JP2024026891A - 造血系統細胞を製造するための方法およびシステム - Google Patents

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Abstract

【課題】造血系統細胞を製造するための方法およびシステムの提供。【解決手段】一態様において、治療のための細胞源として使用することができる、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からインビトロで生成されるナチュラルキラー細胞などの造血系統細胞が本明細書で提供される。この造血系統細胞を作製および使用するための方法および組成物も提供される。本開示は、とりわけ、種々の造血系統細胞のインビトロ産生のための方法を提供する。様々な実施形態において、本明細書中に開示の方法で使用される多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、好ましくはヒト由来の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり得る。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／７４９，９４７号の優先権および恩典を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本開示は、一般には、例えば、ヒト多能性幹細胞からのインビトロ造血細胞生成のための方法および組成物に関する。
背景
胚発生の非常に初期の段階から開始される造血は、全ての血球成分の形成を伴う多段階過程である。健康な成人は、正常な身体機能を維持するために、１日に１０１１～１０１２個の血球を産生しなければならない。赤血球（red blood cell）（ＲＢＣ）および血小板の輸血によって生命が救われる。骨髄、臍帯、または末梢血由来の造血幹細胞（ＨＳＣ）の移植は、血液悪性疾患および他の障害の処置のために長年臨床的に広く使用されている。近年において、樹状細胞（ＤＣ）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、およびＮＫ細胞などの他の重要な造血細胞は、免疫腫瘍学分野におけるその効果から、多大な関心が寄せられている。
幹細胞、特に、多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、身体の任意の細胞型になり得る。高品質な所望の系統の細胞を確実に製造するための過程を開発することが、この新規のテクノロジーの潜在力を発揮するための第一段階である。ＰＳＣの中胚葉の造血系統への系統特異的分化は、広く調査されている（Ｉｖａｎｏｖｓ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｗａｈｌｓｔｅｒ ａｎｄ Ｄａｌｅｙ ２０１６）。これを達成するために、以下の４つの異なる方法論が適用されており、種々の成功を収めている。（１）サイトカイン誘導および支持細胞（マウス骨髄間質区画に由来することが多い）との共培養（Ｃｈｏｉ，Ｖｏｄｙａｎｉｋ，ａｎｄ Ｓｌｕｋｖｉｎ ２００８）；（２）胚様体（ＥＢ）の形成およびサイトカイン誘導（Ｄａｌｅｙ ２００３；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２００７）；（３）２Ｄ培養における直接的なサイトカインの誘導（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｓａｌｖａｇｉｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．２０１１）；および（４）系統特異的な主要転写因子の異所性発現による強制的な誘導（Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｅｂｉｎａ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ ２０１５）。
骨髄由来間質細胞との共培養は、一般的なインビトロでのＰＳＣの造血分化方法である。この共培養は、赤血球（erythrocyte）（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．２００８）、巨核球（Ｌ
ｕ ｅｔ ａｌ．２０１１）、およびリンパ球（Ｄｉｔａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）などの造血細胞のインビトロ成熟でより成功している。しかしながら、異種起源の支持細胞の性質が明確でなく、さらに、スケールアップの潜在性が制限されることから、この方法はさらなる治療薬の製造には不適切であろう。
種々の形式のＰＳＣ培養からの自発的凝集または強制凝集のいずれかによるＥＢ形成法は、おそらく、最も広く使用されている系統特異的分化（造血分化が含まれる）方法である。自発的ＥＢ形成は、均一のサイズのＥＢの形成を必要としない小規模研究のみに適切である。したがって、自発的ＥＢ形成は、分化効率の低さおよび再現性の低さを欠点とする。ＡｇｇｒａＷｅｌｌ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などのデバイスを使用したＥＢの強制凝集は、所望のサイズのＥＢを形成することができる（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．２００８）。しかしながら、かかるデバイスは、大規模製造プロセスのシステムに採用されそうにない。さらに、特異的ＰＳＣ細胞株は、ＥＢの最初の形成後でさえも完全に崩壊し、多数が細胞死するという複数の例が認められており（未発表データ）、細胞株には係留依存性２Ｄ条件から係留非依存性３Ｄ条件へ適応する能力に大きなばらつきがあることが示唆される。
近年、ヒトＩＶ型コラーゲンなどの特異的マトリックス上で２Ｄ付着ＰＳＣを造血細胞に直接誘導することに成功している（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）。しかしながら、この誘導において、商業的に有用な大規模生産を達成するには極めて広大な表面積を必要とするであろう。理論的には多層平床培養表面を有するバイオリアクターを使用すれば可能であろうが、そのような、表面積が広大で層間に狭い空間がある場所に均一な密度でＰＳＣを播種すること、試料採取、ｐＨおよびガス交換の制御、栄養補給、ならびに採取などのいくつかの技術的および操作上の課題が存在する。これら全てにより、細胞製造コストが必然的にさらにより高くなるであろう。
したがって、治療目的に適切な規模でＰＳＣから造血細胞を製造するための実行可能なテクノロジーが必要である。
Ivanovs, A., S. Rybtsov, E. S. Ng, E. G. Stanley, A. G. Elefanty, and A. Medvinsky. 2017. 'Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish', Development, 144: 2323-37. Wahlster, L., and G. Q. Daley. 2016. 'Progress towards generation of human haematopoietic stem cells', Nat Cell Biol, 18: 1111-17. Choi, K. D., M. Vodyanik, and Slukvin, II. 2008. 'Hematopoietic differentiation.' in, StemBook (Harvard Stem Cell Institute Daley, G. Q. 2003. 'From embryos to embryoid bodies: generating blood from embryonic stem cells', Ann N Y Acad Sci, 996: 122-31. Lu, S. J., Q. Feng, S. Caballero, Y. Chen, M. A. Moore, M. B. Grant, and R. Lanza. 2007. 'Generation of functional hemangioblasts from human embryonic stem cells', Nat Methods, 4: 501-9. Feng, Q., N. Shabrani, J. N. Thon, H. Huo, A. Thiel, K. R. Machlus, K. Kim, J. Brooks, F. Li, C. Luo, E. A. Kimbrel, J. Wang, K. S. Kim, J. Italiano, J. Cho, S. J. Lu, and R. Lanza. 2014. 'Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells', Stem Cell Reports, 3: 817-31. Salvagiotto, G., S. Burton, C. A. Daigh, D. Rajesh, Slukvin, II, and N. J. Seay. 2011. 'A defined, feeder-free, serum-free system to generate in vitro hematopoietic progenitors and differentiated blood cells from hESCs and hiPSCs', PLoS One, 6: e17829. Sugimura, R., D. K. Jha, A. Han, C. Soria-Valles, E. L. da Rocha, Y. F. Lu, J. A. Goettel, E. Serrao, R. G. Rowe, M. Malleshaiah, I. Wong, P. Sousa, T. N. Zhu, A. Ditadi, G. Keller, A. N. Engelman, S. B. Snapper, S. Doulatov, and G. Q. Daley. 2017. 'Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells', Nature, 545: 432-38. Ebina, W., and D. J. Rossi. 2015. 'Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells', Embo j, 34: 694-709. Lu, S. J., Q. Feng, J. S. Park, L. Vida, B. S. Lee, M. Strausbauch, P. J. Wettstein, G. R. Honig, and R. Lanza. 2008. 'Biologic properties and enucleation of red blood cells from human embryonic stem cells', Blood, 112: 4475-84. Lu, S. J., F. Li, H. Yin, Q. Feng, E. A. Kimbrel, E. Hahm, J. N. Thon, W. Wang, J. E. Italiano, J. Cho, and R. Lanza. 2011. 'Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice', Cell Res, 21: 530-45. Ditadi, A., C. M. Sturgeon, J. Tober, G. Awong, M. Kennedy, A. D. Yzaguirre, L. Azzola, E. S. Ng, E. G. Stanley, D. L. French, X. Cheng, P. Gadue, N. A. Speck, A. G. Elefanty, and G. Keller. 2015. 'Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages', Nat Cell Biol, 17: 580-91. Ng, E. S., R. P. Davis, T. Hatzistavrou, E. G. Stanley, and A. G. Elefanty. 2008. 'Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay', Curr Protoc Stem Cell Biol, Chapter 1: Unit 1D.3.
本開示は、とりわけ、種々の造血系統細胞のインビトロ産生のための方法を提供する。
一態様において、造血系統細胞のインビトロ産生のための方法であって、
（ａ）第１の培養培地中に多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む複数の第１の球体を提供することであって、前記第１の球体が、直径約６０～１５０マイクロメートル、約７０～１２０マイクロメートル、または約８０～１００マイクロメートルの平均サイズを有し；好ましくは、前記第１の球体を、球体サイズをモニタリングしながら三次元（３Ｄ）球体培養から生成する、提供すること；
（ｂ）第２の培養培地中の前記複数の第１の球体を３Ｄ球体培養して前記ＰＳＣの分化を誘導し、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）を含む複数の第２の球体を生成すること；
（ｃ）第３の培養培地中の前記複数の第２の球体を３Ｄ球体培養して前記ＨＥＣの分化を誘導し、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む複数の第３の球体を生成すること；
（ｄ）前記ＨＰＣを前記複数の第３の球体から放出させてＨＰＣの実質的に単一の細胞の懸濁液を得ること；および
（ｅ）必要に応じて、前記ＨＰＣの実質的に単一の細胞の懸濁液を、赤血球系／巨核球性共通前駆細胞、赤血球、巨核球、血小板、リンパ系共通前駆細胞、リンパ系系統細胞（lymphoid lineage cell）、リンパ球（Ｔリンパ球など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）
細胞、骨髄性共通前駆細胞、顆粒球単球共通前駆細胞、単球、マクロファージ、および／または樹状細胞へさらに分化させること；
を含む、方法を本明細書中に提供する。
別の態様において、リンパ系系統細胞（ＮＫ細胞など）のインビトロ産生のための方法であって、
（ａ）第１の培養培地中に多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む複数の第１の球体を提供することであって、前記第１の球体が、直径約６０～１５０マイクロメートル、約７０～１２０マイクロメートル、または約８０～１００マイクロメートルの平均サイズを有し；好ましくは、前記第１の球体を、球体サイズをモニタリングしながら三次元（３Ｄ）球体培養から生成する、提供すること；
（ｂ）第２の培養培地中の前記複数の第１の球体を３Ｄ球体培養して前記ＰＳＣの分化を誘導し、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）を含む複数の第２の球体を生成すること；
（ｃ）前記複数の第２の球体を酵素的に解離させてＨＥＣの実質的に単一の細胞の懸濁液を得ること；
（ｄ）前記ＨＥＣの実質的に単一の細胞を、インビボ造血ニッチを模倣する足場に播種すること；および
（ｅ）前記足場中で、前記ＨＥＣを培養し、リンパ系系統細胞に分化させること；
を含む、方法を提供する。
さらなる態様において、リンパ系系統細胞（ＮＫ細胞など）のインビトロ産生のための方法であって、
（ａ）第１の培養培地中に多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む複数の第１の球体を提供することであって、前記第１の球体が、直径約６０～１５０マイクロメートル、約７０～１２０マイクロメートル、または約８０～１００マイクロメートルの平均サイズを有し；好ましくは、前記第１の球体を、球体サイズをモニタリングしながら三次元（３Ｄ）球体培養から生成する、提供すること；
（ｂ）第２の培養培地中の前記複数の第１の球体を３Ｄ球体培養して前記ＰＳＣの分化を誘導し、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）を含む複数の第２の球体を生成すること；および
（ｃ）足場を含まない第３の培養培地中で、前記第２の球体中の前記ＨＥＣを培養し、前記リンパ系系統細胞に分化させ、一方で、前記リンパ系系統細胞を前記第２の球体から放出させること；
を含む、方法を提供する。
様々な実施形態において、本明細書中に開示の方法で使用されるＰＣＳは、好ましくはヒト由来の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＣＳは、Ｏｃｔ－４発現について少なくとも９５％陽性である。
いくつかの実施形態において、３Ｄ球体培養は、好ましくは連続的な攪拌下で、スピナーフラスコまたは攪拌タンクバイオリアクター中で培養することを含む。
特定の実施形態において、第１の培養培地は、約１～１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β、約１０～５００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、および約１～５μＭのＹ２７６３２を補充したＰＳＣ培養培地である。いくつかの実施形態において、ＰＳＣ培養培地は、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）、ｍＴｅＳＲ（商標）１、ｍＴｅＳＲ（商標）２、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、または３Ｄ浮遊培養に適切な他の培養培地である。
いくつかの実施形態において、第２の培養培地は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを、各々で好ましくは、約２５～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で補充し、必要に応じて、ＣＨＩＲ９９０１２および／またはＳＢ４３１５４２を、各々で好ましくは、約１～１０、約２～５、または約３μＭの濃度で補充したＰＳＣ培養培地である。いくつかの実施形態において、ＰＳＣ培養培地は、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）、ｍＴｅＳＲ（商標）１、ｍＴｅＳＲ（商標）２、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、または３Ｄ浮遊培養に適切な他の培養培地である。いくつかの実施形態において、第２の培養培地に、（ｉ）第１の期間（例えば、１日目および２日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦ、（ｉｉ）第２の期間（例えば、３日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＣＨＩＲ９９０１２、（ｉｉｉ）第３の期間（例えば、４日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０１２、およびＳＢ４３１５４２、（ｉｖ）第４の期間（例えば、５日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＳＢ４３１５４２、ならびに（ｖ）第５の期間（例えば、６日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを補充することができる。いくつかの実施形態において、前記第２の培養培地中での培養を、低酸素条件（約５％酸素）下で第１の期間～第３の期間（例えば、１日目～４日目）、その後、約２０％の通常の酸素濃度で第４の期間および第５の期間（例えば、５日目および６日目）に行う。
