T细胞的疗效。
实施例13：靶向BCMA的UCAR-T（UCAR-T21）的疗效评价
为了进一步验证我们的UCAR-T同样适用于BCMA靶点，我们制备了靶向BCMA的UCAR-T即UCAR-T21（构建方法同实施例10，序列44）。我们以尾静脉注射的方式每只NCG小鼠接种1.0E+06个在NCI H929细胞（国家实验细胞资源共享平台，目录号1101HUM-PUMC000360）基础上构建的过表达荧光素酶、P2A和EGFP的NCI H929-LAE细胞，建立了人多发性骨髓瘤小鼠模型。然后，尾静脉注射的方式每只注射5.0E+06个T、CAR-T或UCAR-T21细胞。然后，对比UCAR-T21细胞与CAR-T细胞在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果和安全性。实验结果如图15所示，UCAR-T21给予荷瘤小鼠后，会识别肿瘤细胞，在小鼠体内会增殖，对肿瘤细胞进行杀伤，从而缓解小鼠因肿瘤导致的体重下降现象。如图16、17所示，与T细胞对照组相比，UCAR-T21能够显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖。图18结果也表明，UCAR-T21细胞能够显著延长荷瘤小鼠的生存时间。
附录1：sgRNA序列
序列1 sgRNA-B2M1 GGACACCGGGCGCTCATTCT
序列2 sgRNA-B2M2 TATAAGTGGAGGCGTCGCGC
序列3 sgRNA-B2M3 TGCAGGTCCGAGCAGTTAAC
序列4 sgRNA-B2M4 ACATCGGCGCCCTCCGATCT
序列5 sgRNA-B2M5 TACATCGGCGCCCTCCGATC
序列6 sgRNA-B2M6 TAGCTGTGCTCGCGCTACTC
序列7 sgRNA-B2M7 TTCTCTTCCGCTCTTTCGCG
序列8 sgRNA-B2M8 CTGGGGTGCGCGCCCCAGCT
序列9 sgRNA-B2M9 CTGGGGCGCGCACCCCAGAT
序列10 sgRNA-B2M10 TTCAGACTTGTCTTTCAGCA
序列11 sgRNA-B2M11 TATAAGTGGAGGCGTCGCGC
序列12 sgRNA-B2M12 GAAGTTGACTTACTGAAGAA
序列13 sgRNA-B2M13 TCACGTCATCCAGCAGAGAA
序列14 sgRNA-B2M14 GGCCACGGAGCGAGACATCT
序列15 sgRNA-B2M15 CACAGCCCAAGATAGTTAAG
序列16 sgRNA-B2M16 ACTTGTCTTTCAGCAAGGAC
序列17 sgRNA-B2M17 ACCCAGACACATAGCAATTC
序列18 sgRNA-B2M18 GAGTAGCGCGAGCACAGCTA
序列19 sgRNA-B2M19 AGTCACATGGTTCACACGGC
序列20 sgRNA-B2M20 TGGAGAGAGAATTGAAAAAG
序列21 sgRNA-B2M21 TGGGCTGTGACAAAGTCACA
序列22 sgRNA-TRAC1 GGAGCAACAAATCTGACTTT
序列23 sgRNA-TRAC2 GCTGAGAGACTCTAAATCCA
序列24 sgRNA-TRAC3 AAAGTCAGATTTGTTGCTCC
序列25 sgRNA-TRAC4 GAAGACACCTTCTTCCCCAG
序列26 sgRNA-TRAC5 ACAAAACTGTGCTAGACATG
序列27 sgRNA-TRAC6 GTGACAAGTCTGTCTGCCTA
序列28 sgRNA-TRAC7 GTGATGTCAAGCTGGTCGAG
序列29 sgRNA-TRAC8 TGCTCATGACGCTGCGGCTG
序列30 sgRNA-TRAC9 TTAATCTGCTCATGACGCTG
序列31 sgRNA-TRAC10 ATTTTGATTCTCAAACAAAT
序列32 sgRNA-TRAC11 CTCGACCAGCTTGACATCAC
序列33 sgRNA-TRAC12 AACAAATGTGTCACAAAGTA
序列34 sgRNA-TRAC13 ACCCGGCCACTTTCAGGAGG
序列35 sgRNA-TRAC14 CCGAATCCTCCTCCTGAAAG
序列36 sgRNA-TRAC15 AAGTTCCTGTGATGTCAAGC
序列37 sgRNA-TRAC16 CGTCATGAGCAGATTAAACC
序列38 sgRNA-TRAC17 GAGAATCAAAATCGGTGAAT
序列39 sgRNA-TRAC18 GCTGGTACACGGCAGGGTCA
序列40 sgRNA-TRAC19 TCAACAACAGCATTATTCCA
序列41 sgRNA-TRAC20 GATTAAACCCGGCCACTTTC
附录2：CAR编码序列
序列42
UCART19，靶向CD19的CAR的编码序列
GACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACCACCCCAGCCCCCCGACCACCAACACCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCCGCTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGCTAA
序列43
UCART91，靶向IL-13Ra2的CAR的编码序列
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCCAGGATGTGGGAACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTACAGATCCACAGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCACCACTACTCTGCCCCTTGGACATTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGGGAAGCACGTCCGGCTCAGGGAAGCCGGGCTCCGGCGAGGGAAGCACGAAGGGGGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGAAATGGCATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTCGCCACAGTGTCTAGCGGCGGCAGCTACATCTACTACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGACAGGGCACAACAGCCCTGGCCACCAGATTCTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTTCTATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
