WO2008038579A1

WO2008038579A1 - diffÉrentiation/induction in vitro de lymphocytes À partir de cellules souches dont le gÉnotype rÉsulte d'une reconstitution gÉnÉtique

Info

Publication number: WO2008038579A1
Application number: PCT/JP2007/068335
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Wakao; Shin-Ichiro Fujii; Kanako Shimizu; Haruhiko Koseki; Masaru Taniguchi; Atsuo Ogura; Hiroshi Kawamoto
Original assignee: Riken
Priority date: 2006-09-25
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2008-04-03
Also published as: JP5288183B2; EP2083076A1; JPWO2008038579A1; US20110020932A1

Description

明細書

遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞からのリンパ球のインビトロ分化誘導

技術分野

[0001] 本発明は、機能的な細胞、例えば NKT細胞の製造方法を提供する。

背景技術

[0002] ナチュラルキラー（NK)T細胞は、種々のサイト力インを産生し免疫制御機能を有する免疫細胞である。そこで、この特性を活力、した癌、自己免疫疾患に対する治療への応用が考えられているが、その存在量の希少さ故に実験に十分量の細胞を調達することは非常に困難である。さらに生体内より採取した NKT細胞をたとえ体外で増やせたとしても機能欠損が存在する場合は治療などには用いることはできない。したがって、基礎研究、治療に十分量の機能的な NKT細胞をインビトロで得ることを可能にする方法の開発が切望されている。胚性幹細胞（ES細胞）から NKT細胞を作り出すことができれば十分量の目的細胞が得られると考えられる。し力もながら、 ES細胞力、ら T細胞を分化誘導させる方法は報告されて!/、るものの（特許文献 1及び非特許文献 1)、この方法では NKT細胞を作り出すことはできない。

[0003] なお、本発明者らは、 NKT細胞をドナー細胞として用いるクローン動物の作製方法、該方法によって得られるクローン哺乳動物、該クローン動物の胚から胚性幹 (ES )細胞を得る方法並びに該方法によって得られる ES細胞を以前に報告して!/、る (特許文献 2)。

特許文献 1 :米国特許出願公開第 20040171148号

特許文献 2：国際公開第 2006/018998号

非特許文献 l : Schmittら， Nature Immunology vol.5, p410_417 (2004)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明は、 NKT細胞等の機能的な細胞を高効率に生成する方法を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞を用いることにより該遺伝子型を有する所定の細胞、例えば NKT細胞を、インビトロで大量かつ高効率に生成できることを見出し、もって本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである：

〔1〕特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する機能的な分化細胞の製造方法であって、

該遺伝子型を有する幹細胞を培地中で培養して、該幹細胞由来の分化細胞を得ることを含む、方法；

〔2〕該遺伝子型を有する幹細胞が、該遺伝子型を有する細胞の核の移植により樹立された幹細胞である、上記〔1〕の方法；

〔3〕幹細胞が ES細胞である、上記〔1〕又は〔2〕の方法；

〔4〕抗原受容体が T細胞受容体である、上記〔 1〕〜〔3〕の!/、ずれかの方法；

〔 5〕 T細胞受容体が NKT細胞特異的 T細胞受容体である、上記〔4〕の方法；

〔6〕 NKT細胞の核を除核卵母細胞に移植することにより樹立された ES細胞を培地中で培養して、 NKT細胞系譜の細胞を得ることを含む方法である、上記〔1〕の方法;

〔7〕 NKT細胞系譜の細胞が NKT細胞である、上記〔6〕の方法；

〔8〕培養がフィーダ一細胞の存在下で行われる、上記〔1〕〜〔7〕の方法；

〔9〕フィーダ一細胞が Notchリガンドを発現する、上記〔8〕の方法；

〔10〕 Notchリガンドがデルタファミリーのメンバーである、上記〔9〕の方法；

〔11〕デルタファミリーのメンバーが Dlklである、上記〔10〕の方法；

〔12〕培養が、 Flt3リガンド、 IL— 7及び IL— 15からなる群より選ばれる 1以上の因子を用いて行われる、上記〔8〕〜〔； 11〕のいずれかの方法；

