KR20080015033A

KR20080015033A - 배아 줄기 세포로부터 가지 세포를 형성하는 방법

Info

Publication number: KR20080015033A
Application number: KR1020077030573A
Authority: KR
Inventors: 이고르 아이. 슬루크빈; 제임스 에이. 톰슨; 마크스임 에이. 보드야니크; 마리나 이. 구멘유크
Original assignee: 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date: 2005-06-01
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2008-02-15
Also published as: JP2008541762A; AU2006252576B2; US8785189B2; SE531979C2; US8435785B2; US20130230917A1; US7811821B2; WO2006130651A3; IL187628A0; WO2006130651A2; CA2610243C; EP1885845A2; AU2006252576A1; US8133732B2; GB2440494A; SE0702695L; IL187628A; GB0723152D0; GB2440494B; US20120142106A1

Abstract

본 발명은 인간 배아 줄기(ES) 세포로부터 가지 세포를 배양하는 것에 관한 것이다. 인간 ES 세포는 먼저 기질 세포와의 공-배양에 의해 조혈 세포로 배양된다. 이제 조혈 계통으로 분화된 세포는 이후 GM-CSF와 함께 배양되어 골수 전구체 세포의 배양액을 생성한다. 골수 전구체 세포와 사이토킨 GM-CSF 및 IL-4의 배양은 기능성 가지 세포의 생성을 야기한다. 가지 세포는 세포 표면 마커들의 조합에 의해 표시되는, 독특한 표현형을 지닌다.

Description

배아 줄기 세포로부터 가지 세포를 형성하는 방법 {METHOD OF FORMING DENDRITIC CELLS FROM EMBRYONIC STEM CELLS}

배아 줄기 세포는 세포 배양 및 중복성(multipotent)을 나타내는 다양한 계통 제한적인 세포 개체군으로의 분화 둘 모두가 가능한 다능(pluripotent) 세포이다 (Odorico et al., (2001) Stem Cells 19: 193-204). 따라서 인간 배아 줄기(ES) 세포는 다양한 계통-제한적인 경로에 개입하여 분화될 수 있어서 독특한 기능을 수행하는 매우 특이적인 세포 유형을 야기한다.

일반적으로, ES 세포는 고도로 균질하고, 자체-갱신능을 보이며, 인체의 임의의 기능 세포로 분화되는 능력을 지닌다. 이러한 자체-갱신 특성은 적합한 조건하에 세포 배양액에서의 무제한의 팽창 가능성을 지니는 장기간 증식 성능을 초래할 수 있다. 더욱이, 인간 ES 세포가 정해지지 않은 양상으로 분화를 허용하는 경우, 다수의 상이한 조직 유형에 대한 마커를 발현시키는 이질적인 세포 개체군이 수득되는 것으로 이해된다 (WO 01/51616; Shamblott et al., (2001) Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 98:113). 이러한 특징들은 상기 세포가 치료 유용성을 지닌 세포를 생성하기 위한 유일한 균질한 출발 개체군이 되게 한다.

당 분야의 연구자들은 인간 ES 세포로부터 다양한 자손 세포 유형을 배양하는 방법을 개발하기 위해 노력해 왔다. 예를 들어, 미국특허 6,280,718호는 인간 ES 세포를 기질 세포와 함께 배양함에 의해 인간 ES 세포를 조혈 세포롤 배양하는 방법을 기술한다. 인간 ES 세포로부터 자손 세포 유형을 생성하는 일부 방법은 배아유사체의 생성을 포함하며, 이것은 배양액에서 ES 세포에 의해 형성될 수 있고 다양한 분화된 자손 계통으로의 ES 세포의 다양한 분화를 조장할 수 있는 3차원 구조이다. 자손 계통을 생성하기 위한 다른 방법은 인간 ES 세포와 특정 배지의 배양, 작용제 또는 ES 세포를 특정 방향으로의 분화를 촉진하는 인자에 노출시키는 세포의 유형에 의존적이다. 모든 이러한 방법들은 과학적 연구 및 실험을 위해, 그리고 일부 세포 유형의 경우, 치료 목적으로 인체로의 궁극적인 이식을 위해 특정 세포 유형에 대한 공급원을 제공하고자 하는 공통의 목적을 지닌다.

가지 세포는 포유동믈 면역계에서 중요한 기능을 수행하는 면역 세포이다. 가지 세포 (때로 본원에서 DC)는 피부와 같은 환경, 및 코, 폐, 위 및 장의 내층과 접촉하여 신체 조직에 낮은 빈도로 존재하는 강력한 항원-제시 세포이다. 가지 세포는 항원을 흡수하는 능력을 지니며 일차 T 세포 반응을 유도하여 병원체에 대한 일반화된 면역계 반응을 개시한다. 가지 세포는 이들의 긴 돌기 또는 가지로 인해 가지돌기라고 명명되며, 이는 가지 세포 형태학의 특징이다.

가지 세포는 조혈계로부터의 골수에서 연속하여 생성되고 혈액에서 성숙된다. 개체의 가지 세포는 이질적인 표현형 및 기능을 지닌다. 가지 세포는 여러 가지 방식으로 발생되며, 이들의 파생 계통에 따라 가지 세포간에도 차이가 있을 수 있다. 두 독립적인 경로를 따라 CD34+ 조혈 선조로부터 발생되는 가지 세포는 랑게르한스 세포 및 사이질 가지 세포가 된다. 단핵구 또는 플라스모시토이드 T 세포로부터 유래된 가지 세포는 각각 단핵구-유래 DC 또는 플라스모시토이드 DC로서 언급된다. 이들의 세포 기원 표현형에 기초하여, 가지 세포는 보통 두 주요 분류인 골수 또는 림프계로 크게 구분된다. 보통의 골수 DC 전구체가 모든 가지 세포 계통의 근원이라는 것이 또한 현재 제안된 바 있으나, 골수 DC는 보통의 골수 전구체로부터 발생되는 한편 림프계 DC는 보통의 림프계 전구체로부터 발생되는 것으로 여겨진다.

인간 미성숙 가지 세포의 유효성은 항원 프로세싱 및 제시 연구 및 면역성 및 내성 유도의 메커니즘을 이해하는데 유용할 것이다. CD34+ 조혈 줄기 세포 및 단핵구로부터 가지 세포를 분화시키는 시험관내 시스템의 개발에 의해 인간 가지 세포 서브셋의 기능적인 분석이 상당히 촉진되었다. 그러나, 이러한 현존하는 프로토콜을 이용하여, 다수의 인간 가지 세포 선조를 수득하는 것은 어려운 과정이며 공여체에 대한 잠재적인 위험성을 동반한다. 가지 세포 개체발생학과 같은 가지 세포 생물학의 다른 측면은 초기 발생 동안 조직을 수득하는데 있어서의 어려움으로 인해 인간에서 연구된 적이 없다. 인간 ES 세포의 출현은 이러한 제한을 극복하는 기회를 의미한다.

