JP5288183B2

JP5288183B2 - 遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞からのリンパ球のインビトロ分化誘導

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Publication number: JP5288183B2
Application number: JP2008536352A
Authority: JP
Inventors: 宏若尾; 眞一郎藤井; 佳奈子清水; 明彦古関; 克谷口; 淳郎小倉; 宏河本
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2006-09-25
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2027-09-21
Also published as: WO2008038579A1; JPWO2008038579A1; EP2083076A1; US20110020932A1

Description

本発明は、機能的な細胞、例えばＮＫＴ細胞の製造方法を提供する。

ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞は、種々のサイトカインを産生し免疫制御機能を有する免疫細胞である。そこで、この特性を活かした癌、自己免疫疾患に対する治療への応用が考えられているが、その存在量の希少さ故に実験に十分量の細胞を調達することは非常に困難である。さらに生体内より採取したＮＫＴ細胞をたとえ体外で増やせたとしても機能欠損が存在する場合は治療などには用いることはできない。したがって、基礎研究、治療に十分量の機能的なＮＫＴ細胞をインビトロで得ることを可能にする方法の開発が切望されている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）からＮＫＴ細胞を作り出すことができれば十分量の目的細胞が得られると考えられる。しかしながら、ＥＳ細胞からＴ細胞を分化誘導させる方法は報告されているものの（特許文献１及び非特許文献１）、この方法ではＮＫＴ細胞を作り出すことはできない。

なお、本発明者らは、ＮＫＴ細胞をドナー細胞として用いるクローン動物の作製方法、該方法によって得られるクローン哺乳動物、該クローン動物の胚から胚性幹（ＥＳ）細胞を得る方法並びに該方法によって得られるＥＳ細胞を以前に報告している（特許文献２）。
米国特許出願公開第20040171148号国際公開第2006/018998号 Schmittら, Nature Immunology vol.5, p410-417 (2004)

本発明は、ＮＫＴ細胞等の機能的な細胞を高効率に生成する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞を用いることにより該遺伝子型を有する所定の細胞、例えばＮＫＴ細胞を、インビトロで大量かつ高効率に生成できることを見出し、もって本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである：
〔１〕特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する機能的な分化細胞の製造方法であって、
該遺伝子型を有する幹細胞を培地中で培養して、該幹細胞由来の分化細胞を得ることを含む、方法；
〔２〕該遺伝子型を有する幹細胞が、該遺伝子型を有する細胞の核の移植により樹立された幹細胞である、上記〔１〕の方法；
〔３〕幹細胞がＥＳ細胞である、上記〔１〕又は〔２〕の方法；
〔４〕抗原受容体がＴ細胞受容体である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法；
〔５〕Ｔ細胞受容体がＮＫＴ細胞特異的Ｔ細胞受容体である、上記〔４〕の方法；
〔６〕ＮＫＴ細胞の核を除核卵母細胞に移植することにより樹立されたＥＳ細胞を培地中で培養して、ＮＫＴ細胞系譜の細胞を得ることを含む方法である、上記〔１〕の方法；
〔７〕ＮＫＴ細胞系譜の細胞がＮＫＴ細胞である、上記〔６〕の方法；
〔８〕培養がフィーダー細胞の存在下で行われる、上記〔１〕〜〔７〕の方法；
〔９〕フィーダー細胞がＮｏｔｃｈリガンドを発現する、上記〔８〕の方法；
〔１０〕Ｎｏｔｃｈリガンドがデルタファミリーのメンバーである、上記〔９〕の方法；
〔１１〕デルタファミリーのメンバーがＤｌｋ１である、上記〔１０〕の方法；
〔１２〕培養が、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−７及びＩＬ−１５からなる群より選ばれる１以上の因子を用いて行われる、上記〔８〕〜〔１１〕のいずれかの方法；
〔１３〕上記〔１〕〜〔１２〕のいずれかの方法により得られる、分化細胞；
〔１４〕分化細胞がＮＫＴ細胞である、上記〔１３〕の細胞。

本発明の方法によれば、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞から分化細胞（例、ＮＫＴ細胞）を、インビトロで大量かつ高効率に生成できる。本発明の方法はまた、本発明の方法により得られる細胞の移植が意図される場合、移植が意図される個体由来の幹細胞を用いることで免疫拒絶反応を回避できるという利点などを有する。