〔13〕上記〔1〕〜〔； 12〕の!/、ずれかの方法により得られる、分化細胞；

[14]分化細胞が NKT細胞である、上記〔 13〕の細胞。

発明の効果

[0006] 本発明の方法によれば、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞から分化細胞（例、 NKT細胞）を、インビトロで大量かつ高効率に生成できる。本発明の方法はまた、本発明の方法により得られる細胞の移植が意図される場合、移植が意図される個体由来の幹細胞を用いることで免疫拒絶反応を回避できると!/、う利点などを有する。

図面の簡単な説明

[図 1]ΟΡ9細胞又は OP9— dlk細胞上で培養された ntES細胞における各種 mRNA 発現を示す図である。 NKT7/cont： OP9細胞上で培養された ntES細胞（クローン 7) NKT7/dlk:OP9— dlk細胞上で培養された ntES細胞（クローン 7)

[図 2] a GalCer提示 DCと共培養した TCRV [i ' a GalCer—CDldダイ ⁺細胞により放出された、培養液中の IFN_y濃度を示す図である。 ES-T cell:通常の ES細胞から分化した DP細胞 ES— NKT:ntES細胞から分化させた TCRV/3 /αGalCer—CDldダィマー⁺で規定されるNKT細胞 V α 14— NKT:マウス個体より精製した ΝΚΤ細胞

[図 3] a GalCer提示 DCと共培養した TCRV [i ⁺/a GalCer—CDldダイ ⁺細胞により放出された、培養液中の IL 4濃度を示す図である。略号は図 2と同様である。

[図 4]NKT細胞欠損マウスに TCRV /3 ⁺/ a GalCer—CDldダイ ⁺細胞を輸注後に OVAと a—GalCerを投与し、一週間後にリンホーマ細胞 EG7を皮下投与した際の腫瘍径の変化を示す図である。 WT non:C57BL/6マウスにリンホーマ細胞 EG7を皮下投与 WT OVA+Gal:C57BL/6マウスに OVAと a -GalCerを投与し、一週間後にリンホーマ細胞 EG7細胞を皮下投与 Ja— /— 2X10⁶NKT + OVA + Gal:NKT細胞欠損マウスに TCRV/3 /aGalCer— CDldダイ ⁺細胞を輸注後に OVAと a -GalCerを投与し、一週間後にリンホーマ細胞 EG7を皮下投与

[図 5]NKT細胞欠損マウスに TCRV /3 / a GalCer—CDldダイ ⁺細胞を輸注後に OVAと a -GalCerを投与し、一週間後にリンホーマ細胞 EL4を皮下投与した際の腫瘍径の変化を示す図である。 WT non:C57BL/6マウスにリンホーマ細胞 EL4を皮下投与 WT OVA+Gal:C57BL/6マウスに OVAと a -GalCerを投与し、一週間後にリンホーマ細胞 EL4を皮下投与 Ja—/ 2X10⁶NKT + OVA + Gal : NKT細胞欠損マゥスにTCRV /3 / α GalCer— CDldダィマー細胞を輸注後に OVAと a -GalCerを投与し、一週間後にリンホーマ細胞 EL4を皮下投与発明を実施するための最良の形態

[0008] 本発明は、機能的な細胞のインビトロ製造方法、及びそれにより得られる細胞を提供する。本発明の方法は、特定の抗原受容体遺伝子（例、 B細胞受容体、 T細胞受容体）について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞を培地中で培養して、該幹細胞由来の分化細胞を得ることを含み得る。

[0009] 本発明で用いられる幹細胞は、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有するものである限り特に限定されず、例えば、核移植により樹立された幹細胞、 ES細胞になるように遺伝子操作された体細胞（Takahashi and Yamana ka， Cell 126: 663-676 (2006))であり得る。幹細胞としてはまた、 ES細胞又は造血幹細胞等の体性幹細胞が挙げられる力、 ES細胞が好ましい。特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞が核移植により樹立された幹細胞である場合、このような幹細胞は自体公知の方法により作製することができる。例えば、このような幹細胞は、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する細胞の核を、除核した細胞（例、卵母細胞）に移植し、所定の操作に付すことにより作製することができる（例、 Wakayamaら， Nature 394: 369-374 (19 98); Inoueら， Biol. R印 rod. 69: 1394-1400 (2003); WO2006/018998参照）。

[0010] 幹細胞が核移植により樹立された幹細胞である場合、核が抽出される細胞は、抗原受容体遺伝子の再構成が終了している細胞であれば特に限定されないが、抗原受容体の発現細胞であってもよい。このような細胞としては、例えば B細胞、 T細胞、 NKT細胞が挙げられる。核が抽出される細胞はまた、末梢血由来の細胞であり得る