いくつかの実施形態において、第３の培養培地は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＲ１、ｓＤＬＬ－１、ＯＳＭ、および／またはＥＰＯの１またはそれより多くを補充した造血基本培地である。いくつかの実施形態において、造血基本培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）造血前駆体拡大培地ＤＸＦ、および造血幹細胞拡大に適切な他の培養系である。
いくつかの実施形態において、工程（ｅ）は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＲ１、ｓＤＬＬ－１、ＯＳＭ、および／またはＥＰＯの１またはそれより多くを補充した造血基本培地中で培養することを含むことができる。いくつかの実施形態において、造血基本培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）造血前駆体拡大培地ＤＸＦ、および系統特異的な拡大および成熟に適切な他の培養培地である。
がんおよび他の免疫疾患を処置する方法であって、本明細書中に開示の方法のいずれか１つを使用して産生された複数の細胞を必要とする患者に投与することを含む、方法も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または疾患抗原の他の受容体を発現するように操作されている。いくつかの実施形態において、細胞は、リンパ系系統細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および／またはマクロファージなど）である。
また、養子細胞療法のための組成物であって、本明細書中に開示の方法のいずれか１つを使用して産生された複数の細胞を含むことができる、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は、がんまたは他の免疫疾患の処置のためのキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または疾患抗原の他の受容体を発現するように操作されている。いくつかの実施形態において、細胞は、リンパ系系統細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および／またはマクロファージなど）である。
さらなる態様は、がんまたは他の免疫疾患の処置のための本明細書中に開示の方法のいずれか１つを使用して産生された細胞に関する。いくつかの実施形態において、細胞は、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または疾患抗原の他の受容体を発現するように操作されている。いくつかの実施形態において、細胞は、リンパ系系統細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および／またはマクロファージなど）である。
また、本明細書中に開示の培養培地の組成を提供する。
図１Ａ～１Ｅは、３Ｄ造血分化に適切な多能性幹細胞の形態および特徴づけを示す。図１Ａは、典型的なスピナーフラスコスタイルのバイオリアクターの画像である。図１Ｂは、低倍率（４０倍）でのＰＳＣ細胞球体の画像である。図１Ｃは、高倍率（１００倍、スケールバー＝２００ｕＭ）でのＰＳＣ細胞球体の画像である。図１Ｄは、未分化ＰＳＣにおけるＯｃｔ－４発現の代表的なフローサイトメーターの結果を示すグラフである。図１Ｅは、正常な女性核型を示す代表的な核型分析を提供する。
図２は、３Ｄ球体条件下での段階的造血誘導プロセスの模式的説明である。
図３Ａ～３Ｃは、分化の最初の６日間のＨＥＣ集団を特徴づけている。図３Ａは、ＨＥＣ分化効率に及ぼす開始球体サイズの影響を示すグラフである。図３Ｂは、代表的なＨＥＣマーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、造血マーカーＣＤ４３、ＣＤ４１、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４５の時間依存性発現、ならびに多能性マーカーＯｃｔ－４の喪失を示すフローサイトメトリーデータである。図３Ｃは、分化６日目のＨＥＣ由来のＨＥ関連表面マーカー発現の定量的プロファイリングを示すグラフである。 図３Ａ～３Ｃは、分化の最初の６日間のＨＥＣ集団を特徴づけている。図３Ａは、ＨＥＣ分化効率に及ぼす開始球体サイズの影響を示すグラフである。図３Ｂは、代表的なＨＥＣマーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、造血マーカーＣＤ４３、ＣＤ４１、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４５の時間依存性発現、ならびに多能性マーカーＯｃｔ－４の喪失を示すフローサイトメトリーデータである。図３Ｃは、分化６日目のＨＥＣ由来のＨＥ関連表面マーカー発現の定量的プロファイリングを示すグラフである。 図３Ａ～３Ｃは、分化の最初の６日間のＨＥＣ集団を特徴づけている。図３Ａは、ＨＥＣ分化効率に及ぼす開始球体サイズの影響を示すグラフである。図３Ｂは、代表的なＨＥＣマーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、造血マーカーＣＤ４３、ＣＤ４１、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４５の時間依存性発現、ならびに多能性マーカーＯｃｔ－４の喪失を示すフローサイトメトリーデータである。図３Ｃは、分化６日目のＨＥＣ由来のＨＥ関連表面マーカー発現の定量的プロファイリングを示すグラフである。
図４Ａ～４Ｉは、細胞球体の段階依存性形態を示す。図４Ａは、未分化のＰＳＣの球体形態の画像である。図４Ｂは、３日目の球体の画像である。図４Ｃは、６日目の球体の画像である。図４Ｄは、９日目の球体の画像である。図４Ｅは、１２日目の球体の画像である。図４Ｆは、１５日目の球体の画像である。図４Ｇは、大きな球体間で放出されたＨＰＣを示す１００倍の倍率の１５日目の球体の画像である。図４Ｈは、１９日目の球体の画像である。図４Ｉは、２２日目の球体の画像である。別段の記載がない限り、全ての画像の倍率は４０倍である。
図５は、異なる分化段階における球体中のＨＥＣ系統特異的マーカー発現の組織学および免疫蛍光を示す画像を含む。最上の横列：分化０、６、９、１４、および２３日目の球体断面；二番目の横列：分化０、６、９、１４、および２３日目の球体断面のＨＥＣマーカーＣＤ３１（緑色）発現であって、細胞核をＤＡＰｉ（青色）で染色した；三番目の横列：分化０、６、９、１４、および２３日目の球体断面のＨＥＣマーカーＣＤ３４（緑色）発現であって、細胞核をＤＡＰｉ（青色）で染色した；最下の横列：分化０、６、９、１４、および２３日目の球体断面の造血マーカーＣＤ４３（緑色）発現であって、細胞核をＤＡＰｉ（青色）で染色した。全ての画像の倍率は、１００倍である。
図６Ａ～６Ｅは、解離した球体細胞における時間依存性系統特異的マーカー発現を示す。図６Ａは、実験条件Ａおよび条件Ｂ由来の細胞球体におけるＣＤ３１のフローサイトメーター分析を示すグラフである。図６Ｂは、実験条件Ａおよび条件Ｂ由来の細胞球体におけるＣＤ３４のフローサイトメーター分析を示すグラフである。図６Ｃは、実験条件Ａおよび条件Ｂ由来の細胞球体におけるＣＤ４３のフローサイトメーター分析を示すグラフである。図６Ｄは、実験条件Ａおよび条件Ｂ由来の細胞球体におけるＣＤ２３５ａのフローサイトメーター分析を示すグラフである。図６Ｅは、実験条件Ａおよび条件Ｂ由来の細胞球体におけるＣＤ４５のフローサイトメーター分析を示すグラフである。
図７Ａおよび７Ｂは、３Ｄ培養した球体からの時間依存性のＨＰＣ放出量を示す。図７Ａは、実験条件Ａおよび条件Ｂ由来の９日目から２３日目までのＨＰＣの１日あたりの採取数を示す表である。図７Ｂは、両方の条件由来のＨＰＣの採取数を示すグラフである。
図８Ａ～８Ｅは、３Ｄ球体から放出された採取ＨＰＣ中の造血系統特異的マーカー発現を示す。図８Ａは、左から右への以下の対のマーカー発現プロフィールについての、９日目に採取したＨＰＣの代表的なフローサイトメーター分析を含む：ＣＤ３１／ＣＤ４３；ＣＤ３４／ＣＤ４５；ＣＤ３４／ＣＤ１３３；ＣＤ４１／ＣＤ２３５ａ；ＣＤ４５／ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４１／ＣＤ４５。図７Ｂは、球体分化の異なる日に採取したＨＰＣのＣＤ３１、ＣＤ４３の単一および組み合わせた発現プロフィールを示すグラフである。図７Ｃは、球体分化の異なる日に採取したＨＰＣのＣＤ３４およびＣＤ４５の単一または組み合わせた発現プロフィールを示すグラフである。図７Ｄは、球体分化の別々の日に採取したＨＰＣのＣＤ４１、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４５の発現プロフィールを示すグラフである。図７Ｅは、球体分化の別々の日に採取したＨＰＣのＣＤ４１／ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４５／ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４１／ＣＤ４５の組み合わせた発現プロフィールを示すグラフである。 図８Ａ～８Ｅは、３Ｄ球体から放出された採取ＨＰＣ中の造血系統特異的マーカー発現を示す。図８Ａは、左から右への以下の対のマーカー発現プロフィールについての、９日目に採取したＨＰＣの代表的なフローサイトメーター分析を含む：ＣＤ３１／ＣＤ４３；ＣＤ３４／ＣＤ４５；ＣＤ３４／ＣＤ１３３；ＣＤ４１／ＣＤ２３５ａ；ＣＤ４５／ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４１／ＣＤ４５。図７Ｂは、球体分化の異なる日に採取したＨＰＣのＣＤ３１、ＣＤ４３の単一および組み合わせた発現プロフィールを示すグラフである。図７Ｃは、球体分化の異なる日に採取したＨＰＣのＣＤ３４およびＣＤ４５の単一または組み合わせた発現プロフィールを示すグラフである。図７Ｄは、球体分化の別々の日に採取したＨＰＣのＣＤ４１、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４５の発現プロフィールを示すグラフである。図７Ｅは、球体分化の別々の日に採取したＨＰＣのＣＤ４１／ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４５／ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４１／ＣＤ４５の組み合わせた発現プロフィールを示すグラフである。
図９Ａ～９Ｌは、分化の２２日目に（on day 22 or differentiation）解離した球体から精製されたＣＤ３４＋細胞のＣＦＵ形成能力を示す。図９Ａは、ＣＤ３４＋細胞（左）、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋細胞（中央）、およびＣＤ３４－ＣＤ４５－細胞のＣＦＵ形成能力の全培養図である。図９Ｂは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋細胞、およびＣＤ３４－ＣＤ４５－細胞由来のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数および表現型を示すグラフである。図７Ｃは、ＣＤ３４＋細胞におけるＣＤ１３３発現を示すフローサイトメトリーデータである。図９Ｄは、大型のバーストＢＦＵ－Ｅの画像である。図９Ｅは、大型のＣＦＵ－Ｅの画像である。図９Ｆは、ＣＦＵ－ＥおよびＣＦＵ－Ｍの画像である。図９Ｇは、大型の赤色のＣＦＵ－ｍｉｘコロニーの画像である。図９Ｈは、小型のＣＦＵ－Ｅの画像である。図９Ｉは、赤色ＣＦＵ－ｍｉｘの画像である。図９Ｊは、ＣＦＵ－Ｇの画像である。図９Ｋは、ＣＦＵ－Ｍおよび－Ｇの画像である。図９Ｌは、ＣＦＵ－Ｍの画像である。全ての顕微鏡画像の倍率は、４０倍である。 図９Ａ～９Ｌは、分化の２２日目に（on day 22 or differentiation）解離した球体から精製されたＣＤ３４＋細胞のＣＦＵ形成能力を示す。図９Ａは、ＣＤ３４＋細胞（左）、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋細胞（中央）、およびＣＤ３４－ＣＤ４５－細胞のＣＦＵ形成能力の全培養図である。図９Ｂは、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋細胞、およびＣＤ３４－ＣＤ４５－細胞由来のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数および表現型を示すグラフである。図７Ｃは、ＣＤ３４＋細胞におけるＣＤ１３３発現を示すフローサイトメトリーデータである。図９Ｄは、大型のバーストＢＦＵ－Ｅの画像である。図９Ｅは、大型のＣＦＵ－Ｅの画像である。図９Ｆは、ＣＦＵ－ＥおよびＣＦＵ－Ｍの画像である。図９Ｇは、大型の赤色のＣＦＵ－ｍｉｘコロニーの画像である。図９Ｈは、小型のＣＦＵ－Ｅの画像である。図９Ｉは、赤色ＣＦＵ－ｍｉｘの画像である。図９Ｊは、ＣＦＵ－Ｇの画像である。図９Ｋは、ＣＦＵ－Ｍおよび－Ｇの画像である。図９Ｌは、ＣＦＵ－Ｍの画像である。全ての顕微鏡画像の倍率は、４０倍である。
図１０Ａ～１０Ｅは、３Ｄ球体から放出されたＨＰＣが巨核球性および赤血球系の両方の潜在力を有していたことを示す。図１０Ａは、広範な前血小板形成（矢印で示す）を示す、ＭＫ特異的培養物におけるＨＰＣ由来巨核球の顕微鏡画像を含む。図１０Ｂは、ＭＫ（Ｐ２）および血小板（Ｐ１）が豊富な集団についての前方および側方散乱プロットである。図１０Ｃは、ゲートＰ２のＭＫが８３．４％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋であることを示すフローサイトメトリーデータである。図１０Ｄは、６６．２％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋を示すＰ１における血小板のフローサイトメトリーデータである。図１０Ｅは、１０日目の球体から放出されたＨＰＣ由来の大型の拡大した赤血球コロニーの形態の画像を含む（倍率４０倍）。 図１０Ａ～１０Ｅは、３Ｄ球体から放出されたＨＰＣが巨核球性および赤血球系の両方の潜在力を有していたことを示す。図１０Ａは、広範な前血小板形成（矢印で示す）を示す、ＭＫ特異的培養物におけるＨＰＣ由来巨核球の顕微鏡画像を含む。図１０Ｂは、ＭＫ（Ｐ２）および血小板（Ｐ１）が豊富な集団についての前方および側方散乱プロットである。図１０Ｃは、ゲートＰ２のＭＫが８３．４％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋であることを示すフローサイトメトリーデータである。図１０Ｄは、６６．２％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋を示すＰ１における血小板のフローサイトメトリーデータである。図１０Ｅは、１０日目の球体から放出されたＨＰＣ由来の大型の拡大した赤血球コロニーの形態の画像を含む（倍率４０倍）。 図１０Ａ～１０Ｅは、３Ｄ球体から放出されたＨＰＣが巨核球性および赤血球系の両方の潜在力を有していたことを示す。図１０Ａは、広範な前血小板形成（矢印で示す）を示す、ＭＫ特異的培養物におけるＨＰＣ由来巨核球の顕微鏡画像を含む。図１０Ｂは、ＭＫ（Ｐ２）および血小板（Ｐ１）が豊富な集団についての前方および側方散乱プロットである。図１０Ｃは、ゲートＰ２のＭＫが８３．４％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋であることを示すフローサイトメトリーデータである。図１０Ｄは、６６．２％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋を示すＰ１における血小板のフローサイトメトリーデータである。図１０Ｅは、１０日目の球体から放出されたＨＰＣ由来の大型の拡大した赤血球コロニーの形態の画像を含む（倍率４０倍）。 図１０Ａ～１０Ｅは、３Ｄ球体から放出されたＨＰＣが巨核球性および赤血球系の両方の潜在力を有していたことを示す。図１０Ａは、広範な前血小板形成（矢印で示す）を示す、ＭＫ特異的培養物におけるＨＰＣ由来巨核球の顕微鏡画像を含む。図１０Ｂは、ＭＫ（Ｐ２）および血小板（Ｐ１）が豊富な集団についての前方および側方散乱プロットである。図１０Ｃは、ゲートＰ２のＭＫが８３．４％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋であることを示すフローサイトメトリーデータである。図１０Ｄは、６６．２％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋を示すＰ１における血小板のフローサイトメトリーデータである。図１０Ｅは、１０日目の球体から放出されたＨＰＣ由来の大型の拡大した赤血球コロニーの形態の画像を含む（倍率４０倍）。 図１０Ａ～１０Ｅは、３Ｄ球体から放出されたＨＰＣが巨核球性および赤血球系の両方の潜在力を有していたことを示す。図１０Ａは、広範な前血小板形成（矢印で示す）を示す、ＭＫ特異的培養物におけるＨＰＣ由来巨核球の顕微鏡画像を含む。図１０Ｂは、ＭＫ（Ｐ２）および血小板（Ｐ１）が豊富な集団についての前方および側方散乱プロットである。図１０Ｃは、ゲートＰ２のＭＫが８３．４％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋であることを示すフローサイトメトリーデータである。図１０Ｄは、６６．２％ＣＤ４１＋ＣＤ４２＋を示すＰ１における血小板のフローサイトメトリーデータである。図１０Ｅは、１０日目の球体から放出されたＨＰＣ由来の大型の拡大した赤血球コロニーの形態の画像を含む（倍率４０倍）。
図１１Ａ～１１Ｄは、８日目に放出された初期ＨＰＣからのＣＤ５６＋ ｈｉｇｈＮＫ細胞の誘導を示す。図１１Ａは、ＮＫ分化開始前のＨＰＣ（ＨＰＣ－Ａ：８日目；ＨＰＣ－Ｂ：１１日目；ＨＰＣ－Ｃ：１８日目）を特徴づけたグラフである。図１１Ｂは、ＮＫ分化培養物におけるＣＤ５６＋ｈｉｇｈＮＫ細胞を特徴づけたフローサイトメトリーデータを含む。図１１Ｃは、培地番号１におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。図１１Ｄは、培地番号２におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。 図１１Ａ～１１Ｄは、８日目に放出された初期ＨＰＣからのＣＤ５６＋ ｈｉｇｈＮＫ細胞の誘導を示す。図１１Ａは、ＮＫ分化開始前のＨＰＣ（ＨＰＣ－Ａ：８日目；ＨＰＣ－Ｂ：１１日目；ＨＰＣ－Ｃ：１８日目）を特徴づけたグラフである。図１１Ｂは、ＮＫ分化培養物におけるＣＤ５６＋ｈｉｇｈＮＫ細胞を特徴づけたフローサイトメトリーデータを含む。図１１Ｃは、培地番号１におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。図１１Ｄは、培地番号２におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。 図１１Ａ～１１Ｄは、８日目に放出された初期ＨＰＣからのＣＤ５６＋ ｈｉｇｈＮＫ細胞の誘導を示す。図１１Ａは、ＮＫ分化開始前のＨＰＣ（ＨＰＣ－Ａ：８日目；ＨＰＣ－Ｂ：１１日目；ＨＰＣ－Ｃ：１８日目）を特徴づけたグラフである。図１１Ｂは、ＮＫ分化培養物におけるＣＤ５６＋ｈｉｇｈＮＫ細胞を特徴づけたフローサイトメトリーデータを含む。図１１Ｃは、培地番号１におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。図１１Ｄは、培地番号２におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。 図１１Ａ～１１Ｄは、８日目に放出された初期ＨＰＣからのＣＤ５６＋ ｈｉｇｈＮＫ細胞の誘導を示す。図１１Ａは、ＮＫ分化開始前のＨＰＣ（ＨＰＣ－Ａ：８日目；ＨＰＣ－Ｂ：１１日目；ＨＰＣ－Ｃ：１８日目）を特徴づけたグラフである。図１１Ｂは、ＮＫ分化培養物におけるＣＤ５６＋ｈｉｇｈＮＫ細胞を特徴づけたフローサイトメトリーデータを含む。図１１Ｃは、培地番号１におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。図１１Ｄは、培地番号２におけるＮＫ分化の時間依存性ＣＤ５６発現を示すグラフである。
