JPWO2016093350A1 - 改変型免疫細胞、改変型免疫細胞の製造方法、およびこれらの利用 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)不変型のT細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成するT細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞。
本発明の第1の一局面は、改変型免疫細胞を提供する。当該改変型免疫細胞は、(1)外因性の不変型の(インバリアントな)T細胞受容体α鎖および当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のT細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現しているか、または(2)不変型のT細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成するT細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。
本発明の第2の局面は、上記改変型免疫細胞を含んでいる免疫誘導剤を提供する。この改変型免疫細胞は、インターフェロンγの産生、DCの成熟等にしたがって、個体における免疫反応を誘導し得る。上記改変型免疫細胞は、活性化によって免疫誘導能を示し得るが、当該改変型免疫細胞の活性化は、生体の内外において実現され得る。
本発明の第3の局面は、上述の改変型免疫細胞の製造方法を提供する。当該方法は、不変型のT細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成するT細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、CD3陽性細胞に導入することを包含している。
本発明の第4の局面は、改変型免疫細胞の活性化方法を提供する。当該方法は、改変型免疫細胞を、CD1dリガンドまたはγδT細胞の増殖活性化剤とともに共培養することを包含している。当該改変型免疫細胞、CD1dリガンドおよびγδT細胞の増殖活性化剤の詳細はいずれも、これまでの項目に述べられている通りである。
以上をまとめると、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
(2)不変型のT細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成するT細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞、
(3)不変型の上記T細胞受容体α鎖はVα24であり、上記T細胞受容体β鎖はVβ11である、(1)または(2)に記載の改変型免疫細胞、
(4)(i)可変型のT細胞受容体α鎖およびT細胞受容体β鎖、または(ii)T細胞受容体γ鎖およびT細胞受容体δ鎖をその細胞表面にさらに発現している、(1)〜(3)のいずれか1つに記載の改変型免疫細胞、
(5)上記改変型免疫細胞の材料である細胞は、末梢血由来のγδT細胞である、(4)に記載の改変型免疫細胞、
(6)CD1dリガンドおよび/またはγδT細胞の増殖活性化剤によって活性化された、(1)〜(5)のいずれか1つに記載の改変型免疫細胞、
(7)(1)〜(6)のいずれか1つに記載の改変型免疫細胞を含んでいる、免疫誘導剤、
(8)CD1dリガンドおよび/またはγδT細胞の増殖活性化剤をさらに含んでいる、(7)に記載の免疫誘導剤、
(9)不変型のT細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成するT細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、CD3陽性細胞に導入することを包含している、改変型免疫細胞を製造する方法、
(10)2つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、RNAによって形成されている、(9)に記載の方法、
(11)上記改変型免疫細胞の材料は、末梢血、または末梢血を培養した試料から採取されている、(10)に記載の方法、
(12)(9)〜(11)のいずれか1つに記載の方法によって製造された改変型免疫細胞を、CD1dリガンドおよび/またはγδT細胞の増殖活性化剤と共培養することを包含している、改変型免疫細胞を活性化する方法、
(13)上記CD1dリガンドはCD1dと結合している、(12)に記載の方法、
(14)(1)〜(6)のいずれか1つに記載の改変型免疫細胞または(7)もしくは(8)に記載の免疫誘導剤を、対象に投与することを包含している、対象の免疫を誘導する方法。
後述する各実施例において用いた材料および方法は、以下の通りである。
ヒトおよびイヌの組換えGM−CSFおよびIL−4を、R&D systems(Minneapolis, MN)から購入した。IL−2を、Shionogi & Co., LTD(Osaka, Japan)から購入した。α−GalCerは、石井保之博士によって理研において合成された。α−GalCerおよびビヒクル(0.4%のDMSO)をPBSによって希釈した。ゾレドロン酸(ZOL)を、Novartis Pharmaceuticals Ltdから購入した。以下のモノクローナル抗体(mAb)を、それぞれ購入した。BD(San Diego, CA)からの抗ヒトCD3、抗ヒトCD11c(B−ly6)、抗ヒトCD40、抗ヒトCD86(2311)およびヒトのインバリアントNKT細胞のα鎖およびβ鎖の会合受容体(6B11)、Beckman Coulterからの抗ヒトVα24(C15)、Vβ11(C21)およびγ9、e-Bioscienceからの抗ヒトCD3(UCHT1)、MBLからの抗ヒトCD1dテトラマー。FACSCalibur(商標)装置、およびCELLQuest(商標)ソフトウェア(BD Biosciences)もしくはFlowJo(Tree Star, San Carlos, CA)ソフトウェアを、分析のために使用した。