[0011] 特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞は、任意の哺乳動物種に由来する細胞であり得る。このような哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモット等のげつ歯類、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ゥマ、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ブタカ S挙げられる。幹細胞が核移植により樹立された幹細胞である場合、核移植により樹立された幹細胞はまた、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する細胞の核を当該核と同種の哺乳動物由来の除核細胞に移植することにより樹立された細胞、又は当該核を当該核と異種の哺乳動物由来の除核細胞に移植することにより樹立された細胞であり得る。

[0012] 好ましくは、特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する幹細胞は、抗原受容体遺伝子の再構成が終了している免疫細胞の核を有する幹細胞であり得、より好ましくは、 NKT細胞の核を有する ES細胞であり得る。この場合、幹細胞としては、例えば、 WO2006/018998に開示されるものが好適に使用され得る。

[0013] NKT細胞は、その存在割合は少な!/、が免疫系で制御的な役割を担って!/、るリンパ球の一種である。 NKT細胞は T細胞受容体 (TCR)と NK受容体の 2つの抗原受容体を有する。 NKT細胞は通常の T細胞や NK細胞とは異なる特異的なレパートリーを発現している。例えばマウスの β鎖については NKT細胞の 90%以上は主に V /3 8、他に V /3 7や V /3 2という限られたレパートリーを発現し、 α鎖については均一な V a l4 -J a 281を発現して!/、る。この均一な TCR a鎖は、 TCR遺伝子の再構成の際に、 V及び J遺伝子群から 14遺伝子 a 281遺伝子とが選ばれゲノム上で再構成された結果として作製される（Taniguchi et al. , Annu Rev Immunol 21 : 483-513 (20 03))。ヒトではマウスの V a 14と相同性の高い非多型性の V a 24、及び V /3 8. 2に近縁の V β 1 1の組み合わせであることが知られて!/、る。

[0014] 培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、 Eagle MEM培地、 a MEM培地、 DMEM培地、ハム培地、 RPMI 1640培地、 Fischer' s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。培地はまた、血清又は血清代替物を含んでいてもよい。培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸 (例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイト力イン、抗酸化剤、 2—メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含むものであり得る。

[0015] 幹細胞の培養は、フィーダ一細胞の存在下又は不在下で行われ得る力例えば、 NKT細胞を製造する場合には、フィーダ一細胞（例、 OP— 9細胞等のストローマ細胞）の存在下で行われ得る。フィーダ一細胞は、初代培養細胞又は細胞株であり得る。フィーダ一細胞が由来する哺乳動物種は、幹細胞が由来する哺乳動物種と同様であり得、フィーダ一細胞及び幹細胞の双方が由来する動物種が同一であることもまた好ましい。フィーダ一細胞はまた、遺伝学的に改変されていてもよい。例えば、フィーダー細胞は、所望の因子を発現するように、又はその因子の発現を増強するように外来的に遺伝子が導入されたものであり得る。導入される遺伝子は、製造されるべき細胞の種類に応じて適宜選択され得る力例えば、導入される遺伝子は Notchリガンドであり得る。

[0016] Notchリガンドは、 Notch受容体に対する結合因子である。例えば、ヒトでは、 Not ch受容体として、 Notch— 1、 Notch— 2、 Notch— 3、 Notch— 4が同定されている。 Notchリガンドは、製造されるべき細胞の種類に応じて適宜選択され得る力 S、 Note hリガンドとしては Dlkファミリーのメンバーを用いることもまた好ましい。 Dlkファミリーのメンバーとしては、例えば、デルター 1、デルター 3、デルター 4、デルタ様 1 (Delta -like l : Dlkl)、 Dlk3、 Dlk4が挙げられる。 Notchリガンドは改変されたものであつてもよい。 Notchリガンドはまた、天然由来成分又は組換えタンパク質として用いられてもよい。 Notchリガンドの詳細については、例えば、 Furie et al， Cell 53: 505-51 8 (1988); Suzuki et al， EMBO J. 6: 1891-1897 (1987) ;米国特許出願公開第 200401 71148号を参照のこと。

[0017] 本発明の方法における培養ではまた、用いる幹細胞及び作製されるべき分化細胞の種類に応じて所定の因子が適宜使用され得る。例えば、 NKT細胞の作製を目的とする場合には、 Flt3リガンド、 IL— 7及び IL— 15等の因子が用いられる。これらの因子の濃度は NKT細胞の分化を誘導可能である限り特に限定されないが、例えば、約 5〜； 10ng/mlの濃度で用いられ得る。