図１２Ａ～１２Ｄは、インビトロでのｉＰＳ－ＮＫ細胞を特徴づけている。図１２Ａは、典型的なＨＰＣ形態の画像である（倍率４００倍）。図１２Ｂは、３０日目に放出されたｉＰＳ－ＮＫ細胞の形態を示す画像である（倍率４００倍）。図１２Ｃは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ｉＰＳ－ＮＫ細胞（左上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞上のＴＣＲ発現（中央の上）；ＴＣＲ抗体のＰＢＭＣ陽性対照（右上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ３発現（左下）；ＣＤ３抗体のＰＢＭＣ陽性対照（中央の下）、ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９発現（右下）。図１２Ｄは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ＋（左上）、ＮＫｐ４４＋（左中央）；およびＮＫｐ４６＋（左下）である；４９．２％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＳ４＋（右上）であり、３１．８％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１＋（右中央）である；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＳ１－（右下）である。 図１２Ａ～１２Ｄは、インビトロでのｉＰＳ－ＮＫ細胞を特徴づけている。図１２Ａは、典型的なＨＰＣ形態の画像である（倍率４００倍）。図１２Ｂは、３０日目に放出されたｉＰＳ－ＮＫ細胞の形態を示す画像である（倍率４００倍）。図１２Ｃは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ｉＰＳ－ＮＫ細胞（左上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞上のＴＣＲ発現（中央の上）；ＴＣＲ抗体のＰＢＭＣ陽性対照（右上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ３発現（左下）；ＣＤ３抗体のＰＢＭＣ陽性対照（中央の下）、ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９発現（右下）。図１２Ｄは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ＋（左上）、ＮＫｐ４４＋（左中央）；およびＮＫｐ４６＋（左下）である；４９．２％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＳ４＋（右上）であり、３１．８％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１＋（右中央）である；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＳ１－（右下）である。 図１２Ａ～１２Ｄは、インビトロでのｉＰＳ－ＮＫ細胞を特徴づけている。図１２Ａは、典型的なＨＰＣ形態の画像である（倍率４００倍）。図１２Ｂは、３０日目に放出されたｉＰＳ－ＮＫ細胞の形態を示す画像である（倍率４００倍）。図１２Ｃは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ｉＰＳ－ＮＫ細胞（左上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞上のＴＣＲ発現（中央の上）；ＴＣＲ抗体のＰＢＭＣ陽性対照（右上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ３発現（左下）；ＣＤ３抗体のＰＢＭＣ陽性対照（中央の下）、ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９発現（右下）。図１２Ｄは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ＋（左上）、ＮＫｐ４４＋（左中央）；およびＮＫｐ４６＋（左下）である；４９．２％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＳ４＋（右上）であり、３１．８％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１＋（右中央）である；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＳ１－（右下）である。 図１２Ａ～１２Ｄは、インビトロでのｉＰＳ－ＮＫ細胞を特徴づけている。図１２Ａは、典型的なＨＰＣ形態の画像である（倍率４００倍）。図１２Ｂは、３０日目に放出されたｉＰＳ－ＮＫ細胞の形態を示す画像である（倍率４００倍）。図１２Ｃは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ｉＰＳ－ＮＫ細胞（左上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞上のＴＣＲ発現（中央の上）；ＴＣＲ抗体のＰＢＭＣ陽性対照（右上）；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ３発現（左下）；ＣＤ３抗体のＰＢＭＣ陽性対照（中央の下）、ｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ１９発現（右下）。図１２Ｄは、以下の前方および側方散乱プロットを含む：ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ＋（左上）、ＮＫｐ４４＋（左中央）；およびＮＫｐ４６＋（左下）である；４９．２％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＳ４＋（右上）であり、３１．８％ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１＋（右中央）である；ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＳ１－（右下）である。
図１３は、Ｋ５６２標的細胞に対するｉＰＳ－ＮＫ細胞の細胞傷害活性を示すフローサイトメトリーデータを含む。上の横列：Ｋ５６２細胞のみの対照；２番目の横列：Ｅ：Ｔ比１２．５：１；３番目の横列：Ｅ：Ｔ比２５：１；下の横列：Ｅ：Ｔ比５０：１。左の縦列：標的細胞（Ｐ１）およびエフェクター細胞（Ｐ２）の前方および側方散乱プロフィール；左から２番目の縦列：Ｋ５６２（陽性）およびＮＫ（陰性）の両方のＧＦＰヒストグラム；右から２番目の縦列：ＧＦＰ＋Ｋ５６２における死細胞の百分率（ゲートＭ２）。 図１３は、Ｋ５６２標的細胞に対するｉＰＳ－ＮＫ細胞の細胞傷害活性を示すフローサイトメトリーデータを含む。上の横列：Ｋ５６２細胞のみの対照；２番目の横列：Ｅ：Ｔ比１２．５：１；３番目の横列：Ｅ：Ｔ比２５：１；下の横列：Ｅ：Ｔ比５０：１。左の縦列：標的細胞（Ｐ１）およびエフェクター細胞（Ｐ２）の前方および側方散乱プロフィール；左から２番目の縦列：Ｋ５６２（陽性）およびＮＫ（陰性）の両方のＧＦＰヒストグラム；右から２番目の縦列：ＧＦＰ＋Ｋ５６２における死細胞の百分率（ゲートＭ２）。
図１４は、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の８０％より多くがＣＤ５６＋ＣＤ８＋エフェクター細胞であることを示す。パネルＡは、ＣＤ５６＋ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞がＣＤ３を発現しないことを示すフローサイトメトリーデータである。パネルＢは、ＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞の８０％がＣＤ８抗原を発現するが、ＣＤ４抗原を発現しないことを示すフローサイトメトリーデータである。パネルＣは、異なるバッチ由来のＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞の８０％超がＣＤ８抗原を発現するが、ＣＤ３抗原を発現しないことを示すフローサイトメトリーデータである。パネルＤは、異なるバッチ由来のＣＤ５６＋ｉＰＳ－ＮＫ細胞の８０％超がＣＤ８抗原を発現するが、ＴＣＲ抗原を発現しないことを示すフローサイトメトリーデータである。
図１５Ａ～１５Ｄは、支持細胞を含まない条件下でのヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の拡大を示す。採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞／前駆体の全部で５つの異なるバッチを、本発明者らが新規に開発した支持細胞を含まない限定培地を使用してインビトロで拡大させた。図１５Ａは、細胞数が２．４倍増加と５．６倍増加との間で増加し、平均して３．８３倍増加したことを示すグラフである。図１５Ｂは、拡大前のＣＤ５６＋細胞の平均３７．８％から拡大後のＣＤ５６＋細胞の平均９５．２％までＮＫ集団が有意に富化し、最も高い純度が９９％に到達したことを示すグラフである。図１５Ｃは、拡大前のｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ５６／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６／ＮＫＰ４４、およびＣＤ５６／ＮＫＰ４６の代表的な共発現を示すフローサイトメトリーデータを含む。図１５Ｄは、拡大後のｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ５６／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６／ＮＫＰ４４、およびＣＤ５６／ＮＫＰ４６の代表的な共発現を示すフローサイトメトリーデータを含む。 図１５Ａ～１５Ｄは、支持細胞を含まない条件下でのヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の拡大を示す。採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞／前駆体の全部で５つの異なるバッチを、本発明者らが新規に開発した支持細胞を含まない限定培地を使用してインビトロで拡大させた。図１５Ａは、細胞数が２．４倍増加と５．６倍増加との間で増加し、平均して３．８３倍増加したことを示すグラフである。図１５Ｂは、拡大前のＣＤ５６＋細胞の平均３７．８％から拡大後のＣＤ５６＋細胞の平均９５．２％までＮＫ集団が有意に富化し、最も高い純度が９９％に到達したことを示すグラフである。図１５Ｃは、拡大前のｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ５６／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６／ＮＫＰ４４、およびＣＤ５６／ＮＫＰ４６の代表的な共発現を示すフローサイトメトリーデータを含む。図１５Ｄは、拡大後のｉＰＳ－ＮＫ細胞におけるＣＤ５６／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６／ＮＫＰ４４、およびＣＤ５６／ＮＫＰ４６の代表的な共発現を示すフローサイトメトリーデータを含む。
図１６Ａ～１６Ｇは、５００ｍｌバイオリアクター中でのＮＫ細胞系統特異的分化を示す。図１６Ａは、３０ｍｌおよび５００ｍｌのバイオリアクターの両方に由来する３日目および５日目の球体における血液生成内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４の効率的な誘導を示すグラフである。３日目および５日目の球体における初期造血マーカーＣＤ４３の誘導も比較可能である；図１６Ｂは、５００ｍｌバイオリアクターから採取した細胞におけるＮＫマーカーＣＤ５６の発現（赤色ライン）が３つの個別の３０ｍｌバイオリアクターから採取した細胞と非常に類似したパターンを実証したことを示すグラフである。図１６Ｃは、５００ｍｌバイオリアクターから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞が相同のＮＫ細胞形態（homogenous NK cell morphology）を示したことを示す画像である。図１６Ｄは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫＧ２Ｄも発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｅは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫｐ４６も発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｆは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫｐ４４も発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｇは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＫＩＲも発現する（also express and KIR）ことを示すフローサイトメトリーデータである。 図１６Ａ～１６Ｇは、５００ｍｌバイオリアクター中でのＮＫ細胞系統特異的分化を示す。図１６Ａは、３０ｍｌおよび５００ｍｌのバイオリアクターの両方に由来する３日目および５日目の球体における血液生成内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４の効率的な誘導を示すグラフである。３日目および５日目の球体における初期造血マーカーＣＤ４３の誘導も比較可能である；図１６Ｂは、５００ｍｌバイオリアクターから採取した細胞におけるＮＫマーカーＣＤ５６の発現（赤色ライン）が３つの個別の３０ｍｌバイオリアクターから採取した細胞と非常に類似したパターンを実証したことを示すグラフである。図１６Ｃは、５００ｍｌバイオリアクターから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞が相同のＮＫ細胞形態（homogenous NK cell morphology）を示したことを示す画像である。図１６Ｄは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫＧ２Ｄも発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｅは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫｐ４６も発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｆは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫｐ４４も発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｇは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＫＩＲも発現する（also express and KIR）ことを示すフローサイトメトリーデータである。 図１６Ａ～１６Ｇは、５００ｍｌバイオリアクター中でのＮＫ細胞系統特異的分化を示す。図１６Ａは、３０ｍｌおよび５００ｍｌのバイオリアクターの両方に由来する３日目および５日目の球体における血液生成内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４の効率的な誘導を示すグラフである。３日目および５日目の球体における初期造血マーカーＣＤ４３の誘導も比較可能である；図１６Ｂは、５００ｍｌバイオリアクターから採取した細胞におけるＮＫマーカーＣＤ５６の発現（赤色ライン）が３つの個別の３０ｍｌバイオリアクターから採取した細胞と非常に類似したパターンを実証したことを示すグラフである。図１６Ｃは、５００ｍｌバイオリアクターから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞が相同のＮＫ細胞形態（homogenous NK cell morphology）を示したことを示す画像である。図１６Ｄは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫＧ２Ｄも発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｅは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫｐ４６も発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｆは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＮＫｐ４４も発現することを示すフローサイトメトリーデータである。図１６Ｇは、５００ｍｌから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の９０％超がＣＤ５６＋であり、これらの細胞がＫＩＲも発現する（also express and KIR）ことを示すフローサイトメトリーデータである。
図１７は、本開示の３Ｄ造血分化プラットフォームから生成されたＣＤ３＋Ｔリンパ球を示す。２つの個別のバイオリアクターから採取した細胞中のＴ細胞マーカーＣＤ３およびＮＫ細胞マーカーＣＤ５６／ＮＫＧ２Ｄの発現を示す。パネルＡおよびＣ：バイオリアクター番号１および番号２から採取した細胞の６４．５％および６１．７％は、それぞれＣＤ３＋ＣＤ８－である。パネルＢおよびＤ：バイオリアクター番号１および番号２から採取した細胞の６１．５％および７７％は、それぞれＣＤ５６－ＮＫＧ２Ｄ－である。
図１８は、ヒトｉＰＳ－ＮＫがＫ５６２がん細胞を選択的に死滅させるが、正常細胞は死滅させないことを示す。緑色蛍光標識したＫ５６２がん細胞または正常ヒト末梢モノヌクレオチド細胞（ＰＢＭＣ）をヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞と１：１の比で混合し、細胞傷害効果を、２時間のインキュベーション後にフローサイトメーターによって測定した。パネルＡ：ＰＢＭＣとの混合前のｉＰＳ－ＮＫ細胞。パネルＢ：ｉＰＳ－ＮＫ細胞との混合前のＰＢＭＣ。パネルＣ：混合２時間後のｉＰＳ－ＮＫ細胞およびＰＢＭＣであって、ＰＢＭＣはインタクトなままであった。パネルＤ：Ｋ５６２細胞との混合前のｉＰＳ－ＮＫ細胞。パネルＥ：ｉＰＳ－ＮＫ細胞との混合前のＫ５６２細胞。パネルＦ：混合２時間後のｉＰＳ－ＮＫ細胞およびＫ５６２細胞であって、Ｋ５６２細胞の８０％超が殺滅された。
詳細な説明
一態様において、細胞治療の要求を満たすための工業規模での造血細胞の製造に適切な新規の方法論を本明細書中に提供する。３Ｄ培養をＰＳＣから開始すると、これらの細胞は、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）に最初に分化することができ、ＨＥＣは、造血細胞系統および内皮細胞系統の両方になる二分化能を有する中間集団である（Ｄｉｔａｄｉ ｅｔ
ａｌ．２０１５；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｓｗｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０１３）。造血拘束（hematopoietic commitment）および拡大に適切な条件への移行後、