ＯＰ９細胞又はＯＰ９−ｄｌｋ細胞上で培養されたｎｔＥＳ細胞における各種ｍＲＮＡ発現を示す図である。ＮＫＴ７／ｃｏｎｔ：ＯＰ９細胞上で培養されたｎｔＥＳ細胞（クローン７）ＮＫＴ７／ｄｌｋ：ＯＰ９−ｄｌｋ細胞上で培養されたｎｔＥＳ細胞（クローン７） αＧａｌＣｅｒ提示ＤＣと共培養したＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞により放出された、培養液中のＩＦＮγ濃度を示す図である。ＥＳ−Ｔｃｅｌｌ：通常のＥＳ細胞から分化したＤＰ細胞ＥＳ−ＮＫＴ：ｎｔＥＳ細胞から分化させたＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋で規定されるＮＫＴ細胞Ｖα１４−ＮＫＴ：マウス個体より精製したＮＫＴ細胞 αＧａｌＣｅｒ提示ＤＣと共培養したＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞により放出された、培養液中のＩＬ−４濃度を示す図である。略号は図２と同様である。ＮＫＴ細胞欠損マウスにＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞を輸注後にＯＶＡとα−ＧａｌＣｅｒを投与し、一週間後にリンホーマ細胞ＥＧ７を皮下投与した際の腫瘍径の変化を示す図である。ＷＴｎｏｎ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにリンホーマ細胞ＥＧ７を皮下投与ＷＴＯＶＡ＋Ｇａｌ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＯＶＡとα-ＧａｌＣｅｒを投与し、一週間後にリンホーマ細胞ＥＧ７細胞を皮下投与Ｊα−／−２×１０^６ＮＫＴ＋ＯＶＡ＋Ｇａｌ：ＮＫＴ細胞欠損マウスにＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞を輸注後にＯＶＡとα-ＧａｌＣｅｒを投与し、一週間後にリンホーマ細胞ＥＧ７を皮下投与ＮＫＴ細胞欠損マウスにＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞を輸注後にＯＶＡとα-ＧａｌＣｅｒを投与し、一週間後にリンホーマ細胞ＥＬ４を皮下投与した際の腫瘍径の変化を示す図である。ＷＴｎｏｎ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにリンホーマ細胞ＥＬ４を皮下投与ＷＴＯＶＡ＋Ｇａｌ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＯＶＡとα-ＧａｌＣｅｒを投与し、一週間後にリンホーマ細胞ＥＬ４を皮下投与Ｊα−／−２×１０^６ＮＫＴ＋ＯＶＡ＋Ｇａｌ：ＮＫＴ細胞欠損マウスにＴＣＲＶβ^＋/αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞を輸注後にＯＶＡとα-ＧａｌＣｅｒを投与し、一週間後にリンホーマ細胞ＥＬ４を皮下投与

本発明は、機能的な細胞のインビトロ製造方法、及びそれにより得られる細胞を提供する。本発明の方法は、特定の抗原受容体遺伝子（例、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体）について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞を培地中で培養して、該幹細胞由来の分化細胞を得ることを含み得る。

本発明で用いられる幹細胞は、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有するものである限り特に限定されず、例えば、核移植により樹立された幹細胞、ＥＳ細胞になるように遺伝子操作された体細胞（Takahashi and Yamanaka, Cell 126: 663-676 (2006)）であり得る。幹細胞としてはまた、ＥＳ細胞又は造血幹細胞等の体性幹細胞が挙げられるが、ＥＳ細胞が好ましい。特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞が核移植により樹立された幹細胞である場合、このような幹細胞は自体公知の方法により作製することができる。例えば、このような幹細胞は、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する細胞の核を、除核した細胞（例、卵母細胞）に移植し、所定の操作に付すことにより作製することができる（例、Wakayamaら，Nature 394: 369-374 (1998); Inoueら, Biol. Reprod. 69: 1394-1400 (2003); WO2006/018998参照）。

幹細胞が核移植により樹立された幹細胞である場合、核が抽出される細胞は、抗原受容体遺伝子の再構成が終了している細胞であれば特に限定されないが、抗原受容体の発現細胞であってもよい。このような細胞としては、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞が挙げられる。核が抽出される細胞はまた、末梢血由来の細胞であり得る。