ジャーカット細胞株を理研のBRCから得た。American Type Culture Collection(Rockville, MD)から、HEK293細胞株を購入した。ヒトCD1dをHEK293細胞に導入するために、pCMV6-XLA4/hCD1d(OriGene Technologies Inc., Rockville, MD)およびpCAG-ピューロマイシン耐性遺伝子(理研のRCAIにおける西田圭吾博士より提供)を、HEK293細胞にコトランスフェクションし、ピューロマイシンによって選択した。1週間後に、MX-hCD1dをトランスフェクトしたHEK293細胞を、続いて、FACSAria SorterによってhCD1dの発現に基づいて選別した。
健常な血液提供者由来のバフィーコートからヒトPBMCを得、Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)の密度勾配遠心分離によって分離した。PBMC、およびいくつかの場合に磁気ビーズ(Miltenyi Biotec Inc.)分離によって精製したCD14+単球を、PBSを用いて3回にわたって洗浄し、無血清の凍結保存培地Cellbanker2(JUJI Field Inc., Tokyo, Japan)を用いて、使用まで液体窒素に保存した。すべての試験は、理研の施設内審査委員会によって承認された。
磁気ビーズ(Miltenyi Biotec Inc.)を用いて単離したCD14+細胞を、未成熟DC(imDC)の生成のために使用した。GM−CSF(100ng/mL)およびIL−4(25ng/mL)の存在下において3日にわたって単球を培養して、imDCを生成した。
NKT細胞株を調製するために、100U/mLのIL−2の存在下においてα−GalCer(100ng/mL)を用いて、PBMCをパルスした。10〜14日後に、FITC標識の抗VαmAbを用いて、ヒトiNKT細胞を、染色し、抗FITC磁気ビーズ(Miltenyi Biotec Inc.)を用いて選択した。ヒトiNKT細胞を、100U/mLのIL−2、5ng/mLのIL−7および10ng/mLのIL−15の存在下に維持した。
pSP64 Poly(A)ベクターにおけるEGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)を、HindIIIおよびBamHIを用いて切り出し、pGEM-4Zベクター(Promega, Madison, WI)にふたたびクローニングした。この試験に使用したOVAプラスミドはこれまでに述べられている。MART−1用の発現プラスミド(pcDNA3 (+)-MART-1)を単離した。IVTのために、これらのプラスミドを、制限酵素消化(EGFPおよびOVAのためのBamHI、ならびにMART−1のためのNotI)によって直鎖化し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)によって精製し、鋳型として使用した。mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Ambion, Austin, TX)を用いることによって、ベクター上にあるT7プロモータ配列の制御下において、RNAを生成した。キットに基づくDNaseIを用いて鋳型DNAを消化した。IVT RNAを、それからRNeasyMini/Midi Kits(QIAGEN, Valencia, CA)よって精製し、水に溶離させた。RNAの完全性を、変性条件下におけるアガロースゲル電気泳動によって確認し、濃度を、分光光度計によって決定した。
T細胞のRNAエレクトロポレーションを、これまでに報告されている通りに実施した。簡単に説明すると、10%のFCSを含有しているRPMIにおける50ng/mLの抗CD3mAb OKT3(Janssen pharmaceutical, Inc., Tokyo, Japan)および300IU/mLのIL−2を用いて、106細胞/mLのPBLをインビトロにおいて刺激した。2または3日後に、T細胞を、OptiMEMを用いて1回洗浄し、OptiMEMにおいて5×106/100μLの濃度に懸濁させた。10μgの各RNAを4mmのキュベットに移し、100μLの細胞懸濁液を加え、BTXにおいてパルスした。パルス条件は、500V、5m秒の方形波パルスであった。エレクトロポレーション後ただちに、細胞を、300IU/mLのIL−2を有している新しいCMに移し、37℃においてインキュベートした。
NKT−TCR mRNAのエレクトロポレーション後に、Vα24+Vβ11+細胞およびVα24−Vβ11−細胞を、FACS Ariaによって選別し、応答細胞として使用した。刺激細胞について、CD1d 293を、500ng/mLのα−GalCerありまたはなしで、24時間にわたってパルスした。いくつかの実験において、CD1d 293を、10μmol/LのZOLを用いて24時間にわたって処理し、刺激細胞として使用した。1×105の応答細胞を、1×104の刺激細胞とともに24時間にわたって共培養した。培養上清を回収し、インターフェロンγ産生を、IFN−γ ELISA(BD)によって測定した。
NKT−TCR mRNAをエレクトロポレーションしたT細胞を、選別し、それから100ng/mLのα−GalCerの存在下または非存在下において、24時間にわたって自家の未成熟DCとともに共培養した(1:1)。ポジティブコントロールとして100ng/mLのLPSを使用した。24時間後に、DCを、フローサイトメトリーによってCD40およびCD86について分析し、培養上清におけるIL10およびIL12p70の産生を、ELISA(BD)によって測定した。
γδT細胞、またはNKT−TCRをエレクトロポレーションしたγδT細胞の細胞傷害活性を、製造者の指示にしたがってLDHアッセイキット(Takara Bio Company)を用いて、分析した。標的細胞として、CD1d 293を、500ng/mLのα−GalCerまたは10μmol/LのZOLのありまたはなしで、24時間にわたって処理した。1×104の標的細胞を、10×105のエフェクタ細胞とともに、1%FCS/RPMIにおいて12時間にわたって共培養した。培養上清を、テトラゾリウム塩を含んでいる新たに調製したReaction Mixtureとともにインキュベートし、吸光度を490nmにおいて測定した。データは、独立した3回の実験に基づく3つ1組のウェルの平均±標準偏差である。バックグラウンドコントロールの値を引いた後に、細胞傷害性の値(%)を以下の通りに算出した。
