WO2016093350A1 - 改変型免疫細胞、改変型免疫細胞の製造方法、およびこれらの利用 - Google Patents

改変型免疫細胞、改変型免疫細胞の製造方法、およびこれらの利用 Download PDF

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cells
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tcr
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眞一郎 藤井
佳奈子 清水
山崎　哲
順 信賀
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a new tool capable of appropriately inducing immune activation among immune reactions in vivo.
  • Immunotherapy is a treatment method for diseases that do not depend on chemical substances by artificially stimulating innate immunity, acquired immunity, or a combination thereof. Therefore, it is expected as a therapeutic method that can reduce the physical burden on the patient, inducing a function inherent in the living body.
  • Innate immunity is expected to be effective even in cases that are not subject to antigen-specific immune cell therapy because immune cells involved in innate immunity react immediately after pattern recognition of foreign substances in the body. Therefore, the treatment for improving innate immunity has the advantage that it can be used not only for monotherapy but also for combination treatment for the purpose of complementing antigen-specific immune cell therapy.
  • NK cells Natural killer cells
  • ⁇ T cells Natural killer T cells
  • NKT cells natural killer T cells
  • lymphocytes In lymphocytes in vivo, the proportion of these immune cells involved in innate immunity is generally low. Therefore, in actual immunotherapy for improving innate immunity, a method is adopted in which lymphocytes are collected from a treatment target, target immune cells are cultured, the number of cells is amplified, and then returned to the body of the treatment target.
  • the target immune cells may not proliferate and activate as desired.
  • the present inventor utilizes a cell that has been amplified from a patient-derived NKT cell via an initialized cell such as an iPS cell and then redifferentiated into an NKT cell.
  • Patent Documents 1 and 2 a cell that has been amplified from a patient-derived NKT cell via an initialized cell such as an iPS cell and then redifferentiated into an NKT cell.
  • the object of the present invention is to provide a functional immune cell capable of activating innate immunity as a new tool capable of appropriately inducing immune activation in an immune response in vivo, and It is to provide a method for producing immune cells.
  • the present inventor expresses an NKT cell invariant T cell receptor on the surface of a specific T cell, and is activated upon stimulation with a CD1d ligand to produce a Th1 cytokine (particularly, interferon ⁇ ). It was found that modified immune cells with improved can be produced. Furthermore, the modified immune cells not only improved the ability to produce Th1 cytokines by stimulation with the CD1d ligand, but also showed an improvement in cell proliferation ability. To date, no report has been made as to what conditions should be satisfied in order to bring the specific immune cells into a state that brings about the appropriate induction of immunity. As a result of repeated studies based on these findings, the present inventor has completed the present invention. That is, the present invention includes the following features in order to solve the above problems.
  • FIG. 3 shows that the modified immune cells of FIG. 2 can mature dendritic cells. It is the figure which confirmed the NKT cell and (gamma) delta T cell in the peripheral blood of a healthy subject before and after the activation by each ligand. It is the figure which confirmed the modified type
  • FIG. 6 is a diagram confirming the proliferation activation ability and cytokine production ability of the modified immune cells of FIG. 5.
  • the first aspect of the present invention provides a modified immune cell.
  • the modified immune cell comprises (1) an exogenous invariant (invariant) T cell receptor ⁇ chain and an exogenous T cell receptor ⁇ that forms a dimer with the T cell receptor ⁇ chain. (2) a polynucleotide encoding an invariant T cell receptor ⁇ chain and a T cell receptor ⁇ chain that forms a dimer with the T cell receptor ⁇ chain The polynucleotide which codes is included.
  • the modified immune cells express the invariant T cell receptor ⁇ chain and T cell receptor ⁇ chain on their cell surfaces, the Th1 type cytokines are effectively (by more) stimulated by CD1d ligand stimulation. Specifically, it induces production of interferon ⁇ to show a high production amount).
  • the modified immune cells produce interferon ⁇ and almost induce the production of immunosuppressive IL-10 by DC when co-cultured with dendritic cells (DC). Without strong induction of IL-12 (IL-12p70) production. Therefore, the modified immune cells are suitable for use in immunotherapy that improves innate immunity based on direct and indirect cytokine production induction.
  • T cell means a T cell that does not inherently surface express the NKT cell TCR (hereinafter referred to as NKT-TCR). That is, the NKT-TCR ⁇ and ⁇ chains in the modified immune cells are exogenous rather than endogenous. Thus, as used herein, “T cell” can be read as “T cell other than NKT cell”. From the above, when referring to NKT cells in the present specification, “NK” or “natural killer” is always added in front of “T cells” to explain this.
  • NKT cells are CD1d-restricted T cells. That is, a more detailed definition of an NKT cell is a cell with limited diversity of TCR ligands, and such an NKT cell is also referred to as an invariant NKT cell (iNKT cell).
  • TCR exogenous T cell receptor
  • iNKT cells eg, human V ⁇ 24 and mouse V ⁇ 14
  • the exogenous TCR ⁇ chain expressed on the surface of the modified immune cell is a ⁇ chain unique to iNKT cells that form a dimer with the TCR ⁇ chain as described above (for example, human V ⁇ 11 as well as mouse V ⁇ 8.2). V ⁇ 7 and V ⁇ 2).
  • the TCR ⁇ chain is preferably V ⁇ 24 and the TCR ⁇ chain is preferably V ⁇ 11.
  • human V ⁇ 24 is encoded by a polynucleotide represented by the nucleotide sequence registered in GenBank Accession No. DQ341448, and human V ⁇ 11 is , Encoded by the polynucleotide indicated by the base sequence registered in GenBank Accession No. DQ341459.
  • the nucleotide sequence information of the polynucleotide encoding the invariant T cell receptor ⁇ chain used in the present invention is, for example, subcloning an NKT cell line established from a healthy volunteer. Can be determined.
  • base sequence information such as V ⁇ 14, V ⁇ 8.2, V ⁇ 7, V ⁇ 2 can be determined from a mouse-derived NKT cell line. Based on the nucleotide sequence information, the TCR ⁇ chain or TCR ⁇ chain polynucleotide of the present invention can be prepared.
  • the polynucleotide encoding the TCR ⁇ chain used in the present invention preferably has a high homology with SEQ ID NO: 1, and the polynucleotide encoding the TCR ⁇ chain has a high homology with SEQ ID NO: 2.
  • “high homology” refers to homology of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • T cells that can be used as a material for preparing the modified immune cells are T cells, preferably CD3-positive T cells ( ⁇ T cells, ⁇ T cells expressing variable TCR, mucosa-associated invariant T (MAIT) cells, etc.). Yes (in this specification, CD3 positive T cells are also referred to as Cd3 positive cells).
  • the CD3-positive T cells are not particularly limited, and may be established T cell lines or T cells collected from individuals. Specific examples of CD3-positive T cells may be activated T cells, ⁇ T cells and / or MAIT cells. The activated T cell, ⁇ T cell and / or MAIT cell may be activated after (1) being collected in an inactive state, or (2) activated at the time of collecting the cell.
  • an established inactive T cell line or an inactive T cell collected from an individual can be activated by applying a stimulus in vitro.
  • the cells are derived from peripheral blood collected from an individual and activated at the time of collection.
  • CD3 positive T cells derived from the peripheral blood of the individual are the most preferable.
  • the modified immune cells are stored (preferably cryopreserved) or used in the prepared state.
  • the modified immune cell is activated after production and then stored (preferably cryopreserved) or used.
  • the modified immune cell is activated by a CD1d ligand or a ⁇ T cell proliferation activator.
  • the above-mentioned modified immune cells show enhanced cell proliferation ability as well as effective production of interferon ⁇ by activation (Examples 1 to 3), and functional maturation into dendritic cells (DC) (Example 2). Let me show you.
  • CD1d ligand means a glycolipid recognized by NKT-TCR in a state of being bound to CD1d.
  • glycolipids include ⁇ -GalCer ( ⁇ -galactylceramide), ⁇ -C-GalCer ( ⁇ -C-galactylceramide), iGB3 (isoglobintrioxidoylceramide, GD3 (gangliosidyl-3) ), And GSL-1′SA (galacturonic acid). Of these, ⁇ -GalCer or ⁇ -C-GalCer is preferred.
  • ⁇ T cell proliferation activator is a known agent that proliferates and activates ⁇ T cells.
  • the drug include aminobisphosphonate, zoledronic acid, disodium pamidronate, (E) -4-hydroxy-3-methyl-2-butenyl diphosphate, and heat shock protein.
  • the activation of the modified immune cell of the present invention is performed by contacting a CD1d-expressing cell in a state of being pulsed (loaded) with a CD1d ligand and the modified immune cell in an in vitro reaction system. obtain.
  • the activation may be administration of the modified immune cell and a CD1d-expressing cell pulsed with a CD1d ligand to a subject. By administering to the administration subject, the modified immune cell and the CD1d-expressing cell pulsed with the CD1d ligand are contacted in the body of the subject, and the modified immune cell can be activated in the same manner as in an in vitro reaction system.
  • the CD1d-expressing cell and the modified immune cell are administered simultaneously or sequentially to the administration subject.
  • the order in which the two cells are administered to the administration subject is not particularly limited.
  • a CD1d-expressing cell in a state of being pulsed (loaded) with a CD1d ligand can be obtained by co-culturing an arbitrary CD1d-expressing cell and a CD1d ligand and binding the CD1d ligand to CD1d on the cell surface.
