KR20240037179A - 만능 줄기 세포-유래 조혈 계통 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은, 다양한 측면 및 실시양태에서, 조혈 세포 요법을 위한 조혈 계통 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 다양한 조혈 계통은 전구 T 세포를 포함한 T 림프구, 자연 살해 세포, B 림프구, 호중구, 단핵구 및/또는 대식세포, 적혈구, 거대핵세포, 및 혈소판을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터, 전구 T 세포 및 T 세포 계통을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조혈 계통을 개발하기 위한 효율적인 생체외 공정을 제공한다. 다양한 실시양태에서 본 개시내용에 따라 생성된 세포는 기능적이고/이거나 말초 혈액 또는 림프계 기관으로부터 단리된 상응하는 계통과 보다 밀접하게 비슷하다. 본 발명은 일부 측면에서 본원에 개시된 방법에 의해 생산된, 단리된 세포 및 세포 조성물, 뿐만 아니라 입양 세포 요법을 위한 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2021년 3월 31일에 출원된 미국 가특허출원 번호 63/168,360의 이익과 우선권을 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
생체외 만능 세포(pluripotent cell)로부터 조혈 세포(hematopoietic cell)의 생성은 동종이계 적합성 세포(allogeneic compatible cell)-기반 요법에 대한 이의 전망으로 인해 과학계의 관심을 끌었다. 유도 만능 줄기 세포(Induced pluripotent stem cell) (iPSC)는 잠재적으로 "기성품(off-the-shelf)" 치료적 림프구를 생성하기 위한 공급원 역할을 할 수 있다. 문헌 [Nianias, A., & Themeli, M., Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived lymphocytes for adoptive cell immunotherapy: recent advances and challenges. Current Hematologic Malignancy Reports, 14(4), 261-268 (2019)]. 그러나, 임상적으로 관련된 수의 조혈 세포 계통(lineage) (예를 들어, 면역 세포, 림프구 등)을 제조하고 임상적으로 유리한 표현형을 갖는 세포 계통을 제조하는 방법은 여전히 중요한 장애물로 남아 있다. 다양한 측면 및 실시양태에서, 본 발명은 이들 목적을 충족한다.
본 개시내용은, 다양한 측면 및 실시양태에서, 조혈 계통(hematopoietic lineage)을 생성하는 방법을 제공한다. 다양한 조혈 계통은 T 림프구 (전구 T 세포(progenitor T cell)를 포함한 T 세포), 자연 살해 세포(natural killer cell) (NK 세포), B 림프구 (B 세포) (특정 항체를 생성하도록 설계된 B-세포 포함), 호중구, 단핵구 및/또는 대식세포, 거대핵세포(megakaryocyte), 적혈구(red cell), 및 혈소판을 포함한다. 다양한 실시양태에서 본 개시내용에 따라 생성된 세포는 기능적이고/이거나 말초 혈액 또는 림프계 기관(lymphoid organ)으로부터 단리된 상응하는 계통과 보다 밀접하게 비슷하다. 본 발명은 일부 측면에서 본원에 개시된 방법에 의해 생산된, 단리된 세포 및 세포 조성물, 뿐만 아니라 세포 요법을 위한 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 조혈 계통의 세포 집단을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 배양체(embryoid body)로 분화된 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 집단과 같은 만능 줄기 세포 (PSC) 집단을 제조하고, CD34+ 세포를 농축(enriching)하여 CD34-농축 집단(enriched population)을 제조하는 단계를 포함한다. 상기 CD34-농축 집단에서 내피에서 조혈로의 전이(Endothelial-to-hematopoietic transition) (EHT)를 유도하여 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell) (HSC) 집단을 제조한 후, 조혈 계통으로 분화된다. 다양한 실시양태에서, 조혈 계통은 T 림프구 (즉, T 세포), 전구 T 세포, 자연 살해 세포 (NK 세포), B 림프구 (즉, B 세포), 단핵구 및/또는 대식세포, 거대핵세포, 및 혈소판으로부터 선택된다. 본 개시내용의 측면 및 실시양태에 따르면, iPSC-배양체로부터 유래된, CD34+ 세포 집단의 내피에서 조혈로의 전이 (EHT)를 유도하는 것이 우수한 조혈 계통의 생체외 생성을 위해 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
일부 측면 및 실시양태에서, 본 개시내용은 CD7+ 전구 T 세포 집단, 또는 이 집단의 유도체를 생성하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 iPSC (예를 들어, hiPSC)로부터 인간 장기(long-term) 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 생성하는 단계를 포함한다. HSC 집단은 CD34+ 세포 (예를 들어, 배양체로부터 유래된 CD34+ 세포)의 내피에서 조혈로의 전이의 유도에 의해 유래된다. HSC 집단 (또는 이로부터 단리된 세포)은 부분 또는 전체 노치 리간드(Notch ligand) (DLL4, DLL1, SFIP 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) (SHH), TNF-알파, 레트로넥틴(RetroNectin) (또는 다른 세포외 기질 성분), 및/또는 이의 조합과 함께 배양되어, CD7+ 전구 T 세포 또는 이의 유도체 세포 집단을 포함하는 집단을 생산한다. 본 개시내용은 iPSC로부터 생체외에서 생성되며, 생체외에서 T 전구 세포 및 T 세포 계통의 강건한 생산에 의해, 노치 리간드, 소닉 헤지호그 (SHH), 및/또는 세포외 기질의 성분(들)에 반응하는 HSC 집단을 제공한다.
다양한 실시양태에서, iPSC는 예컨대 섬유모세포 또는 PBMC (또는 이로부터 단리된 세포)이나 이에 제한되지는 않는 체세포를 재프로그래밍함으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 림프구, 제대혈 세포, PBMC, CD34+ 세포, 또는 다른 인간 1차 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 말초 혈액으로부터 단리된 CD34+ 세포로부터 유래된다. 다양한 실시양태에서, iPSC는 하나 이상의 HLA 클래스(Class) I 및/또는 클래스 II 대립유전자 또는 이의 마스터 조절인자의 결실에 의해서와 같이, HLA 매칭을 돕기 위해 유전자 편집(gene editing)될 수 있다.
일부 실시양태에서, hiPSC는 CD34+ 세포의 생성 (즉, 단리 또는 농축)에 사용할 수 있는, 배양체 (EB)를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, EB는 해리될 수 있고, CD34+ 조혈 전구체(progenitor)는 단리되거나 농축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 측면에 따른 방법은 만능성 줄기 세포 (예를 들어, EB)로부터 CD34-농축 세포를 생성하고 내피에서 조혈로의 분화를 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CD34 농축 및 EHT는 iPSC 분화의 8일차 내지 14일차에 유도될 수 있다. EHT는 임의의 공정을 사용하여 유도될 수 있다. 일부 실시양태에서, EHT의 유도는 LT-HSC를 포함하는 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 생성한다. 일부 실시양태에서, EHT는 기계적, 생화학적, 약리학적 및/또는 유전적 수단을 사용하여 내피 또는 혈액생성 내피(hemogenic endothelial cell) (HEC) 전구체를 통해 HSC를 생성한다. 일부 실시양태에서, 방법은 기계적, 유전적, 생화학적, 또는 약리학적 수단에 의해 있을 수 있는, PSC, EB, CD34-농축 세포, EC, HEC 또는 HSC에서 dnmt3b의 발현 또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는 기계감수성 수용체 또는 기계감수성 채널의 효능제의 유효량과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 기계감수성 수용체는 피에졸(Piezol)이다. 예시적인 피에졸 효능제는 Yoda1, Jedi1, 및 Jedi2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기계감수성 수용체는 Trpv4이다. 예시적인 Trpv4 효능제는 GSK1016790A이다. 특정 실시양태에서, 피에조(Piezo)1 활성화는 적어도 EB로부터 단리된 CD34+ 세포에 적용되며, 이는 다양한 실시양태에 따라, EHT를 유도하는 다른 방법과 비교하여 T 전구 세포의 우수한 생성을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 방법은 세포에 주기적(cyclic) 2D, 3D, 또는 4D 스트레치(stretch)를 적용하는 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 주기적 2D, 3D, 또는 4D 스트레치가 적용된 세포는 CD34-농축 세포, iPSC, EC, 및 HEC 중 하나 이상으로부터 선택된다. 주기적-변형(cyclic-strain) 생체역학적 스트레칭(stretching)은 Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시킬 수 있다.
일반적으로, 다양한 단계에서, 세포 집단은 원하는 표현형의 세포가 농축될 수 있고/있거나, 원하지 않는 표현형의 세포가 고갈될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ 세포가 농축된다 (EHT를 겪기 전에 및/또는 후에). 일부 실시양태에서, 세포 집단은 CD34+ 세포의 확장(expansion)을 촉진하여 줄기 세포의 확장된 집단을 생성하는 조건 하에 배양된다. 적혈구계(erythroid), 골수계(myeloid), 및 림프계(lymphoid) 계통을 생성하는 조혈 줄기 세포 (HSC)는 CD34의 발현 및 계통 특이적 마커 (Lin-라고 칭함)의 부재를 기준으로 하여 식별할 수 있다.
다양한 실시양태에서, HSC 집단 또는 이의 분획 (예를 들어, CD34+ 분획)은 조혈 계통으로 분화되며, 이는 전구 T 세포, T 세포 및 이의 분획, B 세포, NK 세포, 호중구, 단핵구 또는 대식세포, 거대핵세포, 적혈구, 및 혈소판으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 적어도 부분 또는 전체의 적어도 노치 리간드 (DLL4, DLL1, SFIP 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 소닉 헤지호그 (SHH), TNF-알파, 레트로넥틴 (또는 다른 세포외 기질 성분), 및/또는 이의 조합과, 생체외에서 배양되어 HSC를 CD7+ 전구 T 세포로, 그리고 임의로 T 세포 계통 또는 다른 계통 (예를 들어, NK 세포)으로 분화된다. 다양한 실시양태에서, 노치 리간드는 델타-유사-1(Delta-Like-1) (DL1) 및 델타-유사-4 (DL4), SFIP, 또는 이의 기능적 부분 중 적어도 하나를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 노치 리간드는 2D 또는 3D 배양 시스템에 고정화, 기능화, 및/또는 내장(embedding)된다. 노치 리간드는 세포외 기질의 성분과 함께 포함될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된, 세포 집단, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물, 뿐만 아니라 치료 방법 또는 요법에서의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 필요로 하는 대상체에게 투여시 흉선, 비장, 또는 2차 림프계 기관(secondary lymphoid organ)에 생착(engraftment)이 가능한 림프구 집단 (예컨대 T 세포 전구 집단)이다.
본 개시내용의 다양한 다른 측면 및 실시양태는 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 ETV2 과발현 (OE)이 만능성(pluripotency)에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 도 1은 ETV2 및 GFP 서열을 과발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용한 iPSC의 형질도입 효율을 나타내는 FACS 플롯을 나타낸다. ETV2 과발현은 TRA-1-60 줄기세포능(stemness) 마커의 발현에 의해 나타난 바와 같이 iPSC 줄기세포능에 영향을 미치지 않는다.
도 2는 ETV2 과발현 (OE)이 혈액생성 내피 세포(endothelial cell)의 수율을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 혈액생성 내피 세포 (CD235a-CD34+CD31+로 기재됨)의 대표적인 유동 세포측정 분석(flow cytometric analysis) 및 상대적 정량화는 ETV2-OE가 혈액생성 내피 세포의 형성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
도 3은 ETV2 과발현 (OE)이 iPSC 분화 동안 CD34+ 세포 형성을 향상시킨다는 것을 나타낸다. CD34+ 세포의 대표적인 유동 세포측정 분석 및 상대적 정량화는 ETV2-OE가 CD34+ 세포 형성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
도 4a 및 도 4b는 피에조1 활성화로 유래된 iPSC-유래 HSC가 골수 (BM)-HSC와 유사한 pro-T 세포 분화를 겪는다는 것을 나타낸다. 도 4a는 피에조1 활성화로 유래된 골수 (BM) HSC 및 iPSC-HSC의 CD34+CD7+ pro T 세포에 대한 분화 효율의 FACS 플롯이다. 도 4b는 (1) BM-HSC 및 (2) iPSC-HSC (피에조1 활성화)로 유래된 CD34+CD7+ 세포 (%)의 정량화이다. 도 4b는 3회 실험의 평균을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 피에조1 활성화로 생성된 iPSC-유래 HSC가 T 세포 분화를 겪고 BM-HSC와 유사한 CD3/CD28 비드로 활성화될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 5a는 피에조1 활성화로 생성된 BM-HSC 및 iPSC-유래 HSC로부터 분화된 T 세포의 활성화 효율 (CD3+CD69+ 발현)의 FACS 플롯이다. 도 5b는 (1) BM-HSC 및 (2) iPSC-HSC (피에조1 활성화)로 유래된 CD3+CD69+ 세포 (%)의 정량화이다. 도 5b는 3회 실험의 평균을 나타낸다.