기능적인 가지 세포는 마우스 매크로파지 콜로니-자극 인자 결핍 골수 기질 세포주인 OP9와의 공-배양에 의해 배아유사체를 이용하여 마우스 ES 세포로부터 생성되었다. 본 발명자들은 OP9 세포가 인간 ES 세포로부터 조혈 세포를 유도하는데 사용될 수 있음을 이미 입증하였다. 다양한 계통의 자손을 생성하는 이러한 조혈 세포의 충분한 효능은 이전에 연구되지 않았다.

발명의 개요

일 구체예에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포를 매크로파지 콜로니-자극 인자를 발현시키지 않는 기질 세포와 함께 공-배양하는 단계; 선조 세포를 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자(GM-SCF)와 함께 배양시켜 골수 전구체 세포의 팽창을 야기하는 단계; 및 미성숙 가지 세포의 표현형을 지니는 세포를 회수하는 단계를 포함하며, 줄기 세포는 중복성 림프-조혈 선조 세포로의 분화를 위해 유도되고 배양액에는 사이토킨이 존재하지 않는, 인간 배아 줄기 세포를 가지 세포로 배양시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 가지 세포의 표현형을 지니는 세포를 회수하는 단계가, 골수 전구체 세포를 IL-4, TFN-α, IFN-α, 및 GM-CSF로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토킨과 함께 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 기질 세포가 OP9 세포이고, 배양 단계(b)가 비-유착 조건하에 이루어진다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 골수 전구체 세포를 GM-SCF 및 TNFα 또는 GM-SCF 및 INFα와 함께 배양하는 단계 및 조절 부속 세포를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 조절 부속 세포는 마커 CD1a^low, CD9, CD80^low 및 CD86^low를 특징으로 한다.

본 발명은 또한 인간 가지 세포의 배양액에 관한 것이고, 이 때 배양액 중 세포의 대부분은 CD1a+, DC-SIGN+, CD4+, CD9^low, CD11c+, CD40^low, CD86+, CD80+, CD86+, HLA-ABC+, HLA-DR+의 표현형을 지니며, CD207 및 CD208에 대해 네거티브이다. 바람직하게는, 배양액 중 세포의 적어도 70%가 표현형을 지닌다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 골수 전구체 세포의 배양액에 관한 것이고, 이 때 세포의 대부분은 골수 전구체의 표현현을 지니고, 90%를 초과하는 세포가 HLA-DR에 네거티브인 CD45+, CD4+, CD123^low이고, MPO, M-CSFR, CD11b, CD11c, CD15 및 CD16을 발현시키는 세포의 서브개체군을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포를 마커 CD1a, CD80, CD86, DC-SIGN, HLA-DR^high를 특징으로 하는 가지 세포의 개체군으로 분화시키고, 환자로부터 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 수득하고 제조하며, 배아 줄기 세포-유래 가지 세포를 종양 세포와 융합시켜 세포 백신을 생성하는 것을 포함하여, 세포 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구체예들이 명세서, 청구범위 및 도면 검토 후 당업자에게 자명해질 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1A 및 B는 본 발명의 전체 방법의 도식적인 실례이다.

도 2는 도 1의 단계 2에 제공된 골수 전구체 세포의 형태학 및 표현형적 특징을 예시한다. 도 2A는 GM-CSF의 존재하에 성장시킨 분화된 인간 ES 세포의 위상-대비 현미경사진이다. 도 2B는 상기 배양액으로부터 수득된 세포의 라이트(Wright)-염색된 시토스핀(cytospin)이다. 도 2C는 팽창된 세포의 콜로니 형성 세포(CFC) 가능성을 도표로 만든 것이다 (총수는 5회 실험의 평균이다). 도 2D는 GM-CSF 팽창된 인간 ES 세포에 대한 표면 발현 및 세포내 골수 마커를 입증하는 대표적인 실험으로부터의 데이터 그래프이다.

도 3은 hES 세포-유래 DS의 형태학 및 광 산란 특성을 예시한다. (A) 배양액의 위상 대비 현미경사진 및 (C) 분화된 H1 세포의 라이트-염색된 도포 표본은 수많은 얇은 세포질 처리 ("베일(veils)")를 입증한다; (A) 막대는 15 ㎛이며 (C) 막대는 40 ㎛이다. (B) 평평한-바닥 극저 부착 플레이트에서 배양되는 경우, 세포는 긴 가지돌기를 형성하며; 막대는 25 ㎛이다. (D) hES 세포-유래 골수 선조를 GM-CSF 및 IL-4와 함께 9일 배양 후 단계 3에서 수득된 세포의 광 산란 특성 및 표현형. H1 세포주를 이용한 대표적인 실험으로부터의 표현형 분석은, 광 산란 프로파일을 지니는 R1-게이팅된 세포가 CD1a를 발현시키고 CD14를 약하게 발현시키는 것으로 나타났다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 본원에서 다수의 가지 세포가 인간 ES 세포로부터 생성될 수 있다고 보고한다. 뮤린주 OP9와 같은 매크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF) 결핍 기질 세포주와의 공-배양 시스템은 인간 ES 세포의 조혈 세포로의 분화를 촉진한다. 이러한 조혈 세포는 조혈 세포의 GM-CSF 배양에 의해 탐구되는 능력인, 가지 세포를 생성하는 능력을 지닌다. 인간 ES 세포로부터 유래된 가지 세포는 생체내에서 자연히 생성되는 사이질 인간 가지 세포에 형태학적, 표현형적 및 기능적으로 필적한다.

문헌[Slukvin et al., J. Immunology, 2006, 176: 2924-2932]은 본 발명자들이 본 발명을 기술한 학사 논문이다. 이는 하기에 충분히 기술된 대로 참조로서 포함된다.

전체 방법이 도 1A 및 B에 도식적으로 예시되며, 이 때 과정은 총 세 단계로 나누어지고 하기 실시예 및 문헌[Slukvin, 2006, 상술함]에서 이의 바람직한 형식으로 입증된다. "중복성 림프조혈 선조 세포", "골수 가지 세포(DC) 전구체 세포", "미성숙 DC", "성숙 DC" 및 "조절 DC"는 도 1B에 개시된 세포 개체군을 의미한다.

단계 1에서, 인간 ES 세포를 기질 세포, 바람직하게는 M-CSF 결핍 기질 세포와 함께 공-배양시켜 세포의 중복성 림프조혈 선조 세포로의 분화를 유도한다. 바람직하게는 세포가 OP9 세포이다.