  • CD1d-expressing cells include tumor cells, dendritic cells that are normally present in healthy individuals, or any cell that expresses CD1d from an artificially introduced polynucleotide encoding CD1d (including established cell lines) (See, for example, International Publication Nos. WO2007 / 097370, WO2010 / 061930, WO2013 / 018778, etc.).
  • the TCR ⁇ chain and the TCR ⁇ chain are expressed via a vector introduced into the modified immune cell.
  • the vector consists of mRNA itself
  • the TCR ⁇ and TCR ⁇ chains are translated directly from the mRNA.
  • the modified immune cell maintains the expression of the TCR ⁇ and TCR ⁇ chains for at least about 48 hours after the introduction of mRNA. Therefore, the modified immune cells in this embodiment are preferably used within at least about 48 hours after generation after being activated by the above-mentioned CD1d ligand and / or ⁇ T cell proliferation activator (provided that This is not the case when the modified immune cells are stored (preferably cryopreserved).
  • the modified immune cell in this embodiment returns to its original state in vivo with the degradation of mRNA and does not express the TCR ⁇ chain and the TCR ⁇ chain. That is, immunotherapy using the modified immune cells in this embodiment and immunity induction in a living body do not correspond to gene therapy.
  • the TCR ⁇ chain and TCR ⁇ chain are expressed from DNA maintained in the modified immune cell.
  • the modified immune cells in this embodiment are activated at an appropriate time before use. Therefore, in this embodiment, the modified immune cells can be stably and easily grown to the required number of cells by culture.
  • modified immune cells in one aspect of the present invention are suitable for cells for immunotherapy, immunity inducers described below, and various other uses.
  • the modified immune cells in one aspect of the present invention are suitable as cells for immunotherapy.
  • Diseases that can be treated with the modified immune cells include, but are not limited to, cancer, infectious diseases, and allergic diseases.
  • the modified immune cells can also be used in combination with other immunotherapeutic cells.
  • the modified immune cells can be used together with cells that become functional and activated, etc. as a result of the above-described production of interferon ⁇ , functional maturation of DC, and the like.
  • the treatment is described as an example, but the modified immune cell in one aspect of the present invention is effective in preventing the above-described diseases by inducing immunity in an individual.
  • the second aspect of the present invention provides an immunity-inducing agent comprising the modified immune cell.
  • This modified immune cell can induce an immune response in an individual according to production of interferon ⁇ , maturation of DC, and the like.
  • the modified immune cells can exhibit immunity induction ability by activation, but activation of the modified immune cells can be realized inside and outside the living body.
  • the immunity-inducing agent further includes the modified immune cell activator.
  • modified immune cell activator are specifically described as the above-mentioned CD1d ligand and ⁇ T cell proliferation activators.
  • the immunity-inducing agent is kitted in combination with the activator.
  • the immunity-inducing agent is kitted with a CD1d-expressing cell pulsed with a CD1d ligand.
  • CD1d-expressing cells pulsed with a CD1d ligand can be administered simultaneously with or before or after administration of the immunity-inducing agent.
  • the third aspect of the present invention provides a method for producing the above-described modified immune cell.
  • a polynucleotide encoding an invariant T cell receptor ⁇ chain and a polynucleotide encoding a T cell receptor ⁇ chain that forms a dimer with the T cell receptor ⁇ chain are transferred to CD3 positive cells. Including the introduction.
  • the coding region in each of the two polynucleotides is formed by RNA. That is, a suitable example of the polynucleotide is mRNA. As described above, the main advantage of introducing mRNA into cells is that the method of administering the prepared modified immune cells does not correspond to gene therapy.
  • the coding region in each of the two above polynucleotides can be formed by DNA that can continuously transform cells. Therefore, examples of the polynucleotide include a known vector containing a polynucleotide encoding a T cell receptor ⁇ chain and a polynucleotide encoding a T cell receptor ⁇ chain.
  • the CD3-positive cells are derived from peripheral blood.
  • the peripheral blood is preferably obtained from a subject to which the modified immune cells are to be administered.
  • the CD3 positive cells can be expanded by the ⁇ T cell proliferation activator prior to the introduction of the two polynucleotides. As described in Examples below, ⁇ T cells proliferate by treatment with a proliferation activator. Therefore, ⁇ T cells can be secured in sufficient numbers at least in the initial presence in peripheral blood.
  • the fourth aspect of the present invention provides a method for activating modified immune cells.
  • the method includes co-culturing modified immune cells with a CD1d ligand or ⁇ T cell proliferation activator.
  • the details of the modified immune cells, the CD1d ligand, and the ⁇ T cell proliferation activator are all as described in the above items.
  • the CD1d ligand is bound to CD1d.
  • the CD1d ligand is bound to CD1d expressed on the surface of dendritic cells.
  • the dendritic cell is a human dendritic cell into which a polynucleotide encoding a disease-specific antigen has been introduced. This is because the antigenic peptide can further induce acquired immunity in the subject's body.
  • the CD1d ligand is bound to immobilized CD1d. In this case, the modified immune cells can be used for administration to a subject without requiring isolation of the activated modified immune cells.
  • the present invention includes the following features in order to solve the above problems.
  • a method for producing a modified immune cell comprising: (10) The method according to (9), wherein the coding region in each of the
  • (12) including coculturing a modified immune cell produced by the method according to any one of (9) to (11) with a CD1d ligand and / or a ⁇ T cell proliferation activator.
  • a method of activating modified immune cells (13) The method according to (12), wherein the CD1d ligand is bound to CD1d.
  • a subject comprising administering to the subject the modified immune cell according to any one of (1) to (6) or the immunity-inducing agent according to (7) or (8) To induce immunity.
  • GM-CSF and IL-4 were purchased from R & D systems (Minneapolis, Minn.).
  • IL-2 was purchased from Shionogi & Co., LTD (Osaka, Japan).
  • ⁇ -GalCer was synthesized at RIKEN by Dr. Yasuyuki Ishii.
  • ⁇ -GalCer and vehicle (0.4% DMSO) were diluted with PBS.
  • Zoledronic acid (ZOL) was purchased from Novartis Pharmaceuticals Ltd.
  • the following monoclonal antibodies (mAb) were purchased respectively.
  • a FACSCalibur TM instrument and CELLQuest TM software (BD Biosciences) or FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA) software were used for the analysis.
  • HEK293 cell line was purchased from American Type Culture Collection (Rockville, MD).
  • pCMV6-XLA4 / hCD1d OriGene Technologies Inc., Rockville, MD
  • pCAG-puromycin resistance gene Provided by Dr. Atsushi Nishida at RCAI, RIKEN
  • MX-hCD1d transfected HEK293 cells were subsequently sorted by FACSAria Sorter based on hCD1d expression.
  • Human PBMCs were obtained from buffy coats from healthy blood donors and separated by density gradient centrifugation of Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
  • CD14 + monocytes purified by PBMC and in some cases by magnetic bead (Miltenyi Biotec Inc.) separation, were washed 3 times with PBS and serum-free cryopreservation medium Cellbanker2 (JUJI Field Inc., Tokyo) , Japan) and stored in liquid nitrogen until use. All trials were approved by the RIKEN Institutional Review Board.
  • CD14 + cells isolated using magnetic beads were used for the generation of immature DC (imDC).
  • imDC immature DC
  • Monocytes were cultured for 3 days in the presence of GM-CSF (100 ng / mL) and IL-4 (25 ng / mL) to generate imDC.
  • PBMC peripheral blood cells
  • ⁇ -GalCer 100 ng / mL
  • human iNKT cells were stained with FITC-labeled anti-V ⁇ mAb and selected with anti-FITC magnetic beads (Miltenyi Biotec Inc.).
  • Human iNKT cells were maintained in the presence of 100 U / mL IL-2, 5 ng / mL IL-7 and 10 ng / mL IL-15.
  • V ⁇ 9V ⁇ 2T cell line PBMCs were cultured in the presence of ZOL (100 ⁇ mol / L) and 300 U / mL IL-2. After 10-14 days, ⁇ T cells were stained with FITC-labeled anti- ⁇ 9 mAb and selected with anti-FITC magnetic beads (MiltenyiBiotec Inc.). Human V ⁇ 9V ⁇ 2 T cells were maintained in the presence of 300 U / mL IL-2.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • pSP64 Poly (A) vector was excised using HindIII and BamHI and cloned again into the pGEM-4Z vector (Promega, Madison, Wis.).
  • the OVA plasmid used for this study has been described previously.
  • An expression plasmid (pcDNA3 (+)-MART-1) for MART-1 was isolated.
  • these plasmids were linearized by restriction enzyme digestion (BamHI for EGFP and OVA, and NotI for MART-1) and purified by QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) And used as a mold.
  • RNA was generated under the control of the T7 promoter sequence on the vector by using the mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion, Austin, TX). The template DNA was digested with DNase I based kit. IVT RNA was then purified by RNeasyMini / Midi Kits (QIAGEN, Valencia, CA) and eluted in water. The integrity of the RNA was confirmed by agarose gel electrophoresis under denaturing conditions and the concentration was determined by a spectrophotometer.