特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞は、任意の哺乳動物種に由来する細胞であり得る。このような哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタが挙げられる。幹細胞が核移植により樹立された幹細胞である場合、核移植により樹立された幹細胞はまた、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する細胞の核を当該核と同種の哺乳動物由来の除核細胞に移植することにより樹立された細胞、又は当該核を当該核と異種の哺乳動物由来の除核細胞に移植することにより樹立された細胞であり得る。

好ましくは、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞は、抗原受容体遺伝子の再構成が終了している免疫細胞の核を有する幹細胞であり得、より好ましくは、ＮＫＴ細胞の核を有するＥＳ細胞であり得る。この場合、幹細胞としては、例えば、ＷＯ２００６／０１８９９８に開示されるものが好適に使用され得る。

ＮＫＴ細胞は、その存在割合は少ないが免疫系で制御的な役割を担っているリンパ球の一種である。ＮＫＴ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ受容体の２つの抗原受容体を有する。ＮＫＴ細胞は通常のＴ細胞やＮＫ細胞とは異なる特異的なレパートリーを発現している。例えばマウスのβ鎖についてはＮＫＴ細胞の９０％以上は主にＶβ８、他にＶβ７やＶβ２という限られたレパートリーを発現し、α鎖については均一なＶα１４−Ｊα２８１を発現している。この均一なＴＣＲα鎖は、ＴＣＲ遺伝子の再構成の際に、Ｖ及びＪ遺伝子群からＶα１４遺伝子とＪα２８１遺伝子とが選ばれゲノム上で再構成された結果として作製される（Taniguchi et al., Annu Rev Immunol 21: 483-513 (2003)）。ヒトではマウスのＶα１４と相同性の高い非多型性のＶα２４、及びＶβ８．２に近縁のＶβ１１の組み合わせであることが知られている。

培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。培地はまた、血清又は血清代替物を含んでいてもよい。培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むものであり得る。

幹細胞の培養は、フィーダー細胞の存在下又は不在下で行われ得るが、例えば、ＮＫＴ細胞を製造する場合には、フィーダー細胞（例、ＯＰ−９細胞等のストローマ細胞）の存在下で行われ得る。フィーダー細胞は、初代培養細胞又は細胞株であり得る。フィーダー細胞が由来する哺乳動物種は、幹細胞が由来する哺乳動物種と同様であり得、フィーダー細胞及び幹細胞の双方が由来する動物種が同一であることもまた好ましい。フィーダー細胞はまた、遺伝学的に改変されていてもよい。例えば、フィーダー細胞は、所望の因子を発現するように、又はその因子の発現を増強するように外来的に遺伝子が導入されたものであり得る。導入される遺伝子は、製造されるべき細胞の種類に応じて適宜選択され得るが、例えば、導入される遺伝子はＮｏｔｃｈリガンドであり得る。

Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｎｏｔｃｈ受容体に対する結合因子である。例えば、ヒトでは、Ｎｏｔｃｈ受容体として、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、Ｎｏｔｃｈ−４が同定されている。Ｎｏｔｃｈリガンドは、製造されるべき細胞の種類に応じて適宜選択され得るが、ＮｏｔｃｈリガンドとしてはＤｌｋファミリーのメンバーを用いることもまた好ましい。Ｄｌｋファミリーのメンバーとしては、例えば、デルタ−１、デルタ−３、デルタ−４、デルタ様１（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１：Ｄｌｋ１）、Ｄｌｋ３、Ｄｌｋ４が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドは改変されたものであってもよい。Ｎｏｔｃｈリガンドはまた、天然由来成分又は組換えタンパク質として用いられてもよい。Ｎｏｔｃｈリガンドの詳細については、例えば、Furie et al, Cell 53: 505-518 (1988); Suzuki et al, EMBO J. 6: 1891-1897 (1987)；米国特許出願公開第20040171148号を参照のこと。

本発明の方法における培養ではまた、用いる幹細胞及び作製されるべき分化細胞の種類に応じて所定の因子が適宜使用され得る。例えば、ＮＫＴ細胞の作製を目的とする場合には、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−７及びＩＬ−１５等の因子が用いられる。これらの因子の濃度はＮＫＴ細胞の分化を誘導可能である限り特に限定されないが、例えば、約５〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられ得る。