단계 2에서, 이후 상기 배양액으로부터의 비연합된 ES-유래 세포를 배양시켜 골수 세포 팽창을 발생시킨다. 이는 세포를, 바람직하게는 실시예에 하기 기술된 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)와 함께 배양시킴에 의해 수행되는 것이 바람직하다. 또한 바람직하게는, 이 단계가 비-유착 조건하에 수행된다. 바람직한 비-유착 조건은 조직 배양 플라스크가 하기 기술된 대로 폴리 2-히드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA, Sigma)로 코팅될 것이 요구된다. 당업자는 세포 진탕과 같은 다른 수단에 의해서나, 비-유착 특성을 지니는 것으로 공지된 물질을 이용하여 플라스틱 컨테이너를 싸거나, 시판되는 비-유착 조직 플라스크를 이용하여 세포 유착을 방지할 수도 있었다.

상기 팽창 단계의 결과는 골수 전구체가 부화된 배양액이며, 이후 이 배양액을 단계 3에 이용하여 무혈청 배지에서 GM-CSF 및 IL-4, 또는 가지 세포로의 발생을 조절하는 사이토킨의 다른 조합물 (하기 기술됨)과 함께 배양시켜 가지 세포를 제조한다.

퍼콜(Percoll) 분리로 수행될 수 있는 임의의 분리 절차가 단계 2 및 3 사이에 도시되며, 이는 가지 세포 형성을 유도하기 전에 배양액으로부터 세포 덩어리 및 죽은 세포 둘 모두를 제거하기 위해 사용된다.

하기 기술된 실시예에서, 가지 세포는 사이토킨 첨가 없이 인간 ES 세포와 M-CSF-결핍 기질 세포의 공-배양에 의해 수득된 골수 전구체의 선택적인 팽창에 의해 인간 ES 세포로부터 생성된다. 공-배양 단계로부터 생성된 조혈 세포는 골수 전구체 세포에 이어 미성숙 가지 세포로의 분화를 유도하기에 충분하다.

DC를 생성하는 본 프로토콜의 결정적인 단계는 인간 ES 세포/OP9 공-배양에서의 조혈 분화 효능이었다. 적은 수의 CD34+CD43+Lin-중복성 림프조혈 선조 (3% 미만)를 지니는 공-배양액은 골수 전구체를 팽창시키고, 후속하여 가지 세포로 분화되는데 실패하였다. "Lin-"은 이러한 선조가 특이적인 조혈 계통에 관련된 더 많은 성숙 세포 상에 존재하는 CD11b, CD14, CD2, CD3, CD7, CD19, CD38, CD45RA, 및 HLA-DR 마커를 발현시키지 않음을 나타낸다.

본 발명자들은 다음 단계에 단리된 림프조혈 전구체라기 보다 공-배양액으로부터의 전체 세포 현탁액을 이용하였으며, 여기에서 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)가 가지 세포로 분화될 수 있는 골수 전구체의 팽창을 매개하는데 사용된다. 본 발명자들의 견해에서, 골수 가지 세포 전구체의 팽창에 대해 거의 아무런 효과가 없는, SCF 및 FLT3-L과 같은 다른 인자와 대조적으로, 이러한 팽창을 수행하기 위해 골수 전구체 세포를 야기하는 가장 효과적인 인자는 GM-CSF였다.

인간 ES 세포로부터 유래되고 GM-CSF로 팽창된 골수 전구체는 골수 콜로니-형성 세포 (CFC) 및 가지 세포 표현형을 지니는 더 많은 성숙 세포의 소 개체군을 포함하였다. 그러나, 세포의 대부분은 골수단핵구 계통의 아세포와 형태학적으로 유사하였으며, CD4, CD45, CD123^low을 발현시키고 낮은 수준의 CD14를 발현시켰다. 이러한 세포들은 HLA-DR-네거티브였다. 본 발명자들은 이러한 세포들이 MPO, M-CSFR, CD11b, CD11c, CD15, 및 CD16을 발현시키는 세포의 서브개체군을 포함한다는 것을 발견하였다.

본 발명자들의 방법에 의해 수득된 인간 ES 세포-유래 미성숙 가지 세포는 CD1a+, DC-SIGN+, CD4+, CD9^low, CD11c+, CD40^low, CD80+, CD86+, HLA-ABC+, HLA-DR+, CD207- 및 CD208-의 표현형을 지녔으며, 이러한 표현형은 탯줄 혈액 또는 골수 CD34+ 조혈 줄기 세포로부터 분화된 사이질 가지 세포에 필적한다. 바람직하게는, 이러한 미성숙 가지 세포가 이 시점에 배양된 세포의 70% 이상을 구성한다. 그러나, 인간 ES-유래 가지 세포의 뚜렷한 표현형 특징은 CD14의 공-발현이었다. CD14 발현 수준은 IL-4를 이용하여 분화된 세포에서 가장 낮았으나, TNF-α를 이용하여 분화된 세포 상에서 실질적으로 더 높았다. GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포로부터 발생된 가지 세포는 각각 CD1a+CD14- 및 CD1a-CD14+의 표현형을 지니는 중간체를 통해 랑게르한스 세포 및 진피 및 사이질 가지 세포로 분화된다. 지금까지, 본 발명자들의 배양액에서, CD1a 발현은 항상 적어도 낮은 수준의 CD14 발현을 동반하였으며, 본 발명자들은 이러한 세포 배양액에서 별개의 CD1a+CD14- 또는 CD1a-CD14+ 개체군을 본 적이 없다. 따라서, 가지 세포로 인간 ES 세포를 분화시키기 위해 사용된 배양 조건은 생체내 CD45+ 조혈 줄기 세포로부터의 상응하는 분화 경로의 복제를 강제할 수 없는 유일한 경로를 사용한 것으로 보인다.

하기 실시예는 본 발명의 또 다른 구체예인 세포 개체군을 기술하며, 이 때 70% 이상이 성숙 DC이다.

추가로, 본 발명의 또 다른 구체예는 조절 DC 세포의 개체군에 관한 것이다. GM-CSF 및 TNF-α 또는 GM-CSF 및 IFNα와 배양된 골수 DC 전구체는 낮은 자극 활성을 지닌 CD1a^low, CD9-, CD80^low, CD86^low 부속 세포를 발생시킨다. 이들 세포는 조절 DC일 수 있다.