かなりの数の造血前駆細胞（ＨＰＣ）を３Ｄ球体から放出させることができる。種々の拡大段階での前駆体を採取し、その表現型および機能について分析し、凍結保存することができる。全製造過程は、市販の使い捨ての撹拌タンクバイオリアクターまたは他の大規模細胞製造デバイスに容易に適応することができる３Ｄ浮遊培養条件下で開発される。本明細書中に開示の方法は、効率および再現性が高く、過程中の任意の時期に細胞を試料採取および回収することが容易である。このシステムを、種々の分化段階および異なる系統の細胞（ＨＥＣ、造血幹／前駆細胞、赤血球系／巨核球性前駆体、骨髄系前駆体、リンパ系前駆体、ならびに成熟赤血球、血小板、Ｔリンパ球、およびＮＫ細胞など）の製造のためにカスタマイズすることができる。
いくつかの実施形態において、十分に制御された段階的様式でヒトＰＳＣ球体をＨＥＣの含有率が高い球体に最初に効率的に変換することができる再現性が高くかつ拡大縮小可能な細胞製造プラットフォームテクノロジーを提供する。ＨＥＣ豊富な球体を、その後に、大量の全ての造血系統への分化能を有するＨＰＣを放出することができる造血活性の高い球体に移行させることができる。これらのＨＰＣは、全ての造血系統細胞（巨核球／血小板およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれるが、これらに限定されない）に頑強に分化することができる。いくつかの実施形態において、ヒトＰＳＣ由来のかかるＮＫ細胞を、がん免疫療法のための既製品として利用することができる。
有意には、本明細書中に開示の方法を使用して、使い捨てのバイオリアクターの種々の形態に容易に適応することができる、いかなる支持細胞や担体も含まない限定された３Ｄ浮遊培養条件下で細胞を処理する。第２に、本明細書中に開示の３Ｄ培養法およびシステムを使用して、種々の造血細胞を製造することができる。第３に、本明細書中に開示の３Ｄ培養法およびシステムは、ＨＰＣが球体から自然に放出され、生存率および機能性が高い細胞を採取可能であるので、使い勝手が良い。
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示の３Ｄ培養法およびシステムの投入産出比（ＰＳＣ：ＨＰＣ）は、少なくとも１：５、１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：３０、または約１：３１であると推定される。例えば、ＰＳＣ：ＨＰＣ比１：３１は、作業体積３リットルの単一のバイオリアクターから５．６×１０１０個までのＨＰＣを製造可能である。この簡潔なプラットフォームは、異なる系統の細胞の製造に必要とされる任意のシステムの修正のための確固たる基盤となる。また、この３Ｄプラットフォームは拡大縮小可能であるので、自家治療および同種治療のための細胞の大量製造のための望ましい選択肢となる。
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語がここに集められている。別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素（ｏｎｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）または１を超える要素（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を意味する。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内を意味する。「実質的に」という用語は、５０％を超える、好ましくは８０％を超える、最も好ましくは９０％または９５％を超えることを意味する。
本明細書で使用される場合、「複数の」は、１より多く、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多く、例えば、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００またはそれより多く、またはそれらの間の任意の整数を意味する。
本明細書で使用される場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、所与の実施形態中に存在するが、特定されていない要素を含むことができる組成物、方法およびそれらのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用される。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、本発明のその実施形態の基本的および新規なまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
「からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法およびそれらのそれぞれの構成要素を指し、これらは、実施形態のその記述中に記載されていない一切の要素を除外する。
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞またはＥＳＣ）という用語は、細胞株として連続継代された胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊に由来する多能性細胞を指す。ＥＳ細胞は、精子またはＤＮＡによる卵細胞の受精、核移植、単為生殖などに由来し得る。「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）という用語は、ヒトＥＳ細胞を指す。ＥＳＣの生成は、米国特許第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号に開示されており、体細胞核移植に由来する胚盤胞の内部細胞塊から得られたＥＳＣは、米国特許第５，９４５，５７７号、同第５，９９４，６１９号、同第６，２３５，９７０号に記載されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。胚性幹細胞の識別可能な特徴は、胚性幹細胞の表現型を規定する。したがって、その細胞をその他の細胞と区別することができるように、その細胞が胚性幹細胞の固有の特徴の１つまたはそれより多くを有する場合、細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な識別可能な胚性幹細胞の特徴には、遺伝子発現プロファイル、増殖能力、分化能力、核型、特定の培養条件に対する応答性などが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「多能性」という用語は、異なる条件下で、１を超える分化した細胞型に分化する能力、好ましくは３つすべての胚細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、主に、例えばヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して、１を超える細胞型に、好ましくは３つの胚葉すべてに分化するそれらの能力によって特徴付けられる。このような細胞には、ｈＥＳ細胞、ヒト胚由来細胞（ｈＥＤＣ）および成人由来の幹細胞が含まれる。多能性幹細胞は、遺伝子改変され得る。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、遺伝子改変されていない。遺伝子改変された細胞は、それらの同定を容易にするために、蛍光タンパク質などのマーカーを含み得る。多能性は、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、多能性の好ましい試験は、３つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力の実証である。そのような細胞を単に培養することは、それ自体では、それらを多能性にするわけではないことに注意すべきである。再プログラムされた多能性細胞（例えば、その用語が本明細書において定義されているｉＰＳ細胞）も、一般に培養において限られた数の分裂能を有するに過ぎない初代細胞親と比較して、成長潜在力を失うことなく長期間継代することができるという特徴を有する。
本明細書で使用される場合、「ｉＰＳ細胞」および「人工多能性幹細胞」という用語は交換可能に使用され、例えば、１またはそれを超える遺伝子の強制された発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に誘導された（例えば、誘導または完全な反転によって）多能性幹細胞を指す。
本明細書で使用される「再プログラミング」という用語は、核の発生時計がリセットされるように、体細胞の分化状態を変更または反転させる過程、例えば、初期胚細胞核の遺伝的プログラムを実行することができるように、成体の分化した細胞核の発生状態をリセットして、胚発生に必要とされるすべてのタンパク質を作製することを表す。本明細書に開示される再プログラミングは、体細胞の分化状態の多能性または全能性細胞への完全な復帰を包含する。再プログラミングは、接合子が成体へと発達するにつれて細胞分化中に起こる、核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、エピジェネティックな変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝的パターンの少なくともいくつかの変化、例えば、反転を一般に伴う。
「再生」または「自己再生」または「増殖」という用語は、本明細書では互換的に使用され、長期間にわたっておよび／または何ヶ月から何年も、同一の特殊化されていない細胞型に分裂することによって幹細胞が自らを再生する能力を指すために使用される。いくつかの事例では、増殖は、単一の細胞が２つの同一の娘細胞に繰り返し分裂することによる細胞の拡大を指す。
本明細書で使用される「培養」または「培養する」という用語は、細胞の生存および／または増殖を維持するためのインビトロでの実験手順を指す。
「無担体三次元球体」培養または培養するという用語は、細胞が一切の担体なしに単独で球体を形成することができるように、非接着条件で細胞を培養する技術を指す。接着性を有する細胞を培養するための従来の方法は、細胞がペトリ皿などの容器の平面上で培養されることを特徴とする（二次元培養）。これに対して、三次元培養法では、細胞に付着の手がかりは提供されず、培養は細胞間接触に大きく依存する。本明細書で使用される場合、「担体」または「微小担体」は、浮遊細胞培養のための接着性表面を与えるように設計された、プラスチック、セラミックまたはゼラチンもしくはヒドロゲルなどのその他の材料で作られた固体球形ビーズを指す。繊維構造など、他の形態または形状を有する担体も報告されている。
用語「足場」は、組織工学および組織再生のための新規の機能的組織を形成させるために所望の細胞相互作用を引き起こすように操作されている固体または半個体の材料を指す。いくつかの実施形態において、三次元組織形成を支持することができるこれらの構造に細胞を播種することが多い。足場は、天然組織の細胞外基質を模倣しており、インビボ環境を再現し、細胞が細胞自体の微小環境に影響を及ぼすことが可能である。足場は、通常、以下の目的のうちの少なくとも１つを果たす：細胞を付着および遊走させ、細胞および生物医学的因子を送達および保持し、重要な細胞の栄養素および発現産物を拡散させることができ、細胞の挙動を修正するようにある特定の機械的および生物学的な影響を及ぼす。組織再構築の目的を果たすために、足場は、ある特定の特異的要件を満たさなければならない。細胞の播種および拡散を容易にするためには、多孔度が高く、孔径が適切である必要がある。足場材料は、生体適合性でなければならない。いくつかの実施形態において、生分解性材料が使用された。いくつかの実施形態において、足場内の細胞の回収または採取を容易にするために、酵素処理によるか、ｐＨおよび／または温度などの物理的条件を変化させることによって足場を溶解することができる。いくつかの実施形態において、最適な細胞の分化および製造のための担体として多孔質足場を使用することもできる。孔径、剛性、細胞外基質の含有量、および形状などの足場の物理的特徴を、組織（骨、心臓、肝臓、および皮膚組織などであるが、これらに限定されない）を最適に成長させるためにカスタマイズすることができる。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球などの系統の特異化を促進するために、インビボニッチを模倣するように足場を選択することができる。
「球体（ｓｐｈｅｒｅ）」または「球状体（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）」という用語は、三次元の球形または実質的に球形の細胞の集塊または凝集体を意味する。いくつかの実施形態において、細胞が生体組織内で移動するのと同じように、細胞が細胞の球状体内で移動することを補助するために、細胞外マトリックスを使用することができる。使用されるＥＣＭの最も一般的なタイプは、基底膜抽出物またはコラーゲンである。いくつかの実施形態において、マトリックスまたは足場を含まない球状体培養を使用することも可能であり、細胞は培地中に懸濁されて成長している。これは、継続的な回転によってまたは低接着性プレートを使用することによって達成することができる。実施形態において、球体は、懸滴、回転培養、強制浮遊、攪拌または凹面プレート（ｃｏｎｃａｖｅ ｐｌａｔｅ）法などの単一培養または共培養技術から作製することができる（例えば、Ｂｒｅｓｌｉｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０１３，１８，２４０～２４９；Ｐａｍｐａｌｏｎｉら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００７，８，８３９～８４５；Ｈｓｉａｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２，１０９，１２９３～１３０４；およびＣａｓｔａｎｅｄａら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００，１２６，３０５～３１０を参照；すべて参照により組み込まれる）。いくつかの実施形態において、球体のサイズは、３Ｄ培養中に成長し得る。
本明細書中で使用される場合、「支持細胞を含まない」は、参照される組成物が支持細胞を添加されていない条件を指す。本明細書中で使用される場合、「支持細胞」は、ＰＳ細胞と共培養され、ＰＳ細胞を支持する非ＰＳ細胞を指す。支持には、１またはそれを超える成長因子の産生によってＰＳ細胞培養物の成長および維持を容易にすることが含まれ得る。支持細胞の例には、マウス線維芽細胞、ヒト線維芽細胞などの結合組織の表現型を有する細胞が含まれ得る。
「培養培地」という用語は、「培地」と交換可能に使用され、細胞増殖を可能にする任意の培地を指す。適切な培地は最大の増殖を促進する必要はなく、測定可能な細胞増殖のみを促進する。いくつかの実施形態において、培養培地は、細胞を多能性状態に維持する。いくつかの実施形態において、培養培地は、細胞（例えば、多能性細胞）の、例えば、ＨＥＣおよびＨＰＣへの分化を促進する。本明細書中で使用されるいくつかの例示的な基本培地には、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）、ｂＦＧＦもＴＧＦβも含まない成長因子なしのＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（ＧＦ－ｆｒｅｅ ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから入手可能）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（登録商標）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ｍＴｅＳＲ（商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ｍＴｅＳＲ（商標）２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）（Ｉｒｖｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）造血前駆体拡大培地ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ）が含まれる。それぞれに、適切なバッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸））、Ｎ２（０．１～１０％、例えば１％）およびＢ２７（０．１～１０％、例えば１％）無血清サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）などの化学的に組成が明らかなサプリメント、ペニシリン／ストレプトマイシン（０．１～１０％、例えば１％）などの抗生物質、ＭＥＭ非必須アミノ酸（培養された細胞の成長に不可欠な平衡塩類溶液、アミノ酸およびビタミンから構成されており、非必須アミノ酸を補充するとＭＥＭ非必須アミノ酸溶液になるイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ））、グルコース（０．１～１０％、例えば、０．３０％）、Ｌ－グルタミン（例えば、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））、アスコルビン酸および／またはＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル）の１またはそれより多くを補充することができる。また、本明細書中に開示の分化を誘導するための因子（ヘパリン、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、可溶性δ様タンパク質１（ｓＤＬＬ－１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、インターロイキン（ＩＬ）－３、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、Ｙ２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ４３１５４２、および／またはステムレゲニン１（ＳＲ１）など）も培地に添加することができる。
本明細書で使用される「分化した細胞」という用語は、体細胞系統に分化する過程にある、または最終的に分化した任意の細胞を指す。細胞個体発生の文脈において、形容詞「分化した」および「分化している」は、それが比較されている細胞よりも発生経路をさらに進んだ「分化した細胞」を意味する相対的な用語である。したがって、幹細胞は、系が限定された前駆細胞（中胚葉幹細胞など）に分化することができ、続いて、これは、経路のさらに下流に位置する他の種類の前駆細胞（造血前駆体など）に分化した後、最終段階まで分化した細胞に分化することができ、最終段階まで分化した細胞は特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持している場合または保持していない場合があり得る。
「富化している」および「富化された」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、あるタイプの細胞の収量（割合）が、当初の培養物または調製物中における当該タイプの細胞の割合よりも少なくとも１０％増加することを意味する。