その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。

本発明の方法により製造される細胞は、幹細胞からの分化により生成し得る任意の細胞であり得、例えば、Ｂ細胞等のＢ細胞系譜の細胞（例、ＣＤ１９^＋細胞）、顆粒球等の顆粒球系譜の細胞（例、Ｇｒ−１^＋細胞）、Ｔ細胞等のＴ細胞系譜の細胞（例、ＣＤ４^＋及び／又はＣＤ８^＋細胞）、ＮＫＴ細胞等のＮＫＴ細胞系譜の細胞（例、ＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ提示ＣＤ１ｄ^＋細胞）などの免疫細胞が挙げられる。より詳細には、本発明の方法により製造される細胞がＮＫＴ細胞である場合、製造されたＮＫＴ細胞は機能的なＮＫＴ細胞であり得、例えば、αＧａｌＣｅｒ提示樹状細胞と相互作用することによりＩＦＮ−γ、ＩＬ−４等のサイトカインを産生し得、また、免疫アジュバント効果を発揮し得（例、樹状細胞の成熟促進、抗原特異的Ｔ細胞の誘導）、さらには癌細胞の増殖抑制作用を示し得る。本発明の方法は、このような機能的な細胞を非常に効率的に生成できるという点で優れている。

本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。

（材料及び方法）
ｎｔＥＳ細胞
末梢Ｔリンパ球の一種であるＮＫＴ細胞由来の核移植（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｆｅｒ：ｎｔ）ＥＳ細胞としては、ＮＫＴ細胞より直接核移植法によって先に樹立したＥＳ細胞（ＷＯ２００６／０１８９９８参照）のうちクローン７の細胞を用いた。

ＯＰ９細胞培地
細胞培養に用いたＯＰ９細胞培地は、ＭｉｌｌｉＱ水１リットルにつき１０ｇのαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、２．２ｇの重炭酸ナトリウム（和光純薬）、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、２０％（ｖ/ｖ）の牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＥｑｕｉｔｅｃｈＢｉｏＩｎｃ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，ＴＸ）を含むように調製した培地を、Ｃｏｒｎｉｎｇ社のボトルフィルター（０．４５μｍ）に通して滅菌することにより作製した。

ＯＰ９細胞及びＯＰ９−ｄｌｋ細胞
ＯＰ９細胞は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターＲｉｋｅｎＣｅｌｌＢａｎｋより購入した細胞（ＲＣＢ１１２４）を使用した。ｎｏｔｃｈのリガンドであるｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１を強制発現させたＯＰ９細胞（ＯＰ９−ｄｌｋ細胞）は、既報（Schmitt et al., Nature Immunology 5: 410-417 (2004)）に従い調製した。マウスｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１は、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウス胸腺のｃＤＮＡライブラリから取得した。ＩＲＥＳ−ヒトＮＧＦＲの構造を持つレトロウイルスのＩＲＥＳの上流にｄｌｋを挿入し、ＯＰ９細胞に形質導入した後、抗ヒトＮＧＦＲに対するモノクローナル抗体を用いてその発現を確認した。

ＯＰ９細胞、ＯＰ９−ｄｌｋ細胞及びｎｔＥＳ細胞の維持
ＮＫＴ細胞由来のｎｔＥＳ細胞（クローン７）は、２０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社，２×１０^３Ｕ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）中において、マウス胎児線維芽細胞上で培養維持された。またＯＰ９細胞及びＯＰ９−ｄｌｋ細胞は、９０％コンフルエントで１／４に分割し継代維持された。ｎｔＥＳ細胞との共培養に供されるときは完全にコンフルエントになった後さらに２日以上おいたものを使用した（以下、分化誘導用ＯＰ９細胞及びＯＰ９−ｄｌｋ細胞と称する）。

ＮＫＴ細胞出現の確認
ＮＫＴ細胞はＦＡＣＳ（Fluorescence activated cell sorting）法によって確認した。具体的には、ＦＩＴＣ標識された抗マウスＴＣＲＶβ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）並びにＰＥ標識されたα−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）がのせられたＣＤ１ｄダイマー分子（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）の双方で染色されるもの（αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋）をＮＫＴ細胞と規定した。またネガティブコントロールとしてビヒクル分子がのせられたＰＥ標識ＣＤ１ｄダイマー分子を用いた。