도 6은 피에조1 활성화로 생성된 iPSC-유래 HSC가 기능성 T 세포로 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. IFNγ 발현은 CD3/CD28 비드를 통한 T 세포 수용체 (TCR) 자극 후 T 세포 활성화의 결과이다. 피에조1 활성화시 생성된, iPSC-유래 HSC로부터 분화된 T 세포의 IFNγ 발현은, 기능성 T 세포로 추가로 분화하는 HSC의 능력을 향상시킨다. 도 6은 3회 실험의 평균을 나타낸다.
도 2는 ETV2 과발현 (OE)이 혈액생성 내피 세포(endothelial cell)의 수율을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 혈액생성 내피 세포 (CD235a-CD34+CD31+로 기재됨)의 대표적인 유동 세포측정 분석(flow cytometric analysis) 및 상대적 정량화는 ETV2-OE가 혈액생성 내피 세포의 형성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
도 3은 ETV2 과발현 (OE)이 iPSC 분화 동안 CD34+ 세포 형성을 향상시킨다는 것을 나타낸다. CD34+ 세포의 대표적인 유동 세포측정 분석 및 상대적 정량화는 ETV2-OE가 CD34+ 세포 형성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
도 4a 및 도 4b는 피에조1 활성화로 유래된 iPSC-유래 HSC가 골수 (BM)-HSC와 유사한 pro-T 세포 분화를 겪는다는 것을 나타낸다. 도 4a는 피에조1 활성화로 유래된 골수 (BM) HSC 및 iPSC-HSC의 CD34+CD7+ pro T 세포에 대한 분화 효율의 FACS 플롯이다. 도 4b는 (1) BM-HSC 및 (2) iPSC-HSC (피에조1 활성화)로 유래된 CD34+CD7+ 세포 (%)의 정량화이다. 도 4b는 3회 실험의 평균을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 피에조1 활성화로 생성된 iPSC-유래 HSC가 T 세포 분화를 겪고 BM-HSC와 유사한 CD3/CD28 비드로 활성화될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 5a는 피에조1 활성화로 생성된 BM-HSC 및 iPSC-유래 HSC로부터 분화된 T 세포의 활성화 효율 (CD3+CD69+ 발현)의 FACS 플롯이다. 도 5b는 (1) BM-HSC 및 (2) iPSC-HSC (피에조1 활성화)로 유래된 CD3+CD69+ 세포 (%)의 정량화이다. 도 5b는 3회 실험의 평균을 나타낸다.
도 6은 피에조1 활성화로 생성된 iPSC-유래 HSC가 기능성 T 세포로 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. IFNγ 발현은 CD3/CD28 비드를 통한 T 세포 수용체 (TCR) 자극 후 T 세포 활성화의 결과이다. 피에조1 활성화시 생성된, iPSC-유래 HSC로부터 분화된 T 세포의 IFNγ 발현은, 기능성 T 세포로 추가로 분화하는 HSC의 능력을 향상시킨다. 도 6은 3회 실험의 평균을 나타낸다.
본 개시내용은, 다양한 측면 및 실시양태에서, 세포 요법을 위한 조혈 계통을 생성하는 방법을 제공한다. 다양한 조혈 계통은 T 림프구 (전구 T 세포를 포함한 T 세포), 자연 살해 세포 (NK 세포), B 림프구 (B 세포) (특정 항체를 생성하도록 설계된 B-세포 포함), 호중구, 단핵구 및/또는 대식세포, 거대핵세포, 적혈구, 및 혈소판을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 본 발명은 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터, 전구 T 세포 및 T 세포 계통을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조혈 계통을 개발하기 위한 효율적인 생체외 공정을 제공한다. 다양한 실시양태에서 본 개시내용에 따라 생성된 세포는 기능적이고/이거나 말초 혈액 또는 림프계 기관으로부터 단리된 상응하는 계통과 보다 밀접하게 비슷하다. 본 발명은 일부 측면에서 본원에 개시된 방법에 의해 생산된, 단리된 세포 및 세포 조성물, 뿐만 아니라 세포 요법을 위한 방법을 제공한다.
본 개시내용의 측면 및 실시양태에 따르면, 본질적으로 무제한의 만능 줄기 세포 (PSC)를 생산하는 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 능력을 활용하여 치료적 인간 T 림프구 ("T 세포") 또는 이의 전구체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 조혈 세포의 무한한 공급을 생성한다. 치료적 림프구로서의 1차 T 세포의 사용은 이의 제한된 이용가능성, 세포 수, 제한된 확장 잠재력, 및 조직적합성 문제에 의해 제한되어 왔다. 더욱이, 1차 세포와 비교하여, hiPSC는 시험관내에서 더 쉽게 유전적 변형을 겪을 수 있으므로, 예를 들어, 세포-표적 특이성, 세포 수를 개선시킬 기회를 제공할 뿐만 아니라, HLA-매칭 문제를 우회한다. 게다가, 완전하게 조작된 hiPSC 클론은, 1차 세포와 비교하여, 안정적이고 안전한 공급원으로서 역할을 할 수 있다 (Nianias and Themeli, 2019). 추가로, hiPSC는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 달리, 비-배아 기원(non-embryonic origin)이기 때문에, 이들은 또한 윤리적 우려가 없다. 따라서, 본 개시내용에 따른 hiPSC의 사용은 T 림프구와 같은 치료적 조혈 계통을 생성하는데 1차 세포에 비해 몇가지 이점을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 조혈 계통의 세포 집단을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 배양체로 분화된 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 집단과 같은 만능 줄기 세포 (PSC) 집단을 제조하고, CD34+ 세포를 농축하여 CD34-농축 집단을 제조하는 단계를 포함한다. CD34-농축 집단에서 내피에서 조혈로의 전이 (EHT)를 유도하여 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 제조한 후, 임의로 CD34+ 세포를 추가로 농축한다. 생성된 HSC 집단 (또는 이의 분획)은 조혈 계통으로 분화된다. 다양한 실시양태에서, 조혈 계통은 T 림프구 (즉, T 세포), 전구 T 세포, 자연 살해 세포 (NK 세포), B 림프구 (즉, B 세포), 단핵구 및/또는 대식세포, 거대핵세포, 및 혈소판으로부터 선택된다.
통상적으로, 조혈 계통은 CD34+ 세포를 수확(harvesting)하기 위해 최대 8일차까지 iPSC의 배양체로의 분화에 의해 제조한다. CD34는 혈액생성 내피 세포, 조혈 줄기 세포, 및 조혈 전구 세포의 마커로서 흔히 사용된다. 본 개시내용의 측면 및 실시양태에 따르면, iPSC-배양체로부터 유래될 수 있는, CD34+ 세포 집단의 내피에서 조혈로의 전이 (EHT)를 유도하는 것이 우수한 조혈 계통의 생체외 생성을 위해 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
일부 측면 및 실시양태에서, 본 개시내용은 CD7+ 전구 T 세포 집단, 또는 이 집단의 유도체를 생성하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 방법은 iPSC (예를 들어, hiPSC)로부터 인간 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 생성하는 단계를 포함한다. HSC 집단은 CD34+ 세포 (예를 들어, 배양체로부터 유래된 CD34+ 세포)의 내피에서 조혈로의 전이의 유도에 의해 유래된다. HSC 집단 (또는 이로부터 단리된 세포)을 부분 또는 전부 노치 리간드, 소닉 헤지호그 (SHH), 레트로넥틴 (또는 다른 세포외 기질(들)), 및/또는 이의 조합과 함께 배양하여, CD7+ 전구 T 세포 또는 유도체 세포 집단을 포함하는 집단을 생산한다.
노치 신호전달 경로는 전구 T 세포, pre-T 세포, 및/또는 성숙한 T 림프구의 형성, 분화, 및 기능을 조절한다. 생체내에서, T 세포 발달은 림프구 전구체가 골수 조혈 줄기 세포로부터 분화되어 흉선으로 이동한 후에 진행된다. 특수한 흉선 상피 세포는 T 세포가 제어된 경로를 따라 발달하도록 유도한다. 노치 신호전달은 흉선에서 T 계통 연루(commitment) 동안 중요한 역할을 한다. 림프계 전구체(lymphoid progenitor)가 흉선에 진입함에 따라, 이들은 흉선생성(thymopoiesis)을 유도하는 흉선 상피 상에 노치 리간드의 조밀 발현(dense expression)을 직면한다. 본 개시내용은 iPSC로부터 생체외에서 생성되며 생체외에서 T 전구 세포 및 T 세포 계통의 강건한 생산에 의해, 노치 리간드, SHH, 및/또는 세포외 기질의 성분(들)에 반응하는 HSC 집단을 제공한다.
다양한 실시양태에서, iPSC는 체세포를 재프로그래밍함으로써 제조된다. 용어 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 배아-유사 만능 상태(embryonic-like pluripotent state)로 다시 재프로그래밍된 피부 또는 혈액 세포와 같은 체세포로부터 유래된 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, iPSC는 체세포 예컨대 (그러나 이에 제한되지는 않음) 섬유모세포 또는 PBMC로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 림프구 (예를 들어, T-세포, B-세포, NK-세포 등), 제대혈 세포 (제대혈로부터의 CD3+ 또는 CD8+ 세포 포함), PBMC, CD34+ 세포, 또는 다른 인간 1차 조직으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, iPSC는 말초 혈액으로부터 단리된 CD34+ 세포로부터 유래된다. 다양한 실시양태에서, iPSC는 수령자 (본원에 기재된 바와 같은 치료를 필요로 하는 대상체)에 대해 자가유래(autologous) 또는 동종유래(allogenic) (예를 들어, 하나 이상의 유전자좌에서 HLA-매칭됨)이다. 다양한 실시양태에서, iPSC는 HLA 매칭 (예컨대 베타-2-마이크로글로불린 (B2M), CIITA 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 하나 이상의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 대립유전자 또는 이의 마스터 조절인자의 결실)을 돕기 위해 유전자 편집될 수 있거나, 다른 기능성을 결실 또는 발현하기 위해 유전자 편집될 수 있다. 예를 들어, iPSC는 유전자 편집되어 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C 중 하나 이상이 결실되고, HLA-DP, HLA-DQ, 및 HLA-DR 중 하나 이상이 결실될 수 있다. 특정 실시양태에서, iPSC는 적어도 하나의 HLA 클래스 I 및 적어도 하나의 HLA 클래스 II 복합체의 발현을 유지한다. 특정 실시양태에서, iPSC는 적어도 하나의 보유된 클래스 I 및 클래스 II 유전자좌에 대해 동형접합성(homozygous)이다. 일부 실시양태에서, iPSC는, 예를 들어, 공지되거나 공지되지 않은 TCR 특이성을 가진 T 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, T 세포는 종양 연관 항원에 대한 특이성을 가진 TCR을 보유한다.
체세포는 Sox2, Oct3/4, c-Myc, Nanog, Lin28, 및 klf4로부터 선택된 재프로그래밍 인자의 발현에 의해 재프로그래밍될 수 있다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Sox2, Oct3/4, c-Myc, Nanog, Lin28, 및 klf4이다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Sox2, Oct3/4, c-Myc, 및 klf4이다. iPSC를 제조하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 10,676,165; 미국 특허 9,580,689; 및 미국 특허 9,376,664에 기재되어 있으며, 이들 특허들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다양한 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 널리 공지된 바이러스 벡터 시스템, 예컨대 렌티바이러스, 센다이(Sendai), 또는 홍역 바이러스 시스템을 사용하여 발현된다. 대안적으로, 재프로그래밍 인자는 재프로그래밍 인자를 코딩하는 mRNA(들)를 체세포에 도입함으로써 발현될 수 있다. 더 나아가, iPSC는 재프로그래밍 인자를 발현하는 비통합 에피솜 플라스미드(non-integrating episomal plasmid)를 도입함으로써 생성될 수 있으며, 즉 트랜스진(transgene)-무함유(free) 및 바이러스-무함유 iPSC를 생성할 수 있다. 공지된 에피솜 플라스미드는 제한된 복제 능력으로 이용될 수 있으므로 몇몇 세포 세대에 걸쳐 소실된다.
일부 실시양태에서, 인간 만능 줄기 세포 (예를 들어, iPSC)는 유전자 편집된다. 유전자 편집은, 예를 들어, HLA 유전자의 변형 (예를 들어, 하나 이상의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 유전자의 결실), β2 마이크로글로불린 (β2M)의 결실, CIITA의 결실, T 세포 수용체 (TCR) 유전자의 결실 또는 부가, 키메라 항원 수용체 (CAR) 유전자의 부가를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 CAR은 CD19, CD38, CD33, CD47, CD20 등을 표적화할 수 있다. 예를 들어, iPSC는 T-세포 수용체 (TCR)-형질도입된 iPSC일 수 있다. 이러한 실시양태는 원하는 항원-특이성을 가진 대규모 재생 T 림프구의 생산을 가능하게 한다. 대안적으로, 하나 이상의 HLA 녹아웃 및 TCR 녹아웃을 가진 조작된 iPSC를 GMP-등급 조건 하에, 피더(feeder)-및-혈청-무함유 분화를 위해 생물반응기에 배치하여, 완전히 기능성 및 조직적합성 T 세포를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, iPSC는 CD3+ 세포로부터 제조되거나, 일부 실시양태에서는 T 림프구 (예를 들어, CTL) (T-iPSC)로부터 제조된다. 예를 들어, T 림프구는 원하는 항원 특이성 (예를 들어, HLA-펩티드 리간드를 사용한 세포 분류 사용)으로 단리하고, T-iPSC로 재프로그래밍할 수 있다. 이어서 이들 T-iPSCS는 본 개시내용에 따라 전구 T 세포, 이의 유도체 또는 T 세포 계통으로 재분화된다. T-iPSC가 항원-특이적 T 세포로부터 생산되는 경우, T-iPSC는 재배열된 T 세포 수용체 (TCR) 유전자가 유전된다. 이들 실시양태에서, T-iPSC로부터 재분화된 CTL은 원래의 CTL과 동일한 항원 특이성을 입증한다.