  • T cell RNA electroporation was performed as previously reported. Briefly, using 50 ng / mL anti-CD3 mAb OKT3 (Janssen pharmaceutical, Inc., Tokyo, Japan) and 300 IU / mL IL-2 in RPMI containing 10% FCS, 10 6 cells / mL of PBL was stimulated in vitro. After 2 or 3 days, the T cells were washed once with OptiMEM, it was suspended in a concentration of 5 ⁇ 10 6 / 100 ⁇ L in OptiMEM. 10 ⁇ g of each RNA was transferred to a 4 mm cuvette, 100 ⁇ L of cell suspension was added and pulsed in BTX. The pulse condition was a square wave pulse of 500 V and 5 msec. Immediately after electroporation, cells were transferred to fresh CM with 300 IU / mL IL-2 and incubated at 37 ° C.
  • V ⁇ 24 + V ⁇ 11 + cells and V ⁇ 24 ⁇ V ⁇ 11 ⁇ cells were sorted by FACS Aria and used as responder cells.
  • CD1d 293 was pulsed for 24 hours with or without 500 ng / mL ⁇ -GalCer.
  • CD1d 293 was treated with 10 ⁇ mol / L ZOL for 24 hours and used as stimulator cells.
  • 1 ⁇ 10 5 responder cells were co-cultured with 1 ⁇ 10 4 stimulator cells for 24 hours. Culture supernatants were collected and interferon ⁇ production was measured by IFN- ⁇ ELISA (BD).
  • DC maturation T cells electroporated with NKT-TCR mRNA were sorted and then co-cultured with autologous immature DCs (1: 1) for 24 hours in the presence or absence of 100 ng / mL ⁇ -GalCer. . 100 ng / mL LPS was used as a positive control. After 24 hours, DCs were analyzed for CD40 and CD86 by flow cytometry, and IL10 and IL12p70 production in the culture supernatant was measured by ELISA (BD).
  • cytotoxicity assay The cytotoxic activity of ⁇ T cells or ⁇ T cells electroporated with NKT-TCR was analyzed using the LDH assay kit (Takara Bio Company) according to the manufacturer's instructions.
  • As target cells CD1d 293 was treated for 24 hours with or without 500 ng / mL ⁇ -GalCer or 10 ⁇ mol / L ZOL. 1 ⁇ 10 4 target cells were co-cultured with 1 ⁇ 10 5 effector cells in 1% FCS / RPMI for 12 hours. The culture supernatant was incubated with a freshly prepared Reaction Mixture containing tetrazolium salt and the absorbance was measured at 490 nm.
  • Cytotoxicity (%) ⁇ (effector: target cell mixture-effector cell control) -spontaneous target cell control ⁇ / (maximum target cell control-spontaneous target cell control) ⁇ 100.
  • Example 1 Production of modified immune cells using Jurkat cell line
  • the V ⁇ and V ⁇ chains of the NKT cell TCR from an NKT cell line established from healthy volunteers were first subcloned. Each mRNA was generated from the coding region of TCR ⁇ chain and TCR ⁇ chain (TCR ⁇ chain: SEQ ID NO: 1, TCR ⁇ chain: SEQ ID NO: 2) in DNA by an in vitro transcription method. After transfecting both TCR chains into Jurkat T cells by electroporation, NKT by cytometry using a combination of anti-V ⁇ 24 and anti-V ⁇ 11 Ab, or a combination of CD3 and anti-6B11 or anti-CD1d / Gal-tetramer. -Expression of TCR was determined (Figure 1A).
  • V ⁇ 24 and V ⁇ 11 were assessed by anti-6B11 mAb.
  • the expression level of NKT-TCR was up-regulated from 6 to 12 hours and decreased after 48 hours (FIG. 1B).
  • expression of V ⁇ 24 and V ⁇ 11 on Jurkat cells in excess of 90% was detected after 6 hours.
  • the cells were then cultured with a solid phase of ⁇ -GalCer-conjugated CD1d antibody and evaluated downstream of the TCR signal.
  • MAPK was phosphorylated 10 minutes after stimulation (FIG. 1C), indicating that TCR signaling was clearly enhanced in Jurkat cells transfected with V ⁇ 24 and V ⁇ 11 TCR mRNA.
  • TCR ⁇ chain and TCR ⁇ chain mRNA modified immune cells that transiently express functional NKT-TCR on Jurkat cells could be produced.
  • Example 2 Production of modified immune cells using activated T cells derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy subjects]
  • Primary activated T cells generated by anti-CD3Ab and IL-2 over 3 days were transfected with mRNAs of V ⁇ 24 and V ⁇ 11 TCR chains.
  • Expression of TCR ⁇ -chain (V ⁇ 24) and ⁇ -chain (V ⁇ 11) on T cells transfected with mRNA was evaluated by anti-6B11 mAb.
  • 6B11 + cells are 60-70% from CD3 + T cells, indicating that both chains are clearly expressed on their cell surface (FIGS. 2A and 2B).
  • NKT-TCR + V ⁇ 24 + V ⁇ 11 + transfected cells
  • NKT-TCR ⁇ V ⁇ 24 ⁇ V ⁇ 11 ⁇ non-transfected
  • cytokine production was analyzed by co-culturing NKT-TCR + cells with cells loaded with ⁇ -GalCer (CD1d-HEK293 cells / Gal).
  • NKT-TCR + cells produced more interferon ⁇ but not IL-4 in an ⁇ -GalCer dependent manner.
  • both NKT-TCR ⁇ cells and activated T cells without transfection did not produce interferon ⁇ (FIG. 2D).
  • activated T cells (NKT-TCR + cells) transfected with mRNA of V ⁇ 24TCR and V ⁇ 11TCR are functional for interferon ⁇ production and these 6B11 + cells that are inclined to Th1 type are Th1 type NKT cells. Can be mimicked over 48 hours.
  • NKT-TCR + cells have previously been reported to induce DC maturation in both phenotype and function in vivo and in vitro. It was assessed whether NKT-TCR + T cells could mature DCs. Maturation markers and cytokine production were assessed after culturing mature DCs derived from NKT-TCR + T cells and autologous monocytes.
  • ⁇ T cells are well known as one of innate lymphocytes.
  • ⁇ 9 type ⁇ T cells can be expanded by cells loaded with zoledronic acid (ZA), in which several endogenous ⁇ T cell ligands are upregulated on APC.
  • ZA zoledronic acid
  • FIG. 4 even people with very low frequency of NKT cells in peripheral blood have an appropriate number of ⁇ T cells.
  • ⁇ T cells have the potential to proliferate much more than NKT cells (FIGS. 4A and 4B).
  • ⁇ T cells do not normally express NKT-TCR, but can express NKT-TCR along with ⁇ 9 ⁇ TCR after transfection by electroporation (FIG. 5).
  • NKT-TCR + cells were co-cultured with CD1d-HEK293 cells loaded with ZA, ⁇ T cells produced interferon ⁇ , and it was confirmed that these were ⁇ T cells.
  • ⁇ T cells that are relatively abundant in peripheral blood and can be grown to a sufficient amount for clinical use.
  • ⁇ T cells may not be activated by ZA alone, or may be insufficiently stimulated, but this modified ⁇ T cell newly provides an option to utilize ⁇ -GalCer. Therefore, this modified ⁇ T cell can not utilize ⁇ T cells, or can substantially reduce the number of individuals with low utilization efficiency of ⁇ T cells and provide more individuals with an opportunity for treatment.
  • the ⁇ and ⁇ chain mRNAs of the NKT cell TCR are introduced into each cell.
  • the alpha and beta chains on the cell surface decrease with time.
  • the number of cells is not decreasing.
  • NKT-TCR + cells gradually returned to the state before the introduction of mRNA due to the degradation of the introduced mRNA, and the expression levels of the ⁇ chain and ⁇ chain of the NKT cell TCR gradually decreased. Absent. For this reason, applying the cells obtained in these examples to immunotherapy does not fall under gene therapy. It is clear that the cells of these examples with no introduced foreign factor remaining show extremely low side effects to the extent that they are not comparable to conventional gene therapy. When applying the cells of these examples to immune cell therapy using autologous cells, it can be considered that there are virtually no side effects.
  • the device used for producing the cells and the material derived from the living body can be disposed of by a processing method equivalent to that used in a medical facility.
  • Example 4 Confirmation of in vivo antitumor effect of modified immune cells.
  • ⁇ T cells expressing NKT-TCR (NKT-TCR + ⁇ T cells of Example 3; hereinafter referred to as modified immune cells) ) was used for verification.
  • An immunodeficient mouse inoculated subcutaneously with 2 ⁇ 10 6 K562 cells was prepared as a model animal for evaluating the antitumor effect of the modified immune cells.
  • FIG. 7 shows the results of evaluating the antitumor effect of the modified immune cells based on the tumor size in the model animals measured 12 to 24 days after the inoculation. As shown in FIG. 7, none of the model animals that received the modified immune cells showed an increase in tumor size 12-24 days after inoculation. On the other hand, all the model animals that did not receive the modified immune cells showed an increase in tumor size over time (especially after 17 days after inoculation). This revealed that the modified immune cells (NKT-TCR + ⁇ T cells) exhibit very excellent antitumor activity in vivo.
  • FIG. 8 shows the results of confirming cell proliferation and cell population by flow cytometry after a predetermined number of days from the culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • cell proliferation was confirmed by flow cytometry at each time point 3 days and 7 days after the start of culture. Further, at the time point after 7 days, further analysis was performed using another fluorescently labeled antibody, and the CD3 + CD56 ⁇ cell group (11.0%), the CD3 ⁇ CD56 + cell group (72.1%), the CD16 + CD56 ⁇ cell group ( 76.4%), and the presence of the CD16 ⁇ CD56 + cell group (17.4%) was confirmed.