細胞傷害性(%)={(エフェクタ:標的細胞混合物−エフェクタ細胞コントロール)−自然発生的な標的細胞コントロール}/(最大の標的細胞コントロール−自然発生的な標的細胞コントロール)×100。
インビトロデータにおける差異を、マンホイットニーU検定を用いて分析した。P<0.05を統計的に有意とみなした。
健常なボランティアから確立されているNKT細胞株由来のNKT細胞TCRのVα鎖およびVβ鎖を最初にサブクローニングした。インビトロ転写手法によって、DNAにおけるTCRα鎖およびTCRβ鎖のコード領域(TCRα鎖:配列番号1、TCRβ鎖:配列番号2)からそれぞれのmRNAを生成した。エレクトロポレーションによってジャーカットT細胞に両方のTCR鎖をトランスフェクトした後に、抗Vα24と抗Vβ11Abとの組合せ、またはCD3と抗6B11もしくは抗CD1d/Gal−テトラマーとの組合せを用いたサイトメトリーによってNKT−TCRの発現を決定した(図1A)。
抗CD3AbおよびIL−2によって3日間かけて生成された初代の活性化T細胞に、Vα24およびVβ11のTCR鎖のmRNAをトランスフェクトした。mRNAをトランスフェクトしたT細胞上におけるTCRのα鎖(Vα24)およびβ鎖(Vβ11)の発現を、抗6B11mAbによって評価した。6B11+細胞は、CD3+T細胞由来の60〜70%であり、両方の鎖がそれらの細胞表面に明らかに発現されていることを示している(図2Aおよび2B)。
γδT細胞は、自然リンパ球(innate lymphocytes)の1つとしてよく知られている。γδT細胞のなかでもγ9型のγδT細胞は、いくつかの内因性のγδT細胞リガンドがAPC上において上方制御されている、ゾレドロン酸(ZA)をのせた細胞によって増殖され得る。図4に示すように、末梢血において非常に低頻度にしかNKT細胞が認められない人でさえ、適切な数のγδT細胞を有している。さらに、γδT細胞は、NKT細胞よりはるかに多く増殖する可能性を有している(図4Aおよび4B)。
NKT−TCRを新たに発現させた免疫細胞によるインビボ抗腫瘍効果を検討するため、NKT−TCRを発現させたγδT細胞(実施例3のNKT−TCR+γδT細胞;以下、改変型免疫細胞と称する)を用いて検証を行った。
(1)2x106個の改変型免疫細胞を懸濁させた、100μlの培地(図7における「γδ+NKT TCR」;濃い線)
(2)100μlの培地のみ(図7における「non-treated」;薄い線)。
NKT−TCRをNK細胞に導入した場合にも、実施例3の改変型免疫細胞と同様の効果を示すか検討するため、上述の通りに採取した健常者の末梢血単核球(PBMC)を1000U/mlのIL2を含む培地で培養した。細胞の増殖を確認した後に、NKT−TCRを発現させるためのmRNAを細胞に導入し、NKT−TCRを表面発現している細胞集団を確認した。末梢血単核球(PBMC)の培養から所定の日数の経過後において、フローサイトメトリーによって、細胞の増殖および細胞集団について確認した結果を図8に示す。
Claims (13)
- 外因性の不変型のT細胞受容体α鎖および当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のT細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している、改変型免疫細胞。
- 不変型のT細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成するT細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞。
- 不変型の上記T細胞受容体α鎖はVα24であり、上記T細胞受容体β鎖はVβ11である、請求項1または2に記載の改変型免疫細胞。
- (i)可変型のT細胞受容体α鎖およびT細胞受容体β鎖、または(ii)T細胞受容体γ鎖およびT細胞受容体δ鎖その細胞表面にさらに発現している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の改変型免疫細胞。
- 上記改変型免疫細胞の材料である細胞は、末梢血由来のγδT細胞である、請求項4に記載の改変型免疫細胞。
- CD1dリガンドおよび/またはγδT細胞の増殖活性化剤によって活性化された、請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型免疫細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の改変型免疫細胞を含んでいる、免疫誘導剤。
- CD1dリガンドおよび/またはγδT細胞の増殖活性化剤をさらに含んでいる、請求項7に記載の免疫誘導剤。
- 不変型のT細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該T細胞受容体α鎖と二量体を形成するT細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、CD3陽性細胞に導入することを包含している、改変型免疫細胞を製造する方法。
- 2つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、RNAによって形成されている、請求項9に記載の方法。
- 上記改変型免疫細胞の材料は、末梢血、または末梢血を培養した試料から採取されている、請求項10に記載の方法。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法によって製造された改変型免疫細胞を、CD1dリガンドおよび/またはγδT細胞の増殖活性化剤とともに共培養することを包含している、改変型免疫細胞を活性化する方法。
- 上記CD1dリガンドはCD1dと結合している、請求項12に記載の方法。
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