[0018] その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約 30〜40°C、好ましくは約 37°Cである。 CO濃度は、例えば約;!〜 10%

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、好ましくは約 5%である。

[0019] 本発明の方法により製造される細胞は、幹細胞からの分化により生成し得る任意の細胞であり得、例えば、 B細胞等の B細胞系譜の細胞（例、 CD19+細胞）、顆粒球等の顆粒球系譜の細胞（例、 Gr— 1⁺細胞）、 T細胞等の T細胞系譜の細胞（例、 CD4⁺ 及び/又は CD8⁺細胞）、 NKT細胞等の NKT細胞系譜の細胞（例、 TCRV /3 ⁺/ a GalCer提示 CDld⁺細胞）などの免疫細胞が挙げられる。より詳細には、本発明の方法により製造される細胞が NKT細胞である場合、製造された NKT細胞は機能的な NKT細胞であり得、例えば、 a GalCer提示樹状細胞と相互作用することにより IFN- γ、 IL 4等のサイト力インを産生し得、また、免疫アジュバント効果を発揮し得 (例、樹状細胞の成熟促進、抗原特異的 Τ細胞の誘導）、さらには癌細胞の増殖抑制作用を示し得る。本発明の方法は、このような機能的な細胞を非常に効率的に生成できるとレ、う点で優れて!/、る。

[0020] 本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

[0021] 以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではなレ、。

実施例

[0022] (材料及び方法）

ntES細胞

末梢 Tリンパ球の一種である NKT細胞由来の核移植 (nuclear transfer： nt) ES 細胞としては、 NKT細胞より直接核移植法によって先に樹立した ES細胞 (WO200 6/018998参照）のうちク口ーン 7の細胞を用いた。

[0023] OP9細胞培地

細胞培養に用いた OP9細胞培地は、 MilliQ水 1リットノレにつき 10gの a MEM (Gi bco社）、 2. 2gの重炭酸ナトリウム（和光純薬）、ペニシリン、ストレプトマイシン（Gibe o BRU、 20% (v/v)の牛胎児血清（FCS) (Equitech Bio Inc, Kerrville, TX )を含むように調製した培地を、 Coming社のボトルフィルター（0· 45 m)に通して滅菌することにより作製した。

[0024] OP 9糸田胞及て OP 9— dlk糸田胞

OP9細胞は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター Riken Cell Bankより購入した細胞（RCB1124)を使用した。 notchのリガンドである delta— li ke 1を強制発現させた OP9細胞（OP9— dlk細胞）は、既報（Schmitt et al.， Nature Immunology 5: 410-417 (2004))に従い調製した。マウス delta— like 1は、 RT— P CR法によりマウス胸腺の cDNAライブラリから取得した。 IRES—ヒト NGFRの構造を持つレトロウイルスの IRESの上流に dlkを揷入し、 OP9細胞に形質導入した後、抗ヒト NGFRに対するモノクローナル抗体を用いてその発現を確認した。

[0025] OP9細胞、 OP9— dlk細胞及び ntES細胞の維持

NKT細胞由来の ntES細胞（クローン 7)は、 20%FCS、ペニシリン、ストレプトマイシン（Gibco BRL)、： LIF (Chemicon社， 2 X 10³U/ml)を含む DMEM培地（Sig ma社）中において、マウス胎児線維芽細胞上で培養維持された。また OP9細胞及び OP9— dlk細胞は、 90%コンフルェントで 1/4に分割し継代維持された。 ntES 細胞との共培養に供されるときは完全にコンフルェントになった後さらに 2日以上お V、たものを使用した（以下、分化誘導用 OP9細胞及び OP9— dlk細胞と称する）。

[0026] NKT細朐出現の確認

NKT細胞は FACS (Fluorescence activated cell sorting)法によって確認した。具体的には、 FITC標識された抗マウス TCRV /3 (PharMingen社）並びに PE標識された α —ガラクトシルセラミド（ a GalCer)がのせられた CD Idダイマー分子（PharM ingen社）の双方で染色されるもの（ a GalCer— CDldダイマー ⁺)を NKT細胞と規定した。またネガティブコントロールとしてビヒクル分子がのせられた PE標識 CDldダイマ一分子を用いた。