일부 실시양태에서, hiPSC는 CD34+ 세포의 생성 (즉, 단리 또는 농축)에 사용될 수 있는, 배양체 (EB)를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, EB는 단리될 수 있고, CD34+ 조혈 전구체는 단리되거나 농축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 iPSC 집합체는, 예를 들어, 문헌 [Abecasis B. et al., Expansion of 3D human induced pluripotent stem cell aggregates in bioreactors: Bioprocess intensification and scaling-up approaches. J. of Biotechnol. 246 (2017) 81-93]에 기재딘 바와 같이 생물반응기에서 확장된다.
일부 실시양태에서, 각각의 측면에 따른 방법은 만능 줄기 세포 (예를 들어, EB)로부터 CD34-농축 세포를 생성하고 내피에서 조혈로의 분화(endothelial-to-hematopoietic differentiation)를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 상대적으로 높은 빈도의 LT-HSC를 포함하는 HSC는 기계적, 생화학적, 대사적, 및/또는 지형학적 자극, 뿐만 아니라 인자 예컨대 세포외 기질, 틈새(niche) 인자, 세포-외인성 인자, 세포-고유 특성의 유도를 포함하며; 약리학적 및/또는 유전적 수단을 포함하는, 다양한 자극 또는 인자를 사용하여 세포 집단으로부터 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 EHT의 유도 전에, 만능 줄기 세포로부터 조혈 잠재력을 가진 내피 세포를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서 GATA2/ETV2, GATA2/TAL1, 또는 ER71/GATA2/SCL의 조합된 과발현은 PSC 공급원으로부터 혈액생성 잠재력을 가진 내피 세포의 형성을 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 iPSC에서 E26 형질전환-특이적 변이체 2 (ETV2) 전사 인자의 과발현을 포함한다. CD34+ 농축 후, HSC는 이어서 기계적, 생화학적, 약리학적 및/또는 유전적 자극 또는 변형을 사용하여 내피 세포로부터 생성된다. ETV2는 ETV2의 구성적 또는 유도성 발현, 및 트랜스진-무함유 혈액생성 EC의 생산을 위해, 코딩 비통합 에피솜 플라스미드의 도입에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, ETV2는 iPSC에 도입된 mRNA로부터 발현된다. mRNA는 전기천공법 또는 리포펙션을 포함한, 임의의 이용가능한 방법을 사용하여 도입될 수 있다. ETV2를 발현하는 세포의 분화는 VEGF-A의 부가를 포함할 수 있다. 문헌 [Wang K, et al., Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of ETV2 with mRNA. Sci. Adv. Vol. 6 (2020)] 참조. 이러한 방식으로 생성된 세포는 본 개시내용의 실시양태에 따라 CD34+ 세포를 생성하고 EHT를 유도하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD34 농축 및 EHT는 iPSC 분화의 8일차 내지 14일차, 예컨대 예를 들어, 8일차, 9일차, 10일차, 11일차, 12일차, 13일차, 또는 14일차에 유도될 수 있다. iPSC의 분화는 공지된 기술에 따를 수 있다. 일부 실시양태에서, iPSC 분화는 인자 예컨대, bFGF, Y27632, BMP4, VEGF, SCF, EPO, TPO, IL-6, IL-11, 및/또는 IGF-1의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, hPSC는 피더-무함유, 혈청-무함유, 및/또는 GMP-적합성 물질을 사용하여 분화된다. 일부 실시양태에서, hPSC는 혈청-함유 배지에서 뮤린 골-유래 피더 세포 예컨대 OP9 또는 MS5 세포주와 공동-배양된다. 배양물은 배양체 또는 단층 시스템의 분화를 지원하는 성장 인자 및 시토카인을 함유할 수 있다. OP9 공동-배양 시스템은 T 림프구, B 림프구, 거대핵세포, 단핵구 또는 대식세포, 및 적혈구를 포함한 몇몇 조혈 계통으로 추가로 분화될 수 있는 다능성(multipotent) HSPC를 생성하는데 사용할 수 있다. 문헌 [Netsrithong R. et al., Multilineage differentiation potential of hematoendothelial progenitors derived from human induced pluripotent stem cells , Stem Cell Research & Therapy Vol. 11 Art. 481 (2020)] 참조. 대안적으로, 특정 신호와 함께 정의된 조건을 사용하는 단계별 공정을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 PSC에서 HOXA9, ERG, RORA, SOX4, 및 MYB의 발현은 다계통 잠재력을 가진 CD34+/CD45+ 전구체의 직접적인 분화를 선호한다. 추가로, 인자 HOXB4, CDX4, SCL/TAL1, 또는 RUNX1a의 발현은 인간 PSC에서의 조혈 프로그램을 지원한다. 문헌 [Doulatov S. et al., Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors, Cell Stem Cell. 2013 Oct 3; 13(4)] 참조.
EHT의 유도는 임의의 공지된 공정에 의한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, EHT의 유도는 LT-HSC를 포함하는 조혈 줄기 세포 (HSC) 집단을 생성한다. 일부 실시양태에서, EHT는 기계적, 생화학적, 약리학적 및/또는 유전적 수단 (예를 들어, 자극, 억제, 및/또는 유전자 변형을 통해))을 사용하여 내피 또는 혈액생성 내피 세포 (HEC) 전구체를 통해 HSC를 생성한다. 일부 실시양태에서, EHT는 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC), 단기(short-term) 조혈 줄기 세포 (ST-HSC), 및 조혈 줄기 전구 세포(hematopoietic stem progenitor cell) 중 하나 이상을 포함하는 줄기 세포 집단을 생성한다.
일부 실시양태에서, 방법은 기계적, 유전적, 생화학적, 또는 약리학적 수단에 의해 있을 수 있는, PSC, 배양체, CD34-농축 세포, EC, HEC 또는 HSC에서 dnmt3b의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포에서 DNA (시토신-5-)-메틸트랜스퍼라제 3 베타 (Dnmt3b) 및/또는 GTPase IMAP 패밀리 구성원 6 (Gimap6)의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 포함한다. WO 2019/236943 및 WO 2021/119061을 참조하며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, EHT의 유도는 dnmt3b의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 Dnmt3b의 활성 또는 발현을 증가시키는 기계감수성 수용체 또는 기계감수성 채널의 효능제의 유효량과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 기계감수성 수용체는 피에졸이다. 예시적인 피에졸 효능제는 Yoda1이다. 일부 실시양태에서, 기계감수성 수용체는 Trpv4이다. 예시적인 Trpv4 효능제는 GSK1016790A이다. Yodal (2-[5-[[(2,6-디클로로페닐)메틸]티오]-1,3,4-티아디아졸-2-일]-피라진)은 기계감수성 이온 채널 피에졸을 위해 개발된 소분자 효능제이다. 문헌 [Syeda R, Chemical activation of the mechanotransduction channel Piezol. eLife (2015)]. Yoda 1은 하기의 구조식을 갖고 있다:
Yodal의 유도체는 다양한 실시양태에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 2,6-디클로로페닐 코어를 포함하는 유도체가 일부 실시양태에서 이용된다. 예시적인 효능제는 문헌 [Evans EL, et al., Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizes Yoda1-evoked activation of Piezo1 and aortic relaxation, British J. of Pharmacology 175(1744-1759): 2018]에 개시되어 있다. 또 다른 피에조1 효능제는 Jedi1, Jedi2, 및 이의 유도체 및 유사체를 포함한다. 문헌 [Wang Y., et al., A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive Piezo1 channel. Nature Communications (2018) 9:1300] 참조. 이 피에조1 효능제는 시판되고 있다. 다양한 실시양태에서, 피에조1 효능제 또는 유도체의 유효량은 약 1 μM 내지 약 500 μM, 또는 약 5 μM 내지 약 200 μM, 또는 약 5 μM 내지 약 100 μM의 범위에 있거나, 일부 실시양태에서, 약 25 μM 내지 약 150 μM, 또는 약 25 μM 내지 약 100 μM, 또는 약 25 μM 내지 약 50 μM의 범위에 있다.
다양한 실시양태에서, 약리학적 피에조1 활성화는 CD34+ 세포 (즉, CD34-농축 세포)에 적용된다. 특정 실시양태에서, 약리학적 피에조1 활성화는 iPSC, 배양체, EC, 혈액생성 내피 세포 (HEC), HSC, 조혈 전구체, 뿐만 아니라 조혈 계통(들)에 추가로 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 피에조1 활성화는 적어도 iPSC로부터 생성된 EB, EB로부터 단리된 CD34+ 세포, 및/또는 이의 조합에 적용되며, 이는 다양한 실시양태에 따라서, EHT를 유도하는 다른 방법과 비교하여 T 전구 세포의 우수한 생성을 가능하게 한다.
대안적으로 또는 추가로, Dnmt3b의 활성 또는 발현은 세포, 예를 들어 CD34-농축 세포에서 직접적으로 증가될 수 있다. 예를 들어, Dnmt3b의 mRNA 발현은 Dnmt3b-코딩 전사물을 세포에 전달하거나, Dnmt3b-코딩 트랜스진, 트랜스진-무함유 방법을 도입함으로써 증가될 수 있으며, 비통합 에피솜을 세포에 도입하는 것으로 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 세포에서 Dnmt3b 발현 요소에 유전적 변형을 도입하기 위해, 예컨대 프로모터 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성을 증가시키고/시키거나, RNA 스플라이싱에 영향을 미치기 위해 이용되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 방법은 단독으로 또는 Dnmt3b 및/또는 주기적 변형 또는 피에졸 활성화시 상향- 또는 하향 조절되는 다른 유전자와 조합하여, 세포에서 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키는 것을 포함한다. Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시키기 위해, Gimap6-코딩 mRNA 전사물을 세포에 도입할 수 있고, 에피솜; 또는 대안적으로 Gimap6-인코딩 트랜스진을 세포에 도입하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 트랜스진-무함유 접근법이 또한 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 세포에서 Gimap6 발현 요소에 유전적 변형 (예컨대 프로모터 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성을 증가시키거나, RNA 스플라이싱에 영향을 미치기 위한 하나 이상의 유전자 변형)을 도입하기 위해 이용된다.
세포로의 mRNA 전달을 이용하는 본 개시내용의 실시양태에서, 공지된 화학적 변형을 사용하여 세포에서의 선천적-면역 반응(innate-immune response)을 피할 수 있다. 예를 들어, 표준 뉴클레오티드(canonical nucleotide)만을 포함하는 합성 RNA는 패턴 인식 수용체에 결합할 수 있으며, 세포에서 강력한 면역 반응을 촉발할 수 있다. 이 반응은 번역 차단, 염증성 시토카인의 분비, 및 세포 사멸을 초래할 수 있다. 특정 비표준 뉴클레오티드를 포함하는 RNA는 선천성 면역계의 검출을 피할 수 있으며, 높은 효율로 단백질로 번역될 수 있다. 특히 선천적 면역 반응을 피하기 위한 뉴클레오티드 변형과 관련하여 본원에 참조로 포함된 US 9,181,319를 참조한다.
일부 실시양태에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현은 원하는 수준의 과발현을 지향할 수 있는 트랜스진을 세포에 도입함으로써 증가된다 (다양한 프로모터 강도 또는 발현 제어 요소의 다른 선택으로). 트랜스진은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 다양한 바이러스 벡터 또는 형질감염 시약 (지질 나노입자 포함)을 사용하여 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 발현은 트랜스진-무함유 방법 (예를 들어, 에피솜 전달)에 의해 증가된다. 일부 실시양태에서, Dnmt3b 및/또는 Gimap6 또는 본원에 개시된 다른 유전자의 발현 또는 활성은, 예를 들어, 프로모터 강도, 리보솜 결합, 또는 RNA 안정성을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형을 도입하기 위해, 유전자 편집 기술을 사용하여 증가된다.