実施例１：ｎｔＥＳ細胞の分化誘導
ＬＩＦの存在下クローン７を３．５ｃｍ培養皿で２０−３０％コンフルエントまで培養したものをリン酸バッファー（ＰＢＳ）で２回洗浄後、ＴＥ（トリプシン／ＥＤＴＡ，Ｓｉｇｍａ社）を加えて３７℃のインキュベーター中で５分静置後、電動ピペットでよく攪拌し５００×ｇで５分間遠心分離して上清を除去後、細胞数を計測した。これらの細胞をＯＰ９細胞培養液で懸濁し、分化誘導用のＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞上に撒いた（各１．０×１０^５／１０ｃｍ培養皿）。その後、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中に３日静置させ培養液を交換した。さらに２日間培養を継続し、ｍｅｓｏｄｅｒｍ（中胚葉）群の細胞を誘導した。これらの中胚葉細胞群はＴＥ処理によってＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞と分離された。共培養細胞はＰＢＳ、４ｍｌで二度洗浄した後、培養皿一枚当たり４ｍｌのＴＥを入れ３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中に５分間静置後８ｍｌのＯＰ９細胞培養液で中和し電動ピペットでよく攪拌し再び３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中に３０分間静置した。上清を回収して細胞数を計測した後、１．０×１０^６の中胚葉細胞群を新たに分化誘導用のＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞上（１０ｃｍ培養皿）に撒き直した。この時から、ＯＰ９細胞培養液中にはマウスｆｌｔ３−リガンド（ｆｌｔ３Ｌ）（Ｒ＆Ｄ社）を５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。その後２日おきに培養液並びにｆｌｔ３Ｌを交換した。また共培養開始後７日目からはマウスＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ社）、ヒトＩＬ−１５（Ｒ＆Ｄ社、ＯＰ９−ｄｌｋ細胞との共培養時のみ）も同時に各５ｎｇ／ｍｌの濃度で培養液中に添加し、培養液とともに２日ごとに交換した。この状態で血液・リンパ球系の幹細胞（ｈｅｍａｔｏｂｌａｓｔ，ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ)を出現させた。その後これらの細胞数が数百万になるまで培地交換とサイトカインの交換を続けた。その後分化誘導用のＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞の６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０^６の濃度で細胞を撒き直し、ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ（未熟なＴ、Ｂ細胞のコロニー）を形成させた（共培養開始後１３−１６日で出現）。ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅがＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞を全て覆い尽くすまで上記のように培地交換とサイトカインの交換を続けた。その後はこれらのｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅの細胞を電動ピペットでよく攪拌しＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞から分離し、新たに分化誘導用ＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞上（１０ｃｍ培養皿）に撒き直した。その後も培地、サイトカイン交換を２日ごとに行い培養を継続した。さらに細胞数が１０ｃｍ培養皿あたり１×１０^８を超えた時点での別の分化誘導用ＯＰ９細胞もしくはＯＰ９−ｄｌｋ細胞（１０ｃｍ培養皿）上に分割し、増殖させた。
本実験では核移植技術によってできたｎｔＥＳ細胞（クローン７）と並行して通常の受精卵より樹立したＥＳ細胞を用いて実験が正常に進行しているか否かを確認した。即ち、後者の細胞を用いるとＯＰ９−ｄｌｋ細胞上ではＣＤ４^＋ＣＤ８^＋の二重陽性Ｔ細胞（ＤＰ細胞）が産生され、ＯＰ９細胞上ではＢ細胞が生ずるはずである。

１）ＯＰ９細胞を用いたＢ細胞及び顆粒球の分化誘導
これらの細胞は抗マウスＣＤ１９、及び抗マウスＧｒ−１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）によって確認した。ＯＰ９細胞上ではクローン７からも通常のＥＳ細胞からもＣＤ１９^＋（Ｂ細胞マーカー）、Ｇｒ−１^＋（顆粒球マーカー）の細胞が出現するのに対してＯＰ９−ｄｌｋ細胞を用いた場合ではこれらの細胞は生成しなかった。