[0027] 実施例 1： ntES細胞の分化誘導

LIFの存在下クローン 7を 3. 5cm培養皿で 20— 30%コンフルェントまで培養したものをリン酸バッファー（PBS)で 2回洗浄後、 TE (トリプシン/ EDTA, Sigma社）を加えて 37°Cのインキュベータ一中で 5分静置後、電動ピペットでよく攪拌し 500 X g で 5分間遠心分離して上清を除去後、細胞数を計測した。これらの細胞を OP9細胞培養液で懸濁し、分化誘導用の OP9細胞もしくは OP9— dlk細胞上に撒いた（各 1. 0 X 10⁵/10cm培養皿）。その後、 37°C、 5% COのインキュベータ一中に 3日静置

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させ培養液を交換した。さらに 2日間培養を継続し、 mesoderm (中胚葉)群の細胞を誘導した。これらの中胚葉細胞群は TE処理によって OP9細胞もしくは OP9— dlk 細胞と分離された。共培養細胞は PBS、 4mlで二度洗浄した後、培養皿一枚当たり 4mlの TEを入れ 37°C、 5% COのインキュベータ一中に 5分間静置後 8mlの OP9

2

細胞培養液で中和し電動ピペットでよく攪拌し再び 37°C、 5% COのインキュベータ

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一中に 30分間静置した。上清を回収して細胞数を計測した後、 1. 0 X 10⁶の中胚葉細胞群を新たに分化誘導用の OP9細胞もしくは OP9— dlk細胞上（ 1 Ocm培養皿）に撒き直した。この時から、 OP9細胞培養液中にはマウス flt3 リガンド（flt3U (R &D社）を 5ng/mlの濃度で添加した。その後 2日おきに培養液並びに flt3Lを交換した。また共培養開始後 7日目からはマウス IL— 7 (R&D社）、ヒト IL— 15 (R&D社、 OP9— dlk細胞との共培養時のみ)も同時に各 5ng/mlの濃度で培養液中に添カロし、培養液とともに 2日ごとに交換した。この状態で血液'リンパ球系の幹細胞 (hema toblast, lymphoblast)を出現させた。その後これらの細胞数が数百万になるまで培地交換とサイト力インの交換を続けた。その後分化誘導用の OP9細胞もしくは OP9 — dlk細胞の 6ゥエルプレートに 1ゥエル当たり 1 X 10⁶の濃度で細胞を撒き直し、 cob ble stone (未熟な T、 Β細胞のコロニー）を形成させた（共培養開始後 13— 16日で出現）。 cobble stoneが OP9細胞もしくは OP9— dlk細胞を全て覆い尽くすまで上記のように培地交換とサイト力インの交換を続けた。その後はこれらの cobble stone の細胞を電動ピペットでよく攪拌し OP9細胞もしくは OP9— dlk細胞から分離し、新たに分化誘導用 OP9細胞もしくは OP9— dlk細胞上（10cm培養皿）に撒き直した。その後も培地、サイト力イン交換を 2日ごとに行い培養を継続した。さらに細胞数が 10 cm培養皿あたり 1 X 10⁸を超えた時点での別の分化誘導用 OP9細胞もしくは OP9 dlk細胞（10cm培養皿）上に分割し、増殖させた。

本実験では核移植技術によってできた ntES細胞（クローン 7)と並行して通常の受精卵より樹立した ES細胞を用いて実験が正常に進行しているか否かを確認した。即ち、後者の細胞を用いると OP9— dlk細胞上では CD4⁺CD8 ⁺の二重陽性 T細胞（D P細胞）が産生され、 OP9細胞上では B細胞が生ずるはずである。

1) ΟΡ9細胞を用いた B細胞及び顆粒球の分化誘導

これらの細胞は抗マウス CD19、及び抗マウス Gr—lモノクローナル抗体（PharMi ngen社）によって確認した。 OP9細胞上ではクローン 7からも通常の ES細胞からも C D 19⁺ (B細胞マーカー）、 Gr— 1 ⁺ (顆粒球マーカー）の細胞が出現するのに対して OP9— dlk細胞を用いた場合ではこれらの細胞は生成しなかった。