본 개시내용의 다양한 실시양태에 따라 적용될 수 있는, 다양한 편집 기술이 공지되어 있다. 유전자 편집 기술은 CRISPR-Cas (예를 들어, CRISPR-Cas9), 징크 핑거(zinc finger) (ZF), 및 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 DNA-결합 도메인 중 하나 이상 및 Fok1 엔도뉴클레아제의 절단 도메인을 함유하는 융합 단백질을 사용하여 세포에서 원하는 DNA 영역에서 이중-가닥 파단(break)을 생성할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2012/0064620, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0239315, 미국 특허 번호 8,470,973, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0217119, 미국 특허 번호 8,420,782, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0301073, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0145940, 미국 특허 번호 8,450,471, 미국 특허 번호 8,440,431, 미국 특허 번호 8,440,432, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0122581을 참조하며, 이들 모두의 내용은 본원에 참조로 포함된다). 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, CRISPR 연관련 Cas 시스템 (예를 들어, CRISPR-Cas9)을 사용하여 수행된다. 예를 들어, US 8,697,359, US 8,906,616, 및 US 8,999,641을 참조하며, 이들 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 방법은 주기적 2D, 3D, 또는 4D 스트레치를 세포에 적용하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 주기적 2D, 3D, 또는 4D 스트레치가 적용된 세포는 CD34-농축 세포, iPSC, EC, 및 HEC 중 하나 이상으로부터 선택된다. 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조된 WO 2017/096215에 기재된 바와 같이, 주기적-균주 생체역학적 스트레칭을 제공하는 생물반응기에 세포 집단을 도입한다. 주기적-변형 생체역학적 스트레칭은 Dnmt3b 및/또는 Gimap6의 활성 또는 발현을 증가시킬 수 있다. 이들 실시양태에서, 기계적 수단은 세포에, 또는 그 위에 배양된 세포 (예를 들어, EC 또는 HEC)를 갖는 세포 배양 표면에 신장력(stretching force)을 적용한다. 예를 들어, 가요성(flexible) 생체적합성 및/또는 생체모방 표면에 부착된 신장력을 제공하기 위한 컴퓨터 제어 진공 펌프 시스템 또는 다른 수단 (예를 들어, 플렉스셀(FlexCell)™ 장력 시스템(Tension System), 시토스트레처 시스템(Cytostretcher System))을 정의되고 제어된 주기적 변형 조건 하에 세포에 생체외 주기적 2D, 3D, 또는 4D 스트레치를 적용하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 적용된 주기적 스트레치는 수 시간 또는 수일 (예를 들어, 약 7일) 동안 약 1% 내지 약 20% 주기적 변형 (예를 들어, 약 6% 주기적 변형)일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 주기적 변형은 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 48시간, 적어도 약 72시간, 적어도 약 96시간, 적어도 약 120시간, 적어도 약 144시간, 또는 적어도 약 168시간 동안 적용된다.
대안적으로 또는 게다가, EHT는 Trpv4 활성화에 의해 자극된다. Trpv4 활성화는 세포 (예를 들어, CD34-농축 세포, EC, 또는 HEC)를 GSK1016790A, 4알파-PDD, 또는 이의 유사체 및/또는 유도체로부터 임의로 선택되는, 하나 이상의 Trpv4 효능제와 접촉시킴에 의한 것일 수 있다.
일반적으로, 다양한 단계에서, 세포 집단은 원하는 표현형의 세포가 농축되고/되거나, 원하지 않는 표현형의 세포가 고갈될 수 있다. 이러한 양성 및 음성 선택 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 세포는 형광 활성화 세포 분류기, 또는 특정 세포 표면 항원과 세포를 결합하는 자기 비드를 사용하여 세포 표면 항원 (본원에 기재된 것들 포함)을 기준으로 하여 분류할 수 있다. 음성 선택 컬럼을 사용하여 원하지 않는 세포-표면 마커를 발현하는 세포를 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD34+ 세포가 농축된다 (EHT를 겪기 전에 및/또는 후에). 일부 실시양태에서, 세포 집단은 CD34+ 세포의 확장을 촉진하여 줄기 세포의 확장된 집단을 생성하는 조건 하에 배양된다.
다양한 실시양태에서, CD34+ 세포 (예를 들어, 부유체(floater) 및/또는 부착 세포(adherent cell))는 iPSC 분화의 8일차 내지 15일차에 내피에서 조혈로의 전이를 겪는 배양물로부터 수확된다.
다양한 실시양태에서, HSC 또는 CD34-농축 세포는 추가로 확장된다. 예를 들어, HSC 또는 CD34-농축 세포는 US 8,168,428; US 9,028,811; US 10,272,110; 및 US 10,278,990에 기재된 방법에 따라 확장될 수 있으며, 이들 특허는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, HSC 또는 CD34-농축 세포의 생체외 확장은 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 또는 PGE2 유도체를 이용한다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, HSC는 적어도 약 0.01% LT-HSC, 또는 적어도 약 0.05% LT-HSC, 또는 적어도 약 0.1% LT-HSC, 또는 적어도 약 0.5% LT-HSC, 또는 적어도 약 1% LT-HSC를 포함한다.
적혈구계, 골수계, 및 림프계 계통을 생성하는 조혈 줄기 세포 (HSC)는 CD34의 발현 및 계통 특이적 마커 (Lin-라고 칭함)의 부재를 기준으로 하여 식별할 수 있다. 일부 실시양태에서, HSC를 포함하는 줄기 세포의 집단은, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조된 US 9,834,754에 기재된 바와 같이 농축된다. 예를 들어, 이 공정은 CD34, CD90, CD38 및 CD43 중 하나 이상의 발현을 기준으로 하여 세포 집단을 분류하는 것을 포함할 수 있다. 추가 분화를 위해 CD34+, CD90+, CD38-, 및 CD43- 중 하나 이상의 분획을 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조혈 계통으로의 분화를 위한 줄기 세포 집단은 적어도 약 80% CD34+, 또는 적어도 약 90% CD34+, 또는 적어도 약 95% CD34+이다.
일부 실시양태에서, 줄기 세포 집단, 또는 CD34-농축 세포 또는 이의 분획, 또는 유도체 집단은 US 2020/0308540에 기재된 바와 같이 확장되며, 이 출원은그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 세포는, 예를 들어, SR1 또는 SR1-유도체를 포함한, 아릴 탄화수소 수용체 길항제에 세포를 노출시킴으로써 확장된다. 또한, 문헌 [Wagner et al., Cell Stem Cell 2016;18(1):144-55 and Boitano A., et al., Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells. Science 2010 Sep 10; 329(5997): 1345-1348] 참조.
일부 실시양태에서, CD34+ 세포의 확장을 촉진하는 화합물은, 예를 들어, UM171 또는 UM729를 포함한, 피리미도인돌 유도체를 포함한다 (본원에 참조로 포함된 US 2020/0308540을 참조한다).
일부 실시양태에서, 줄기 세포 집단 또는 CD34-농축 세포는 2020/205969 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 기재된 바와 같이, 페리오스틴(Periostin) 및/또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (pdgfra)를 발현하는 세포에 대해 추가로 농축되거나 페리오스틴 및/또는 pdgfra를 발현하도록 변형된다. 이러한 발현은 코딩 전사물을 세포에 전달함으로써, 또는 코딩 트랜스진, 또는 트랜스진-무함유 방법을 도입함으로써일 수 있으며, 비통합 에피솜을 세포에 도입하는 것으로 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집은 세포에서 발현 요소에 유전적 변형을 도입하거나, 예컨대 프로모터 활성 또는 강도, 리보솜 결합, RNA 안정성을 변형시키거나, RNA 스플라이싱에 영향을 미치기 위해 이용된다.
또 다른 실시양태에서, 줄기 세포 집단 또는 CD34-농축 세포는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH1의 억제제와 함께 배양된다. 대안적으로, EZH1은 줄기 세포 집단에서 부분적으로 또는 완전히 결실되거나 불활성화되거나 일시적으로 침묵된다. EZH1의 억제는 골수계 전구 세포(myeloid progenitor cell) (예를 들어, CD34+CD45+)를 림프계 계통으로 지향할 수 있다. 그 전문이 본원에 참조된 WO 2018/048828을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, EZH1은 줄기 세포 집단에서 과발현된다.
다양한 실시양태에서, HSC 집단 또는 이의 분획은 조혈 계통으로 분화되며, 이는 전구 T 세포, T 세포 및 이의 분획, B 세포, 특정 항체를 생산하도록 맞춤 설계된 B-세포, NK 세포, 호중구, 단핵구 또는 대식세포, 거대핵세포, 적혈구, 및 혈소판으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 HSC를 CD7+ 전구 T 세포로, 그리고 임의로 T 세포 계통 또는 다른 계통 (예를 들어, NK 세포)로 분화시키기 위해, 노치 리간드, 부분 또는 전체, SHH, 세포외 기질 성분(들) 및/또는 이의 조합과 함께 생체외에서 배양된다. 추가로, 공지된 공정에 따르면, 이종의(xenogenic) OP9-DL1 세포는 T 세포로의 분화를 위해 종종 사용된다. OP9-DL1 공동-배양 시스템은 노치 리간드 델타 유사-1 (DLL1)로 형질도입된 골수 간질 세포주 (OP9)를 사용하여 줄기 세포 공급원으로부터 T 세포 발달을 지원한다. OP9-DL1 시스템은 임상 적용을 위한 세포의 잠재력을 제한한다. 임상 용도를 위해 hiPSC로부터 T 림프구를 생성할 수 있는 피더-세포-무함유 시스템에 대한 필요성이 있으며, 일부 실시양태에서 본 발명은 이러한 목적을 충족한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "노치 리간드"는 조혈 줄기 세포 또는 전구 T 세포의 막에 존재하는 노치 수용체 폴리펩티드에 결합이 가능한 리간드를 지칭한다. 노치 수용체는 노치-1, 노치-2, 노치-3, 및 노치-4를 포함한다. 노치 리간드는 전형적으로 아미노 말단에 20-22개의 아미노산을 포함하고, 세포외 표면에 3 내지 8개의 EGF 반복부을 포함하는 DSL 도메인 (D-델타, S-세레이트(Serrate), 및 L-Lag2)을 갖고 있다. 다양한 실시양태에서, 노치 리간드는 델타-유사-1 (DLL1), 델타-유사-4 (DLL4), SFIP3, 또는 이의 기능적 부분 중 적어도 하나를 포함한다. 생체내에서 흉선 간질 세포에 의해 들어오는 림프구 전구체에 전달되는 주요 신호는 피질 흉선 상피 세포에 의해 발현되는 DL4에 의해 매개된다.
최초의 흉선내 전구체는 높은 수준의 CD34 및 CD7을 발현하고, CD1a를 발현하지 않으며, 성숙한 T 세포 마커: CD4, CD8 및 CD3에 대해 삼중-음성 (TN)이다. T 세포 계통에 대한 연루는 CD7을 발현하는 전흉선세포(pro-thymocyte)에 의한 CD1a의 발현과 연관되어 있다. 따라서, T-세포 발달의 미성숙 단계는 전형적으로 CD34+CD1a- (가장 미성숙) 및 CD34+CD1a+ 세포로서 기술된다. 초기 흉선세포에 의한 CD34+CD7+CD1a-에서 CD34+CD7+CD1a+로의 전이는 T 세포 연루와 연관되어 있다. CD34+CD7+CD1a+ 세포는 T-계통이 제한될 가능성이 높다. 이 단계 이후, 흉선세포는 CD4 미성숙 단일 양성 단계로 진행되며, 이 시점에서 CD8의 부재 하에 CD4가 발현된다. 그 후, 세포의 하위집합은 CD4+CD8+ 이중 양성 (DP) 단계로 분화된다. 마지막으로, TCRα 재배열 후, TCRαβ를 발현하는 DP 흉선세포는 양성 및 음성 선택을 겪고, CD4+CD8- 및 CD4-CD8+ 단일 양성 (SP) T-세포를 산출한다.
일부 실시양태에서, 전구 T 세포는 CD7 발현을 위한 농축에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 전구 T 세포는 US 2020/0308540에 기재된 바와 같이 확장되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 세포는, 예를 들어, SR1 또는 SR1-유도체를 포함한, 아릴 탄화수소 수용체 길항제에 세포를 노출시킴으로써 확장될 수 있다. 또한, 문헌 [Wagner et al., Cell Stem Cell 2016;18(1):144-55] 참조. 일부 실시양태에서, 확장을 촉진하는 화합물은, 예를 들어, UM171 또는 UM729를 포함하는 피리미도인돌 유도체를 포함한다 (본원에 참조로 포함된 US 2020/0308540을 참조한다).
전구 T 세포로의 분화는 일부 실시양태에서 줄기 세포 인자 (SCF), Flt3L 및 인터루킨 (IL)-7의 존재를 추가로 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 생성된 CD7+ 전구 T 세포는 CD1a를 발현한다. CD7+ 전구 T 세포는 CD34를 발현하지 않거나 HSC 집단과 비교하여 감소된 수준의 CD34를 발현한다. 일부 실시양태에서, CD7+ 전구 T 세포 (또는 이의 일부)는 CD5를 추가로 발현한다. 따라서, 전구 T 세포의 표현형은 CD7+CD1a+일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전구 T 세포의 표현형은 CD7+CD5+이다. 일부 실시양태에서, 전구 T 세포는 CD7+CD1a+CD5+, 및 임의로 CD34+이다.
일부 실시양태에서, 전구 T 세포는 감소된 수준의 CD34 발현, 최소 CD34 발현 (HSC 집단과 비교하여), 또는 CD34 발현 없음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, CD34 발현은 HSC 집단에 비해, 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 75% 만큼 집단에서 감소된다.
일부 실시양태에서, 노치 리간드는 노치 신호전달에 결합하고 관여할 수 있는 항-노치 (효능성) 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 (인간 또는 인간화 항체 포함), 단일 쇄 항체 (scFv), 나노바디, 또는 노치 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 다른 항체 단편 또는 항원-결합 분자이다.