본원에서 사용된 M-CSF 결핍 기질 세포 (OP9 세포)를 지니는 공-배양 시스템은 뮤린 ES 세포와 함께 사용된 OP9 세포에 기초한 시스템과 상이하다. 본원에 기술된 방법은 마우스 시스템과 다르게, OP9 세포와의 이차 공-배양을 이용하지 않는다. 본 발명자들은 최대량의 골수 선조가 생성된 후 이들 선조를 GM-CSF와 함께 원료공급-없는 비-유착 조건으로 팽창시켰을 때의 공-배양액으로부터 인간 ES 세포 유도체를 수집하였다. 이 기술은 가지 세포 발생의 추가 연구에 유용한 가지 세포 선구체의 별개 개체군을 초래하였다.

배아체 분화 동안 HLA-DR을 발현시키고 성체 림프구의 증식을 일으킬 수 있는 세포가 생성됨이 최근에 발견되었다 [Zhan, et al., 2004,. Lancet Jul 10; 364(9429): 163-71]. 그러나, 이 시스템에서 생성된 세포의 항원-제시 특성 및 표현형은 입증되지 않았다. 본 보고서에 기술된 수득된 세포는 매크로파지일 수 있었다. 본 발명자들의 결과는, 인간 ES 세포가 항원-제시 가지 세포의 형태학, 표현형 및 기능적 특성을 지닌 세포로 직접 분화될 수 있다는 증거를 최초로 제시한다. 더욱이, 이러한 방법은 이미 비교적 효과적이다. 본 발명자들은 초기에 10⁷개로 플레이팅된 인간 ES 세포로부터 4 x 10⁷개 만큼 많은 가지 세포를 한번에 성장시킬 수 있었다.

가지 세포가 분명한 과학적인 중요성 및 응용성을 지니는 한편, 이들은 인간 약제에서도 잠재적인 용도를 지닌다. 여러 가지 연구에서 생체내에서 운반된 펩티드-펄싱된 가지 세포가 마우스에서 항-종양 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있음이 입증되었다. 이러한 연구들이 인간에서 암 면역치료용 가지 세포-기재 백신의 후속적인 개발을 촉진시켰다. 이러한 기술에서, 말초혈로부터 단리된 미성숙 가지 세포 전구체 또는 말초혈 단핵 세포 및 CD34+ 조혈 선조로부터 생성된 가지 세포가 가지 세포 기재 백신의 임상적 연구에 사용된다. 그러나, 이러한 기술은 고되고, 각 백신접종에 대한 신규한 가지 세포의 반복적인 생성을 요구하며 표준화시키기가 어렵다. 배아 줄기 세포는 제한없이 팽창될 수 있고, 다양한 유형의 세포로 분화될 수 있어서, 가지 세포 백신을 위한 보편적이고 도달할 수 있는 공급원이 될 수 있다. 잠재적으로, 주요 HLA 일배체형 조합을 지니는 가지 세포가 공여체 MHC 일배체형을 매칭시키기 위해 인간 ES 세포로부터 수득될 수 있다. 임상적 설정에서, 인간 ES-세포 유래 가지 세포는 통상적인 공급원으로부터의 가지 세포에 비해 여러 가지의 이점을 지닐 것이다. 많은 절대수의 가지 세포가 동일한 공여체 세포주로부터 생성될 수 있었고, 동일주의 가지 세포가 다수의 백신접종에 사용될 수 있었다. 인간 ES 세포로부터 가지 세포의 유도는 덜 고되고, 생체반응기 기술의 수행에서 표준화를 위해 더욱 개정될 수 있다. 병원체 오염의 위험이 적고 공여체 수집의 위험이 없다는 것은 인간 ES 세포-유래 가지 세포의 임상적 사용에서의 또 다른 중요한 이점이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포를 CD1a⁺, CD80⁺, CD86⁺, DC-SIGN⁺, HLA-DR^high임을 특징으로 하는 가지 세포의 개체군으로 분화시키고, 환자로부터 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 수득하고 제조하며, 배아 줄기-세포 유래 가지 세포를 암 세포와 융합시키는 것을 포함하여, 세포 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다 [Gong, et al., J. Immunology, 2000, 165:1705-1711 and Parkhurst, et al., 2003, J. Immunology. 170:5317-5325 (둘 모두는 참조로서 포함됨)는 세포 융합에 대한 일반적인 기술을 개시함].

또 다른 구체예에서, 본 발명은 동종이형 암 세포와 융합된 가지 세포를 인간 배아 줄기 세포로부터 분화시키는 것을 포함하여, 암 치료용 가지 세포 백신을 형성하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 종양 백신을 생성하는 다양한 방법을 이해하고 인지할 것이다. 예를 들어, 미국특허 출원 공개 US2002/0131962 Al 및 US2 006/0063255 Al이 여러 가지 방법을 기술한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간 배아 줄기 세포를 CD11b, CD11c 및 CD16을 발현시키는 세포의 서브개체군을 포함하는 CD45+CD4+CD123^low 골수 전구체로 분화시키고, 골수 전구체를 유전적으로 변경시켜 면역원성 종양 단백질/펩티드를 발현시키고, 유전적으로 개질된 골수 전구체를 면역원성 가지 세포로 분화시키는 것을 포함하여, 암을 치료하기 위한 가지 세포 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 혹자는 면역 반응의 표적이 될 조양 유전자를 지니는 세포를 트랜스펙션시키길 원할 수 있다. 예를 들어, 혹자는 흑색종-항원-3 (MAGE-3), 전립선산 포스파타아제 (PAP) 또는 전립선 특이적인 막 항원 (PSMA)를 지니는 세포를 트랜스펙션시키길 원할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 동일 세포주로부터 수득된 인간 배아 줄기 세포-유래 조직의 거부를 치료하기 위해 사용될 수 있는 면역허용 특성을 지니는 가지 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. "면역허용 특성"이란 세포가 숙주 면역 시스템에 의한 이식 거부를 억제하는 것을 의미한다. 세포는 이식된 조직에 대한 숙주의 유해한 면역 반응을 하향-조절할 것이다. 이러한 목적을 위해, hES 세포-유래 골수 전구체를 유도하여 GM-CSF 및 TNF-α 또는 GM-CSF 및 IFNα와의 배양에 의해 조절 DC로 분화시킬 것이다.