本明細書で使用される「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの、但しこれらに限定されない任意の化合物または物質を意味する。「薬剤」は、合成のおよび天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性の実体を含むがこれらに限定されない、任意の化学物質、実体または部分であり得る。いくつかの実施形態において、薬剤は、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸または炭水化物であり、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマーならびにこれらの改変および組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、薬剤は、化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分には、マクロライド、レプトマイシンおよび関連する天然産物またはこれらの類似体を含む、置換されていないまたは置換された、アルキル、芳香族またはヘテロシクリル部分が含まれた。化合物は、所望の活性および／または特性を有することが公知であり得、または多様な化合物のライブラリーから選択することができる。
「小分子」という用語は、複数の炭素－炭素結合および１５００ダルトン未満の分子量を有する有機化合物を指す。典型的には、このような化合物は、タンパク質との構造的相互作用、例えば水素結合を媒介する１またはそれを超える官能基を含み、典型的には、少なくとも１つの、アミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を含み、いくつかの実施形態においては、官能化学基の少なくとも２つを含む。小分子剤は、１またはそれを超える、化学的官能基および／またはヘテロ原子で置換された、環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含み得る。
本明細書で使用される「マーカー」という用語は、細胞の特徴および／または表現型を記述するために使用される。マーカーは、関心対象の特徴を含む細胞の選択のために使用することができる。マーカーは特定の細胞によって異なる。マーカーは、特定の細胞型の細胞の形態的、機能的もしくは生化学的（酵素的）特徴などの特徴であり、または細胞型によって発現される分子である。好ましくは、このようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは、当技術分野で利用可能な抗体またはその他の結合分子に対するエピトープを保有する。しかしながら、マーカーは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸およびステロイドを含むがこれらに限定されない、細胞内に見出される任意の分子からなり得る。形態的特徴または形質の例には、形状、サイズおよび核対細胞質比が含まれるが、これらに限定されない。機能的特徴または形質の例には、特定の基材に付着する能力、特定の色素を取り込むまたは排除する能力、特定の条件下で遊走する能力および特定の系統に沿って分化する能力が含まれるが、これらに限定されない。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出され得る。マーカーは、形態的特徴の不存在またはタンパク質、脂質などの不存在でもあり得る。マーカーは、ポリペプチドの存在および不存在の独特な特徴ならびに他の形態的特徴の一団の組み合わせであり得る。
本明細書で使用される細胞の単離された集団に関する「単離された集団」という用語は、混合したまたは不均一な細胞の集団から取り出され、分離された細胞の集団を指す。いくつかの実施形態において、単離された集団は、細胞がそこから単離または富化された不均一な集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。
特定の細胞集団に関して、「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。表現し直すと、胚体内胚葉細胞の集団に関する「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語は、約２０％未満、より好ましくは約１５％、約１０％、約８％、約７％未満、最も好ましくは約５％、約４％、約３％、約２％、約１％未満、または１％未満の、本明細書の用語によって定義される胚体内胚葉細胞やそれらの子孫ではない細胞を含有する細胞の集団を指す。いくつかの実施形態において、本開示は、胚体内胚葉細胞の集団を拡大する方法であって、胚体内胚葉細胞の拡大された集団が胚体内胚葉細胞の実質的に純粋な集団である、方法を包含する。同様に、多能性幹細胞の「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」集団に関して、約２０％未満、より好ましくは約１５％、約１０％、約８％、約７％未満、最も好ましくは約５％、約４％、約３％、約２％、約１％未満を含有する細胞の集団を指す。
「造血系統細胞」は、本明細書中で使用される場合、ＰＳＣおよび／またはその子孫からインビトロで分化した細胞を指し、以下のうちの１つまたは複数が含まれ得る：血管芽細胞、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）、造血幹細胞、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、赤血球系／巨核球性前駆細胞、赤血球、巨核球、血小板、およびリンパ系系統細胞。用語「リンパ系系統細胞」には、以下のうちの１つまたは複数が含まれる：リンパ系前駆細胞、リンパ球（Ｔリンパ球など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄系前駆細胞、顆粒球単球前駆細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞。
「血液生成内皮細胞」は、造血能を獲得しており、多系統の造血幹細胞および前駆細胞を生じることができるＰＳＣからインビトロで分化した細胞を指す。ＨＥＣのヒトマーカーには、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、およびＣＤ１８４が含まれる。
「造血前駆細胞」は、有糸分裂を維持しており、さらなる前駆細胞もしくは前駆体細胞（precursor cell）を産生することができか、最終の運命の造血細胞系統に分化するこ
とができる細胞を指す。ＨＰＣのヒトマーカーには、以下が含まれる：ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ１３３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４１、およびＣＤ４５、ここで、ＣＤ４１＋は巨核球前駆体（megakaryocyte progenitor）を示し、ＣＤ２３５ａ＋は赤血球前
駆体を示し、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋は初期リンパ系／骨髄系系統前駆体を示し、ＣＤ５６＋はＮＫ系統前駆体を示し、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋は造血幹細胞を示す。
「処置」または「処置すること」という用語は、以下を含む目的での物質の投与を意味する：（ｉ）疾患もしくは状態を予防する、すなわち、疾患もしくは状態の臨床症状を発症させない；（ｉｉ）疾患もしくは状態を阻害する、すなわち、臨床症状の発症を阻止する；および／または（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を緩和する、すなわち、臨床症状の退行を引き起こす。
本明細書中で使用される場合、用語「がん」は、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、説明している。がんの例には、黒色腫、癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。がんのさらなる具体例には、扁平上皮がん（例えば、上皮扁平上皮がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、および肺の扁平上皮癌が含まれる）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がんまたは胃がん（gastric or stomach cancer）（消化管がんが含まれる）、膵臓がん、膠芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーム、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮癌、唾液癌、腎臓がんまたは腎がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部がんが含まれる。
本明細書中で使用される用語「疾患抗原」は、高分子（疾患に関連する全てのタンパク質またはペプチドが含まれる）を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、免疫応答（例えば、ある特定の免疫細胞の活性化および／または抗体の生成に関与する）を誘発することができる分子である。また、Ｔ細胞受容体は、抗原（ペプチドまたはペプチド断片がＭＨＣ分子と複合体を形成している抗原であるとしても）を認識した。任意の高分子（ほとんど全てのタンパク質またはペプチドが含まれる）は抗原であり得る。また、抗原は、ゲノムＤＮＡまたは組換えＤＮＡに由来し得る。例えば、免疫応答を誘発することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、「抗原」をコードする。実施形態において、抗原は遺伝子の全長ヌクレオチド配列によって専らコードされる必要はなく、抗原は遺伝子にコードされる必要もまったくない。実施形態において、抗原は、合成することができるか、生物試料（例えば、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的構成要素を有する流体）に由来し得る。本明細書中で使用される場合、「腫瘍抗原」、または互換的に「がん抗原」には、がん（例えば、免疫応答を誘発することができるがん細胞または腫瘍微小環境）上に存在するか関連する任意の分子が含まれる（腫瘍関連抗原が含まれる）。
「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、宿主内で免疫応答を誘発する腫瘍細胞内で産生される抗原性物質である。腫瘍抗原は、診断試験を用いた腫瘍細胞の同定で有用な腫瘍マーカーであり、がん療法用の有力な候補である。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、原発性または転移性の黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、および腺癌（乳がん、前立腺がん、卵巣がん、および膵臓がんなど）が含まれるが、これらに限定されないがんに由来し得る。ＴＡＡは、患者特異的であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、ｐ５３、Ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、α－アクチニン－４、チロシナーゼ、ＴＲＰｌ／ｇｐ７５、ＴＲＰ２、ｇｐｌＯＯ、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ １、ガングリオシド、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２、ＷＴ１、ＥｐｈＡ３、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、テロメラーゼ、サバイビン、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。
本開示の様々な態様が、以下でさらに詳述されている。追加の定義は、本明細書全体に記載されている。
多能性幹細胞
様々な実施形態において、造血細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞（ｈｐＳＣ）、核移植由来幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含むがこれらに限定されないヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から産生され得る。このようなｈＰＳＣを取得する方法は、当技術分野において周知である。
多能性幹細胞は、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植されたときに奇形腫を誘発することができる；（ｂ）３つの胚葉すべての細胞型（例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞型）に分化することができる；（ｃ）胚性幹細胞の１またはそれを超えるマーカー（例えば、ＯＣＴ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３表面抗原、ＳＳＥＡ－４表面抗原、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１など）を発現する幹細胞として機能的に定義される。特定の実施形態において、多能性幹細胞は、ＯＣＴ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０およびＴＲＡ－１－８１からなる群から選択される１またはそれを超えるマーカーを発現する。例示的な多能性幹細胞は、例えば、当技術分野で知られている方法を使用して生成することができる。例示的な多能性幹細胞には、胚盤胞期の胚のＩＣＭに由来する胚性幹細胞、および（必要に応じて、胚の残りを破壊することなく）卵割期または桑実胚期の胚の１またはそれを超える割球に由来する胚性幹細胞が含まれる。このような胚性幹細胞は、受精によって、または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖および雄核発生などの無性生殖手段によって産生された胚性物質から生成することができる。さらなる例示的な多能性幹細胞には、因子の組み合わせ（本明細書では、複数の再プログラミング因子と呼ばれる）を発現することによって体細胞を再プログラミングすることによって生成される人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれる。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年または成体の体細胞を使用して生成することができる。
特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために使用することができる因子には、例えば、ＯＣＴ４（ＯＣＴ３／４と呼ばれることもある）、ＳＯＸ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４の組み合わせが含まれる。他の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために使用することができる因子には、例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８の組み合わせが含まれる。特定の実施形態において、体細胞を首尾よく再プログラムするために、少なくとも２つの再プログラミング因子が体細胞中で発現される。他の実施形態において、体細胞を首尾よく再プログラムするために、少なくとも３つの再プログラミング因子が体細胞中で発現される。他の実施形態において、体細胞を首尾よく再プログラムするために、少なくとも４つの再プログラミング因子が体細胞中で発現される。他の実施形態において、さらなる再プログラミング因子が同定され、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために、単独で、または１もしくはそれを超える公知の再プログラミング因子と組み合わせて使用される。人工多能性幹細胞は機能的に定義され、さまざまな方法（組み込みベクター、非組み込みベクター、化学的手段など）のいずれかを使用して再プログラムされた細胞が含まれる。多能性幹細胞は、寿命、効力、ホーミングを増加させるために、同種免疫応答を防止もしくは低減するために、またはこのような多能性細胞から分化した細胞中に所望の因子を送達するために、遺伝子改変またはその他の方法で改変され得る。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）は、体細胞中での複数の再プログラミング因子のタンパク質形質導入によって作製することができる。特定の実施形態において、体細胞を首尾よく再プログラムするために、少なくとも２つの再プログラミングタンパク質が体細胞中に形質導入される。他の実施形態において、体細胞を首尾よく再プログラムするために、少なくとも３つの再プログラミングタンパク質が体細胞中に形質導入される。他の実施形態において、体細胞を首尾よく再プログラムするために、少なくとも４つの再プログラミングタンパク質が体細胞中に形質導入される。
多能性幹細胞は、任意の種からのものであり得る。胚性幹細胞は、例えば、マウス、非ヒト霊長類の複数の種およびヒトで首尾よく得られており、胚性幹様細胞は、多数のさらなる種から生成されている。したがって、当業者は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（家庭および野生のイヌ）、ネコ（家庭およびライオン、トラ、チーターなどの野生のネコ）、ウサギ、ハムスター、スナネズミ、リス、モルモット、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むがこれらに限定されない任意の種から胚性幹細胞および胚由来幹細胞を生成することができる。特定の実施形態において、種は絶滅危惧種である。特定の実施形態において、種は現在絶滅した種である。
同様に、ｉＰＳ細胞は、任意の種からのものであり得る。これらのｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒト細胞を使用して首尾よく生成されている。さらに、ｉＰＳ細胞は、胚、胎児、新生児および成体の組織を使用して首尾よく生成されている。したがって、任意の種からのドナー細胞を使用して、ｉＰＳ細胞を容易に生成することができる。したがって、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジなど）、イヌ（家庭および野生のイヌ）、ネコ（家庭およびライオン、トラ、チーターなどの野生のネコ）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、アライグマ、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラなど）などを含むがこれらに限定されない任意の種からｉＰＳ細胞を生成することができる。特定の実施形態において、種は絶滅危惧種である。特定の実施形態において、種は現在絶滅した種である。
人工多能性幹細胞は、出発点として、事実上、任意の発達段階の任意の体細胞を使用して生成することができる。例えば、細胞は、胚、胎児、新生児、幼若または成体のドナーからのものであり得る。使用することができる例示的な体細胞には、皮膚試料もしくは生検によって得られた皮膚線維芽細胞、滑膜組織からの滑膜細胞、包皮細胞、頬細胞または肺線維芽細胞などの線維芽細胞が含まれる。皮膚および頬は、適切な細胞の容易に入手可能で容易に獲得可能な供給源を提供するが、事実上任意の細胞を使用することができる。特定の実施形態において、体細胞は線維芽細胞ではない。
人工多能性幹細胞は、体細胞中で１またはそれを超える再プログラミング因子の発現を発現または誘導することによって産生され得る。体細胞は、皮膚線維芽細胞、滑膜線維芽細胞もしくは肺線維芽細胞などの線維芽細胞、または非線維芽細胞の体細胞であり得る。体細胞は、（ウイルス形質導入、組み込みまたは非組み込みベクターなどを通じて）少なくとも１、２、３、４、５の再プログラミング因子の発現および／または（例えば、タンパク質形質導入ドメイン、電気穿孔、微量注入、陽イオン性両親媒性物質、含有する脂質二重層との融合、界面活性剤による透過処理などを使用して）少なくとも１、２、３、４、５の再プログラミング因子との接触を生じさせることを通じて再プログラムされ得る。再プログラミング因子は、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｃ－ＭＹＣおよびＫＬＦ４から選択され得る。再プログラミング因子の発現は、体細胞を、再プログラミング因子の発現を誘導する小さな有機分子剤などの少なくとも１つの剤と接触させることによって誘導され得る。