일부 실시양태에서, 노치 리간드는 델타 패밀리 노치 리간드이다. 델타 패밀리 리간드는 일부 실시양태에서 델타-1 (진뱅크 수탁 번호(Genbank Accession No.) AF003522, 호모 사피엔스(Homo sapiens)), 델타-유사 1 (DLL1, 진뱅크 수탁 번호 NM_005618 및 NP_005609, 호모 사피엔스; 진뱅크 수탁 번호 X80903, 148324, 엠. 머스쿨러스(M. musculus)), 델타-4 (진뱅크 수탁 번호 AF273454, BAB18580, 머스 머스쿨러스(Mus musculus); 진뱅크 수탁 번호 AF279305, AAF81912, 호모 사피엔스), 및/또는 델타-유사 4 (DLL4; G진뱅크 수탁 번호 Q9NR61, AAF76427, AF253468, NM_019074, 호모 사피엔스; 진뱅크 수탁 번호 NM 019454, 머스 머스쿨러스)이다. 노치 리간드는 시판되고 있거나, 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 노치 리간드는 인간 DLL1 또는 DLL4 노치 리간드와 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 97% 동일한 (예를 들어, 약 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 노치 리간드 (이의 단편 또는 일부 포함)의 기능적 유도체는 노치 수용체에 결합하여 활성화시킬 수 있을 것이다. 노치 수용체에 대한 결합은 시험관내 결합 검정 및 수용체 활성화/세포 신호전달 검정을 포함한 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 노치 리간드는 가용성이며, 자기 농축(magnetic enrichment) 또는 농축 공정(concentration process)을 허용하도록 임의로 상자성인, 미세입자 또는 나노입자 상에 임의로 고정화된다. 또 다른 실시양태에서, 노치 리간드는, 임의로 VCAM-1과 같은 다른 접착 분자와 함께, 2D 또는 3D 배양 표면 상에 고정화된다. 그 전문이 본원에 참조로 포함된 US 2020/0399599를 참조한다. 다른 실시양태에서, 비드 또는 입자는 중합체 (예를 들어, 폴리스티렌 또는 PLGA), 금, 철 덱스트란이거나, 지질 및/또는 단백질로부터 형성된 입자와 같은 생물학적 물질로 구축된다. 다양한 실시예에서, 입자는 약 0.01 μm (10 nm) 내지 약 500 μm (예를 들어, 약 1 μm 내지 약 7 μm)의 직경 또는 최대 치수를 갖고 있다. 또 다른 실시양태에서, 그 전문이 본원에 참조로 포함된, WO 2020/131582에 기재된 바와 같이, 접합된 리간드를 가진 중합체성 스캐폴드가 이용될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 폴리락트산, 폴리글리콜산, PLGA, 알기네이트 또는 알기네이트 유도체, 젤라틴, 콜라겐, 아가로스, 히알루론산, 폴리(리신), 폴리히드록시부티레이트, 폴리-엡실론-카프로락톤, 폴리포스파진, 폴리(비닐 알콜), 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(알릴아민), 폴리(아크릴레이트), 폴리(4-아미노메틸스티렌), 플루로닉 폴리올, 폴리옥사머, 폴리(우론산), 폴리(무수물), 폴리(비닐피롤리돈), 및 이의 임의의 조합으로 구축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 약 1 pm 내지 100 pm의 직경을 갖는 기공(pore)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 노치 리간드의 C-말단은 선택된 지지체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 이는, 예를 들어, 비오틴 분자를 통해, 지지체에 효소적으로 접합될 수 있는 노치 리간드의 C-말단 말단부에 서열을 부가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지지체에 접합된 단백질 A 또는 단백질 G에 결합함으로써 Fc 세그먼트가 고정화될 수 있도록, 노치 리간드-Fc 융합체가 제조된다. 물론, 공지된 단백질 접합 방법 중 임의의 것을 이용할 수 있다.
따라서, 다양한 실시양태에서, 노치 리간드는 2D 또는 3D 배양 시스템에 고정화, 기능화, 및/또는 내장된다. 노치 리간드는 피브로넥틴, 레트로넥틴, 및 라미닌으로부터 선택된 하나 이상과 같은 세포외 기질의 성분과 함께 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 노치 리간드, 및/또는 세포외 기질의 성분은 3D 배양 조건을 제공하는 불활성 물질에 내장된다. 예시적인 물질은 셀룰로스, 알기네이트, 및 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 노치 리간드, 세포외 기질의 성분, 또는 이의 조합은 세포에 지형학적 패턴(topographical pattern) 및/또는 질감(texture) (예를 들어, 조도(roughness))을 제공하는 배양 조건과 접촉되어 있어 분화 및/또는 확장에 도움이 된다.
일부 실시양태에서, HSC는 TNF-α 및/또는 아릴 탄화수소/다이옥신 수용체 (SR1)의 길항제를 포함하는 배지에서, 그리고 노치 리간드의 존재 하에 배양함으로써 전구 T 세포로 분화된다. 그 전문이 본원에 참조로 포함된 US 2020/0390817, US 2021/0169934, 및 US 2021/0169935를 참조한다. 일부 실시양태에서, HSC는 고정화된 델타-유사-4 리간드 및 피브로넥틴 단편의 존재 하에, TNF-α, IL-7, 트롬보포이에틴 (TPO), Flt3L, 및 줄기 세포 인자 (SCF), 및 임의로 SR1을 포함하는 배지에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 세 가지 기능성 도메인: 인간 피브로넥틴 세포-결합 도메인 (C-도메인), 헤파린-결합 도메인 (H-도메인), 및 CS-1 서열 도메인을 함유하는 재조합 인간 피브로넥틴인 레트로넥틴과 함께 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 고정화된 델타-유사-4 리간드 및 레트로넥틴의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 고정화된 델타-유사-4 리간드, TNF-알파 및 레트로넥틴의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 고정화된 델타-유사-1 리간드 및 레트로넥틴의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 SFIP3 및 레트로넥틴의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 고정화된 델타-유사-4 리간드 및 SHH 분자 및/또는 이의 기능적 유도체의 존재 하에 배양된다. 예시적인 피브로넥틴 단편은 하나 이상의 RGDS, CS-1, 및 헤파린-결합 모티프를 포함한다. 피브로넥틴 단편은 용액 상태로 유리되어 있을 수 있거나 배양 표면이나 입자 상에 고정화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD7+ 전구 T 세포를 제조하기 위해 5일 내지 7일 동안 배양된다.
다양한 실시양태에서, 방법은 세포외 기질 성분(들)을 포함하거나 포함하지 않으면서 노치 리간드 (상기에 기재된 실시양태 중 임의의 것을 포함)와 함께 HSC 집단을 배양하고, 임의로 TNF-알파를 배양물에 분화의 특정 단계에서 첨가함으로써, 전구 T 세포, 또는 T 세포 계통을 생산한다. 따라서, 일부 실시양태에서 생성된 세포는 T 세포 계통에 연루된 전구체 또는 전구 세포 ("전구 T 세포")이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD7+ 전구 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD25+ 미성숙 T 세포이거나, CD4 또는 CD8 계통 연루를 겪은 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD4+CD8+ 이중 양성 (DP), CD4-CD8+, 또는 CD4+CD8-이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD4-CD8+ 또는 CD4+CD8- 및 TCRhi인 단일 양성 (SP) 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 TCRαβ+ 및/또는 TCRγΔ+이다. 다양한 실시양태에서, 세포는 CD3+이다.
전구 T 세포의 입양 전달(adoptive transfer)은 T 세포 재구성을 향상시키기 위한 전략이다. 전구 T 세포는 발달이 미성숙하고 숙주 흉선에서 양성 및 음성 선택을 겪는다. 따라서, 그들은 이식편-대-숙주 질환(graft-versus-host disease) (GVHD)과 연관된 임상적 도전과제를 우회할 수 있는 숙주 관용 T 세포를 산출하는 수령자의 주요 조직적합성 복합체 (MHC)로 제한되게 된다. 중요하게는, 전구 T 세포의 생착이 흉선 구조를 복원하고 HSC-유래 전구체에 의한 후속 흉선 시딩을 개선한다. 전구 T 세포는, 이의 고유한 재생 의학 특성 외에도, T 세포 수용체 (TCR) 및 키메라 항원 수용체 (CAR) (유전자 또는 mRNA 전달을 통해)로 또한 조작되어 종양-연관 항원에 특이성을 부여할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 전구 T 세포는 하나 이상의 노치 리간드를 포함하여, 원하는 T 세포 계통의 세포를 생성시키기 위해 적합한 조건 하에 추가로 배양된다. 예를 들어, 세포는 T 세포 계통의 세포를 형성하기에 충분한 시간 동안 기재된 바와 같이 하나 이상의 노치 리간드의 존재 하에 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 또는 전구 T 세포는 가용성 노치 리간드 또는 입자 또는 다른 지지체에 접합된 노치 리간드, 또는 노치 리간드 발현 세포와 함께 현탁액에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 전구 T 세포 또는 줄기 세포는 현탁액 중 가용성 또는 접합된 노치 리간드와 함께, 생물반응기, 임의로 폐쇄형 또는 폐쇄형, 자동 생물반응기에서 현탁액 중 또는 부착 형식으로 배양된다. 원하는 T 세포 계통에 대한 연루 및 분화를 촉진하는 하나 이상의 시토카인, 세포외 기질 성분(들) 및 흉선 틈새 인자(들)가 또한 배양물 또는 반응기에 첨가될 수 있다. 이러한 시토카인 또는 인자는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다양한 실시양태에서, HSC 집단은 약 4일 내지 약 21일, 또는 약 6일 내지 약 18일, 또는 약 7일 내지 약 14일 동안 노치 리간드와 함께 배양되어 전구 T 세포를 생성한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 집단 또는 이의 유도체는 적어도 약 21일 또는 적어도 약 28일 동안 배양되어 성숙한 T 세포 계통 또는 NK 세포를 생성한다.
다양한 실시양태에서, HSC 집단은 인공 흉선 오가노이드(artificial thymic organoid) (ATO)에서 배양된다. 문헌 [Hagen, M. et al. (2019)]을 참조한다. ATO는 혈청-무함유 조건에서 노치 리간드-발현 간질 세포주와 함께 HSC (또는 HSC의 집합체)의 배양을 포함할 것이다. 인공 흉선 오가노이드는 3D 시스템이며, 이는 조혈 전구체를 나이브(naive) CD3+CD8+ 및 CD3+CD4+ T 세포로 분화하도록 유도한다.
다양한 실시양태에서, 방법은 전구 T 세포의 유도체를 생성하거나 전구 T 세포로부터 T 세포 계통을 생성하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전구 T 세포 또는 T 세포 계통의 유도체는 CD3 및 T 세포 수용체를 발현한다. 일부 실시양태에서, T 세포 계통은 CD8+ 및/또는 CD4+이다. 예를 들어, T 세포 계통은 CD8+CD4-, CD8-CD4+, CD8+CD4+, 및 CD8-CD4- 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, iPSC, CD34+ 세포, 또는 이의 유도체는 전구체-T, T-세포, 및/또는 NK 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 변형된다.
일부 실시양태에서, T 세포 계통은 조절 T 세포(regulatory T cell)이다. T 조절 세포 (또는 T reg)는 CD4+CD25+로 정의된다. Treg는 자기 항원과 외부 항원에 대한 면역 반응을 제어하고 자가면역 질환(autoimmune disease)을 예방하는데 도움을 준다. 전구 T 세포를 Treg로 분화시키는 것은 일부 실시양태에서 전구 T 세포 또는 Treg 전구체를 TGFβ 및 임의로 IL-2 및/또는 IL-10과 함께 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, HSC 집단 또는 이의 분획은 B 림프구 ("B 세포")로 분화된다. 예를 들어, CD34+ 또는 CD34+CD43+ 세포를 MS5 기질 세포 또는 S17 기질 세포와 함께 배양하는 것은 (예를 들어, 15일-25일, 또는 약 21일 동안) CD19, CD45, 및 CD10의 발현으로 B-림프계 동일성(lymphoid identity)을 생성시킬 수 있다. 문헌 [Carpenter L. et al., Human induced pluripotent stem cells are capable of B-cell lymphopoiesis, Blood 117(15):4008-4011]. [Dubois F. et al., Toward a better definition of hematopoietic progenitors suitable for B cell differentiation, Plos One Dec. 15, 2020]을 참조한다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 생산된 B 세포는 표면 IgM (sIgM)을 발현하고 VDJ 재배열을 겪는다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 생산된 B 세포는 성숙을 위해 대상체의 비장 및 2차 림프계 조직(secondary lymphoid tissue)에 생착될 것이다.