실험 프로토콜 및 결과

GM- CSF 를 이용한 인간 ES 세포-유래 골수 선조의 팽창

본 발명자들은 최근에 본원에 기술된 프로토콜을 개시하기 위해 사용된 단계로서, 원료공급 세포로서 마우스 M-CSF 결핍 골수 줄기 세포주 OP9의 세포를 이용한, 인간 ES 세포로부터의 조혈 분화를 위한 시험관내 배양 시스템을 개발하였다. 인간 ES 세포는 OP9 세포와 함께 공-배양되어, 콜로니-형성 세포 중에서 고도로 부화되고 적혈구, 골수 및 림프계 선조를 함유하며 CD34+CD43+Lin-중복성 조혈 선조의 개체군를 포함하는 CD34+ 세포로 분화될 것이다. 이 단계는 사이토킨 첨가를 요구하지 않는다. OP9 공-배양 시스템 중 골수 콜로니-형성 세포 (CFC)의 최대 팽창은 분화 9일 내지 10일에 관찰되었다. 골수 선조의 선택적인 팽창을 유도하기 위해, 본 발명자들은 9일 또는 10일째의 인간 ES 세포/OP9 공-배양액으로부터 생성된 세포를 회수하고, 세포를 GM-CSF의 존재하에 비-유착 조건으로 배양시켰다. 배양 초기 단계에, 많은 세포의 응집물이 형성되었다. GM-CSF 배양을 개시한 지 약 3일 후에, 개개 세포가 출현하였고 빠르게 팽창되었다. GM-CSF와 함께 배양한 지 9-10일 후에 퍼콜 분리에 의해 덩어리 및 죽은 세포를 제거한 다음, 본 발명자들은 세포의 90%가 CD45 포지티브인 세포 개체군을 수득하였다. 90%를 초과하는 이러한 CD45+ 세포가 세포내 MPO (골수세포형과산화효소, 골수 세포의 마커)를 함유하였으나 TdT (말단 데옥시누클레오티딜 트랜스퍼라아제, 림프계 세포의 마커)는 함유하지 않았으며, 골수 선조의 마커인 CD33을 발현시켰다. 또한, 이러한 인간 ES 세포-유래 골수 세포는 CD4 포지티브였으며, IL-3 수용체 α-사슬 CD123을 약하게 발현 시켰다. 50%를 초과하는 이러한 세포가 CD16, CD15, CD11b 및 CD11c를 발현시켰다 (표 2). 형태학적으로, GM-CSF-팽창된 세포는 다중-엽이 있거나 둥근 핵을 지녔고, 골수의 골수단핵구 전구체를 닮은, 적당한 양의 회색빛이 도는, 때로 공포가 있는, 가시적인 과립이 없는 세포질을 지녔다 (도 2B). GM-CSF-팽창된 세포의 일부는 골수 CFC 가능성을 보유하였으나, 적혈구 또는 다중-계통 CFC 가능성은 검출되지 않았다 (도 2C). 또한, 적당한 수준의 CD14, 낮은 수준의 CD1a 뿐만 아니라 HLA-DR 및 CD80 및 CD86 공-자극제 분자를 발현시키는 전진한 성숙 단계에서, 비교적 적은 개체군의 세포가 존재하였다 (표 2).

말초혈 CD34+ 세포 상에서의 피부 림프구-관련 항원 (CLA) 발현은 랑게르한스 세포로 추가로 분화되는 선조를 규정하는 반면, CD34+CLA-세포는 사이질 DC-유사 세포를 생성시킨다. OP9 공-배양액으로부터 수득된 전체 세포 개체군 또는 단리된 인간 ES 세포-유래 CD34+ 세포에서 어떠한 현저한 CLA 발현도 검출되지 않았다. 그러나, CLA 발현이 GM-CSF로 생성된 골수 선조의 소 서브셋 상에서 발견되었다.

GM-SCF는 골수 전구체의 팽창에서 가장 중요한 인자인 것으로 보였다. 별도로, SCF, FLT3L, 또는 FLT3L과 함께 SCF를 GM-SCF-보충된 배양액에 첨가하는 것은 10일의 배양 동안 총 세포 산출 및 골수 CFC 수에 거의 아무런 영향을 미치지 않았다 (표 1). 이러한 데이터는, OP9 시스템에서 생성된 분화된 인간 ES 세포의 GM-CSF를 이용한 배양이 MPO, M-CSFR, CD11b, CD11c, CD15 및 CD16을 발현시키는 세포 의 서브개체군을 포함하는 CD45+CD4+CD123^low 골수 전구체의 유일한 개체군으로 현저하게 팽창된다는 것을 입증한다.

인간 ES -세포 유래 골수 전구체의 가지 세포로의 분화

골수 전구체의 가지 세포로의 분화를 유도하기 위해, 본 발명자들은 전구체 세포의 배양액과 GM-CSF 및 IL-4, TNF-α, 및 IFN-α의 다양한 조합물을 배양시켰다. 통상적인 실험에서, GM-CSF 및 IL-4와 함께 배양시킨 지 7-10일 후, 세포의 대부분이 덩어리로 보이게 되었다. 또한, 잘-규정된 가지돌기를 지니는 개개의 부유 세포가 배양액에 나타났다. 형태학적으로, 이러한 세포들은 크고, 높은 핵 세포질 비를 지녔으며, 타원형 또는 신장-형태의 핵과, 매우 섬세한 세포질 과정을 지니며 공포가 없는, 때로 과립상의 세포질을 지녔다 (도 3A 및 C). 크기 및 입도의 흐름 세포측정 분석에 기초하여, 두 세포 개체군이 관칠되었다 (도 3D): R1, 높은 산란 프로파일 및 가지 세포 표현형을 지니는 세포; 및 R2, 가지 세포 마커가 부족하고 두 번째 단계에서 생성된 골수 선조와 표현형적으로 더 유사한, 낮은 산란 프로파일을 지니는 세포. R1 게이팅 세포로서 동정된 가지 세포는 CD1a, DC-SIGN, CD4, CD11c, HLA-ABC 및 HLA-DR, CD80 및 CD86을 발현시켰다. 추가로, 이러한 세포들은 CD9, CD11b, CD123, 및 CD40을 낮은 수준으로 발현시켰다. CD14 발현은 매우 약했으나, 검출가능하였고, CD14-포지티브 세포의 대부분은 CD1a를 공동-발현시켰다. 그러나, 모든 세포에서 CD83 발현은 없었다.

IL-4에 추가하여, 골수 전구체의 가지 세포로의 분화는 TNF-α 및 IFN-α 또 는 이들의 조합물과 같은 다른 사이토킨을 이용하여 달성될 수 있다. 그러나, TNF-α를 지니는 배양액 중 세포의 대부분은 낮은 수준의 CD1a, 높은 수준의 CD14를 공동-발현시켰고 CD9의 발현은 없었다. 또한, TNF-α를 지니는 배양액에서, 세포는 공자극 분자의 발현을 하향조절하였다. 예상된 대로, 이러한 세포 배양액에 IFN-α를 첨가시키는 것은 MHC 클래스 I 분자의 발현을 증가시켰다. 그러나, IFN-α 배양액은 감소된 수의 CD1a+ 세포 뿐만 아니라 감소된 CD14 발현을 초래하였다. 단핵구-DC 분화 경로와 유사하게, 인간 ES 세포-유래 가지 세포에 대한 DC-SIGN의 발현은 IL-4에 우선 의존적이었다. 세포 수율, 표현형 및 기능적 특성에 기초하여 (표 1 및 2), 본 발명자들은 GM-CSF 및 IL-4의 조합이 인간 ES 세포로부터 기능성 가지 세포를 생성하는 최상의 조건을 제공한다는 결론을 내렸다.