  • NKT-TCR mRNA V ⁇ 24 mRNA and V ⁇ 11 mRNA was electroporated at 8 days after the start of the culture, and confirmed 6 hours later by flow cytometry of V ⁇ 24 + V ⁇ 11 + cells.
  • NKT-TCR expression itself was suppressed in NK cells compared to CD3 + cells. Therefore, it is clear that cells that exert the same effect as modified immune cells based on CD3 + cells as prepared in Example 3 can be obtained only inefficiently when NK cells are used as a material. became.
  • the above experiments show very unexpected results that felt the normal expectation for those skilled in the art that if NKT-TCR mRNA is introduced into NK cells, cells exhibiting NKT cell-like functions can be obtained. Indicated. Therefore, as shown in Example 3, it was revealed that CD3 + cells are very suitable for producing modified immune cells for immunotherapy.
  • the present invention can be used for immune cell therapy.
  • the present invention can be used as an immune inducer that activates effector cells and other immune cells that directly exert cytotoxic immunity.

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Abstract

　本発明の改変型免疫細胞は、（１）外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現しているか、（２）Ｔ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。これによって、生体内における免疫を適切に誘導し得る新たなツールを提供する。

Description

改変型免疫細胞、改変型免疫細胞の製造方法、およびこれらの利用
　本発明は、生体内における免疫反応の内、免疫の活性化を適切に誘導し得る新たなツールに関する。
　免疫細胞の分類、成熟過程および細胞の機能などを明らかにするこれまでの研究の成果に基づいて、免疫療法には種々の免疫細胞が利用されている。免疫療法は、自然免疫、獲得免疫またはこれらの組合せを人為的に刺激誘導することによって、化学物質に依存しない疾患の治療法である。したがって、生体に本来的に備わっている機能を惹起させるという、患者の肉体的負担を軽減し得る治療法として期待されている。
　自然免疫は、自然免疫に関与する免疫細胞が体内の異物をパターン認識して即座に反応するため、抗原特異的な免疫細胞治療の対象外となる症例に対しても効果が見込まれる。従って、自然免疫を向上させる治療は、単独治療に限らず、抗原特異的な免疫細胞治療を補完する目的での併用治療にも利用可能という利点を有する。
　自然免疫に関与する免疫細胞として、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、γδＴ細胞およびナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）が知られている。生体内のリンパ球では、自然免疫に関与するこれらの免疫細胞の割合は一般に低い。そのため、自然免疫を向上させる実際の免疫療法では、治療対象からリンパ球を採取して目的の免疫細胞を培養し、細胞数を増幅させた後に治療対象の体内に戻す方法が採用されている。しかし、従来の方法では、治療対象から採取したリンパ球の状態によっては、目的の免疫細胞が所望の通りに増殖・活性化しないことがあった。
　このような課題に鑑み、本発明者は、患者由来のＮＫＴ細胞からｉＰＳ細胞などの初期化された細胞を経由することによって当該細胞を増幅させた後に、ＮＫＴ細胞に再分化させた細胞を利用する方法の確立に関わっている（特許文献１および２）。
国際公開公報「ＷＯ２００８／０３８５７９号（２００８年４月３日公開）」 国際公開公報「ＷＯ２０１０／０２７０９４（２０１０年３月１１日公開）」
　本発明者は、生体内の自然免疫を増強させる種々のアプローチを検討した結果、自然免疫に関与する細胞自体を増殖・活性化させるのではなく、自然免疫を容易かつ効果的に活性化させ、細胞増殖能も向上させ得るという優れた機能性を付与した、新規の免疫細胞を作製する必要があるとの結論に達した。
　以上の検討に鑑みて、本発明の目的は、生体内における免疫反応の内、免疫の活性化を適切に誘導し得る新たなツールとして、自然免疫を活性化させ得る機能的な免疫細胞および当該免疫細胞の製造方法を提供することである。
　本発明者は、特定のＴ細胞の表面に、ＮＫＴ細胞の不変型のＴ細胞受容体を発現させることによって、ＣＤ１ｄリガンドによる刺激を受けて活性化されてＴｈ１サイトカイン（特にインターフェロンγ）の産生能が向上した改変型免疫細胞を作製できることを見出した。さらに、当該改変型免疫細胞は、ＣＤ１ｄリガンドの刺激によってＴｈ１サイトカインの産生能を向上させただけでなく、細胞増殖能の向上を示した。特定の上記免疫細胞を、適切な上記免疫誘導をもたらす状態にするには、いかなる条件を満たすべきかについて、これまで一切の報告がなされていない。本発明者は、これらの知見に基づいて研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
　（１）外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している、改変型免疫細胞、
　（２）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞。
　本発明によれば、生体内における免疫反応の内、免疫の活性化を適切に誘導し得る新たなツールを提供することができる。
Ｔ細胞株を用いて改変型免疫細胞を作製できたことを示す図である。 ＰＢＭＣ由来の活性化Ｔ細胞を用いて作製した改変型免疫細胞およびそのサイトカイン産生能を確認した図である。 図２の改変型免疫細胞が樹状細胞を成熟させ得ることを示す図である。 健常者の末梢血におけるＮＫＴ細胞およびγδＴ細胞を、各リガンドによる活性化の前後を確認した図である。 ＰＢＭＣ由来のγδＴ細胞を用いて作製した改変型免疫細胞を確認した図である。 図５の改変型免疫細胞の増殖活性化能およびサイトカイン産生能を確認した図である。 腫瘍細胞の接種から１２～２４日後に測定したモデル動物における腫瘍サイズに基づいて、改変型免疫細胞による抗腫瘍効果を評価した結果を示す図である。 末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の培養から所定の日数の経過後において、フローサイトメトリーによって、細胞の増殖および細胞集団について確認した結果を示す図である。
　〔本発明の改変型免疫細胞〕
　本発明の第１の一局面は、改変型免疫細胞を提供する。当該改変型免疫細胞は、（１）外因性の不変型の（インバリアントな）Ｔ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現しているか、または（２）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる。
　上記改変型免疫細胞は、不変型のＴ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している間、ＣＤ１ｄリガンドの刺激によってＴｈ１型のサイトカインを、効果的に（より詳細にはインターフェロンγの産生を誘導して高い産生量を示すように）産生する。本発明によれば、実施例に証明されている通り、細胞株すら材料になり得るので、自然免疫を向上させる機能的な免疫細胞を所望の数だけ利用できることと、実質的に同じ利点を享受できる。実施例に証明されている通り、上記改変型免疫細胞は、インターフェロンγを産生し、かつ樹状細胞（ＤＣ）と共培養したときに、ＤＣによる免疫抑制性のＩＬ－１０の産生をほとんど誘導せずにＩＬ－１２（ＩＬ－１２ｐ７０）の産生を強く誘導する。したがって、上記改変型免疫細胞は、直接的および間接的なサイトカインの産生誘導に基づいて、自然免疫を向上させる免疫療法への利用に適している。
　本明細書に使用されるとき、用語“Ｔ細胞”は、ＮＫＴ細胞のＴＣＲ（以下、ＮＫＴ－ＴＣＲと記載する）を本来的に表面発現していないＴ細胞を意味する。つまり、改変型免疫細胞におけるＮＫＴ－ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、内因性ではなく、外因性である。したがって、本明細書に使用されるとき、“Ｔ細胞”は“ＮＫＴ細胞以外のＴ細胞”と読み換えられ得る。以上のことから、本明細書においてＮＫＴ細胞に言及する場合、“ＮＫ”または“ナチュラルキラー”を、“Ｔ細胞”の前に必ず付してこれを説明する。
　本明細書に使用されるとき“ＮＫＴ細胞”は、ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞である。すなわち、ＮＫＴ細胞のより詳細な定義は、ＴＣＲのリガンドに対する多様性が限られている細胞であり、このようなＮＫＴ細胞は不変ＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）とも称される。
　改変型免疫細胞の表面に発現している外因性のＴ細胞受容体（以下、ＴＣＲと記載する）α鎖は、ｉＮＫＴ細胞に特有のα鎖（例えば、ヒトのＶα２４およびマウスのＶα１４）である。改変型免疫細胞の表面に発現している外因性のＴＣＲβ鎖は、上述の通りＴＣＲα鎖と二量体を形成するｉＮＫＴ細胞に特有のβ鎖（例えば、ヒトのＶβ１１、ならびにマウスのＶβ８．２、Ｖβ７およびＶβ２）である。なお、上記改変型免疫細胞において、ヒト由来のＴ細胞を用いる場合はＴＣＲα鎖はＶα２４であること、ＴＣＲβ鎖はＶβ１１であることが好ましい。