２）ＯＰ９−ｄｌｋ細胞を用いたＮＫＴ及びＴ細胞分化誘導
先の報告（Schmitt et al., Nature Immunology 5: 410-417 (2004)）で示されているように通常のＥＳ細胞（Ｍ１）をＯＰ９−ｄｌｋ細胞上で培養・分化させた場合はＣＤ４^＋ＣＤ８^＋のＤＰ細胞産生が見られた。一方、クローン７をＯＰ９−ｄｌｋ細胞上で培養・分化させた場合はこれらＤＰ細胞に加えてＣＤ８^＋ＳＰ細胞、ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻細胞などの細胞の出現が見られた。この時細胞を抗マウスＴＣＲＶβとαＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマーで染色するとクローン７由来のリンパ球の８０％以上がＮＫＴ細胞（ＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋）であった。一方、ネガティブコントロールとしてビヒクル分子がのせられたＣＤ１ｄダイマー分子を用いるとこれらの細胞は染色されなかった。また通常のＥＳ細胞からできたＤＰ細胞中にはこのような細胞は出現してこなかった。以上の結果より、末梢の遺伝子再構成の済んだＮＫＴ細胞の核の核移植により作製したＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）を用いると非常に高い効率でＴＣＲＶβ^＋αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋で規定されるＮＫＴ細胞が産生できることが判明した。

３）ＮＫＴ細胞表面上の共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現
マウス胸腺中で見られるＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋で規定されるＮＫＴ細胞はその殆どがＮＫ１．１^＋、ＣＤ４４^ｈｉｇｈ、ＣＤ６９^＋、ＣＤ４^＋であり、ＣＤ８^＋の集団は殆どいない。ところがクローン７より産生されたＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋で規定されるＮＫＴ細胞表面上ではＮＫ１．１やＣＤ６９の発現は殆ど観察されず、ＣＤ４４を発現している細胞もごく僅かであった。さらに同細胞中のＣＤ４を発現している細胞は殆ど存在せず約半数がＣＤ８単一陽性であり、残りはＣＤ４⁻ＣＤ８⁻であった。また使用されているＴＣＲＶβ鎖のレパートリーはＶβ８であった。

４）クローン７の分化誘導に伴う遺伝子プログラムの変化
ＯＰ９細胞並びにＯＰ９−ｄｌｋ細胞上で分化させたＥＳ細胞並びにｎｔＥＳ細胞であるクローン７の分化誘導に伴う変化を遺伝子レベルで追跡するため、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって、Ｔ、Ｂ細胞分化に重要な因子のｍＲＮＡの発現を検討した。ＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋で規定されるＮＫＴ細胞特異的なｍＲＮＡ（ｖα１４−ｊα２８１）はＯＰ９細胞上では観察されなかったが、ＯＰ９−ｄｌｋ細胞上では培養１５日目で出現が確認された（図１）。またＢ細胞受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のレパートリーの生成に必要なｒａｇの発現はＯＰ９細胞上では培養１９日で出現したのに対してＯＰ９−ｄｌｋ細胞上では培養１２日目から確認された。さらにＴ細胞分化のプログラムに必須のｇａｔａ３の発現も同条件下で観察された。これに対してＢ細胞の分化・成熟に必要と考えられるＩｇα、λ５の発現は通常のＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞（クローン７）の場合ともＯＰ９細胞上でのみ観察された。以上の事実より以前の報告（Schmitt et al., Nature Immunology vol.5, p410-417 (2004)）で示されているような胚性幹細胞からのＴ細胞の分化にはｄｌｋが必須であることが確認され、ＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋で規定されるＮＫＴ細胞はＴ細胞分化の場合とほぼ同一条件下で発生・分化してくることが判明した。