さらなる例示的な多能性幹細胞には、因子の組み合わせ（「複数の再プログラミング因子」）の発現を発現または誘導することによって体細胞を再プログラムすることによって生成される人工多能性幹細胞が含まれる。ｉＰＳ細胞は細胞バンクから入手され得る。ｉＰＳ細胞の作製は、分化した細胞の生産における最初のステップであり得る。ｉＰＳ細胞は、組織に適合した造血細胞を生成することを目標として、特定の患者または適合したドナーからの材料を使用して特異的に生成され得る。ｉＰＳＣは、予定されるレシピエントにおいて実質的に免疫原性ではない細胞から、例えば、自家細胞からまたは予定されるレシピエントに対して組織適合性のある細胞から産生することができる。
体細胞はまた、再プログラミング因子が（例えば、ウイルスベクター、プラスミドなどを使用して）発現され、（例えば、小さな有機分子を使用して）再プログラミング因子の発現が誘導されるコンビナトリアルアプローチを使用して再プログラミングされ得る。例えば、再プログラミング因子は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用する感染によって体細胞中で発現され得る。また、再プログラミング因子は、エピソームプラスミドなどの非組み込みベクターを使用して体細胞中で発現され得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９ Ｍａｙ ８；３２４（５９２８）：７９７－８０１を参照。再プログラミング因子が非組み込みベクターを使用して発現される場合、因子は、電気穿孔、形質移入またはベクターによる体細胞の形質転換を使用して細胞内で発現され得る。例えば、マウス細胞では、体細胞を再プログラムするには、組み込みウイルスベクターを使用した４つの因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｃ－ＭＹＣおよびＫＬＦ４）の発現で十分である。ヒト細胞では、組み込みウイルスベクターを使用した４つの因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８）の発現は、体細胞を再プログラムするのに十分である。
再プログラミング因子が細胞内で発現されたら、細胞を培養し得る。時間の経過とともに、ＥＳ特性を有する細胞が培養皿中に現れる。細胞は、例えば、ＥＳ形態に基づいて、または選択可能もしくは検出可能なマーカーの発現に基づいて選択および継代培養され得る。細胞はＥＳ細胞に似た細胞（これらは、推定ｉＰＳ細胞である）の培養物を作製するために培養され得る。
ｉＰＳ細胞の多能性を確認するために、細胞は、１またはそれを超える多能性のアッセイにおいて試験され得る。例えば、細胞は、ＥＳ細胞マーカーの発現について試験され得る。細胞は、ＳＣＩＤマウス中に移植されたときに奇形腫を生成する能力について評価され得る。細胞は、分化して３つの胚葉すべての細胞型を産生する能力について評価され得る。多能性ｉＰＳＣが得られたら、本明細書に開示される細胞型を産生するために使用され得る。
ｈＰＳＣを取得する別の方法は、単為生殖によるものである。「単為生殖」（「単為生殖的に（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）活性化された」および「単為生殖的に（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）活性化された」は、本明細書では互換的に使用される）は、精子進入の不存在下において卵母細胞の活性化が起こる過程を指し、すべての雌性起源のＤＮＡを含む卵母細胞または胚細胞、例えば、割球の活性化によって得られる、栄養外胚葉と内部細胞塊とを含む初期胚の発生を表す。関連する態様において、「単為生殖生物」とは、このような活性化によって取得される得られた細胞を指す。別の関連する態様において、「胚盤胞」は、外側の栄養膜細胞と内部細胞塊（ＩＣＭ）から構成される中空の細胞球を含む受精したまたは（ｏｆ）活性化された卵母細胞の卵割期を指す。さらに関連する態様において、「胚盤胞形成」は、卵母細胞の受精または活性化の後に、卵母細胞が外側の栄養膜細胞とＩＣＭから構成される中空の細胞球へと発達することが可能な時間（例えば、５～６日）、卵母細胞をその後培地中で培養する過程を指す。
ｈＰＳＣを取得する別の方法は、核移植によるものである。本明細書で使用される場合、「核移植」は、適切なレシピエント細胞中への、典型的には、その内在性核ＤＮＡを除去または不活化するために、移植または融合の前、同時または後に処理される同一のまたは異なる種の卵母細胞中への、ドナー細胞またはドナー細胞からのＤＮＡの融合または移植を指す。核移植のために使用されるドナー細胞には、胚性細胞および分化した細胞、例えば、体細胞および生殖細胞が含まれる。ドナー細胞は、増殖性細胞周期（Ｇ１、Ｇ２、ＳまたはＭ）または非増殖性（ＧＯまたは静止）にあり得る。好ましくは、ドナー細胞またはドナー細胞からのＤＮＡは、増殖している哺乳動物細胞培養物、例えば、線維芽細胞培養物に由来する。ドナー細胞は、必要に応じて、トランスジェニックであり得る、すなわち、１またはそれを超える遺伝的付加、置換または欠失修飾を含み得る。
ｈＰＳＣを取得するためのさらなる方法は、人工多能性幹細胞を取得するための細胞の再プログラミングによることである。Ｔａｋａｈａｓｈｉら、（Ｃｅｌｌ １３１，８６１～８７２（２００７））は、胚またはＥＳ（胚性幹）細胞を一切使用せずに分化した細胞を再プログラミングし、ＥＳ細胞と同様の多能性および成長する能力を有する人工多能性幹細胞を確立するための方法を開示している。分化した線維芽細胞に対する核再プログラミング因子には、以下の４つの遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子；Ｓｏｘファミリー遺伝子；Ｋｌｆファミリー遺伝子；およびＭｙｃファミリー遺伝子、の産物が含まれる。
細胞の多能性状態は、好ましくは、適切な条件下で細胞を培養することによって、例えば、線維芽細胞支持細胞層または別の支持細胞層または白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む培養物上で培養することによって維持される。このような培養細胞の多能性状態は、様々な方法によって、例えば、（ｉ）多能性細胞に特徴的なマーカーの発現を確認すること；（ｉｉ）多能性細胞の遺伝子型を発現する細胞を含有するキメラ動物の作製；（ｉｉｉ）インビボで異なる分化した細胞型を産生する動物、例えばＳＣＩＤマウス中への細胞の注射；（ｉｖ）インビトロでの胚様体およびその他の分化した細胞型への（例えば、支持細胞層またはＬＩＦの不存在下で培養した場合の）細胞の分化の観察、によって確認することができる。
本開示において使用される細胞の多能性状態は、様々な方法によって確認することができる。例えば、細胞は、特徴的なＥＳ細胞マーカーの存在または不存在について試験することができる。ヒトＥＳ細胞の場合、このようなマーカーの例は、ＳＳＥＡ－４、ＳＳＥＡ－３、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＯＣＴ４を含めて上で特定されており、当技術分野において公知である。
また、多能性は、細胞を適切な動物、例えば、ＳＣＩＤマウス中に注入し、分化した細胞および組織の産生を観察することによって確認することができる。多能性を確認するさらに別の方法は、対象の多能性細胞を使用してキメラ動物を作製し、導入された細胞の異なる細胞型への寄与を観察することである。
多能性を確認するさらに別の方法は、分化に有利な条件下（例えば、線維芽細胞支持細胞層の除去）で培養されたときの、胚様体および他の分化した細胞型へのＥＳ細胞の分化を観察することである。この方法は利用されており、対象の多能性細胞が組織培養において胚様体および様々な分化した細胞型を生じさせることが確認されている。
ｈＰＳＣは、造血系列細胞を誘導することが所望されるまで、通例の継代によって、多能性状態で培養して維持することができる。
造血細胞を産生するための３Ｄマトリックスおよび無担体球体培養
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、全ての造血系統の細胞を生じる。ＰＳＣから造血細胞を作製する方法は著しく発展している。しかしながら、工業的な大量製造に適切な過程は依然として利用できず、幹細胞を臨床に応用するための明らかな障壁となっている。
いくつかの実施形態において、ヒトＰＳＣをＨＥＣに変換し、さらにＨＰＣに変換し、次に、造血細胞のほとんど全ての系統（ＭＫ／血小板、ＲＢＣ、およびＮＫ細胞が含まれるが、これらに限定されない）に頑強に分化させることができる、再現性が高く拡大縮小可能な定義された３Ｄ球体分化システムを本明細書中に提供する。
以前に報告された方法と比較して、本明細書中で開示の３Ｄ球体システムは、以下の技術的局面（制限されない）における大きな利点を有する：
（１）分化の開始時にＰＳＣの球体サイズが十分に制御され、このことは、高効率かつ小さなばらつきでヒトＰＳＣを中胚葉系統に向けた相同の特異化（homogenous specification）に重要である。所望の球体サイズに均一化されると、酸素、栄養素、および分化
誘導因子／分子が球体の中心部を通過することができ、その結果、分化過程が同期化されて純粋な系統特異的集団が生成され、胚様体（ＥＢ）および他のいわゆるオルガノイド系が自発的に形成されない。本開示のシステムは、球体サイズを最適化する労力を最小にしながら異なるｈＥＳＣ株またはｉＰＳＣ株からＨＥＣ、ＨＰＣ、および造血細胞を産生するのに適切である；
（２）本開示の３Ｄ球体プラットフォームは、支持細胞、血清、未定義のマトリックス、またはキャリアを必要としないため、臨床への適用に有望なｃＧＭＰ準拠細胞の製造に適している；
（３）ＰＳＣの拡大および分化の全過程が３Ｄ浮遊培養条件下にあり、市販の任意の所望の作業体積の使い捨てのバイオリアクターに容易にスケールアップできる；
（４）ＨＰＣを、酵素的解離などのいかなる処置も用いずに、単一細胞として懸濁液に自然かつ自動的に放出させることができる。放出されたＨＰＣは高い生存率を維持するため、下流過程（必要に応じた体積減少、濾過、低温保存、および富化／枯渇など）に対する耐性が高い；
（５）他の中胚葉系統の副生成物（間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮細胞、および平滑筋細胞など）を、本開示の３Ｄ球体プラットフォームから得ることができる。
細胞培養表面を改変し、それによって細胞がそれらの表面に付着するのを防ぐことによって３Ｄ培養形成を促進する強制浮遊法；浮遊状態での細胞成長を支える懸滴法；細胞が互いに接着して３Ｄ球状体を形成することを促進する攪拌／回転系など、様々な３Ｄ球体培養手順を使用することができる。
３Ｄ球状体を生成するための１つの方法は、表面を改変することによって管の表面（vessel surface）への付着を防ぎ、細胞の強制浮遊を生じさせることである。これは細胞
間接触を促進し、続いて、多細胞球体の形成を促進する。例示的な表面改変には、ポリ－２－ヒドロキシエチルメタクリラート（ポリ－ＨＥＭＡ）およびアガロースが含まれる。
３Ｄ球状体作製の懸滴法は、トレイのウェル中にピペットで移される一定の小分量（通常は２０ｍｌ）の単一細胞懸濁液を使用する。強制浮遊と同様に、球状体の必要とされるサイズに応じて、播種懸濁液の細胞密度（例えば、５０、１００、５００細胞／ウェルなど）は、必要に応じて変更することができる。細胞を播種した後、続いて、トレイを逆さにし、細胞懸濁液の一定分量は、表面張力により一定の位置に保持される懸滴に変わる。細胞は滴の先端、液体と空気の界面に蓄積し、増殖することが可能となる。
３Ｄ球状体を作製するための攪拌ベースのアプローチは、（ｉ）スピナーフラスコバイオリアクターと、（ｉｉ）回転培養系の２つのカテゴリーに大まかに分類することができる。これらの方法の背後にある一般的な原理は、細胞懸濁液を容器の中に入れ、懸濁液を動かし続ける、すなわち、穏やかに攪拌し、または容器を回転させることである。懸濁された細胞が絶えず動いているということは、細胞が容器の壁に付着せず、代わりに細胞間相互作用を形成することを意味する。スピナーフラスコバイオリアクター（通例、「スピナー」として知られている）は、細胞懸濁液を保持するための容器と、細胞懸濁液が絶えず混合されることを確保するための攪拌要素とを含む。回転式細胞培養バイオリアクターは、スピナーフラスコバイオリアクターと同様の手段によって機能するが、細胞懸濁液を動かし続けるために攪拌バー／ロッドを使用する代わりに、培養容器自体を回転させる。
いくつかの実施形態において、スピナーフラスコをベースとした３Ｄ球体培養プロトコルが本明細書において提供される。フィーダー細胞およびマトリックスの不存在下で規定の培養培地（defined culture medium）を加えたスピナーフラスコ中において、複数のｈＰＳＣを実質的に均一な球体として連続的に培養することができる。培地は、ｈｉＰＳＣおよびｈＥＳなどのｈＰＳＣの増殖および拡大を支持するように設計された、任意の規定の、異種由来成分を含まない（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）、無血清の細胞培養培地であり得る。一例では、培地はＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）である。いくつかの実施形態において、培地は、ｍＴｅＳＲＴＭ１、ｍＴｅＳＲＴＭ２、ＴｅＳＲＴＭ－Ｅ８ＴＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはその他の幹細胞培地であり得る。培地には、Ｙ２７６３２などのＲｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）の小分子阻害剤、またはチアゾビビン、ＲＯＣＫ ＩＩ阻害剤（ＳＲ３６７７など）およびＧＳＫ４２９２８６Ａなどのその他のＲＯＣＫ阻害剤を補充することができる。この浮遊培養系を使用すると、ｈＰＳＣ培養物を連続継代し、少なくとも１０継代にわたって一貫して拡大させることができる。３Ｄ－ｈｉＰＳＣ球体に対する典型的な継代間隔は約３～６日であり得、その時点で、球体は直径約２３０～２６０μｍのサイズに成長することができる。球体のサイズは、培養物の一定分量を取り、例えば顕微鏡検査を使用して観察することによってモニターすることができる。次いで、球体は、例えば、初代および幹細胞株ならびに組織を剥離するためのタンパク質分解およびコラーゲン分解活性を有する酵素を使用して、単一の（または実質的に単一の）細胞へと解離させることができる。一例では、酵素は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ）またはＴｒｙｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）またはトリプシン／ＥＤＴＡである。その後、例えば６０～７０ＲＰＭでの連続攪拌下スピナーフラスコ中で、脱会合した細胞（disassociated cell）を再凝集させて球体を再形成することができる。少なくと
も３～５回の反復継代後に高多能性マーカーの発現（ＯＣＴ４）および正常な核型とともに均一な構造を維持しながら、球体のサイズは徐々に増加した。本明細書で使用される場合、「継代」は、単一細胞から望ましいサイズの球体に成長した細胞球体培養物を意味すると理解され、その時点で、球体は単一細胞へと脱会合し、次の継代のために再び播種される。継代は、３Ｄ－ｈｉＰＳＣ球体の場合、ｈＰＳＣの種類および培養条件に応じて、約３～６日またはそれより長い時間またはそれより短い時間を要し得る。十分な量の３Ｄ－ｈＰＳＣ球体が得られたら、以下でより詳細に説明されているように、３Ｄ－ｈＰＳＣ球体は３Ｄ球体分化を受けることができる。
いくつかの実施形態において、ｈｉＰＳＣ細胞を、ラミニン５２１またはラミニン５１１などのマトリックスを含むＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＵＳＡ）で培養することができる。コンフルエントかつ未分化のｈｉＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）またはＴｒｉｐＬＥを使用して継代し、１μＭのＹ２７６３２を補充したＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）中１ｃｍ２あたり６～８×１０４細胞の密度で低（１／２）濃度のマトリックスでコーティングした表面上に播種し、３～７日間培養することができる。ｈｉＰＳＣを、この条件で３～５回、または必要に応じた継代数で拡大することができる。ｈｉＰＳＣの未分化状態を、フローサイトメトリー分析によってＯｃｔ－４の発現レベル（９５％を超えるＯｃｔ－４陽性）を用いて定量することができる。
３Ｄ浮遊培養を開始するために、コンフルエントな未分化のｈｉＰＳＣを、ＡｃｃｕｔａｓｅまたはＴｒｉｐＬＥによって解離することができ、スピナーフラスコに、Ｙ２７６３２（約１μＭ）を補充したＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）中に、例えば、１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞を、３０ｍＬスピナーフラスコ（Ａｂｅｌ Ｂｉｏｔｔ）中にて撹拌速度５０～８０ＲＰＭで４８時間連続培養することができる。播種から４８時間後、少量の試料を取り出すことができ、形態および球体サイズを顕微鏡検査によって試験することができる。球体サイズが直径２５０～３００マイクロメートルに到達するまで、定期的に培地を新鮮にすることができる。継代のために、ｈｉＰＳＣ球体をＰＢＳ（Ｍｇ－、Ｃａ－）で洗浄し、次いで、ＡｃｃｕｔａｓｅまたはＴｒｉｐＬＥなどの酵素によって解離することができる。次いで、解離した単一のｈｉＰＳＣ細胞を、拡大または造血分化の開始のいずれかのために望ましい密度で播種することができる。
ｈＰＳＣからＨＥＣおよび造血系統を生成するために、懸濁液中の３Ｄ－ｈＰＳＣ球体を、定義された成長因子および小分子を用いた段階的様式で直接誘導することができる（図２）。いくつかの実施形態において、これは、３Ｄスピナーフラスコまたは他の３Ｄ球体培養方法で行うことができる。様々な実施形態において、連続的な３Ｄ球体培養は、いくつかの解離／再凝集工程と統合することができるが、分化を誘導するために、異なる段階で成長因子および小分子を添加することが可能である。
図２に示すように、ｈＰＳＣ（例えば、ｈｉＰＳＣ）を、Ｙ２７６３２（約１μＭ）を補充したＨＥＣ誘導培地Ｍ１（例えば、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）、ｍＴｅＳＲ（商標）１、ｍＴｅＳＲ（商標）２、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、または３Ｄ浮遊培養に適切な他の培養培地）中に、単一細胞として所望の密度（例えば、細胞サイズに応じて、０．５～１．５×１０６細胞／ｍｌ）で播種し、所望の球体サイズになるまで約６～２４時間または約１２時間培養することができる。典型的な球体サイズは、播種密度に応じて直径が６０～１５０マイクロメートル、約７０～１２０マイクロメートル、または約８０～１００マイクロメートルであり得る。理論に拘束されることを望まないが、幾何的配置（geometry）、細胞間接触、ならびに球体の外側に勾配を形成することができる栄養素および成長因子への到達性に起因して、球体サイズがＨＥＣ分化に影響を及ぼし得ると考えられる。いくつかの実施形態において、ＨＥＣ分化の開始前に、球体サイズを、例えば、顕微鏡法を用いて、直径が約６０～１１０マイクロメートル、約７０～１００マイクロメートル、または約８０～９０マイクロメートル範囲にあることをモニタリングすることができる。