　本発明に使用されるＴ細胞受容体の一実施形態において、例えば、ヒトのＶα２４は、GenBank Accession No.DQ341448に登録されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドにコードされており、ヒトのＶβ１１は、GenBank Accession No.DQ341459に登録されている塩基配列によって示されるポリヌクレオチドにコードされている。また、本発明に使用される不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報は、実施例１に示される通り、例えば健常なボランティアから確立されているＮＫＴ細胞株をサブクローニングすることによって、決定され得る。同様に、マウス由来のＮＫＴ細胞株から、Ｖα１４、Ｖβ８．２、Ｖβ７、Ｖβ２等の塩基配列情報を決定することができる。当該塩基配列情報に基づいて、本発明のＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖のポリヌクレオチドを作製することができる。
　好適には、本発明に用いるＴＣＲα鎖をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号１と高い相同性を示すものが好ましく、ＴＣＲβ鎖をコードしているポリヌクレオチドは、配列番号２と高い相同性を示すものが好ましい。ここで、「高い相同性」とは９０％以上の相同性、好ましくは９５％以上の相同性、より好ましくは９８％以上の相同性をいう。
　上記改変型免疫細胞の作製材料になり得る細胞は、Ｔ細胞であり、好ましくはＣＤ３陽性Ｔ細胞（γδＴ細胞、可変型ＴＣＲを発現するαβＴ細胞および粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞など）である（本明細書において、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を意図してＣｄ３陽性細胞とも称する）。ＣＤ３陽性Ｔ細胞は、特に限定されないが、樹立されているＴ細胞株または個体から採取されたＴ細胞などであり得る。ＣＤ３陽性Ｔ細胞の具体例は、活性化Ｔ細胞、γδＴ細胞および／またはＭＡＩＴ細胞などであり得る。上記活性化Ｔ細胞、γδＴ細胞および／またはＭＡＩＴ細胞は、（１）未活性の状態において採取した後に活性化させるか、または（２）細胞を採取した時点において活性化されていてもよい。ここで、（１）の場合、例えば、樹立されている未活性のＴ細胞株または個体から採取された未活性のＴ細胞は、試験管内において刺激を与えることによって活性化され得る。（２）の場合、例えば、上記細胞は、個体から採取した末梢血に由来しており、かつ採取時に活性化されている。後述する実施例３において確認されている通り、作製材料として個体から採取した細胞を改変型免疫細胞として当該個体に戻す免疫療法または免疫誘導において、当該個体の末梢血由来のＣＤ３陽性Ｔ細胞が最も好ましい。
　一実施形態において、上記改変型免疫細胞は、作製した状態のまま保存（好ましくは凍結保存）または使用される。他の実施形態において、上記改変型免疫細胞は、作製後に活性化してから保存（好ましくは凍結保存）または使用される。この実施形態において、上記改変型免疫細胞は、ＣＤ１ｄリガンドまたはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化されている。上記改変型免疫細胞は、活性化によって、インターフェロンγの効果的な産生とともに細胞増殖能の向上を示し（実施例１～３）、樹状細胞（ＤＣ）に機能的な成熟（実施例２）を示させる。
　ＣＤ１ｄリガンドは、ＣＤ１ｄと結合した状態においてＮＫＴ－ＴＣＲによって認識される糖脂質を意味する。当該糖脂質の例としては、α－ＧａｌＣｅｒ（α－ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、α－Ｃ－ＧａｌＣｅｒ（α－Ｃ－ｇａｌａｃｔｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ｉＧＢ３（ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｒｉｈｅｘｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ）、ＧＤ３（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ　３）、ＧＳＬ－１（α－ｌｉｎｋｅｄ　ｇｌｕｃｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、およびＧＳＬ－１’ＳＡ（ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）が挙げられる。これらのうちα－ＧａｌＣｅｒまたはα－Ｃ－ＧａｌＣｅｒが好ましい。
　γδＴ細胞の増殖活性化剤は、γδＴ細胞を増殖活性化する公知の薬剤である。当該薬剤としては、アミノビスホスホネート、ゾレドロン酸、パミドロン酸二ナトリウム、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸、およびヒートショックプロテインなどが挙げられる。
　一実施形態において、本発明の改変型免疫細胞の活性化は、ＣＤ１ｄリガンドをパルス（ロード）した状態のＣＤ１ｄ発現細胞と、上記改変型免疫細胞とをインビトロの反応系において接触させることによって実施され得る。別の実施形態において、上記活性化は、上記改変型免疫細胞およびＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞を投与対象に投与することでもよい。投与対象に投与することによって、対象の体内において上記改変型免疫細胞とＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞とが接触し、当該改変型免疫細胞はインビトロの反応系と同様に活性化され得る。この場合において、上記ＣＤ１ｄ発現細胞および改変型免疫細胞は、投与対象に対して、同時または逐次に投与される。ここで、上記ＣＤ１ｄ発現細胞および改変型免疫細胞が投与対象に対して逐次に投与される場合、当該２つの細胞を投与対象に投与する順序は特に限定されない。
　ＣＤ１ｄリガンドをパルス（ロード）した状態のＣＤ１ｄ発現細胞は、任意のＣＤ１ｄ発現細胞とＣＤ１ｄリガンドとを共培養して、細胞表面上のＣＤ１ｄにＣＤ１ｄリガンドを結合させることによって得られる。ＣＤ１ｄ発現細胞は、腫瘍細胞、健常者に通常に存在する樹状細胞、または人為的に導入されたＣＤ１ｄをコードするポリヌクレオチドからＣＤ１ｄを発現している任意の細胞（樹立された細胞株を包含している）であり得る（例えば国際公開ＷＯ２００７／０９７３７０号、ＷＯ２０１０／０６１９３０、ＷＯ２０１３／０１８７７８などを参照のこと）。
　一実施形態において、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、上記改変型免疫細胞に導入されたベクターを介して発現される。この実施形態において、ベクターがｍＲＮＡ自身からなる場合、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、ｍＲＮＡから直接的に翻訳される。この実施形態において、上記改変型免疫細胞は、ｍＲＮＡの導入から少なくとも約４８時間にわたって上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の発現を維持する。したがって、この実施形態における上記改変型免疫細胞は、上述のＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化された後に、作製から少なくとも約４８時間以内に使用されることが好ましい（但し、上記改変型免疫細胞が保存（好ましくは凍結保存）された場合にはこの限りではない。）。この実施形態における上記改変型免疫細胞は、ｍＲＮＡの分解にともなって生体内の本来の状態に戻り、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を発現しなくなるからである。すなわち、この実施形態における上記改変型免疫細胞を用いた免疫療法および生体における免疫誘導は、遺伝子治療に該当しない。
　一実施形態において、上記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、上記改変型免疫細胞に維持されているＤＮＡから発現されている。この実施形態における上記改変型免疫細胞は、使用前の適切な時点に活性化される。したがって、この実施形態において、上記改変型免疫細胞は、培養によって安定的かつ容易に必要な細胞数にまで増殖させられ得る。
　本発明の一局面における改変型免疫細胞は、免疫療法用の細胞、後述の免疫誘導剤、および種々の他の用途に適している。
　上述の通り、本発明の一局面における改変型免疫細胞は、免疫療法用の細胞として適している。当該改変型免疫細胞によって治療可能な疾患としては、がん、感染症およびアレルギー疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。また、この改変型免疫細胞は、他の免疫療法用の細胞と組み合わせて使用され得る。特に、上述したインターフェロンγの産生、ＤＣの機能的な成熟等の結果として、機能的になる細胞および活性化される細胞などとともに、上記改変型免疫細胞は使用され得る。ここでは、治療を例に挙げて説明したが、本発明の一局面における改変型免疫細胞は、個体における免疫を誘導することによって、上述の疾患の予防に有効である。
　〔本発明の免疫誘導剤〕
　本発明の第２の局面は、上記改変型免疫細胞を含んでいる免疫誘導剤を提供する。この改変型免疫細胞は、インターフェロンγの産生、ＤＣの成熟等にしたがって、個体における免疫反応を誘導し得る。上記改変型免疫細胞は、活性化によって免疫誘導能を示し得るが、当該改変型免疫細胞の活性化は、生体の内外において実現され得る。
　したがって、一実施形態において、上記免疫誘導剤は、上記改変型免疫細胞の活性化剤をさらに含んでいる。当該活性化剤は、上述のＣＤ１ｄリガンドおよびγδＴ細胞の増殖活性化剤として具体的に説明されている。他の実施形態において、上記免疫誘導剤は、上記活性化剤と組み合わせてキット化されている。
　また、別の態様において上記免疫誘導剤は、ＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞と組み合わせてキット化されている。この実施形態において、上記免疫誘導剤の投与と同時または投与の前後に、ＣＤ１ｄリガンドをパルスされたＣＤ１ｄ発現細胞が投与され得る。
　〔本発明の改変型免疫細胞の製造方法〕
　本発明の第３の局面は、上述の改変型免疫細胞の製造方法を提供する。当該方法は、不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ３陽性細胞に導入することを包含している。
　一実施形態において、２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、ＲＮＡによって形成されている。すなわち、当該ポリヌクレオチドの好適な例はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡを細胞に導入することの主な利点は、上述の通り、作製された改変型免疫細胞を投与する方法が遺伝子治療に該当しないことである。