実施例２：ｎｔＥＳ細胞から誘導されたＮＫＴ細胞の機能解析
１）インビトロでのサイトカイン産生機能
ＴＣＲＶβ^＋/αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋で規定されるこれらのＮＫＴ細胞が実際に機能を有するか否かを検証した。マウスより調製したこれらの細胞はαＧａｌＣｅｒが提示された樹状細胞（ＤＣ）と相互作用しＩＦＮ−γ、ＩＬ−４などのサイトカインを産生する。そこでクローン７から誘導したＴＣＲＶβ^＋/αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞をαＧａｌＣｅｒ提示ＤＣと共培養し、培養液中に放出される各サイトカインの濃度をＥＬＩＳＡ法にて定量した。マウスＩＬ−１０はＯｐｔＥＩＡｍＩＬ−１０ＥＬＩＳＡキット（日本ベクトン・ディッキンソン社）、マウスＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３はＲ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｄｕｏｓｅｔ（各ＤＹ４８５，ＤＹ４０４，ＤＹ４１３）を用いた。ＤＣは、ＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドＴＣＲＪα２８１鎖欠損マウス）の脾細胞からマウスＣＤ１１ｃ−ビーズ〔ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）マイクロビーズ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社〕を用いて純化した。このビーズを用いて磁気カラムを通した後の純度は９６％以上であった。これらのＣＤ１１ｃ^＋細胞はコントロールとして通常のＥＳ細胞より分化させたＤＰ細胞とαＧａｌＣｅｒ提示ＤＣとを共培養して上清中のサイトカインの定量にも使用した。実験の結果、これらのＤＰ細胞を用いた培養ではＩＦＮ−γもＩＬ−４も産生されなかったのに対してＴＣＲＶβ^＋/αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞を用いると両サイトカインの産生が観察された（図２、３）。さらにαＧａｌＣｅｒ提示ＤＣ単独の培養からはこれらのサイトカイン産生が見られなかったのでＩＦＮ−γ並びにＩＬ−４はＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞より放出されたものと結論付けられる。

２）ｎｔＥＳ細胞由来ＮＫＴ細胞のインビボでの免疫アジュバント効果
上記で示されたように、クローン７から誘導したＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞は適切な刺激に呼応してインビトロでＩＦＮ−γ、ＩＬ−４などのサイトカイン産生能を示す。また、ＮＫＴ細胞はそのアゴニストであるαＧａｌＣｅｒにより活性化する際に樹状細胞を成熟化させ、インビボで免疫アジュバント効果を発揮し、抗原特異的なＴ細胞を誘導することが知られている（Fujiiら2003, J. Exp. Med. 198, p267-279）。そこでＣ５７ＢＬ／６由来（自己）やＢＡＬＢ／ｃ由来（アロ）のＮＫＴ細胞を、ＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドＴＣＲＪα２８１鎖欠損マウス）に輸注した後、ＯＶＡタンパク質抗原とαＧａｌＣｅｒ（２μｇ／マウス）を同時投与して、免疫アジュバント能を発揮するか否か検討することにより、獲得免疫誘導を可能にするためのＮＫＴ細胞数の閾値を検討した。その後、我々が樹立したｎｔＥＳ細胞由来ＮＫＴ細胞によるアジュバント効果が誘導できるか否か検討し、自己又はアロＮＫＴ細胞輸注の場合と比較した。
具体的には、生体内ＤＣに抗原を効果的に取り込ませるため、ＴＡＰ遺伝子欠損マウスの脾細胞に高浸透圧（１０ｍｇ／ｍｌ）で取り込ませた細胞結合（cell-associated）オボアルブミン（ＯＶＡ）（２×１０^７細胞／マウス）を同時に静脈内注入し、７日後マウスを頚椎脱臼により安楽死させ脾臓の単核細胞を調製した。これらの細胞を再びＯＶＡペプチド存在下で６時間刺激した後、抗マウスＣＤ８α抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）、並びに抗ＩＦＮ−γ抗体を用いてＣＤ８^＋細胞内におけるＩＦＮ−γの産生を調べた。その結果、αＧａｌＣｅｒ並びに細胞結合ＯＶＡを共投与したものではＯＶＡ再刺激によってＣＤ８^＋細胞に抗原特異的なＩＦＮ−γの産生が確認されたがαＧａｌＣｅｒ又はＯＶＡ単独で免疫したマウスではＯＶＡ再刺激によっても同細胞内でＩＦＮ−γは確認されなかった。このＯＶＡ特異的なＩＦＮ−γ産生は、ＮＫＴ細胞依存性であり（Fujiiら, 2003, J. Exp. Med. 198, p267-279）、前述したようにＮＫＴ細胞の欠損したマウスに抗原とαＧａｌＣｅｒで免疫する前に予めＮＫＴ細胞を投与することによって回復できると考えられる。そこでＮＫＴ細胞をＣ５７ＢＬ／６並びにＢＡＬＢ／ｃマウスから純化し、ＮＫＴ細胞欠損マウスに養子移入した。戻すＮＫＴ細胞数が２×１０^６で同系の場合（Ｃ５７ＢＬ／６由来）にはαＧａｌＣｅｒ並びにＯＶＡで免疫された脾細胞中のＣＤ８^＋細胞はＯＶＡ再刺激によってＩＦＮ−γを産生するがその割合は０．３８％であった。これに対して同数の同種異系ＮＫＴ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ由来）を戻した場合は０．１３％の脾臓ＣＤ８^＋細胞中でＩＦＮ−γが確認された。このことは、同系に比べてアロＮＫＴ細胞が投与後にホストによって拒絶されている可能性を示す。我々の誘導したｎｔＥＳ細胞（クローン７）由来のＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞２×１０^６個を同マウスに輸注した後に、ＯＶＡとαＧａｌＣｅｒで免疫した場合は、ＯＶＡ依存的に０．３８％のＩＦＮ−γの産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞が観察され、同系の場合とほぼ同様の力価を持った抗原特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞が観察された。