면역세포화학에 의하면, 인간 ES 세포-유래 가지 세포는 CD68에 대해 포지티브였으나 그리 강하지 않았고, 매우 낮은 수준의 세포질내 CD83을 발현시켰으나 막 CD83은 발현시키지 않았다. 성숙 가지 세포의 고도로 선택적인 마커였던 액틴-결합 단백질인 파신(fascin)이 검출되지 않았다. 이로부터, 본 발명자들은, 기술된 방법에 의해 생성된 가지 세포가 지금까지는 미성숙하다는 결론을 내렸다. 이러한 미성숙 가지 세포가 추가로 성숙될 수 있는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 프로토콜로부터 생성된 세포를 칼슘 이온운반체 A23187로 처리하였다. 이러한 처리는 CD83, CD86 및 HLA-DR 발현을 상향-조절하였다. 세포질내 CD68 염색 강도는 실질적으로 증가되었으며 CD68의 핵주위 응축이 그렇게 생성된 세포에서 뚜렷하였다. 또한, 일부 세포는 파신-포지티브가 되었다. LPS, TNF-α, IL-1β, PGE2, 및 IL-6은 hES 세포-유래 DC의 성숙을 유도하는데 효과적이지 않았다. 포괄하여 생각해 보면, 이러한 데이터는 통상의 가지 세포 형태 및 표현형을 지니는 세포가 인간 ES 세포로부터 생성될 수 있음을 입증한다.

가지 세포는 동종이형 T 세포 반응을 유도하고 항원을 프로세싱하고 제시할 수 있다.

본 발명자들은 다음으로 본 인간 ES 세포-유래 가지 세포가 가지 세포로서 충분히 기능적인지를 결정하는 연구를 수행하였다. DQ 오브알부민 검정에 의해 측정된 대로, 인간 ES 세포-유래 가지 세포는 항원을 흡수하고 프로세싱할 수 있었다. GM-CSF 및 IL-4로 처리된 배양액에서 수득된 세포가 항원 제시에 가장 효과적이었던 반면, GM-CSF 및 TNF-α로 분화된 가지 세포는 덜 효과적이었다.

가지 세포의 기능성의 특질은 나이브 세포를 자극하는 이들의 능력에 있다. 본 발명자들의 시험에 의해, 인간 ES 세포-유래 가지 세포는 오로지 나이브인 탯줄 혈액 T 세포를 자극할 수 있었다. GM-CSF 및 IL-4를 이용한 배양액에서 생성된 미성숙 가지 세포가 가장 강력한 자극 세포였던 반면, 세포 배양액에 TNF-α를 첨가하는 것은 나이브 T 림프구를 자극하는 세포의 능력을 현저하게 감소시켰다. 또한, 가지 세포는 성체 공여체 T-세포를 자극할 수 있었다.

MHC 클래스 I 경로를 통해 항원을 제시하는 가지 세포의 수용량을 평가하기 위해, 본 발명자들은 HLA-A02 H1 세포주-유래 가지 세포를 불활성화된 CMV 바이러스로 펄싱하고 CMV pp65 NLVPMVATV 펩티드에 특이성을 지니는 HLA-A0201 제한된 CMV-특이적인 T 세포 클론 HLA를 자극하는 세포의 능력을 평가하였다. T-세포로의 가지 세포의 첨가가 동종이형 반응을 유도하는 동안, 세포가 CMV 펄싱된 H1-유래 가지 세포로 자극될 때 반응에서 T 세포에 의한 현저한 증가가 수득되었다 (표 3). 대체적으로, 이러한 데이터는 본 배양 시스템이 가지 세포의 특징적인 표현형, 형태학 및 독특한 항원-제시 특성을 지니는 세포를 생성할 수 있음을 입증한다.

방법 및 재료

세포주, 사이토킨 및 모노클로날 항체 ( mAbs )

인간 ES 세포주 Hl (계대 32-51) 및 H9 (계대 40-44)를 마우스 배아 섬유모세포상에서의 매주 계대에 의해 미분화된 상태로 유지시켰다. 마우스 골수 기질 세포주 OP9를 토루 나카노 박사로부터 수득하였다 (Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University, Japan). 이 세포주를 젤라틴화된 10 cm 디시 (BD Bioscience, Bedford, MA) 상에서 20% 규정된 우태아 혈청 (FBS; HyClone Laboratories, Logan, UT)이 보충된 α-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 구성된 OP9 성장 배지 중에 유지시켰다. 살균, 재조합, 내독소 및 무-발열원 SCF, FLT3-L, TNF-α, IL-4를 펩로테크 (Peprotech)(Rocky Hill, NJ)로부터 입수하였고, GM-SCF를 베를렉스 래보러토리스 (Berlex Laboratories)(Richmond, CA)로부터 수득하였으며, IFN-α를 세링 코퍼레이션 (Schering Corporation) (Kenilworth, NJ)으로부터 수득하였다. 뮤린 세포와의 검출가능한 교차-반응성을 지니지 않는 하기 마우스 항-인간 mAbs를 흐름 세포측정 분석에 이용하였다: CD1a-PE, CD4-PE, CD11b-FITC, CD16-PE, CD33-FITC, CD80-PE, CD86-PE, HLA-DR-PE, 골수세포형과산화효소 (MPO)-FITC, 말단 데옥시누클레오티딜 트랜스퍼라아제 (TdT)-FITC (Caltag, Burlingame, CA); CD9-PE, CD14-FITC, CD40-PE, CD43-FITC, CD45-PE, CD209 (DC-SIGN)-FITC, CLA-FITC (BD Pharmingen); CD11c-PE, CD34-PerCP-Cy5.5 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems [BDIS], San Jose, CA); CD83-FITC, CD208 (DC-LAMP; Beckman Coulter, Miami, FL); CD123-FITC (Miltenyi Biotech, Auburn, CA); HLA-ABC-FITC (Sigma, St.Louis, MO); CD207 (Vector Laboratories).