ＨＥＣ分化を開始させるために、Ｍ１を除去し、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを約１０～１００、約２５～５０、または約３０～４０ｎｇ／ｍＬの濃度で補充したＨＥＣ誘導培地Ｍ２（例えば、成長因子なしのＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（登録商標）、ｍＴｅＳＲ（商標）１、ｍＴｅＳＲ（商標）２、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、または３Ｄ浮遊培養における中胚葉分化の促進に適切な他の培養培地）で置き換えることができる。Ｍ２中のＨｉＰＳＣ球体を、低酸素条件（約５％酸素）下で約１～１０日間または３～８日間または４日間培養し、その後に約２０％の通常の酸素濃度でさらに約１～５日間または約２日間培養することができる。理論に拘束されることを望まないが、低酸素条件は初期胚発生条件を模倣することができ、分化を誘導することができると考えられる。
細胞が低酸素条件でいくらかの期間（例えば、１～５日間）経過した後に、小分子ＣＨＩＲ９９０２１を、約１～１０、約２～５、または約３μＭで添加することができる。小分子ＳＢ４３１５４２を、ＣＨＩＲ９９０２１と共に、またはその後に（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１添加の０～３日後に）、約１～１０、約２～５、または約３μＭで添加することができる。図２に示した例では、ＣＨＩＲ９９０２１を３日目および４日目に添加し、ＳＢ４３１５４２を４日目および５日目に添加する。その後に、ＣＨＩＲ９９０２１およびＳＢ４３１５４２を、培養培地から除去することができる。
ＨＥＣ分化の後期（例えば、６日目またはそれ以降）の間に、細胞球体を、酵素での処置（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、ＴｒｙｐＬＥ、またはトリプシン／ＥＤＴＡにて３７℃で１５～３０分間）によって実質的に単一細胞の懸濁液に解離することができる。ＨＥＣ特異的表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４（ＶＥ－カドヘリン）、ＣＤ３４、およびＣＤ４３の発現を、フローサイトメトリーを使用して分析することができる。ＨＥＣの実質的に単一の細胞を、インビボ造血ニッチを模倣した足場に播種することができる。ニッチは、バイオマテリアル（マトリックス、足場、および細胞の運命を制御する重要な調節シグナルを示す培養基質など）の存在下で細胞を培養することによって模倣することができる。バイオマテリアルは、天然、半合成、および合成のバイオマテリアル、ならびに／またはその混合物であり得る。足場に適切な合成材料には、多孔質固体、ナノ繊維、およびヒドロゲル（キトサン、ポリ乳酸、ポリスチレン、ペプチド（自己集合性ペプチドが含まれる）から選択されるポリマー、ポリエチレングリコールホスファート、ポリエチレングリコールフマラート、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリラート、ポリ酢酸セルロースから構成されるヒドロゲル、および／またはそのコポリマーが含まれる（例えば、Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１（４）：３８１－３８７；Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ９５：４４２６－４４３８；Ｌｉｔｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０８，１７８７－１７９６；Ｃａｒｌｅｔｔｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；６９５：１７－３９；Ｇｅｃｋｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１０ Ａｐｒｉｌ；５（３）：４６９－４８４（これら全てのその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。播種した時点で、細胞を、足場内にて適切な培地および適切な成長因子の存在下で培養して、所望のリンパ系系統細胞（リンパ球（Ｔリンパ球など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄性共通前駆細胞、顆粒球単球共通前駆細胞、単球、マクロファージ、および／または樹状細胞など）に分化させることができる。当業者は、所望のリンパ系系統細胞に応じて適切な培地および適切な成長因子が選択されることを認識するはずである。
あるいは、ＨＥＣ含有球体（酵素的解離を行わない）を、造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化して拡大するように、造血拘束および拡大培地Ｍ３（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）（Ｉｒｖｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）造血前駆体拡大培地ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ）、および３Ｄ浮遊培養における造血幹細胞拡大に適切な他の培養系などの基本培地）に移行することができる。Ｍ３に、ＴＰＯ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－３（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＲ１（０．７５μＭ）、ＯＳＭ（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）のうちの１つまたは複数を、拡大の第１期の約３～１０日間、約４～８日間、または約５日間に補充することができる。ＨＰＣを球体から自動的に（球体の酵素的解離を使用せずに）放出させることができる。
造血分化／拡大培地Ｍ４（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）（Ｉｒｖｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）造血前駆体拡大培地ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ）、ならびに３Ｄ浮遊培養における巨核球性、赤血球系、骨髄系、およびリンパ系の系統の種々の造血細胞の系統特異的な拡大および成熟に適切な他の培養系などの基本培地）中でさらに分化および拡大することができる。Ｍ４に、ＴＰＯ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－３（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＲ１（０．７５μＭ）、ＯＳＭ（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ）のうちの１つまたは複数を、かかる第２期の拡大（４０日目までまたはそれより長期に）に補充することができる。当業者は、異なる培地および成長因子を使用して、異なる細胞型（赤血球系／巨核球性共通前駆細胞、赤血球、巨核球、血小板、リンパ系共通前駆細胞、リンパ系系統細胞、リンパ球（Ｔリンパ球など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄性共通前駆細胞、顆粒球単球共通前駆細胞、単球、マクロファージ、および／または樹状細胞、または前記任意の２またはそれより多くの混合物など）への分化を促進することができることを理解するであろう。
分化中に培地を毎日交換することができる。第１の培地から第２の培地に切り替える場合、第２の培地への徐々の順化は、第１の培地および第２の培地の希釈系列を通じて達成することができる。例えば、１００％の第１の培地から１００％の第２の培地への徐々の順化には、第１の培地および第２の培地を７５％：２５％、５０％：５０％、および２５％：７５％で順次中間培養することが含まれ得、細胞は各培地組成中で２～６日を経る。他の希釈系列を使用することもできる。
様々な実施形態において、種々の目的のための細胞治療のために使用することができるｈＰＳＣから望ましい細胞、具体的にはＨＥＣおよび造血細胞を生成するための新しい、効率的な、確定された３Ｄ球体プラットフォームを本明細書中に提供する。
造血細胞の使用
重要なことに、本明細書中に実証されるように、本開示の３Ｄ ＰＳＣ分化システムを用いて生成されたＨＰＣは、複能性ＨＳＣの特徴に類似している複数のＣＦＵ型を頑強に生じることができる全ての血液系統の複数の細胞型（具体的にはＣＤ３４＋集団）を形成する能力を保有する。さらに、特定の条件下での培養後、ＭＫおよび赤血球系細胞の共通の前駆体を示し得るＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４１＋二重陽性ＨＰＣは、ＭＫ／血小板および赤血球系細胞をそれぞれ優先的に生成した。ヒトＰＳＣ由来ＭＫ／血小板およびＲＢＣを、輸血治療のために使用することができるだけでなく、治療タンパク質の担体としての機能も果たすことができる。この目的を達成するために、マスターＰＳＣバンクを、創傷部位または腫瘍部位などでの活性化の際に治療タンパク質を放出することができるＭＫ／血小板製造のための治療タンパク質を発現するように操作することができる。血小板α－顆粒シグナル配列が特徴づけられているので、治療組換え融合タンパク質をコードする遺伝子をＰＳＣに導入することができる。ＭＫ細胞への分化後、これらのタンパク質は、α－顆粒にパッケージングされ、所望の部位で放出されて治療目的を達成する。これらのタンパク質には、傷害部位への局所送達による血友病の処置のための第ＶＩＩＩ因子；糖尿病性潰瘍および熱傷などの処置におけるフィブリン誘導性創傷治癒応答の促進のためのエリスロポエチン；およびインスリン様成長因子１、塩基性線維芽細胞成長因子、抗血管新生／抗腫瘍タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。同様に、ユニバーサルＲｈＤ陰性Ｏ型ＲＢＣ製造のための操作されたマスターＰＳＣバンクを使用して、治療タンパク質（例えば、抗原特異的免疫寛容の誘導に関与するタンパク質）を発現するユニバーサルＲＢＣを生成することができる。ＲＢＣの表面または細胞の内部に特異的抗原を発現するユニバーサルＲＢＣを、過感受性個体に移植することができる。ＲＢＣが循環し、老化し、除去されるとき、免疫系の自己免疫を防止する天然の機序を使用して特異的抗原がプロセシングされる。
リンパ系系統潜在力（lymphoid lineage potential）の獲得は、胚内の卵黄嚢における一次造血と対照的な大動脈・性腺・中腎（ＡＧＭ）領域内の二次造血の重要な指標と長きにわたって見なされてきた（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２０１８）。本明細書中の実施例に示すように、本開示の３Ｄ分化ＰＳＣ球体から得たＨＰＣは、ＣＤ５６＋ｈｉｇｈＮＫ細胞を生成し、これは、本開示の定義されたシステムが二次造血の発生を支持することを示唆している。いくつかの以前の報告ではリンパ系細胞の生成が示されているが、これらの研究のほとんどが支持細胞および／または血清を使用しており（ｄｅ Ｐｏｏｔｅｒ ａｎｄ Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ ２００７；Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｄｉｔａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）、臨床へ適用される可能性が制限される。
したがって、本開示の別の有意な技術的利点は、血清および支持細胞を含まない３Ｄ条件での純粋で真正のＮＫ細胞の生成である。これにより、がん免疫療法のための腫瘍特異的抗原を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を保有し得るＰＳＣ（例えば、ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ）から臨床的に関連する用量のＮＫ細胞の製造が実現可能になる。操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞を利用する養子細胞治療は、Ｂ細胞悪性疾患患者の処置において臨床的に成功していることが示されている（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０）。しかしながら、同種Ｔ細胞の注入は重篤な移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを負い得るので、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、自家Ｔ細胞の製造過程および輸血に起因する重篤な制限がある（Ｍｅｈｔａ ａｎｄ Ｒｅｚｖａｎｉ ２０１８）。Ｔ細胞およびＢ細胞と異なり、ＮＫ細胞は、再構成された抗原特異的受容体を発現しない。ＮＫ細胞受容体は生殖系列にコードされており、標的細胞上のその特異的なリガンドとの結合の際に活性化機能または阻害機能を有する。ＫＩＲは最も研究されているＮＫ細胞受容体であり、ＨＬＡクラスＩ分子を認識する。ＮＫＧ２Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄ、－Ｅ、および－Ｆなどの他の受容体は、非古典的ＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ｅ）を認識する。健康な細胞は、阻害ＮＫ受容体を介したその表面上の「自己」ＨＬＡ分子の認識によってＮＫ細胞から保護されている（Ｌａｎｉｅｒ ２００１；Ｙｏｋｏｙａｍａ １９９８）。腫瘍細胞またはウイルス感染細胞は、Ｔ細胞による攻撃を回避するための偽装としてそのＨＬＡ分子を下方調節するか喪失することが多い（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｇａｓｔａｕｔ，ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ １９９９；Ａｌｇａｒｒａ ｅｔ ａｌ．２００４）。初期の臨床調査において、自家ＮＫ細胞養子療法ががん処置に無効であることが証明された（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．２００３；ｄｅＭａｇａｌｈａｅｓ－Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０００）。しかしながら、ＨＳＣ移植（Ｒｕｇｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２００２）およびがん治療（Ｂａｃｈａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１４）において同種反応性ＮＫ細胞が臨床上の利点を有することは、期待できる結果であることが実証された。したがって、同種異系細胞治療のためには、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－Ｔより優れた選択肢であると考えられる。
しかしながら、ＣＡＲ－ＮＫは、ＮＫ細胞の供給源が限定されていることによりその進歩が妨げられている。ＮＫ細胞は、末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）、および臍帯血（ＣＢ）から回収することができる。この過程は複雑であり、ドナーに望ましくない健康上のリスクを生じ得る（Ｗｉｎｔｅｒｓ ２００６；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．２０１０）。採取されたＮＫ細胞は、拡大能力が制限されており、少量のＴ細胞またはＢ細胞の汚染によってＧＶＨＤを生じ得る。ＣＢから採取されたＮＫ細胞が進行中の臨床試験で使用されているが、これらのＮＫ細胞はＧＭＰ等級の人工抗原提示細胞との共培養によって有意に拡大されなければならない（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．２０１３）。細胞株ＮＫ－９２がいくつかのＣＡＲ－ＮＫ臨床試験で使用されている（中国）。ＮＫ－９２細胞株は、ＮＫ細胞リンパ腫患者に由来していた。これらの細胞は、ＥＢＶ陽性であり、リンパ腫で見いだされる複数の細胞遺伝学的異常を保有し得る（ＭａｃＬｅｏｄ ｅｔ ａｌ．２００２）。したがって、ＮＫ－９２由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞は患者への注入前に照射されなければならず、これらの細胞のインビボでの残存性および機能に悪影響を及ぼす（Ｓｃｈｏｎｆｅｌｄ
ｅｔ ａｌ．２０１５）。ヒトＰＳＣ（ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの両方）は、ＮＫ細胞を生成することができることが証明されている（Ｋｎｏｒｒ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７）。初期に報告された研究はスピンＥＢ生成に依存しており（（Ｋｎｏｒｒ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）、これはスケールアップ過程には適さない。ＰＳＣ培養（Ｋｎｏｒｒ ｅｔ ａｌ．２０１３）およびＮＫ分化（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７）のために異種起源の支持細胞が使用されていた。本発明者らの新規に開発した３Ｄ ＮＫ製造過程は、３Ｄ球体分化を臓器構造の微小環境を模倣した３Ｄ足場と組み合わせており、以前に報告された過程に勝る以下の有意な利点を有する：（１）拡大縮小性に制限がないこと；（２）本発明者らのＮＫ特異的培養培地は、定義されており、血清を含まず、支持細胞を含まない；（３）ＮＫ集団は、Ｔ細胞およびＢ細胞に汚染されておらず、純粋であること。また、本発明者らは、ＨＬＡクラスＩ分子（Ａ、Ｂ、Ｃ）を発現しないが、非古典的クラスＩ分子ＨＬＡ－Ｅを発現するｈｉＰＳＣ株を樹立した。マスターＰＳＣバンクを樹立するためにＮＫに適合したＣＡＲをかかるｈｉＰＳＣ株に操作することにより、本発明者らは、真に既製の治療製品のためのユニバーサルＣＡＲ－ＮＫ細胞を生成することができる。
したがって、再生可能なｈＰＳＣからＨＥＣおよびＨＰＣを生成するための頑強かつ定義された３Ｄ球体プラットフォームに加えて、これらに由来する系統特異的造血細胞を本明細書中に提供する。このシステムは、大規模生産の取り組みに適しているだけでなく、支持細胞、動物の血清、およびマトリックスへの依存を排除するので、ｃＧＭＰに準拠した細胞製造プロトコルに適しており、この過程を臨床移行により適したものとする。単一のバイオリアクターまたは統合された多段階のバイオリアクターのいずれかを使用して、任意の造血細胞を要求に応じて製造することができる。当業者が認識するように、かかる技術的利点の応用は無制限である。
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供した細胞組成物を、細胞治療で使用することができる。細胞治療を、例えば、養子細胞療法、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療、操作ＴＣＲ
Ｔ細胞治療、腫瘍浸潤性リンパ球治療、抗原訓練Ｔ細胞治療、または富化抗原特異的Ｔ細胞治療から選択することができる。