[0029] 2) OP9— dlk細胞を用 1/、た NKT及び T細胞分化誘導

先の報告（Schmitt et al.， Nature Immunology 5: 410-417 (2004))で示されているように通常の ES細胞（Ml )を OP9— dlk細胞上で培養 .分化させた場合は CD4+CD 8 +の DP細胞産生が見られた。一方、クローン 7を OP9— dlk細胞上で培養'分化させた場合はこれら DP細胞に加えて CD8 + SP細胞、 CD4— CD8_細胞などの細胞の出現が見られた。この時細胞を抗マウス TCRV /3と a GalCer— CD l dダイマーで染色するとクローン 7由来のリンパ球の 80%以上が NKT細胞（TCRV [i ' a GalCer CD l dダイマー ⁺)であった。一方、ネガティブコントロールとしてビヒクル分子がのせられた CD l dダイマー分子を用いるとこれらの細胞は染色されなかった。また通常の ES細胞からできた DP細胞中にはこのような細胞は出現してこなかった。以上の結果より、末梢の遺伝子再構成の済んだ NKT細胞の核の核移植により作製した ES細胞（ntES細胞）を用いると非常に高!/、効率で TCRV β ⁺ a GalCer— CDl dダイマー +で規定される NKT細胞が産生できることが判明した。

[0030] 3) NKT細胞表面上の共受容体（co— receptor)の発現

マウス胸腺中で見られる TCRV β ⁺/ α GalCer— CD l dダイマー ⁺で規定される Ν ΚΤ細胞はその殆どが ΝΚ1 · 1 +、 CD44^high、 CD69⁺、 CD4+であり、 CD8 +の集団は殆どいない。ところがクローン 7より産生された TCRV /3 ⁺/ a GalCer— CD l dダイマ一 ⁺で規定される NKT細胞表面上では NK1. 1や CD69の発現は殆ど観察されず、 CD44を発現している細胞もごく僅かであった。さらに同細胞中の CD4を発現している細胞は殆ど存在せず約半数が CD8単一陽性であり、残りは CD4— CD8—であつた。また使用されている TCRV /3鎖のレパートリーは V /3 8であった。

[0031] 4)クローン 7の分化誘導に伴う遺伝子プログラムの変化

OP9細胞並びに OP9— dlk細胞上で分化させた ES細胞並びに ntES細胞であるクローン 7の分化誘導に伴う変化を遺伝子レベルで追跡するため、半定量的 RT— P CR法によって、 T、 Β細胞分化に重要な因子の mRNAの発現を検討した。 TCRV /3 / a GalCer— CDl dダイマーで規定される NKT細胞特異的な mRNA (v a 14 -j a 281 )は OP9細胞上では観察されな力、つた力 OP9 dlk細胞上では培養 15 日目で出現が確認された（図 1)。また B細胞受容体、 T細胞受容体 (TCR)のレバートリーの生成に必要な ragの発現は OP9細胞上では培養 19日で出現したのに対して OP9 dlk細胞上では培養 12日目力も確認された。さらに T細胞分化のプログラムに必須の gata3の発現も同条件下で観察された。これに対して B細胞の分化'成熟に必要と考えられる Ig a、 λ 5の発現は通常の ES細胞、 ntES細胞（クローン 7)の場合とも OP9細胞上でのみ観察された。以上の事実より以前の報告（Schmitt et al.， Na ture Immunology vol.5, p410_417 (2004))で示されているような胚性幹細胞からの T 細胞の分化には dlkが必須であることが確認され、 TCRV β ⁺/ α GalCer- CD l d ダイマー +で規定される Νκτ細胞は丁細胞分化の場合とほぼ同一条件下で発生 ·分化してくることが判明した。