３）ｎｔＥＳ細胞由来ＮＫＴ細胞による癌増殖阻害効果
上記２）の実験によりｎｔＥＳ細胞由来のＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞は、免疫アジュバント能を発揮することが明らかとなった。次に、この機能が、誘導された抗原特異的なＴ細胞による癌転移阻止機能に結びつくか否かを検討した。ＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドＴＣＲＪα２８１鎖欠損マウス）にｎｔＥＳ細胞由来のＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞２×１０^６個を静脈内注入によって戻し、一時間後にαＧａｌＣｅｒ並びにＯＶＡで免疫した。その一週間後に、ＯＶＡ抗原を発現している癌細胞であるＥＧ７細胞（ＯＶＡ抗原を発現しているＥＬ４リンホーマ細胞）、又はこの抗原を発現していない別の癌細胞であるＥＬ４リンホーマ細胞を２×１０^６個ずつ皮下投与して腫瘍径を系時的に測定することにより腫瘍形成・増殖に及ぼす効果を比較検討した。この実験によりＩＦＮ−γ産生性の抗原特異的な獲得免疫の誘導が、抗腫瘍効果を示すかどうかを判定できる。結果を図４、５に示す。
１５日後の評価により、ｎｔＥＳ細胞由来のＴＣＲＶβ^＋／αＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄダイマー^＋細胞を投与したマウス５匹中４匹については、ＥＧ７細胞が拒絶され癌細胞の増殖を抑制した。１匹については腫瘍径の増大がみられたが、非常にわずかであった。
実験の結果、ｎｔＥＳ細胞由来ＮＫＴ細胞を輸注したものは抗原特異的に癌細胞の増殖を抑制したのに対してこれらの細胞を輸注していないマウス又は免疫抗原が異なる癌細胞を輸注したマウスでは癌の増殖を抑制することができなかった。以上の実験結果から、ｎｔＥＳ細胞由来ＮＫＴ細胞は抗原特異的な免疫アジュバント効果を発揮することにより癌細胞の増殖を抑止することが証明できた。

本出願は、日本で出願された特願2006-259295（出願日：2006年9月25日）を基礎としており、そこに開示される内容は、本明細書にすべて包含される。

Claims

ＮＫＴ細胞特異的Ｔ細胞受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有し、αＧａｌＣｅｒ提示樹状細胞と相互作用することによりＩＦＮ−γ及びＩＬ−４を産生し得る、機能的なＮＫＴ細胞の製造方法であって、
該遺伝子型を有する幹細胞を、Ｄｌｋ１を発現するＯＰ９細胞の存在下で、Ｆｌｔ３リガンドを含む培地中で培養し、該ＯＰ９細胞との共培養開始後７日目にＩＬ−７及びＩＬ−１５を培地に添加して更に培養して、該幹細胞由来の、該遺伝子型を有し、αＧａｌＣｅｒ提示樹状細胞と相互作用することによりＩＦＮ−γ及びＩＬ−４を産生し得る、機能的なＮＫＴ細胞を得ることを含み、該幹細胞がＥＳ細胞又はＥＳ細胞になるように遺伝子操作された体細胞である、方法。
該遺伝子型を有する幹細胞が、該遺伝子型を有する細胞の核の移植により樹立されたＥＳ細胞である、請求項１記載の方法。
該ＥＳ細胞が、ＮＫＴ細胞の核を除核卵母細胞に移植することにより樹立されたものである、請求項２記載の方法。