일부 실시양태에서, HSC 집단 또는 이의 분획은 단핵구, 대식세포, 또는 호중구로 분화된다. 예를 들어, 적혈골수계 전구체(erythromyeloid precursor) (EMP) (CD43+CD45+)는 IL-6, IL-3, 갑상선 퍼옥시다제 (TPO), SCF, FGF2, 및 VEGF와의 배양에 이어서, 단핵구로의 분화에 의해 생성될 수 있다. 단핵구로의 분화는 M-CSF, IL-3, 및 IL-6과의 배양을 이용한다. 문헌 [Cao X et al., Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives, Stem Cell Reports. 2019 Jun 11; 12(6): 1282-1297]을 참조한다. 본 개시내용에 따라 제조된 단핵구 및 대식세포 계통은 CD14+이며 세포내이입(endocytosis) 및 식세포(phagocytic) 기능을 나타낼 것이다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 생체외에서 M1 (염증유발성(pro-inflammatory)) 또는 M2 (면역억제성) 표현형으로 분극화된다. 일부 실시양태에서, 식세포 마커, 예컨대 CD33 및 CD11b를 가진 CD45+ 조혈 세포가 생성되고, 임의로 후속적으로 iPSC 유래 hCD34+ 세포의 분화에 의해 호중구 특이적 마커, 예컨대 CD66b, CD16b, GPI-80 등을 가진 세포가 생성된다. 이들 공정은 SCF, IL3, FLT3, IL6, GM-CSF, G-CSF, EPO, TPO, 및/또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는, 성장 인자 및 시토카인의 혼합물을 함유하는 분화 배지를 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 호중구 및 이의 전구체는 문헌 [Saeki L., et al., A Feeder-Free and Efficient Production of Functional Neutrophils from Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells Vol. 27, Issue 1, 2009, Pages 59-67]; [Morishima T. et al., Neutrophil differentiation from human-induced pluripotent stem cells. J. Cell. Physiol. 226: 1283-1291, 2011]; [Yokoyama Y. et al., Derivation of functional mature neutrophils from human embryonic stem cells. Blood 2009 Jun 25;113(26):6584-92]; 및 [Sweeney CL et al., Generation of functionally mature neutrophils from induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol 2014; 1124:189-206]에 기재된 방법에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, HSC 집단 또는 이의 분획은 거대핵세포 또는 혈소판으로 분화된다. 예를 들어, 거대핵세포 (혈소판의 재생가능한 공급원으로서)는 수일 (예를 들어, 5일) 동안 SCF, IL-11, 및 TPO와 함께 배양하여 HSC 또는 이의 분획으로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, IL-3, IL-6, SDF-1 및 FGF-4와 같은 다른 시토카인 및 성장 인자를 이용할 수 있다. 거대핵세포는 CD42b+CD61+가 될 것이다. 문헌 [Liu L., Efficient Generation of Megakaryocytes From Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Food and Drug Administration-Approved Pharmacological Reagents, Stem Cells Transl Med. 2015 Apr; 4(4): 309-319]을 참조한다. 혈소판은 IL-11을 가진 혈청 무함유 배지에서 배양하여 거대핵세포로부터 추가로 생성될 수 있다. CD41+CD42a+ 혈소판-유사-입자가 배지로부터 회수된다.
일부 실시양태에서, 전구 T 세포의 유도체는 자연 살해 (NK) 세포이다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 10,266,805에 기재된 바와 같이 전구 T 세포로부터 생성된다. 예를 들어, 전구 T 세포는 IL-15와 함께 배양될 때 NK 세포를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 iPSC, 배아체(embryonic body), hCD34+ 세포, 또는 NK 세포의 유전자 편집을 기반으로 하거나, NK 세포에서의 mRNA 발현을 통해 CAR을 발현한다.
일부 실시양태에서, HSC 집단 또는 이의 분획은 적혈구 또는 이의 유도체로 분화된다. 본 개시내용에 따라 생산된 적혈구는, 예를 들어, 유전성(inherited) 또는 후천성(acquired) 적혈구 장애(red cell disorder), 골수 부전 장애(bone marrow failure disorder), 고소-관련 생리학적 및 병리학적 병태(high-altitude-related physiological and pathological condition), 화학물질 또는 방사선 노출과 관련된 병태를 위해, 및/또는 HSC 이식(HSC transplant)을 겪은 대상체의 치료를 위해 요법에서 투여되거나 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 제조된 적혈구는 인간 질환 또는 생리학적 또는 병리학적 병태를 치료하기 위해 약물 (효소를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 산소 운반체, 또는 다른 적합한 물질을 전달하거나 캡슐화(encapsulating)하는 제약상 허용되는 조성물로서 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된, 세포 집단, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포 집단은 필요한 대상체에게 투여시 흉선, 비장, 또는 2차 림프계 기관에 생착이 가능한 림프구 집단이다. 다양한 실시양태에서, 원하는 세포 집단 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 세포 요법을 위한 조성물이 제조된다. 제약 조성물은 적어도 약 102개 세포, 또는 적어도 약 103개, 또는 적어도 약 104개, 또는 적어도 약 105개, 또는 적어도 약 106개, 또는 적어도 약 107개, 또는 적어도 약 108개 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 수령자 체중의 킬로그램당 약 100,000 내지 약 400,000개 세포 (예를 들어, 약 200,000개 세포/kg)를 포함하는 제약 조성물이 투여된다.
본 개시내용의 세포 조성물은 정맥내 주입 또는 다른 투여 경로에 적합한 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있고, 조성물은 적합한 동결 보호제를 포함할 수 있다. 예시적인 담체는 DMSO (예를 들어, 약 10% DMSO)이다. 세포 조성물은 단위 바이알 또는 백(bag)에 제공될 수 있으며 사용 전까지 냉동 보관될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 부피는 약 1 액량 온스 내지 1 파인트이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CD7+ 전구 T 세포, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 제공하며, 여기서 CD7+ 전구 T 세포는 본원에 개시된 방법에 의해 생산된다. 다양한 실시양태에서, 전구 T 세포는 수령자의 흉선 또는 비장에 생착이 가능하다. 전구 T 세포는 골수 이식 환자에서 백혈병이나 다른 유형의 암의 재발 위험을 감소시키고, 환자에서 심각한 이환률과 사망률을 유발하는 이식 후 감염의 수를 감소시킬 수 있는 잠재력을 갖고 있다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 의해 생산된, 전구 T 세포 또는 T 세포 계통의 유도체, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 T 세포 집단 (또는 전구 T 세포 집단) 또는 NK 세포 집단이며, 이들은, 예를 들어, 림프구감소증(lymphopenia), 암, 면역 결핍증(immune deficiency), 바이러스 감염, 자가면역 질환 (특히 T 세포 집단이 Treg을 포함하는 경우), 림프구감소증, 암, 면역 결핍증, 바이러스 감염, 자가면역 질환 (특히 T 세포 집단이 Treg을 포함하는 경우), 골격 이형성증(skeletal dysplasia), 골수 부전 증후군(bone marrow failure syndrome), 또는 T 세포 발달이나 기능을 손상시키는 유전적 장애(genetic disorder)로부터 선택된 병태를 갖는 인간 대상체의 경우, 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)에 유용하다. 예시적인 유전적 장애는 면역계에 영향을 미칠 수 있으며, 면역손상 상태(immunocompromised state), 또는 자가면역 또는 염증유발성 상태로서 나타난다. 일부 실시양태에서, 대상체는 임의로 혈액학적 악성종양(hematological malignancy) 또는 고형 종양(solid tumor)인 암을 갖고 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CAR-T 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 B 림프구 집단이며, 대상체의 비장 또는 2차 림프계 조직에 생착이 가능하다. 본 개시내용에 따른 B-세포 집단은 예를 들어 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 기생충 감염을 포함한, 감염성 질환으로부터 보호하거나 치료를 제공하는, 면역 손상된 환자의 체액성 면역을 부분적으로 재구성할 수 있는 잠재력을 갖고 있다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 B 세포는 생체내에서 항원-특이적 항체의 생산을 위해 형질 세포로 분화할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 생산된 B 세포는 암 면역요법에 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 B 세포 (CAR B 세포)는 iPSC, 배아체, hCD34+ 세포, 조혈 전구 세포, 또는 B 세포 수준에서 유전자 변형에 의해 제조된다. CAR B 세포는 표면 BCR을 발현하고/하거나 암 항원 또는 감염성 질환 항원과 같은 표적 항원을 인식하는 재조합 모노클로날 항체를 분비한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용에 따라 생산된 B 세포는 항체 (예를 들어, 감염체(infectious agent)로부터 보호를 제공하기 위한 백신 항체)의 생체외 생산에 사용된다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 단핵구 또는 대식세포 세포 집단이고, 세포 집단은 종양을 포함한, 대상체의 다양한 조직에서 생착 및 성숙이 가능하다. 다양한 실시양태에서, 단핵구 또는 대식세포 세포 집단은 대상체에서 조직 상주(tissue resident) 대식세포를 형성할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 대식세포는 주로 M1 (염증유발성) 또는 M2 (면역억제성) 표현형이다. 다양한 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 다양한 조직 또는 기관 중 임의의 것의 암, 간 또는 신장 염증성 질환, 또는 박테리아 감염 (예를 들어, 유치 의료 장치(indwelling medical device)의 집락화 또는 감염 또는 패혈증)을 갖고 있다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 거대핵세포 집단이거나, 이로부터 발생된 혈소판이다. 이들 세포 또는 혈소판은 예를 들어 응고 경로에 영향을 미치는 유전성 혈소판 결함(inherited platelet defect)을 치료하는데 유용한다.
일부 실시양태에서, 세포 집단은 적혈구 집단이다.
일부 실시양태에서, 세포 집단 (또는 혈소판)은 자가유래 세포 또는 보편적으로 적합한 공여자 세포 또는 HLA-변형 또는 HLA 널(null) 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같음)로부터 유래된다. 즉, 세포 집단은 수령자 대상체의 세포로부터 제조되거나 공여자 세포 (예를 들어, 보편적 공여자 세포, HLA-매칭 세포, HLA-변형 세포, 또는 HLA-널 세포)로부터 제조된 iPSC로부터 생성된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포 집단, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 위한 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 혈액 (악성 및 비악성), 골수, 및 면역 질환을 치료하는데 사용된다. 다양한 실시양태에서, 인간 대상체는 림프구감소증, 암, 면역 결핍증, 자가면역 질환, 골격 이형성증, 혈색소병증(hemoglobinopathy), 빈혈, 골수 부전 증후군, 및 유전적 장애 (예를 들어, 면역계에 영향을 미치는 유전적 장애) 중 하나 이상을 포함하는 병태를 갖고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암, 예컨대 혈액학적 악성종양 또는 고형 종양을 갖고 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia); 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia); 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia); 골수증식성 장애(myeloproliferative disorder); 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome); 다발성 골수종(multiple myeloma); 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin lymphoma); 호지킨병(Hodgkin disease); 재생 불량 빈혈(aplastic anemia); 순수 적혈구 무형성증(pure red-cell aplasia); 발작성 야간 혈색소뇨증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria); 판코니 빈혈(Fanconi anemia); 지중해빈혈(thalassemia major); 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia); 중증 복합 면역결핍(severe combined immunodeficiency) (SCID); 비스콧-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome); 혈구탐식성 림프조직구증가증(hemophagocytic lymphohistiocytosis); 선천적 대사 이상(inborn errors of metabolism); 중증 선천성 호중구감소증(severe congenital neutropenia); 슈와크만-다이아몬드 증후군(Shwachman-Diamond syndrome); 다이아몬드-블랙팬 빈혈(Diamond-Blackfan anemia); 및 백혈구 부착 결핍(leukocyte adhesion deficiency)으로부터 선택된 병태를 갖고 있다.
본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 세포 계통은, 예를 들어, 정맥내 주입에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 골수파괴(myeloablative), 비-골수파괴(non-myeloablative), 또는 면역독소-기반(immunotoxin-based) (예를 들어, 항-c-Kit, 항-CD45 등) 조건화 레지메(conditioning regime)에 따라 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 관련 수치의 ±10%를 의미한다.
본 개시내용의 특정 측면 및 실시양태는 하기의 실시예를 참조하여 추가로 기재된다.
실시예
실시예 1 - ETV2 과발현은 혈액생성 내피 세포의 수율을 증가시키고 iPSC 분화 동안 CD34+ 세포 제제를 향상시키나 만능성에는 영향을 미치지 않는다.
방법
iPSC는 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이 그리고 본질적으로 문헌 [Yu, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells, Science 318, 1917-1920, (2007)]; 및 [J. Yu, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801, (2009)]에 기재된 바와 같이 에피솜 재프로그래밍에 의해 hCD34+ 세포로부터 개발되었다. 배양체 및 혈액생성 내피 분화는 본질적으로 문헌 [R. Sugimura, et al., Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature 545, 432-438, (2017)]; [C. M. Sturgeon, et al, Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 32, 554-561, (2014)]; [J. Yu, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920, (2007)]; 및 [J. Yu, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801, (2009)]에 기재된 바와 같이 수행되었다.