列 2 : ntES細からされた ΝΚΤ細のネ幾食^ gネ斤

1 )インビトロでのサイト力イン産生機能

TCRV /3 ⁺/ a GalCer— CDl dダイマー ⁺で規定されるこれらの NKT細胞が実際に機能を有するか否かを検証した。マウスより調製したこれらの細胞は a GalCerが提示された樹状細胞（DC)と相互作用し IFN— γ、 IL 4などのサイト力インを産生する。そこでクローン 7から誘導した TCRV /3 ⁺/ a GalCer— CD l dダイマー ⁺細胞を a GalCer提示 DCと共培養し、培養液中に放出される各サイト力インの濃度を ELIS A法にて定量した。マウス IL—10は OptEIA mIL—10 ELISAキット（日本べタトン'ディッキンソン社）、マウス IFN— γ、 IL— 4、 IL— 13は R&D systems社、 Duo set (各 DY485, DY404, DY413)を用いた。 DCは、 NKT細胞欠損マウス（C57B L/6バックグランド TCR J a 281鎖欠損マウス）の脾細胞からマウス CD l lc ビ一ズ〔CDl lc (N418)マイクロビーズ， Miltenyi社〕を用いて純化した。このビーズを用いて磁気カラムを通した後の純度は 96 %以上であった。これらの CD l lc⁺細胞はコントロールとして通常の ES細胞より分化させた DP細胞と a GalCer提示 DCとを共培養して上清中のサイト力インの定量にも使用した。実験の結果、これらの DP細胞を用いた培養では IFN— γも IL— 4も産生されなかったのに対して TCRV /3 ⁺/ α GalCer—CD l dダイマー ⁺細胞を用いると両サイト力インの産生が観察された（図 2、 3)。さらに a GalCer提示 DC単独の培養からはこれらのサイト力イン産生が見られなかったので IFN— γ並びに IL— 4は TCRV [i ⁺/ a GalCer— CDl dダイマー ⁺細胞より放出されたものと結論付けられる。

2) ntES細胞由来 NKT細胞のインビボでの免疫アジュバント効果

上記で示されたように、クローン7から誘導した丁 ^¥ /3 ⁺/ « 0&1じ6 —じ01 (1ダイマ一 ⁺細胞は適切な刺激に呼応してインビトロで IFN— γ、 IL— 4などのサイトカイン産生能を示す。また、 NKT細胞はそのァゴニストである a GalCerにより活性化する際に樹状細胞を成熟化させ、インビボで免疫アジュバント効果を発揮し、抗原特異的な T細胞を誘導することが知られている（Fujiiら 2003， J. Exp. Med. 198， p267_279) 。そこで C57BL/6由来（自己）や BALB/c由来（ァ口）の NKT細胞を、 NKT細胞欠損マウス（C57BL/6バックグランド TCR J α 281鎖欠損マウス）に輸注した後、 OVAタンパク質抗原と a GalCer (2 g /マウス）を同時投与して、免疫アジュバント能を発揮するか否か検討することにより、獲得免疫誘導を可能にするための NKT細胞数の閾値を検討した。その後、我々が樹立した ntES細胞由来 NKT細胞によるァジュバント効果が誘導できるか否か検討し、自己又はァロ NKT細胞輸注の場合と比較した。

具体的には、生体内 DCに抗原を効果的に取り込ませるため、 TAP遺伝子欠損マウスの脾細胞に高浸透圧（10mg/ml)で取り込ませた細胞結合（ceU-associated)ォボアルブミン（OVA) (2 X 10⁷細胞/マウス）を同時に静脈内注入し、 7日後マウスを頸椎脱臼により安楽死させ脾臓の単核細胞を調製した。これらの細胞を再び OVA ペプチド存在下で 6時間刺激した後、抗マウス CD8 a抗体（PharMingen社）、並びに抗 IFN— γ抗体を用いて CD8⁺細胞内における IFN— γの産生を調べた。その結果、 a GalCer並びに細胞結合 OVAを共投与したものでは OVA再刺激によって CD8⁺細胞に抗原特異的な IFN— γの産生が確認されたが a GalCer又は OVA単独で免疫したマウスでは OVA再刺激によっても同細胞内で IFN— γは確認されなかった。この OVA特異的な IFN— γ産生は、 ΝΚΤ細胞依存性であり（Fujiiら， 2003， J. Exp. Med. 198， p267_279)、前述したように NKT細胞の欠損したマウスに抗原と a GalCerで免疫する前に予め NKT細胞を投与することによって回復できると考えられる。そこで NKT細胞を C57BL/6並びに BALB/cマウスから純化し、 NKT細胞欠損マウスに養子移入した。戻す NKT細胞数が 2 X 10⁶で同系の場合（C57BL/6 由来）には a GalCer並びに OVAで免疫された脾細胞中の CD8 ⁺細胞は OVA再刺激によって IFN— γを産生するがその割合は 0. 38 %であった。これに対して同数の同種異系 ΝΚΤ細胞（BALB/c由来）を戻した場合は 0. 13%の脾臓 CD 8 ⁺細胞中で IFN— γが確認された。このことは、同系に比べてァロ ΝΚΤ細胞が投与後にホストによって拒絶されている可能性を示す。我々の誘導した ntES細胞（クローン 7)由来の TCRV [i ⁺/ a GalCer— CDl dダイマー ⁺細胞 2 X 10⁶個を同マウスに輸注した後に、 OVAと a GalCerで免疫した場合は、 OVA依存的に 0. 38 %の IFN— γの産生 CD8+T細胞が観察され、同系の場合とほぼ同様の力価を持った抗原特異的な CD8+T細胞が観察された。