　他の実施形態において、２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、持続的に細胞を形質転換し得るＤＮＡによって形成され得る。したがって、上記ポリヌクレオチドの例としては、Ｔ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよびＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、公知のベクターなどが挙げられる。
　一実施形態において、上記ＣＤ３陽性細胞は末梢血に由来する。当該末梢血は、上記改変型免疫細胞を投与する予定の対象から得られることが好ましい。上記ＣＤ３陽性細胞がγδＴ細胞である実施形態において、上記ＣＤ３陽性細胞は、２つのポリヌクレオチドの導入前に、上記γδＴ細胞の増殖活性化剤によって増殖させられ得る。後述の実施例に記載の通り、γδＴ細胞は、増殖活性化剤を用いた処理によって増殖する。したがって、γδＴ細胞は、末梢血における初期の存在数が少なくとも、十分な数を確保され得る。
　〔本発明の改変型免疫細胞の活性化方法〕
　本発明の第４の局面は、改変型免疫細胞の活性化方法を提供する。当該方法は、改変型免疫細胞を、ＣＤ１ｄリガンドまたはγδＴ細胞の増殖活性化剤とともに共培養することを包含している。当該改変型免疫細胞、ＣＤ１ｄリガンドおよびγδＴ細胞の増殖活性化剤の詳細はいずれも、これまでの項目に述べられている通りである。
　好ましい実施形態において、上記ＣＤ１ｄリガンドはＣＤ１ｄと結合している。いくつかの実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、樹状細胞の表面に発現しているＣＤ１ｄと結合している。特定の実施形態において、上記樹状細胞は、疾患特異的な抗原をコードしているポリヌクレオチドを導入したヒトの樹状細胞である。上記抗原ペプチドが対象の体内における獲得免疫をさらに誘導可能だからである。他の実施形態において、ＣＤ１ｄリガンドは、固相化されているＣＤ１ｄと結合している。この場合、活性化された改変型免疫細胞の単離を要することなく、当該改変型免疫細胞を対象への投与に使用し得る。
　（まとめ）
　以上をまとめると、本発明は上記の課題を解決するために、以下の特徴を包含している。
　（１）外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している、改変型免疫細胞、
　（２）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞、
　（３）不変型の上記Ｔ細胞受容体α鎖はＶα２４であり、上記Ｔ細胞受容体β鎖はＶβ１１である、（１）または（２）に記載の改変型免疫細胞、
　（４）（ｉ）可変型のＴ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖、または（ｉｉ）Ｔ細胞受容体γ鎖およびＴ細胞受容体δ鎖をその細胞表面にさらに発現している、（１）～（３）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞、
　（５）上記改変型免疫細胞の材料である細胞は、末梢血由来のγδＴ細胞である、（４）に記載の改変型免疫細胞、
　（６）ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化された、（１）～（５）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞、
　（７）（１）～（６）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞を含んでいる、免疫誘導剤、
　（８）ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤をさらに含んでいる、（７）に記載の免疫誘導剤、
　（９）不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ３陽性細胞に導入することを包含している、改変型免疫細胞を製造する方法、
　（１０）２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、ＲＮＡによって形成されている、（９）に記載の方法、
　（１１）上記改変型免疫細胞の材料は、末梢血、または末梢血を培養した試料から採取されている、（１０）に記載の方法、
　（１２）（９）～（１１）のいずれか１つに記載の方法によって製造された改変型免疫細胞を、ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤と共培養することを包含している、改変型免疫細胞を活性化する方法、
　（１３）上記ＣＤ１ｄリガンドはＣＤ１ｄと結合している、（１２）に記載の方法、
　（１４）（１）～（６）のいずれか１つに記載の改変型免疫細胞または（７）もしくは（８）に記載の免疫誘導剤を、対象に投与することを包含している、対象の免疫を誘導する方法。
　〔材料および方法〕
　後述する各実施例において用いた材料および方法は、以下の通りである。
　（試薬）
　ヒトおよびイヌの組換えＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４を、R&D systems（Minneapolis, MN）から購入した。ＩＬ－２を、Shionogi & Co., LTD（Osaka, Japan）から購入した。α－ＧａｌＣｅｒは、石井保之博士によって理研において合成された。α－ＧａｌＣｅｒおよびビヒクル（０．４％のＤＭＳＯ）をＰＢＳによって希釈した。ゾレドロン酸（ＺＯＬ）を、Novartis Pharmaceuticals Ltdから購入した。以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、それぞれ購入した。BD（San Diego, CA）からの抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ１１ｃ（Ｂ－ｌｙ６）、抗ヒトＣＤ４０、抗ヒトＣＤ８６（２３１１）およびヒトのインバリアントＮＫＴ細胞のα鎖およびβ鎖の会合受容体（６Ｂ１１）、Beckman Coulterからの抗ヒトＶα２４（Ｃ１５）、Ｖβ１１（Ｃ２１）およびγ９、e-Bioscienceからの抗ヒトＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、MBLからの抗ヒトＣＤ１ｄテトラマー。FACSCalibur（商標）装置、およびCELLQuest（商標）ソフトウェア（BD Biosciences）もしくはFlowJo（Tree Star, San Carlos, CA）ソフトウェアを、分析のために使用した。
　（細胞株）
　ジャーカット細胞株を理研のＢＲＣから得た。American Type Culture Collection（Rockville, MD）から、ＨＥＫ２９３細胞株を購入した。ヒトＣＤ１ｄをＨＥＫ２９３細胞に導入するために、pCMV6-XLA4/hCD1d（OriGene Technologies Inc., Rockville, MD）およびpCAG-ピューロマイシン耐性遺伝子（理研のＲＣＡＩにおける西田圭吾博士より提供）を、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションし、ピューロマイシンによって選択した。１週間後に、MX-hCD1dをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、続いて、FACSAria SorterによってｈＣＤ１ｄの発現に基づいて選別した。
　（ヒトＰＢＭＣの単離）
　健常な血液提供者由来のバフィーコートからヒトＰＢＭＣを得、Ficoll-Hypaque（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）の密度勾配遠心分離によって分離した。ＰＢＭＣ、およびいくつかの場合に磁気ビーズ（Miltenyi Biotec Inc.）分離によって精製したＣＤ１４＋単球を、ＰＢＳを用いて３回にわたって洗浄し、無血清の凍結保存培地Cellbanker2（JUJI Field Inc., Tokyo, Japan）を用いて、使用まで液体窒素に保存した。すべての試験は、理研の施設内審査委員会によって承認された。
　（ヒト樹状細胞（ＤＣ）の生成）
　磁気ビーズ（Miltenyi Biotec Inc.）を用いて単離したＣＤ１４＋細胞を、未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ）の生成のために使用した。ＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－４（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下において３日にわたって単球を培養して、ｉｍＤＣを生成した。
　（ｉＮＫＴ細胞株およびＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞株のインビトロ生成）
　ＮＫＴ細胞株を調製するために、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２の存在下においてα－ＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて、ＰＢＭＣをパルスした。１０～１４日後に、ＦＩＴＣ標識の抗ＶαｍＡｂを用いて、ヒトｉＮＫＴ細胞を、染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズ（Miltenyi Biotec Inc.）を用いて選択した。ヒトｉＮＫＴ細胞を、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５の存在下に維持した。
　Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞株を調製するために、ＺＯＬ（１００μｍｏｌ／Ｌ）および３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２の存在下においてＰＢＭＣを培養した。１０～１４日後に、ＦＩＴＣ標識の抗γ９ｍＡｂを用いて、γδＴ細胞を、染色し、抗ＦＩＴＣ磁気ビーズ（MiltenyiBiotec Inc.）を用いて選択した。ヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、３００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２の存在下に維持した。
　（ＲＮＡのインビトロ転写（ＩＶＴ））