간단히 말해서, hiPSC를 해리하고 L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 아스코르브산, 인간 홀로-트랜스페린(holo-Transferrin), 모노티오글리세롤, BMP4, 및 Y-27632가 보충된 배지에 재현탁시켰다. 다음으로, EB 형성을 위해 세포를 10 cm 접시 (EZSPHERE 또는 낮은 부착 플레이트)에 시딩하였다. 1일차에, bFGF와 BMP4를 배지에 첨가하였다. 2일차에, 배지를 SB431542, CHIR99021, bFGF, 및 BMP4를 함유하는 배지로 교체하였다. 4일차에, 세포배지를 VEGF와 bFGF가 보충된 배지로 교체하였다. 6일차에, 세포 배지를 bFGF, VEGF, 인터루킨(IL)-6, IGF-1, IL-11, SCF, 및 EPO가 보충된 배지로 교체하였다. 세포를 5% CO2, 5% O2, 및 95% 습도 인큐베이터에서 유지하였다. CD34+ 세포를 수확하기 위해, EB를 8일차에 해리하고, 세포를 70 μm 스트레이너(strainer)를 통해 여과하고, CD34+ 세포를 CD34 자기 비드 염색(magnetic bead staining)에 의해 단리하였다.
결과
EF1A 프로모터의 제어 하에 ETV2 및 GFP 서열을 둘 다 함유하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 형질도입하였다. 형질도입 후, iPSC 배양물의 약 45%가 GFP 양성으로 관찰되어, ETV2 과발현 (ETV2-OE)을 확인하였다. iPSC 세포의 ETV2-OE는 줄기세포능 마커 발현 TRA-1-60에 의해 나타난 바와 같이 iPSC의 만능성 특성을 보존한다는 것이 추가로 관찰되었다 (도 1). 도 1은 ETV2 및 GFP 서열을 과발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용한 iPSC의 형질도입 효율을 나타내는 FACS 플롯을 나타낸다.
다음으로, ETV2-OE-iPSC는 (ETV2 없이 GFP 서열을 보유하는 벡터로 형질도입된 대조군 iPSC와 함께) 배양체로 분화되었고 후속적으로 혈액생성 내피 세포로 분화되었다 (Strugeon et al., 2014). 결과는 CD235a- 집단 내의 CD34+ 및 CD31+ 마커의 발현에 의해 입증된 바와 같이 ETV2의 과발현이 혈액생성 내피 세포의 형성을 촉진한다는 것을 시사한다 (도 2). 구체적으로, 도 2는 혈액생성 내피 세포 (본원에서는 CD235a-CD34+CD31+로 정의됨)의 대표적인 유동 세포측정 분석을 나타내며, 상대적 정량화는 ETV2-OE가 대조군과 비교하여 혈액생성 내피 세포의 형성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
게다가, 결과는 ETV2-OE가 CD34+ 세포의 형성을 향상시킨다는 것을 시사한다 (도 3). 도 3은 CD34+ 세포의 대표적인 유동 세포측정 분석 및 상대적 정량화는 ETV2-OE가 CD34+ 세포 형성을 향상시킨다는 것을 입증한다.
전반적으로, 이들 데이터는 iPSC의 ETV2 과발현이 만능성 특성에 영향을 미치지 않으며 혈액생성 내피 및 조혈 분화를 겪는 그들의 능력을 용이하게 한다는 것을 나타낸다.
실시예 2 - 피에조1 활성화로 생성된 iPSC-유래 HSC는 골수-유래 HSC와 유사한 T 세포 분화를 겪는다.
방법
EHT를 분석하기 위해, EB-유래 CD34+ 세포를 Y-27632, TPO, IL-3, SCF, IL-6, IL-11, IGF-1, VEGF, bFGF, BMP4, 및 FLT3을 함유하는 배지에 현탁시켰다. 세포가 대략 4시간-18시간 동안 웰의 바닥에 부착된 후 (육안 검사에 의해), Yoda1을 배양물에 첨가하였다. 4일-7일 후, 분석을 위해 세포를 수집하였다.
iPSC는 8일 동안 배양체로 분화되었다. 8일차에, iPSC-유래 배양체로부터의 CD34+ 세포를 수확하고 추가로 5일 내지 7일 동안 배양하여 내피에서 조혈 (EHT)로의 전이를 유도하였다. 이어서, 추가 조혈 계통 분화를 위해 5일차 내지 7일차에 EHT 배양물로부터 CD34+ 세포를 수확하였다.
5일-7일차 (또는 iPSC로부터의 총 13일-21일차 분화) 사이의 EHT 배양물로부터 수확한 CD34+ 세포를 rhDL4 및 레트로넥틴으로 미리 코팅된 48-웰 플레이트에 시딩하였다. T 계통 분화는 aMEM, FBS, ITS-G, 2BME, 아스코르브산-2-포스페이트, 글루타맥스(Glutamax), rhSCF, rhTPO, rhIL7, FLT3L, rhSDF-1a, 및 SB203580을 함유하는 배지에서 유도되었다.
2일차 내지 6일차에, 배지의 80%를 격일로 바꾸었다. D7에, 세포를 새로운 코팅된 플레이트로 옮기고 pro-T 세포 (CD34+ CD7+ CD5+/-)의 존재를 분석하였다.
8일차 내지 13일차에, 배지의 80%를 격일로 바꾸었다. D14에, 100,000개의 세포/웰을 새로운 코팅된 플레이트로 옮기고 세포를 pre-T 세포 (CD34- CD7+ CD5+/-)의 존재에 대해 분석하였다.
15일차 내지 20일차에, 배지의 80%를 격일로 바꾸었다. 세포를 D21에 수확하고, 세포를, T 세포의 대용물로서, FACS를 통해, CD3, CD8, CD5, CD7, TCRab 발현에 대해 분석하고/하거나, CD3/CD28 비드를 사용하여 활성화시켜 그들의 기능적 특성을 평가하였다.
21일의 분화 후, 세포를 수집하고 대략 80,000개의 세포를 RPMI 1640 (L-글루타민 없음; 페놀 레드 없음)에 더하여 FBS, L-글루타민, IL-2의 새로운 96-웰 배양 플레이트에 다시 시딩한 다음에, 1:1 CD3/CD28 비드로 활성화시켰다. CD3/CD28 비드로 활성화 72시간 후, 세포를 FACS에 의한 CD3, CD69, CD25 발현 및 RT-qPCR을 사용한 IFN-γ 발현에 대해 분석하였다. 상청액을 ELISA에 의해 분석하였다.
결과
도 4a 및 도 4b는 피에조1 활성화로 유래된 iPSC-유래 HSC가 골수 (BM)-HSC와 유사한 pro-T 세포 분화를 겪는다는 것을 나타낸다. 추가로, 도 5a 및 도 5b는 피에조1 활성화로 생성된 iPSC-유래 HSC가 T 세포 분화를 겪고 BM-HSC와 유사한 CD3/CD28 비드로 활성화될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 6은 피에조1 활성화로 생성된 iPSC-유래 HSC가, CD3/CD28 비드로 자극시 IFNγ 발현에 의해 입증된 바와 같이, 기능성 T 세포로 분화할 수 있다는 것을 나타낸다. 종합하여, 이들 결과는 HSC 형성 동안 피에조1 활성화가 전구 T 세포 및 기능성 T 세포를 생체외에서 추가로 분화시키는 HSC의 능력을 향상시킨다는 것을 입증한다.
참고문헌
Claims (123)
- 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell) (PSC) 집단을 제조하는 단계;
CD34+ 세포를 농축하여(enriching) CD34-농축 집단(enriched population)을 제조하는 단계;
상기 CD34-농축 집단의 내피에서 조혈로의 전이(endothelial-to-hematopoietic transition)를 유도하여 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell) (HSC)를 포함하는 집단을 제조하는 단계, 및 임의로 내피에서 조혈로의 전이를 겪는 CD34-농축 집단으로부터 세포를 수확(harvesting)하는 단계; 및
상기 HSC 집단을 조혈 계통(hematopoietic lineage)으로 분화하는 단계
를 포함하는, 조혈 계통의 세포 집단을 제조하기 위한 방법. - 제1항에 있어서, PSC 집단이 림프구, 제대혈 세포, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell), CD34+ 세포, 또는 인간 1차 조직(human primary tissue)으로부터 유래된 인간 iPSC 집단인 방법.
- 제2항에 있어서, PSC 집단이 말초 혈액으로부터 단리된 CD34-농축 세포로부터 유래되는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, iPSC가 하나 이상의 HLA 클래스(Class) I 및/또는 클래스 II 유전자에 대해 동형접합성(homozygous)인 방법.
- 제2항에 있어서, iPSC가 하나 이상의 HLA 클래스 I 유전자를 결실시키고/시키거나, 하나 이상의 클래스 II 유전자를 결실시키고/시키거나, HLA 또는 MHC 발현 또는 제시 능력(presentation capacity)을 제어(governing)하는 하나 이상의 유전자를 결실시키도록 유전자 편집(gene-editing)되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, HLA 또는 MHC 발현 또는 제시 능력을 제어하는 하나 이상의 유전자가 β2-마이크로글로불린 및/또는 CIITA인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, CD34-농축 및 내피에서 조혈로의 전이가 iPSC 분화의 8일차 내지 15일차에 유도되는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 내피에서 조혈로의 전이가 장기(long-term) 조혈 줄기 세포 (LT-HSC), 단기(short-term) 조혈 줄기 세포, 및 조혈 줄기 전구 세포(hematopoietic stem progenitor cell) 중 하나 이상을 포함하는 HSC 집단을 생성하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, CD34+ 세포가, CD34+ 부유체(floater) 및/또는 부착 세포(adherent cell)의 수확을 포함하여, 내피에서 조혈로의 전이를 겪는 배양물로부터 수확되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, HSC 집단이 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 내피에서 조혈로의 전이의 유도가 dnmt3b의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 포함하는 방법.
- 제7항에 있어서, 내피에서 조혈로의 전이의 유도가 주기적 스트레치(cyclic stretch)를 CD34-농축 세포에 적용하는 것을 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 주기적 스트레치가 2D, 3D, 또는 4D 주기적 스트레치인 방법.
- 제7항에 있어서, 내피에서 조혈로의 전이의 유도가 피에조(Piezo)1 활성화를 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 피에조1 활성화가 CD34-농축 세포 또는 이의 분획을 Yoda1, Jedi1, Jedi2, 또는 이의 유사체 또는 유도체로부터 임의로 선택되는, 하나 이상의 피에조1 효능제와 접촉시킴에 의한 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 내피에서 조혈로의 전이의 유도가 Trpv4 활성화를 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, Trpv4 활성화가 세포 CD34-농축 세포를 GSK1016790A, 4알파-PDD, 또는 이의 유사체 또는 유도체로부터 임의로 선택되는, 하나 이상의 Trpv4 효능제와 접촉시킴에 의한 것인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 계통이 전구-T 세포, T 림프구, B 림프구, 자연 살해 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포, 적혈구(red cell), 거대핵세포(megakaryocyte), 및 혈소판으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, HSC 집단 또는 이의 분획이 전구 T 세포, T 세포, NK 세포, 및/또는 이의 분획 또는 유사체로 생체외 분화되는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, HSC 집단 또는 이의 분획이 부분 또는 전부 노치 리간드(Notch ligand)와 함께 배양되어 CD7+ 전구 T 세포 또는 유도체 세포 집단을 포함하는 집단을 생산하는 것인 방법
- 제20항에 있어서, CD7+ 전구 T 세포가 CD1a를 발현하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, CD7+ 전구 T 세포가 CD34를 발현하지 않거나 HSC 집단과 비교하여 감소된 수준의 CD34를 발현하는 것인 방법.
- 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CD7+ 전구 T 세포가 CD5를 발현하는 것인 방법.
- 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 노치 리간드가 DLL1, DLL4, SFIP3, 또는 이의 기능적 부분 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
- 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 노치 리간드가 2D 또는 3D 배양 시스템에 고정화, 기능화, 및/또는 내장되는 것인 방법.
- 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 노치 리간드가, 피브로넥틴, 레트로넥틴(RetroNectin), 및 라미닌, 이의 유도체 또는 유사체, 및/또는 이의 조합으로부터 임의로 선택되는, 세포외 기질의 성분과 함께 포함되는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 노치 리간드, 및/또는 세포외 기질의 성분이, 셀룰로스, 알기네이트, 및 이의 조합으로부터 임의로 선택되는, 3D 배양 조건을 제공하는 불활성 물질에 내장(embedding)되는 것인 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 노치 리간드, 세포외 기질의 성분, 또는 이의 조합이 세포에 지형학적 패턴(topographical pattern) 및/또는 조도(roughness)를 제공하는 배양 조건과 접촉되어 있는 것인 방법.
- 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 노치 리간드, 세포외 기질의 성분, 지형학적 패턴 및/또는 조도, 또는 이의 조합이 시토카인 및/또는 TNF-알파 및 SHH 중 하나 이상으로부터 임의로 선택되는 성장 인자와 함께 배양되는 것인 방법.
- 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, HSC 집단 또는 이의 분획이 인공 흉선 오가노이드(artificial thymic organoid)에서 배양되는 것인 방법.
- 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 전구 T 세포로부터 T 세포 계통을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
- 제31항에 있어서, T 세포 계통이 적어도 하나의 CD3 및 T 세포 수용체를 발현하는 것인 방법.
- 제32항에 있어서, T 세포 계통이 CD8+ 및/또는 CD4+인 방법.
- 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 계통이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 것인 방법.
- 제31항에 있어서, T 세포 계통이 조절 T 세포(regulatory T cell)인 방법.