3) ntES細胞由来 NKT細胞による癌増殖阻害効果

上記 2)の実験により ntES細胞由来の TCRV [i ⁺/ a GalCer— CD l dダイマー ⁺ 細胞は、免疫アジュバント能を発揮することが明らかとなった。次に、この機能が、誘導された抗原特異的な T細胞による癌転移阻止機能に結びつくか否かを検討した。

NKT細胞欠損マウス（C57BL/6バックグランド TCR J α 281鎖欠損マウス）に nt ES細胞由来の TCRV β ⁺/ α GalCer— CD l dダイマー ⁺細胞 2 X 10⁶個を静脈内注入によって戻し、一時間後に a GalCer並びに OVAで免疫した。その一週間後に、 OVA抗原を発現して!/、る癌細胞である EG7細胞（OVA抗原を発現して!/、る EL4リンホーマ細胞）、又はこの抗原を発現して!/、な!/、別の癌細胞である EL4リンホーマ細胞を 2 X 10⁶個ずつ皮下投与して腫瘍径を系時的に測定することにより腫瘍形成-増殖に及ぼす効果を比較検討した。この実験により IFN— γ産生性の抗原特異的な獲得免疫の誘導が、抗腫瘍効果を示すかどうかを判定できる。結果を図 4、 5に示す。

15日後の評価により、 ntES細胞由来の TCRV [i ⁺/ a GalCer— CD 1 dダイマー ⁺細胞を投与したマウス 5匹中 4匹については、 EG7細胞が拒絶され癌細胞の増殖を抑制した。 1匹については腫瘍径の増大がみられた力非常にわずかであった。実験の結果、 ntES細胞由来 NKT細胞を輸注したものは抗原特異的に癌細胞の増殖を抑制したのに対してこれらの細胞を輸注していないマウス又は免疫抗原が異なる癌細胞を輸注したマウスでは癌の増殖を抑制することができな力、つた。以上の実験結果から、 ntES細胞由来 NKT細胞は抗原特異的な免疫アジュバント効果を発揮することにより癌細胞の増殖を抑止することが証明できた。

本出願は、日本で出願された特願 2006-259295 (出願日： 2006年 9月 25日 )を基礎としており、そこに開示される内容は、本明細書にすべて包含される。

Claims

請求の範囲

[I] 特定の抗原受容体遺伝子について遺伝子再構成後の遺伝子型を有する機能的な分化細胞の製造方法であって、

該遺伝子型を有する幹細胞を培地中で培養して、該幹細胞由来の分化細胞を得ることを含む、方法。

[2] 該遺伝子型を有する幹細胞が、該遺伝子型を有する細胞の核の移植により樹立された幹細胞である、請求項 1記載の方法。

[3] 幹細胞が ES細胞である、請求項 1又は 2記載の方法。

[4] 抗原受容体が T細胞受容体である、請求項;!〜 3のいずれか 1項記載の方法。

[5] T細胞受容体が NKT細胞特異的 T細胞受容体である、請求項 4記載の方法。

[6] NKT細胞の核を除核卵母細胞に移植することにより樹立された ES細胞を培地中で培養して、 NKT細胞系譜の細胞を得ることを含む方法である、請求項 1記載の方法。

[7] NKT細胞系譜の細胞が NKT細胞である、請求項 6記載の方法。

[8] 培養がフィーダ一細胞の存在下で行われる、請求項;!〜 7記載の方法。

[9] フィーダ一細胞が Notchリガンドを発現する、請求項 8記載の方法。

[10] Notchリガンドがデルタファミリーのメンバーである、請求項 9記載の方法。

[I I] デルタファミリーのメンバーが Dlklである、請求項 10記載の方法。

[12] 培養が、 Flt3リガンド、 IL— 7及び IL— 15からなる群より選ばれる 1以上の因子を用いて行われる、請求項 8〜； 11のいずれか 1項記載の方法。

[13] 請求項;!〜 12のいずれか 1項記載の方法により得られる、分化細胞。

[14] 分化細胞が NKT細胞である、請求項 13記載の細胞。