　pSP64 Poly（A）ベクターにおけるＥＧＦＰ（enhanced Green Fluorescent Protein）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて切り出し、pGEM-4Zベクター（Promega, Madison, WI）にふたたびクローニングした。この試験に使用したＯＶＡプラスミドはこれまでに述べられている。ＭＡＲＴ－１用の発現プラスミド（pcDNA3 （＋）-MART-1）を単離した。ＩＶＴのために、これらのプラスミドを、制限酵素消化（ＥＧＦＰおよびＯＶＡのためのＢａｍＨＩ、ならびにＭＡＲＴ－１のためのＮｏｔＩ）によって直鎖化し、QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）によって精製し、鋳型として使用した。mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit（Ambion, Austin, TX）を用いることによって、ベクター上にあるＴ７プロモータ配列の制御下において、ＲＮＡを生成した。キットに基づくＤＮａｓｅＩを用いて鋳型ＤＮＡを消化した。ＩＶＴ　ＲＮＡを、それからRNeasyMini/Midi Kits（QIAGEN, Valencia, CA）よって精製し、水に溶離させた。ＲＮＡの完全性を、変性条件下におけるアガロースゲル電気泳動によって確認し、濃度を、分光光度計によって決定した。
　（ＴＣＲを導入したＰＢＬの調製）
　Ｔ細胞のＲＮＡエレクトロポレーションを、これまでに報告されている通りに実施した。簡単に説明すると、１０％のＦＣＳを含有しているＲＰＭＩにおける５０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｍＡｂ　ＯＫＴ３（Janssen pharmaceutical, Inc., Tokyo, Japan）および３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を用いて、１０６細胞／ｍＬのＰＢＬをインビトロにおいて刺激した。２または３日後に、Ｔ細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭを用いて１回洗浄し、ＯｐｔｉＭＥＭにおいて５×１０６／１００μＬの濃度に懸濁させた。１０μｇの各ＲＮＡを４ｍｍのキュベットに移し、１００μＬの細胞懸濁液を加え、ＢＴＸにおいてパルスした。パルス条件は、５００Ｖ、５ｍ秒の方形波パルスであった。エレクトロポレーション後ただちに、細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有している新しいＣＭに移し、３７℃においてインキュベートした。
　（サイトカイン産生アッセイ）
　ＮＫＴ－ＴＣＲ　ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後に、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞およびＶα２４－Ｖβ１１－細胞を、FACS Ariaによって選別し、応答細胞として使用した。刺激細胞について、ＣＤ１ｄ　２９３を、５００ｎｇ／ｍＬのα－ＧａｌＣｅｒありまたはなしで、２４時間にわたってパルスした。いくつかの実験において、ＣＤ１ｄ　２９３を、１０μｍｏｌ／ＬのＺＯＬを用いて２４時間にわたって処理し、刺激細胞として使用した。１×１０５の応答細胞を、１×１０４の刺激細胞とともに２４時間にわたって共培養した。培養上清を回収し、インターフェロンγ産生を、ＩＦＮ－γ　ＥＬＩＳＡ（BD）によって測定した。
　（ＤＣ成熟）
　ＮＫＴ－ＴＣＲ　ｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたＴ細胞を、選別し、それから１００ｎｇ／ｍＬのα－ＧａｌＣｅｒの存在下または非存在下において、２４時間にわたって自家の未成熟ＤＣとともに共培養した（１：１）。ポジティブコントロールとして１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを使用した。２４時間後に、ＤＣを、フローサイトメトリーによってＣＤ４０およびＣＤ８６について分析し、培養上清におけるＩＬ１０およびＩＬ１２ｐ７０の産生を、ＥＬＩＳＡ（BD）によって測定した。
　（細胞傷害性アッセイ）
　γδＴ細胞、またはＮＫＴ－ＴＣＲをエレクトロポレーションしたγδＴ細胞の細胞傷害活性を、製造者の指示にしたがってＬＤＨアッセイキット（Takara Bio Company）を用いて、分析した。標的細胞として、ＣＤ１ｄ　２９３を、５００ｎｇ／ｍＬのα－ＧａｌＣｅｒまたは１０μｍｏｌ／ＬのＺＯＬのありまたはなしで、２４時間にわたって処理した。１×１０４の標的細胞を、１０×１０５のエフェクタ細胞とともに、１％ＦＣＳ／ＲＰＭＩにおいて１２時間にわたって共培養した。培養上清を、テトラゾリウム塩を含んでいる新たに調製したReaction Mixtureとともにインキュベートし、吸光度を４９０ｎｍにおいて測定した。データは、独立した３回の実験に基づく３つ１組のウェルの平均±標準偏差である。バックグラウンドコントロールの値を引いた後に、細胞傷害性の値（％）を以下の通りに算出した。
細胞傷害性（％）＝｛（エフェクタ：標的細胞混合物－エフェクタ細胞コントロール）－自然発生的な標的細胞コントロール｝／（最大の標的細胞コントロール－自然発生的な標的細胞コントロール）×１００。
　（統計分析）
　インビトロデータにおける差異を、マンホイットニーＵ検定を用いて分析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
　〔実施例１：ジャーカット細胞株を用いた改変型免疫細胞の作製〕
　健常なボランティアから確立されているＮＫＴ細胞株由来のＮＫＴ細胞ＴＣＲのＶα鎖およびＶβ鎖を最初にサブクローニングした。インビトロ転写手法によって、ＤＮＡにおけるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のコード領域（ＴＣＲα鎖：配列番号１、ＴＣＲβ鎖：配列番号２）からそれぞれのｍＲＮＡを生成した。エレクトロポレーションによってジャーカットＴ細胞に両方のＴＣＲ鎖をトランスフェクトした後に、抗Ｖα２４と抗Ｖβ１１Ａｂとの組合せ、またはＣＤ３と抗６Ｂ１１もしくは抗ＣＤ１ｄ／Ｇａｌ－テトラマーとの組合せを用いたサイトメトリーによってＮＫＴ－ＴＣＲの発現を決定した（図１Ａ）。
　これまでに報告されている通り、Ｖα２４およびＶβ１１の両方の発現は、抗６Ｂ１１ｍＡｂによって評価された。ＮＫＴ－ＴＣＲの発現レベルは、６～１２時間に上方制御され、４８時間以降に低下した（図１Ｂ）。特に、９０％を超えるジャーカット細胞上におけるＶα２４およびＶβ１１の発現を６時間以降に検出した。それから、細胞を、α－ＧａｌＣｅｒ結合ＣＤ１ｄ抗体の固相とともに培養した後に、ＴＣＲシグナルの下流を評価した。ＭＡＰＫは刺激後の１０分間にリン酸化されており（図１Ｃ）、ＴＣＲシグナル伝達は、Ｖα２４およびＶβ１１のＴＣＲのｍＲＮＡをトランスフェクトしたジャーカット細胞において明らかに増強されたことを示している。
　以上のように、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のｍＲＮＡを導入することによって、ジャーカット細胞上に機能的なＮＫＴ－ＴＣＲを一過性に発現している改変型免疫細胞を、作製できた。
　〔実施例２：健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来の活性化Ｔ細胞を用いた改変型免疫細胞の作製〕
　抗ＣＤ３ＡｂおよびＩＬ－２によって３日間かけて生成された初代の活性化Ｔ細胞に、Ｖα２４およびＶβ１１のＴＣＲ鎖のｍＲＮＡをトランスフェクトした。ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞上におけるＴＣＲのα鎖（Ｖα２４）およびβ鎖（Ｖβ１１）の発現を、抗６Ｂ１１ｍＡｂによって評価した。６Ｂ１１＋細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞由来の６０～７０％であり、両方の鎖がそれらの細胞表面に明らかに発現されていることを示している（図２Ａおよび２Ｂ）。
　α－ＧａｌＣｅｒ結合ＣＤ１ｄ抗体の固相を用いた刺激後に、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋トランスフェクトした（以下、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋と記載する）細胞およびＶα２４－Ｖβ１１－非トランスフェクトの（以下、ＮＫＴ－ＴＣＲ－と記載する）細胞におけるＴＣＲシグナル伝達を分析した。ＮＫＴ－ＴＣＲ－細胞ではなく、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋細胞は、ＭＡＰキナーゼシグナルの活性化を示した（図２Ｃの右欄）。
　さらに、α－ＧａｌＣｅｒをロードした細胞（ＣＤ１ｄ－ＨＥＫ２９３細胞／Ｇａｌ）とともに、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋細胞を共培養することによって、サイトカイン産生を分析した。ＮＫＴ－ＴＣＲ＋細胞は、ＩＬ－４ではなく、インターフェロンγを、α－ＧａｌＣｅｒ依存的により多く産生した。しかし、ＮＫＴ－ＴＣＲ－細胞およびトランスフェクションなしの活性化Ｔ細胞の両方は、インターフェロンγを産生しなかった（図２Ｄ）。したがって、Ｖα２４ＴＣＲおよびＶβ１１ＴＣＲのｍＲＮＡをトランスフェクトした活性化Ｔ細胞（ＮＫＴ－ＴＣＲ＋細胞）は、インターフェロンγ産生について機能的であり、Ｔｈ１型に傾いたこれらの６Ｂ１１＋細胞が、Ｔｈ１型のＮＫＴ細胞を４８時間にわたって模倣し得ることを示している。
　続いて、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋細胞のアジュバント効果を確認した。ＮＫＴ細胞は、インビボおよびインビトロにおいて表現型および機能の両方においてＤＣの成熟を誘導するとこれまでに報告されている。ＮＫＴ－ＴＣＲ＋Ｔ細胞がＤＣを成熟させ得るか否かを評価した。成熟マーカーおよびサイトカイン産生を、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋Ｔ細胞および自家の単球由来の成熟ＤＣを培養した後に、評価した。
　ＮＫＴ－ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＤＣ上の共刺激分子の上方制御は、ＬＰＳ刺激による上方制御と同様に認められた（図３Ａ）。また、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋Ｔ細胞によって成熟されたＤＣにおいて、ＩＬ－１２ｐ７０の産生は、抗原特異的に顕著に認められ、ＩＬ－１０の産生は、ほとんど認められなかった（図３Ｂ）。Ｌ－１２ｐ７０は、免疫を刺激する方向に作用し、ＩＬ－１０は、逆に免疫を抑制する方向に作用する。したがって、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋Ｔ細胞によるＤＣの成熟は、免疫誘導にとってＬＰＳ刺激よりはるかに好ましい。