- 제31항에 있어서, T 세포 계통이 감마-델타 T 세포인 방법.
- 제31항에 있어서, T 세포 계통이 알파-베타 T 세포인 방법.
- 제31항에 있어서, T 세포 계통이 세포독성 T 세포인 방법.
- 제31항에 있어서, 전구 T 세포로부터 자연 살해 (NK) 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
- 제39항에 있어서, NK 세포 계통이 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 것인 방법.
- 제19항 내지 제40항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, T 세포 또는 NK 세포 집단, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물.
- 제41항에 있어서, 세포 집단이 흉선 또는 2차 림프계 기관(secondary lymphoid organ)에 생착(engraftment)이 가능한 T 세포 또는 NK 세포 집단.
- 제41항 또는 제42항의 T 세포 또는 NK 세포 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 위한 방법.
- 제43항에 있어서, 인간 대상체가 림프구감소증(lymphopenia), 암, 면역 결핍증(immune deficiency), 자가면역 질환, 바이러스 감염, 골격 이형성증(skeletal dysplasia), 및 골수 부전 증후군(bone marrow failure syndrome) 중 하나 이상을 포함하는 병태(condition)를 갖고 있는 것인 방법.
- 제44항에 있어서, 대상체가, 임의로 혈액학적 악성종양(hematological malignancy) 또는 고형 종양(solid tumor)인, 암을 갖고 있는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, HSC 집단 또는 이의 분획이 B 림프구 또는 이의 유도체로 분화되는 것인 방법.
- 제46항의 방법에 의해 생산된, B 림프구 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물.
- 제47항에 있어서, 대상체의 비장 또는 2차 림프계 조직에 생착하는 B 림프구 집단.
- 제47항 또는 제48항의 B 림프구 집단, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법 또는 백신접종(vaccination)을 위한 방법.
- 제49항에 있어서, 인간 대상체가 면역 손상된(immune compromised) 것인 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 인간 대상체가 즉각적인 치료를 위해 및/또는 보호 면역(protective immunity)을 획득하기 위해 항체 요법 또는 백신접종을 필요로 하는 방법.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 대상체가 바이러스, 박테리아, 진균, 또는 기생충 감염을 갖고 있거나, 감염될 위험이 있는 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 대상체가 암을 갖고 있거나 암에 걸릴 위험이 있는 방법.
- 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포가 CAR-B 세포인 방법.
- 제18항에 있어서, HSC 집단 또는 이의 분획이 호중구, 단핵구 또는 대식세포로 분화되는 것인 방법.
- 제55항의 방법에 의해 생산된, 호중구, 단핵구, 또는 대식세포 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물.
- 제56항의 호중구, 단핵구 또는 대식세포 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 위한 방법.
- 제57항에 있어서, 대상체가 암, 후천성(acquired) 또는 유전적 혈액학적 질환(genetic hematological disease), 간 또는 신장 염증성 질환, 또는 박테리아 감염으로부터 선택된 병태를 갖고 있는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, HSC 집단 또는 이의 분획이 거대핵세포로, 그리고 임의로 혈소판으로 분화되는 것인 방법.
- 제59항의 방법에 의해 생산된, 거대핵세포 집단 또는 이로부터 유래된 혈소판 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물.
- 제60항의 거대핵세포 또는 혈소판 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 위한 방법.
- 제61항에 있어서, 대상체가 유전성(inherited) 또는 후천성 혈소판 결함(platelet defect)을 갖고 있는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, HSC 집단 또는 이의 분획이 적혈구 또는 이의 유도체로 분화되는 것인 방법.
- 제63항의 방법에 의해 생산된, 적혈구 집단 또는 이로부터 유래된 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물.
- 제64항의 세포 집단 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 이를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 위한 방법.
- 제65항에 있어서, 대상체가 유전성 또는 후천성 적혈구 장애(red cell disorder), 골수 부전 장애(bone marrow failure disorder), 고소-관련 생리학적 및 병리학적 병태(high-altitude-related physiological and pathological condition)를 갖고 있거나, 대상체가 HSC 이식(HSC transplant)을 겪고 있는 것인 방법.
- 제65항에 있어서, 제약상 허용되는 조성물이 하나 이상의 약물 또는 산소 담체를 전달하거나 캡슐화(encapsulating)하는데 사용되는 것인 방법.
- 인간 만능 줄기 세포로부터 인간 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)를 포함하는 HSC 집단을 생성하는 단계로서, 여기서 HSC 집단이 CD34+ 세포의 내피에서 조혈로의 전이에 의해 유래되는 것인 단계; 및
HSC 집단 또는 이로부터 단리된 세포를 부분 또는 전체 노치 리간드, 및/또는 세포외 기질의 성분과 함께 배양하여 CD7+ 전구 T 세포 또는 유도체 세포 집단을 포함하는 집단을 생산하는 단계
를 포함하는 방법. - 제68항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)인 방법.
- 제69항에 있어서, 인간 만능 줄기 세포가 림프구, 제대혈 세포, 말초 혈액 단핵 세포, CD34+ 세포, 또는 인간 1차 조직으로부터 유래되는 것인 방법.
- 제70항에 있어서, iPSC 집단이 말초 혈액으로부터 단리된 CD34-농축 세포로부터 유래되는 것인 방법.
- 제70항에 있어서, iPSC 집단이 말초 혈액으로부터 단리된 T 림프구로부터 유래되는 것인 방법.
- 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, iPSC가 하나 이상의 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 유전자에 대해 동형접합성인 방법.
- 제73항에 있어서, iPSC가 하나 이상의 HLA 클래스 I 유전자, 하나 이상의 클래스 II 유전자를 결실시키고/시키거나, HLA 또는 MHC 발현 또는 제시 능력을 제어하는 하나 이상의 유전자를 결실시키도록 유전자 편집되는 것인 방법.
- 제74항에 있어서, HLA 또는 MHC 발현 또는 제시 능력을 제어하는 하나 이상의 유전자가 β2-마이크로글로불린 및/또는 CIITA인 방법.
- 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, CD34+ 세포의 내피에서 조혈로의 전이가 iPSC 분화의 8일차 내지 15일차에 유도되는 것인 방법.
- 제76항에 있어서, CD34+ 세포가, CD34+ 세포 부유체 및/또는 부착 세포의 수확을 포함하여, 내피에서 조혈로의 전이를 겪는 배양물로부터 수확되는 것인 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 내피에서 조혈로의 전이가 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC), 단기 조혈 줄기 세포, 및 조혈 줄기 전구 세포 중 하나 이상을 포함하는 HSC 집단을 생성하는 것인 방법.
- 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, HSC 집단을 생성하는 것이 CD34+ 세포에서 dnmt3b의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 포함하는 방법.
- 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, HSC 집단을 생성하는 것이 주기적 스트레치를 CD34+ 세포에 적용하는 것을 포함하는 방법.
- 제80항에 있어서, 하나 이상의 세포 집단에 2D, 3D, 또는 4D 주기적 스트레치가 적용되고, 주기적 스트레치에 적용된 세포가 iPSC, CD34+ 세포, 내피 세포 (EC), 및 혈액생성 내피 세포 (HEC)로부터 임의로 선택되는 것인 방법.
- 제68항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, HSC 집단을 생성하는 것이 피에조1 활성화를 포함하는 것인 방법.
- 제82항에 있어서, 피에조1 활성화에 적용된 세포가 iPSC, EB, CD34+ 세포, EC, HEC, 및 HSC 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제82항 또는 제83항에 있어서, 피에조1 활성화가 세포를 Yoda1, Jedi1, Jedi2, 또는 이의 유사체 또는 유도체로부터 임의로 선택되는, 하나 이상의 피에조1 효능제와 접촉시킴에 의한 것인 방법.
- 제68항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, HSC 집단을 생성하는 것이 CD34+ 세포의 Trpv4 활성화를 포함하는 것인 방법.
- 제85항에 있어서, Trpv4 활성화가 만능 줄기 세포 또는 이로부터 분화된 세포를 GSK1016790A, 4알파-PDD, 또는 이의 유사체 또는 유도체로부터 임의로 선택되는, 하나 이상의 Trpv4 효능제와 접촉시킴에 의한 것인 방법.
- 제68항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, HSC 집단이 인간 iPSC의 8일차부터 17일차 분화로부터 유래되는 것인 방법.
- 제68항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, CD7+ 전구 T 세포가 CD1a를 발현하는 것인 방법.
- 제68항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, CD7+ 전구 T 세포가 CD34를 발현하지 않거나, HSC 집단과 비교하여 감소된 수준의 CD34를 발현하는 것인 방법.
- 제68항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, CD7+ 전구 T 세포가 CD5를 발현하는 것인 방법.
- 제68항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 노치 리간드가 DLL1 및 DLL4, 또는 이의 기능적 부분 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
- 제91항에 있어서, 노치 리간드가 DLL1 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 것인 방법.
- 제91항에 있어서, 노치 리간드가 DLL4 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 부분을 포함하는 것인 방법.
- 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 노치 리간드가 2D 또는 3D 배양 시스템에 고정화, 기능화, 및/또는 내장되는 것인 방법.
- 제94항에 있어서, 노치 리간드가, 피브로넥틴, 레트로넥틴, 및 라미닌으로부터 임의로 선택되는, 세포외 기질의 성분과 함께 포함되는 것인 방법.
- 제95항에 있어서, 노치 리간드, 및/또는 세포외 기질의 성분이, 셀룰로스, 알기네이트, 및 이의 조합으로부터 임의로 선택되는, 3D 배양 조건을 제공하는 불활성 물질에 내장되는 것인 방법.
- 제95항 또는 제96항에 있어서, 노치 리간드, 세포외 기질의 성분, 또는 이의 조합이 세포에 지형학적 패턴 및/또는 조도를 제공하는 배양 조건과 접촉되어 있는 것인 방법.
- 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 노치 리간드, 세포외 기질의 성분, 지형학적 패턴 및/또는 조도, 또는 이의 조합이 시토카인 및/또는 TNF-알파, SHH, 또는 이의 조합으로부터 임의로 선택되는 성장 인자와 함께 배양되는 것인 방법.
- 제68항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포 집단이 인공 흉선 오가노이드에서 배양되는 것인 방법.
- 제68항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 전구 T 세포의 유도체를 생성하거나 전구 T 세포로부터 T 세포 계통을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
- 제100항에 있어서, 전구 T 세포의 유도체 또는 T 세포 계통이 CD3 및 T 세포 수용체를 발현하는 것인 방법.
- 제101항에 있어서, T 세포 계통이 CD8+ 및/또는 CD4+인 방법.
- 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 계통이 변형되어 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 것인 방법.
- 제100항에 있어서, T 세포 계통이 조절 T 세포인 방법.
- 제100항에 있어서, T 세포 계통이 감마-델타 T 세포인 방법.
- 제100항에 있어서, T 세포 계통이 알파-베타 T 세포인 방법.
- 제100항에 있어서, T 세포 계통이 세포독성 T 세포인 방법.
- 제100항에 있어서, 전구 T 세포의 유도체가 자연 살해 (NK) 세포인 방법.
- 제68항 내지 제99항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, CD7+ 전구 T 세포 또는 이의 제약상 허용되는 조성물.
- 제109항에 있어서, 전구 T 세포가 CD34- 또는 CD34low인 CD7+ 전구 T 세포 또는 이의 조성물.
- 제109항 또는 제110항에 있어서, 투여시 흉선 또는 비장에 생착이 가능한 CD7+ 전구 T 세포.
- 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항의 CD7+ 전구 T 세포 또는 이의 제약상 허용되는 조성물을 T 세포 수의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 요법을 위한 방법.
- 제112항에 있어서, 인간 대상체가 림프구감소증, 암, 면역 결핍증, 자가면역 질환, 골격 이형성증, 골수 부전 증후군, 및 바이러스 감염 중 하나 이상을 포함하는 병태를 갖고 있는 것인 방법.
- 제113항에 있어서, 대상체가 암을 갖고 있는 것인 방법.
- 제114항에 있어서, 암이 혈액학적 악성종양인 방법
- 제114항에 있어서, 대상체가 고형 종양을 갖고 있는 것인 방법.
- 제100항 내지 제108항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된, CD7+ 전구 T 세포 또는 T 세포 계통의 유도체, 또는 이의 제약상 허용되는 조성물.
- 제117항에 있어서, CD7+ 전구 세포 또는 T 세포 계통의 유도체가 흉선 또는 비장에 생착이 가능한 것인 CD7+ 전구 T 세포의 유도체.
- 제117항 또는 제118항에 따른, CD7+ 전구 T 세포 또는 T 세포 계통의 유도체, 또는 이의 조성물을 T 세포 수의 증가를 필요로 하는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)을 위한 방법.
- 제119항에 있어서, 인간 대상체가 림프구감소증, 암, 면역 결핍증, 자가면역 질환, 골격 이형성증, 골수 부전 증후군, 및 바이러스 감염 중 하나 이상을 포함하는 병태를 갖고 있는 방법.
- 제120항에 있어서, 대상체가 암을 갖고 있는 것인 방법.
- 제121항에 있어서, 암이 혈액학적 악성종양인 방법.
- 제121항에 있어서, 대상체가 고형 종양을 갖고 있는 것인 방법.
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