OP9 세포와의 공-배양액에서 인간 ES 세포의 조혈 분화

조혈 세포로의 인간 ES 세포 분화의 유도를 앞서 기술한 대로 수행하였다 [Vodyanik, et al. 2005. Blood 105:617, 본원에서 참조로서 포함됨]. 간단히 말해, 미분화된 인간 ES 세포를 1 mg/ml의 콜라게나아제 IV (Invitrogen)로 처리함에 의해 회수하고 OP9 배양액에 10% FBS (HyClone) 및 100 μM 메틸 β-D-티오갈락토피라노시드 (MTG) (Sigma, StXouis, MO)가 보충된 αMEM에서 10 cm 디시 당 약 1.5x10⁶개/20 ml의 밀도로 첨가하였다. 인간 ES 세포/OP9 공-배양액을 사이토킨을 첨가하지 않고 4, 6 및 8일째에 배지 절반을 교체하며 9-10일 동안 인큐베이션시켰다. 이후 인간 ES 세포가 조혈 세포로 분화되었다.

인간 ES 세포-유래 가지 세포의 생성

인간 ES 세포로부터 가지 세포를 생성하는데 사용된 프로토콜의 개략적인 도표를 도 1에 도시한다. 인간 ES 세포/OP9를 공-배양한 지 9-10일에, 인간 ES 세포의 분화된 유도체가 콜라게나제 IV (Invitrogen; α-MEM 중 1 mg/ml)로 20분 동안 37℃에서 처리하고, 0.05% 트립신-0.5 mM EDTA (Invitrogen)로 15분 동안 37℃에서 처리함에 의해 회수되었다. FBS에 의한 트립신 불활성화 이후, 이들 세포를 10% FBS (HyClone) 및 100 ng/ml GM-CSF가 보충된 αMEM에 재현탁시키고, 세포 유착을 방지하기 위해 폴리 2-히드록시에틸 메타크릴레이트 (HEMA, Sigma)로 코팅된 조직 배양 플라스크 (BD Bioscience)로 옮겼다. 이후 세포를 매 4일마다 배지 절반을 교체하며 8-10일 동인 배양시켜 가지 세포 전구체를 팽창시켰다. 이러한 인간 ES 세포-유래 가지 세포 전구체의 팽창에 대한 SCF 및 FLT3-L의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 (1) 100 ng/ml GM-SCF + 20 ng/ml SCF; (2) 100 ng/ml GM-SCF + 50 ng/ml FLT3-L; 또는 (3) 100 ng/ml GM-SCF + 20 ng/ml SCF + 50 ng/ml FLT3-L의 존재하에 세포를 배양시켰다. 후속하여, 세포를 20% 퍼콜 (Sigma) 상에서 회전시켜 죽은 세포 및 세포 응집물을 제거하였다. 세 번째 단계로서, 퍼콜-분리된 세포를 HEMA-코팅된 플라스크에서 지질 혼합물 1 (Sigma) 및 100 ng/ml GM-CSF가 보충된 스템스팬(StemSpan)^® 무-혈청 팽창 배지 (SFEM; Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) 중에서, 하기 사이토킨을 첨가하며 배양하였다: (1) 100 ng/ml IL-4, (2) 20 ng/ml TNF-α, (3) 10⁴ U/ml IFN-α, 및 (4) 100 ng/ml IL-4 + 20 ng/ml TNF-α. 세포를 매 4일마다 배지 절반을 교체하며 7-9일 동안 배양하였다. 가지 세포를 추가로 성숙시키기 위해, 본 발명자들은 단계 3에서 수득된 세포를 400 ng/ml의 A23187 칼슘 이온운반체 (Sigma)를 지니는 SFEM 배지에서 48시간 동안 배양시켰다.

흐름 세포측정 분석

세포를 2% 정상 마우스 혈청 (Sigma)이 보충된 PBS-FBS (0.05% 아지드화나트륨, 1 mM EDTA, 및 2% FBS를 함유하는 FBS)에서 제조하고, mAbs의 조합물로 표지시켰다. 샘플을 셀퀘스트 액퀴지션 소프트웨어 (CellQuest acquisition software) (BDIS)를 지니는 FACSCalibur 흐름 세포측정기 (BDIS)를 이용하여 분석하였다. 리스트 모드 파일을 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc., Ashland, OR)에 의해 분석하였다. 포지티브 염색 및 배경 선형 눈금의 평균 형광 강도(MFI) 값에 대한 역치를 확립하기 위해 적절히 동형-매칭된 대조 mAbs (BD Pharmingen)를 이용한 대조 염색을 포함시켰다. 포지티브 세포의 백분율(%)을 특이적인 mAb로 염색된 포지티브 세포의 % - 상응하는 동형 대조군으로의 배경 염색 %로서 산출하였다. ΔMFI는, 특이적인 mAb로 염색된 세포의 MFI - 상응하는 동형 대조군으로 염색된 세포의 MFI로서 산출되었다. 선형 눈금의 MFI를 주어진 세포에 대한 상대적인 항원 밀도의 지표로서 사용하였다.

항원 프로세싱 검정

단백분해 상에서 밝은 녹색 형광을 나타내는 자체-켄칭된 오브알부민의 컨주게이트 (DQ-OVA; Molecular Probes, Eugene, OR)를 이용하여 오브알부민 (OA) 프로세싱 검정을 수행하였다. 도 1의 단계 3에서 수득된 가지 세포를 100 ㎍/ml의 DQ-OVA와 함께 2% FBS 및 1% 비필수 아미노산을 함유하는 DMEM/F12 (Invitrogen)에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 4℃에서 인큐베이션시킨 세포를 배경 형광성에 대한 대조군으로서 이용하였다. OVA 단백분해를 흐름 세포측정에 의해 평가하였다.

클론원성 선조 세포 검정

조혈 클론원성 검정을 1% 메틸셀룰로오스, 30% FBS, 1% BSA, 50 ng/ml SCF, 20 ng/ml 과립구-매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 20 ng/ml IL-3, 20 ng/ml IL-6, 20 ng/ml 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 및 3 유닛/ml 에리트로포에틴으로 구성된 H4435 반고체 배지를 지니는 1 ml/디시의 MethoCult GF (Stem Cell Technologies)를 이용하여 35 mm의 저 유착 플라스틱 디시 (Stem Cell Technologies)에서 수행하였다. 모든 클론원성 선조 검정을 이중으로 수행하였고 적혈구 (E-CFC), 과립구, 매크로파지, 거대핵세포 (GEMM-CFC), 과립구-매크로파지 (GM-CFC), 과립구 (G-CFC) 및 매크로파지 (M-CFC)로서의 이들의 콜로니 형태학에 따라 인큐베이션한 지 14-21일 후에 CFC의 점수를 매겼다. CFC의 빈도를 10⁶개의 총 세포에 대해 산출하였다.