　〔実施例３：健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のγδＴ細胞を用いた改変型免疫細胞の作製〕
　γδＴ細胞は、自然リンパ球（innate lymphocytes）の１つとしてよく知られている。γδＴ細胞のなかでもγ９型のγδＴ細胞は、いくつかの内因性のγδＴ細胞リガンドがＡＰＣ上において上方制御されている、ゾレドロン酸（ＺＡ）をのせた細胞によって増殖され得る。図４に示すように、末梢血において非常に低頻度にしかＮＫＴ細胞が認められない人でさえ、適切な数のγδＴ細胞を有している。さらに、γδＴ細胞は、ＮＫＴ細胞よりはるかに多く増殖する可能性を有している（図４Ａおよび４Ｂ）。
　明らかに、γδＴ細胞は、ＮＫＴ－ＴＣＲを通常には発現していないが、エレクトロポレーションによるトランスフェクション後に、γ９δＴＣＲとともにＮＫＴ－ＴＣＲを発現し得る（図５）。これらのＮＫＴ－ＴＣＲ＋細胞を、ＺＡをのせたＣＤ１ｄ－ＨＥＫ２９３細胞と共培養すると、γδＴ細胞はインターフェロンγを産生し、これらがγδＴ細胞であることを確認した。
　γδＴ細胞にＮＫＴ－ＴＣＲを発現させたことによる機能の違いを調べるため、（１）ＺＡで刺激を与えて培養したγδＴ細胞と、（２）ＣＤ１ｄ－ＨＥＫ２９３細胞／Ｇａｌと共培養した上記ＮＫＴ－ＴＣＲ＋γδＴ細胞とを比較した。その結果を図６に示す。刺激または共培養から７２時間後における細胞数を計測したところ、細胞増殖に顕著な違いがあった（図６の左パネル）。同様に、刺激または共培養から４８時間後にインターフェロンγの産生量をＥＬＩＳＡによって測定したところ、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋γδＴ細胞において産生量の顕著な増加が認められた（図６の右パネル）。
　以上より、ＮＫＴ－ＴＣＲを発現させ、かつα－ＧａｌＣｅｒの刺激を与えることによって、γδＴ細胞の細胞増殖能およびインターフェロンγの産生量を向上させることが示された。
　以上のことから、末梢血に相対的に多く存在し、かつ臨床用途に十分な量に増殖させ得るγδＴ細胞を改変することによって、γδＴ細胞の利用能を大きく向上させ得ることが分かった。また、個体差に基づいて、γδＴ細胞は、ＺＡ単独では活性化されないか、または刺激が不十分な場合を生じるが、この改変型γδＴ細胞は、α－ＧａｌＣｅｒを利用する選択肢を新たにもたらす。よって、この改変型γδＴ細胞は、γδＴ細胞を利用できないか、またはγδＴ細胞の利用有効性の低い個体を実質的に減少させ、より多くの個体に治療の機会を与え得る。
　さらに、以上の各実施例に共通して、各細胞に導入されているのは、ＮＫＴ細胞ＴＣＲのα鎖およびβ鎖のｍＲＮＡである。実施例１および２において非常によく証明されている通り、細胞表面におけるα鎖およびβ鎖が時間の経過にしたがって減少している。しかし、細胞数が減少している訳ではない。つまり、ＮＫＴ－ＴＣＲ＋細胞は、導入されたｍＲＮＡの分解によって、ＮＫＴ細胞ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の発現量が徐々に低下し、最終的にｍＲＮＡの導入前の状態に戻っているに過ぎない。このため、これらの実施例で得られた細胞を免疫療法に適用することは、遺伝子治療に該当しない。導入される外来因子が残留しないこれらの実施例の細胞は、従来の遺伝子治療と比較にならないほど、極めて低い副作用しか示さないことが明らかである。自家細胞を使用する免疫細胞療法に、これらの実施例の細胞を適用する場合、実質的に副作用はないとみなし得る。
　また、遺伝子治療を実施するための規制を受けないため、これらの実施例の細胞を扱う場所にほとんど制限がない。時間の経過によって細胞の性質が生体内の状態に戻るので、細胞の作製に使用した器具および生体由来の材料を、医療施設において通常に使用される器具などと同等の処理方法によって処分し得る。
　〔実施例４：改変型免疫細胞のインビボ抗腫瘍効果の確認〕
　ＮＫＴ－ＴＣＲを新たに発現させた免疫細胞によるインビボ抗腫瘍効果を検討するため、ＮＫＴ－ＴＣＲを発現させたγδＴ細胞（実施例３のＮＫＴ－ＴＣＲ＋γδＴ細胞；以下、改変型免疫細胞と称する）を用いて検証を行った。
　２ｘ１０６個のＫ５６２細胞を皮下接種された免疫不全マウスを、改変型免疫細胞による抗腫瘍効果を評価するモデル動物として準備した。改変型免疫細胞を実施例３と同じ手順にしたがって作製した。以下の２種類の処理物を、上記モデル動物における腫瘍接種部位に対して接種の７日後に投与した（それぞれｎ＝２）。
（１）２ｘ１０６個の改変型免疫細胞を懸濁させた、１００μｌの培地（図７における「γδ＋ＮＫＴ　ＴＣＲ」；濃い線）
（２）１００μｌの培地のみ（図７における「non-treated」；薄い線）。
　上記接種の１２～２４日後に測定したモデル動物における腫瘍サイズに基づいて、改変型免疫細胞による抗腫瘍効果を評価した結果を図７に示す。図７に示す通り、改変型免疫細胞の投与を受けたモデル動物はいずれも、接種の１２～２４日後において、腫瘍サイズの増大を示さなかった。一方、改変型免疫細胞の投与を受けなかったモデル動物ではいずれも、時間の経過とともに（特に接種の１７日以降に）腫瘍サイズの増大が認められた。このことから、上記改変型免疫細胞（ＮＫＴ－ＴＣＲ＋γδＴ細胞）は、非常に優れた抗腫瘍活性をインビボにおいて示すことが明らかになった。
　〔比較例：ＮＫＴ－ＴＣＲを導入したＮＫ細胞の有効性〕
　ＮＫＴ－ＴＣＲをＮＫ細胞に導入した場合にも、実施例３の改変型免疫細胞と同様の効果を示すか検討するため、上述の通りに採取した健常者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ２を含む培地で培養した。細胞の増殖を確認した後に、ＮＫＴ－ＴＣＲを発現させるためのｍＲＮＡを細胞に導入し、ＮＫＴ－ＴＣＲを表面発現している細胞集団を確認した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の培養から所定の日数の経過後において、フローサイトメトリーによって、細胞の増殖および細胞集団について確認した結果を図８に示す。
　図８における矢印の左側に示す通り、培養開始の３日後および７日後のそれぞれの時点におけるフローサイトメトリーによって、細胞の増殖を確認した。また、７日後の時点では、他の蛍光標識抗体を用いてさらに分析して、ＣＤ３＋ＣＤ５６－細胞群（11.0％）、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞群（72.1％）、ＣＤ１６＋ＣＤ５６－細胞群（76.4％）、ＣＤ１６－ＣＤ５６＋細胞群（17.4％）が存在することを確認した。培養開始の８日後の時点でＮＫＴ－ＴＣＲ　ｍＲＮＡ（Ｖα２４ｍ　ＲＮＡおよびＶβ１１　ｍＲＮＡ）をエレクトロポレーションし、その６時間後にＶα２４＋Ｖβ１１＋細胞のフローサイトメトリーで確認した。図８の矢印の右側に示す通り、ＣＤ３＋細胞では抗６Ｂ１１ｍＡｂに反応する細胞が41.0％、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞が71.5％の割合であったのに対し、ＮＫ細胞が含まれるＣＤ５６＋細胞では抗６Ｂ１１ｍＡｂに反応する細胞が2.31％、Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞が8.5％であった。
　以上の通り、ＣＤ３＋細胞と比べて、ＮＫ細胞ではＮＫＴ－ＴＣＲの発現自体が抑えられてしまった。したがって、実施例３において作製したようなＣＤ３＋細胞に基づく改変型免疫細胞と同様の効果を発揮する細胞は、ＮＫ細胞を材料にした場合には極めて非効率にしか得らないことが明らかになった。以上の実験は、ＮＫＴ－ＴＣＲのｍＲＮＡをＮＫ細胞に導入すれば、ＮＫＴ細胞様の機能を示す細胞が得られるのではないかという、当業者にとって通常の予想を裏切る、極めて予想外の結果を示した。したがって、実施例３に示した通り、免疫療法用の改変型免疫細胞の作製には、ＣＤ３＋細胞が非常に適していることが、明らかになった。
　本発明は上述した各実施形態および各実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態および各実施例にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
　本発明は、免疫細胞療法に利用することができる。特に、本発明は、直接に細胞傷害性免疫を発揮するエフェクター細胞および他の免疫細胞を活性化させる免疫誘導剤として利用可能である。

Claims (13)

  1. 　外因性の不変型のＴ細胞受容体α鎖および当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成する外因性のＴ細胞受容体β鎖をその細胞表面に発現している、改変型免疫細胞。
  2. 　不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでいる、改変型免疫細胞。
  3. 　不変型の上記Ｔ細胞受容体α鎖はＶα２４であり、上記Ｔ細胞受容体β鎖はＶβ１１である、請求項１または２に記載の改変型免疫細胞。
  4. 　（ｉ）可変型のＴ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖、または（ｉｉ）Ｔ細胞受容体γ鎖およびＴ細胞受容体δ鎖その細胞表面にさらに発現している、請求項１～３のいずれか１項に記載の改変型免疫細胞。
  5. 　上記改変型免疫細胞の材料である細胞は、末梢血由来のγδＴ細胞である、請求項４に記載の改変型免疫細胞。
  6. 　ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤によって活性化された、請求項１～５のいずれか１項に記載の改変型免疫細胞。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の改変型免疫細胞を含んでいる、免疫誘導剤。
  8. 　ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤をさらに含んでいる、請求項７に記載の免疫誘導剤。
  9. 　不変型のＴ細胞受容体α鎖をコードするポリヌクレオチドおよび当該Ｔ細胞受容体α鎖と二量体を形成するＴ細胞受容体β鎖をコードするポリヌクレオチドを、ＣＤ３陽性細胞に導入することを包含している、改変型免疫細胞を製造する方法。
  10. 　２つの上記ポリヌクレオチドのそれぞれにおけるコード領域は、ＲＮＡによって形成されている、請求項９に記載の方法。
  11. 　上記改変型免疫細胞の材料は、末梢血、または末梢血を培養した試料から採取されている、請求項１０に記載の方法。
  12. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法によって製造された改変型免疫細胞を、ＣＤ１ｄリガンドおよび／またはγδＴ細胞の増殖活性化剤とともに共培養することを包含している、改変型免疫細胞を活性化する方法。
  13. 　上記ＣＤ１ｄリガンドはＣＤ１ｄと結合している、請求項１２に記載の方法。
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