序列44
UCART21，靶向BCMA的CAR的编码序列
GACATTGTGCTCACTCAGTCACCTCCCAGCCTGGCCATGAGCCTGGGAAAAAGGGCCACCATCTCCTGTAGAGCCAGTGAGTCCGTCACAATCTTGGGGAGCCATCTTATTCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGGCAGCCTCCAACCCTTCTTATTCAGCTCGCGTCAAACGTCCAGACGGGTGTACCTGCCAGATTTTCTGGTAGCGGGTCCCGCACTGATTTTACACTGACCATAGATCCAGTGGAAGAAGACGATGTGGCCGTGTATTATTGTCTGCAGAGCAGAACGATTCCTCGCACATTTGGTGGGGGTACTAAGCTGGAGATTAAGGGAAGCACGTCCGGCTCAGGGAAGCCGGGCTCCGGCGAGGGAAGCACGAAGGGGCAAATTCAGCTGGTCCAGAGCGGACCTGAGCTGAAAAAACCCGGCGAGACTGTTAAGATCAGTTGTAAAGCATCTGGCTATACCTTCACCGACTACAGCATAAATTGGGTGAAACGGGCCCCTGGAAAGGGCCTCAAATGGATGGGTTGGATCAATACCGAAACTAGGGAGCCTGCTTATGCATATGACTTCCGCGGGAGATTCGCCTTTTCACTCGAGACATCTGCCTCTACTGCTTACCTCCAAATAAACAACCTCAAGTATGAAGATACAGCCACTTACTTTTGCGCCCTCGACTATAGTTACGCCATGGACTACTGGGGACAGGGAACCTCCGTTACCGTCAGTTCCACCACCACCCCAGCCCCCCGACCACCAACACCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGCAAGCGCGGCCGCAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCCGCTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGCGTGAAGTTCAGCCGCAGCGCCGACGCCCCCGCCTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGCCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCCGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCCGCCGCAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGCCGCCGCGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCCGCTAA。

Claims (17)

1.一种sgRNA套组，其包含：
核苷酸序列如序列3、6、9、12、14、15、16、18和19任一所示的靶向B2M基因的sgRNA，和
核苷酸序列如序列37和41任一所示的靶向TRAC基因的sgRNA。
2.如权利要求1所述的sgRNA套组，其包含：
核苷酸序列如序列14所示的靶向B2M基因的sgRNA和核苷酸序列如序列37所示的靶向TRAC基因的sgRNA；
核苷酸序列如序列14所示的靶向B2M基因的sgRNA和核苷酸序列如序列41所示的靶向TRAC基因的sgRNA；
核苷酸序列如序列18所示的靶向B2M基因的sgRNA和核苷酸序列如序列37所示的靶向TRAC基因的sgRNA；或
核苷酸序列如序列18所示的靶向B2M基因的sgRNA和核苷酸序列如序列41所示的靶向TRAC基因的sgRNA。
3.一种生成TRAC/B2M双阴性T细胞的方法，其包括：使用如权利要求1或2所述的sgRNA套组处理T细胞，使得其中的B2M基因和TRAC基因被敲除。
4.如权利要求3所述的方法，其中使用sgRNA套组处理T细胞通过电转Cas9蛋白和所述sgRNA套组所形成的复合物来进行。
5.如权利要求3所述的方法，其中在每100μL电转体系中，sgRNA用量为每种80~288pmol，Cas9蛋白用量为160~320pmol，T细胞用量为5.0E+06~2.0E+07个。
6.如权利要求5所述的方法，其中在每100μL电转体系中，sgRNA用量为每种160pmol，Cas9蛋白用量为62.4pmol，T细胞用量为5.0E+06、7.5E+06、1.0E+07或2.0E+07个。
7.如权利要求3所述的方法，其进一步包括：在用sgRNA套组处理T细胞之后，分选和/或扩充TRAC/B2M双阴性细胞。
8.如权利要求3所述的方法，其进一步包括：在用sgRNA套组处理T细胞之后，在分选TRAC/B2M双阴性细胞之后扩充TRAC/B2M双阴性细胞。
9.如权利要求3所述的方法，其进一步包括：在用sgRNA套组处理T细胞之前，使用编码CAR多肽的核酸处理T细胞，使得CAR多肽在T细胞表面表达。
10.如权利要求3所述的方法，其进一步包括：在用sgRNA套组处理T细胞之后，使用编码CAR多肽的核酸处理T细胞，使得CAR多肽在T细胞表面表达。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中使用编码CAR多肽的核酸处理T细胞通过慢病毒感染来进行。
12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述CAR靶向CD19、IL-13Ra2、或BCMA。
13.如权利要求12所述的方法，其中靶向CD19的CAR由序列42编码，靶向IL-13Ra2的CAR由序列43编码，靶向BCMA的CAR由序列44编码。
14.通过如权利要求3-8任一项所述的方法获得的TRAC/B2M双阴性T细胞。
15.通过如权利要求9或10所述的方法获得的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞。
16.如权利要求15所述的TRAC/B2M双阴性CAR-T细胞制备用于治疗恶性血液肿瘤、恶性实体肿瘤、或自身免疫性疾病的药物的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述恶性血液肿瘤是白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征或脊髓发育不良，所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮或抗合成酶抗体综合征，所述恶性实体瘤是胶质母细胞瘤、肝癌、胃癌、结直肠癌、黑色素瘤或肺癌。
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