동종이형 혼합된 림프구 반응 ( MLR )

성체 단핵 세포를 건강한 실험실 지원자로부터 수득된 말초혈 샘플로부터 히스토파크(Histopaque)-1077 상에서 밀도 구배 원심분리에 의해 단리시켰다. 단핵 탯줄 혈액 세포도 캠브렉스 바이오 사이언스 (Cambrex Bio Science) (Walkersville, MD)로부터 구입하였다. 단핵 세포는 플라스틱 유착에 의해 단핵구를 빼앗기며 이를 응답 세포로서 이용하였다. 등급이 매겨진 수 (1x10³ 내지 3xlO⁴/웰)의 조사된 (35Gy) 자극 세포를 1x10⁵개의 응답 세포와 함께 6일 동안 96-웰 평평한 바닥 플레이트 (Corning)에서 5% 인간 AB 혈청을 함유하는 RPPMI 1640 (Sigma)에서 공-배양시켰다. 16시간의 마지막 인큐베이션 동안 [3H]티미딘 (Sigma)을 첨가하였다 (1 μCi/웰). 유리 섬유 필터 상으로 세포를 회수하고 [3H]티미딘의 혼입을 섬광 계수에 의해 측정하였다.

상기 발명은 명확한 이해를 목적으로 예시 및 실시예에 의해 다소 상세하게 기술되었으나, 본 발명의 특정 개질이 당업자에게는 통상적인 최적화의 사항으로 이해되며, 이는 본 발명의 정신 또는 첨부된 청구범위의 범위를 벗어나지 않고 수행될 수 있다.

표 1. 각 배양 단계 후 상대적인 세포 수율^*

^*각 단계에서의 상대적인 세포 수율은 초기에 플레이팅된 한 미분화된 인간 ES 세포로부터 수득된 세포의 수로서 산출되었다 (OP9상에 플레이팅된 인간 ES 세포의 총 수 / 상응하는 단계 이후 수득된 세포의 총 수); 결과는 4 내지 10회의 실험의 평균±SD로서 산출되었다.

표 2. 상이한 사이토킨 조합물에 의해 유도된 DC의 표현형 분석^*

^*결과는 4회 내지 5회의 독립적인 실험의 평균±SD이다; 단계 3에 대해 R1 게이팅 세포의 배양 % 및 ΔMFI가 산출됨.

표 3. Hl-유래 DC의 항원-제시 용량^*

^*HLA-A02 H1-유래 가지 세포 (GM-CSF+IL-4로 단계 3에서 수득된 세포)를 CMV 바이러스와 함께 또는 CMV 바이러스 없이 밤새 인큐베이션시킨 다음 CMV pp65에 특이성을 지니는 HLA-A0201 제한된 동종이형 T 세포 클론에 첨가하였다. 결과를 3회 반복의 평균±SD로서 나타내었다.

Claims

(a) 인간 배아 줄기 세포를 매크로파지 콜로니-자극 인자를 발현시키지 않는 기질 세포와 공-배양시키는 단계로서, 줄기 세포는 중복성(multipotent) 림프-조혈 선조 세포로 분화되도록 유도되며, 배양액에는 사이토킨이 존재하지 않는 단계;

(b) 선조 세포를 과립구/매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)와 함께 배양시켜 골수 전구체 세포의 팽창을 야기시키는 단계; 및

(c) 미성숙 가지 세포의 표현형을 지니는 세포를 회수하는 단계를 포함하여, 인간 배아 줄기 세포를 가지 세포로 배양하는 방법.
제 1항에 있어서, 가지 세포의 표현형을 지니는 세포를 회수하는 단계가 골수 전구체 세포를 하나 이상의 사이토킨과 함께 배양하는 것을 포함하는 방법.
제 2항에 있어서, 사이토킨이 IL-4, TFN-α, IFN-α 및 GM-CSF로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서, 기질 세포가 OP9 세포인 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (b)의 배양이 비-유착 조건하에 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 (b)와 단계 (c) 사이에, 세포 배양액으로부터 세포 덩어리 및 죽은 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 골수 전구체 세포를 GM-CSF 및 TNFα 또는 GM-CSF 및 INFα와 함께 배양시키는 단계 및 마커 CD1a^low, CD9, CD80^low 및 CD86^low의 특징이 있는 조절 부속 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 골수 전구체 세포의 팽창이 무-혈청 조건하에 수행되는 방법.
배양액 중 세포의 대부분이 CD1a+, DC-SIGN+, CD4+, CD9^low, CD11c+, CD40^low, CD86+, CD80+, CD86+, HLA-ABC+, HLA-DR+의 표현형을 지니고, CD207 및 CD208에 대해 네거티브인 인간 가지 세포의 배양액.
세포의 대부분이 골수 전구체의 표현형을 지니고 이 중 세포의 90% 이상이 HLA-DR에 대해 네거티브인 CD45+, CD4+, CD123^low이며, MPO, M-CSFR, CD11b, CD11c, CD15 및 CD16을 발현시키는 세포의 서브개체군을 포함하는 골수 전구체 세포의 배양액.
세포의 대부분이 CD1a^low, CD80^low, CD86^low 표현형을 발현시키고, 나이브 T 세포의 증식을 유도하는 감소된 능력을 나타내는 인간 조절 DC의 배양액.
a. 인간 배아 줄기 세포를 마커 CD1a, CD80, CD86, DC-SIGN, HLA-DR^high의 특징이 있는 가지 세포의 개체군으로 분화시키고,

b. 환자로부터 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 수득하고 제조하며,

c. 배아 줄기 세포-유래 가지 세포를 종양 세포와 융합시켜서 세포 백신을 생성하는 것을 포함하여, 세포 백신을 제조하는 방법.
a. 인간 배아 줄기 세포를 CD11b+, CD11c+, CD16+ 세포의 서브개체군을 포함하는 CD45+CD4+CD123^low 골수 전구체로 분화시키고,

b. 골수 전구체 세포를 변경시켜 면역원성 종양 단백질 또는 펩티드를 발현시키고,

c. 유전적으로 개질된 골수 전구체를 면역원성 가지 세포로 분화시키는 것을 포함하여, 암 치료용 가지 세포 백신을 제조하는 방법.
제 13항에 있어서, 변경된 골수 전구체 세포가 MAGE3, PAP 및 PSMA로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 발현시키는 방법.
a. hES 세포를 골수 전구체 세포로 분화시키는 단계, 및

b. 골수 전구체를 GM-CSF 및 TNFα 또는 GM-CSF 및 IFNα와 함께 배양시킴에 의해, CD1a^low, CD9-, CD80^low, CD86^low의 특징이 있는 조절 가지 세포를 수득하는 단계를 포함하여, 동일 세포주로부터 수득된 인간 배아 줄기 세포-유래 조직의 거부 치료에 사용될 수 있는 면역허용 특성을 지니는 가지 세포를 제조하는 방법.