いくつかの実施形態において、細胞組成物を、薬学的に許与され得る量および薬学的に許容され得る組成で製剤化することができる。用語「薬学的に許容され得る」は、有効成分（例えば、ナノ粒子の生物学的に活性なタンパク質）の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性材料を意味する。かかる組成物は、いくつかの実施形態において、塩、緩衝剤、防腐剤、および必要に応じた他の治療剤を含み得る。また、医薬組成物は、いくつかの実施形態において、適切な防腐剤を含み得る。医薬組成物は、いくつかの実施形態において、単位剤形であってよく、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。いくつかの実施形態において、非経口投与に適切な医薬組成物は、いくつかの実施形態においてレシピエント被験体の血液と等張のナノ粒子の無菌の水性または非水性の調製物を含む。この調製物は、公知の方法にしたがって製剤化され得る。無菌注射調製物はまた、非毒性の非経口で許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌した注射用の液剤または懸濁剤であってよい。
本明細書中に開示の組成物は、多数の治療用途（例えば、がん、自己免疫疾患、および感染症の処置が含まれる）がある。本明細書中に記載の方法は、本明細書中に記載の細胞を使用することによって被験体におけるがんを処置することを含む。被験体におけるがんの症状を軽減または改善する方法、ならびにがんの成長を阻害し、そして／または１またはそれを超えるがん細胞を死滅させる方法も提供する。実施形態では、本明細書中に記載の方法は、本明細書中に記載の医薬組成物を投与した被験体における腫瘍のサイズを減少させ、そして／またはがん細胞数を減少させる。
実施形態では、がんは血液学的がんである。実施形態では、血液学的がんは、白血病またはリンパ腫である。本明細書中で使用される場合、「血液学的がん」は、造血組織またはリンパ系組織の腫瘍（例えば、血液、骨髄、またはリンパ節に影響を及ぼす腫瘍）を指す。例示的な血液悪性疾患には、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、毛様細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、または大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、または前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、ワンデンシュトレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性新生物、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、または骨髄異形成／骨髄増殖性新生物が含まれるが、これらに限定されない。
実施形態では、がんは固形がんである。例示的な固形がんには、卵巣がん、直腸がん、胃がん、睾丸がん、肛門部のがん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、骨のがん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、子宮頸癌、扁平上皮がん、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、膣癌、軟部組織肉腫、尿道がん、外陰癌、陰茎がん、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂癌、脊髄軸の腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、前記がんの転移性病変、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
実施形態では、細胞を、疾患が処置または防止されるのに適切な様式で投与する。投与の量および頻度は、患者の健康状態、患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定される。適切な投与量を、臨床試験によって決定してよい。例えば、「有効量」または「治療量」を示す場合、投与すべき医薬組成物の正確な量を、腫瘍サイズ、感染または転移の範囲、被験体の年齢、体重、および健康状態の個別の相違を考慮して医師が決定することができる。実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物を、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重）（前記範囲内の全ての整数値が含まれる））の投与量で投与することができる。実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物を、これらの投与量で複数回投与することができる。実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物を、免疫療法に記載の注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８を参照のこと）。
実施形態では、細胞を、被験体に非経口投与する。実施形態では、細胞を、被験体に、静脈内、皮下、腫瘍内、結節内、筋肉内、皮内、または腹腔内に投与する。実施形態では、細胞を、腫瘍またはリンパ節内に直接投与する（例えば、注射する）。実施形態では、細胞を、注入（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ
Ｍｅｄ．３１９：１６７６、１９８８に記載）または静注として投与する。実施形態では、細胞を、注射デポー製剤として投与する。
実施形態では、被験体は哺乳動物である。実施形態では、被験体は、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、またはマウスである。実施形態では、被験体はヒトである。実施形態では、被験体は、小児被験体（例えば、１８歳未満、例えば、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳未満、またはそれ未満）である。実施形態では、被験体は成人（例えば、少なくとも１８歳、例えば、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、または８０～９０歳）である。
実施例
実施例１：全ての造血系統に適切な３Ｄ球体分化
ｈｉＰＳＣの２Ｄ培養から３Ｄ浮遊培養への移行
図１Ａは、本開示で使用した典型的な小型バイオリアクターを示す。また、作業体積が２５０ｍｌ～３Ｌのスピナーフラスコを、大規模実験のために使用することができる。２Ｄ ｈｉＰＳＣ培養の３Ｄ浮遊培養への首尾の良い移行を、図１Ｂおよび１Ｃに示すように丸形球体の形態のｈｉＰＳＣの形成およびその後の成長によって特徴づけた。３Ｄ移行したｈｉＰＳＣの多能性をモニタリングするために、多能性マーカーＯｃｔ－４の発現を、フローサイトメトリーによって測定した。高品質の未分化多能性幹細胞は、Ｏｃｔ－４陽性である（９５％以上、図１Ｄ）。また、３Ｄ球体下で培養したｈｉＰＳＣは正常な核型を有する（図１Ｅ）。
ｈｉＰＳＣの血液生成内皮系統および造血系統への段階的誘導
ｈｉＰＳＣをＨＥＣおよびＨＰＣに誘導するためのストラテジーを、図２に示す。高収量で純粋なＨＥＣ集団を得るために、Ｏｃｔ－４発現について９５％より多くが陽性の３Ｄ移行したｈｉＰＳＣのみを使用することが非常に重要である（図１Ｄおよび３Ｂに示す）。個別の細胞株について、ＨＥＣ誘導の開示時に最適な球体サイズを最初に決定することが重要である。図３Ａに示すように、１つのｈｉＰＳＣ株由来の代表的な結果から、８０～８５マイクロメートル（直径）の球体サイズから開始すると、１００マイクロメートルを超えるサイズの球体から開始するよりもＨＥＣの生成効率が高いことが実証された。したがって、この研究で示したほとんどの分化は、８０～８５マイクロメートルの球体サイズから開始した。
確実にＨＥＣ集団が造血系統に分化するように、ＨＥＣの生成効率を、主に、典型的なＨＥＣマーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、およびＣＤ１８４、ならびに造血マーカーＣＤ４３の発現によってモニタリングした。図３Ｂに示すように、分化誘導前（０日目）の球体細胞はＣＤ３１およびＣＤ３４を発現しなかったのに対して、その９５％はＯｃｔ－４陽性であった。早くも３日目には、少数ではあるが区別可能なＣＤ３１＋集団（３１．２％）が出現し、その後にＣＤ３４を発現した（１５．７％）。ＣＤ４３発現（２％）は、この時点では非常に低かった。この段階でのＯｃｔ－４発現は、既に２．９％まで有意に低下し、多能性の喪失が確認された。ＨＥＣ集団は、通常、球体分化６日目にそのピークレベルに到達した。図３Ｂに示すように、懸濁球体中の全集団のうちの６６％が、ＣＤ３１およびＣＤ１４４（ＶＥ－カドヘリン）の両方に陽性であり、これらの両方はＨＥＣのマーカーである。さらに、図３Ｂおよび３Ｃに示すように、ＣＤ３１＋集団のうちの１５．２％がＣＤ４３＋であり、ＨＥＣ集団の造血系統への強力な早期の拘束を示していた。また、有意なＣＤ３４＋集団（２１．４％）がＣＤ３１＋集団から出現した。また、ＨＥＣ画分はＣＤ２３５ａ（２３．５％）を発現したが、ＣＤ４５の発現はほとんど検出されず、造血前駆体の赤血球系系統への初期の拘束を示していた（Ｐａｌｉｓ ２０１６）。また、ＣＤ３１＋ＨＥＣの大部分はＣＤ１８４＋であった；しかしながら、いくつかのＣＤ３１－細胞はＣＤ１８４＋でもあった。興味深いことに、ＣＤ４３＋集団のうちで、造血系統の拘束にはＣＤ３４発現の減少を伴うようであった。これらの結果から、本発明者らの分化過程がその後の造血分化に理想的な高品質のＨＥＣを高効率で生成することが明確に確認される。
３Ｄ系統特異的造血分化の形態の変化
３Ｄ浮遊培養過程の主な技術的利点の１つは、長期過程の異なる段階において試料採取および形態の変化のモニタリングを行うことができることである。３Ｄ懸濁条件下での分化過程全体にわたって、有意な形態の変化が認められた。未分化のｈｉＰＳＣ球体は、均一な丸形で、サイズの変動範囲は小さかった（図４Ａ）。早くも分化３日目には、サイズの変動が有意に増加し、ほとんどの球体の内側に空洞空間が形成された（図４Ｂ）。６日目の球体（図４Ｃ）は、より大きく成長した（サイズおよび内部空洞の両方）。６日目から９日目までに、培養培地中に大量の懸濁細胞が存在し、球体からのＨＰＣ放出の開始を示していた（図４Ｄ）。図４Ｅおよび４Ｆに示すように、９日目から１５日目までおよびそれ以降もさらにより大量のＨＰＣを放出した。図４Ｇ（より高倍率の画像）は、典型的な非付着性の円形のＨＰＣ形態を示す。
この懸濁液中の大量のＨＰＣの自然な自己放出が大規模製造中の採取過程の開発に極めて有利であり、この放出を定期的な培地の補充によって達成することができることを強調することが重要である。懸濁液中のＨＰＣを、工業規模の生産のために考案された遠心分離またはタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）などの体積減少法によって容易に採取することができる（Ｃｕｎｈａ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
異なる分化段階での３Ｄ培養球体の組織学的検査およびＨＥＣマーカーの免疫蛍光分析
異なる造血分化段階での細胞球体の内側の進行性の形態変化を可視化するために、球体の切片を、ヘマトキシリン（図５中の上の横列）またはＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４３の抗体（図５中の下の３つの横列）のいずれかで染色した。未分化ｈｉＰＳＣを有する０日目に、細胞球体は、より小型で、典型的な多能性幹細胞の大きな核と細胞質との比を反映する最も顕著な核染色パターンを示した。０日目にはＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４３の発現は認められなかった。６日目のＨＥＣ集団のピークにおいて、全ての球体において上皮形態（０日目）から間葉系形態への明確な移行が認められた。全ての球体の内側に強力なＣＤ３１＋集団が存在し、これはｈｉＰＳＣからＨＥＣへの高効率の移行を示す。これは、ＣＤ３４＋細胞および少数ではあるが区別可能な数のＣＤ４３＋細胞の存在によってさらに確認される。９日目の球体は、より大きなサイズに成長し、内側に空洞が形成された。全ての集団においてＣＤ３１およびＣＤ３４の発現は高いままであった。球体の内側のＣＤ４３＋細胞の百分率が比較的低いことから、ほとんどのＣＤ４３＋細胞が培地内に放出されたことが示された（図５）。１４日目に、より小型の細胞のコアと共に、ほとんどの球体中に遥かに大きな空洞が存在し、ＣＤ３１＋およびＣＤ３４＋の両方であった。ＣＤ４３＋ＨＰＣは、球体の内側にも存在していた。分化２３日目に平均的な球体は巨大な空洞を伴ってより一層大きく成長した。この段階においてかかる球体の細胞コアの内部に非常に強力なＣＤ３４発現が残存し、頑強な長期造血分化を示していた。
異なる分化段階での系統特異的マーカーの動的変化
最適な長期造血分化効率を達成するための最良の条件を定義するために、３Ｄ球体の造血分化を、多数の異なる培地条件下で試験した（データ示さず）。試験した全ての条件のうちで、本発明者らは、この研究に適切な２つの最良の条件（条件Ａおよび条件Ｂと称する）を特定した。
条件ＡおよびＢの実験についてのｈｉＰＳＣの開始数は、２０×１０６細胞で同一であった。分化０日目から１９日目まで、細胞球体中の系統特異的マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ２３５ａ、およびＣＤ４５の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。図６Ａ～６Ｅに示すように、実験条件ＡとＢとの間で、５つ全てのマーカーにおいて発現プロフィールの有意な変動が認められた。条件Ａでは、球体中のＣＤ３１＋細胞、ＣＤ３４＋細胞、およびＣＤ４３＋細胞の百分率は、条件Ｂより有意に高く、ＨＥＣ生成効率を高めるには条件Ａが最適であることが確認された（図６Ａ～６Ｃ）。条件Ｂの球体細胞中のＣＤ３４＋およびＣＤ３１＋の百分率は、１９日目のより後期の分化段階で条件Ａに相当した（図６Ｂ）。前駆細胞上のＣＤ２３５ａの発現により、赤血球系系統潜在力が特定される。ＣＤ２３５ａ＋球体細胞の百分率は、条件Ａより有意に高く、８日目でピークレベルに到達した。対照的に、球体細胞中のＣＤ２３５ａの発現は、条件Ｂにおいて分化５日目に完全に抑制された。以前の報告では、初期の造血中に、Ｗｎｔシグナル伝達経路の操作によってＨＥＣ中のＣＤ２３５ａ発現が抑制されると二次造血が促進されるが一次造血は抑制されることが示されていた（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）。条件ＡおよびＢの両方において球体中のＣＤ４５＋細胞の百分率は１２日目まで低く、１２日目から１９日目まで有意に増加した（図６Ｅ）。まとめると、本発明者らは、球体中に高い百分率でＨＥＣを生成するには条件Ａが最適な条件であると結論づける。図６Ａ～６Ｅに示すように、条件Ａにおいて球体から早期に採取したＨＰＣは、赤血球および巨核球の生成に適切であった。あるいは、条件Ｂにおける一次造血の抑制は、球体中の初期造血を二次造血表現型に駆動し得る。表１Ａおよび１Ｂ中に示したデータと併せて、条件Ｂにおける球体は、特により後期の分化段階で、ＣＤ３４＋細胞の遥かに高い総細胞数および百分率を示し、より多くのＨＰＣを放出した。これらの所見は、条件ＢがＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋造血幹細胞（ＨＳＣ）などの二次造血細胞の産生のためのより良い選択肢であることを強く示す。結論として、本発明者らは、２つの３Ｄ球体造血分化条件を同定し、製造目的の相違によってこれらの条件を選択することができる。
Figure 2024026891000001
Figure 2024026891000002
大量のＨＰＣの放出および採取
図４Ａ～４Ｉに示すように、３Ｄ球体造血分化培養の８日目～９日目に相当数のＨＰＣが放出され始めた。ＨＰＣの放出数は、９日目以来着実に増加した。ＨＰＣを実験条件ＡおよびＢから毎日または一日おきに採取し、各採取の総細胞数を図７Ａおよび７Ｂに示した。条件Ａでは、ＨＰＣの合わせた総採取数は２８５．６×１０６であった；それに対して、条件ＢについてのＨＰＣの合わせた総採取数は６２４．１４×１０６に到達した。９日目および１０日目の両方において、条件Ａにおける球体は、条件Ｂにおける球体より多くのＨＰＣを放出した。しかしながら、１４から２３日目まで、条件Ｂにおける球体は、条件Ａにおける球体より有意に多くのＨＰＣを放出した。この球体由来のＨＰＣ放出の逆の傾向は、図５および６Ａ～６Ｅに示した球体細胞の造血系統マーカー（ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４１、およびＣＤ４５）の発現プロフィールと一致しており、２つの条件下において一次造血よりも二次造血を明確に優先することが示唆される。両方の球体細胞およびＨＰＣ放出に関する本発明者らの結果は、本発明者らが高効率の３Ｄ造血分化過程の開発に成功したことを明確に実証した。最適化された条件下で、本発明者らのこのプロトコルにおいて、各投入ｈｉＰＳＣから３１個までのＨＰＣを生成することができる。１０００ｍｌバイオリアクターは６００～１０００×１０６個の未分化ｈｉＰＳＣを収容することができると考えられ、２５日間の産生過程についての予想されるＨＰＣの最終産出量は３．１×１０１０細胞に到達できる。
採取したＨＰＣの特徴づけ
採取したＨＰＣの造血系統特異的マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって分析した。図８Ａに示すように、９日目に代表的な実験から採取したＨＰＣは９７．６％がＣＤ３１＋ＣＤ４３＋であり、これは、ＨＥＣを起源とし、また、完全に造血系統に拘束されていることを示す。この段階ではＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＨＰＣの存在率も高かったが、ＣＤ１３３＋ＨＰＣは存在しなかった。ＨＰＣは高い百分率（６８％）でＣＤ４１＋であり、これは、以前に報告されている通り、巨核球系統潜在力が優勢であることを示していた（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）。大部分のＨＰＣは、巨核球／赤血球系系統の共通前駆体（ＣＤ４１＋ＣＤ２３５ａ＋）または赤血球系／骨髄系の系統の共通前駆体（ＣＤ４５＋ＣＤ２３５ａ＋）のいずれかであり、これらの細胞のうちで巨核球／骨髄系共通前駆体（ＣＤ４１＋ＣＤ４５＋）はほんの少ししか存在しなかった。
図８Ｂに示すように、種々の分化段階で採取されたＨＰＣは、全てＣＤ３１＋ＣＤ４３＋であり、高純度であることが確認された。ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＨＰＣは、骨髄系系統細胞だけでなく、ＮＫ細胞などのリンパ系系統細胞も生成することができる多系統潜在力を保有すると考えられる（Ｋｎｏｒｒ ｅｔ ａｌ．２０１３）。図８Ｃに示した１つの代表的な実験では、ＨＰＣ上のＣＤ３４およびＣＤ４５の両方の発現を８日目から１７日目まで毎日追跡し、かなりの百分率（６０％超）の８日目から１３日目までに放出されたＨＰＣ集団がＣＤ３４＋ＣＤ４５＋であり、次いで、これらの細胞は、１４日目（３４％）から１７日目（２％）まで徐々に減少した。
図８Ｄに示すように、初期（８日目および９日目）のＨＰＣはＣＤ４１＋およびＣＤ２３５ａ＋が優勢であったが、しかしながら、ＨＰＣ集団は、ＣＤ４５＋ＨＰＣに徐々に置き換えられた。同様に、ＣＤ４１＋ＣＤ２３５＋ＭＫ／赤血球系の共通前駆体の百分率は８日目に最高となり、９日目から１４日目まで徐々に減少した。興味深いことに、ＣＤ４５＋ＣＤ２３５ａ＋ＨＰＣおよびＣＤ４１＋ＣＤ４５＋ＨＰＣなどの他の共通前駆体は、１０日目から１４日目までにも認められた。
本発明者らの結果は、本発明者らの新規の過程がリンパ系（ＮＫ細胞またはＴ細胞）または骨髄系（マクロファージ、好中球など）の両方の細胞の将来的な製造に適切である多様な造血前駆体を大量に生成することができることを実証している。これらの細胞は、ＣＡＲ－ＮＫおよびＣＡＲ－マクロファージなどの新世代の免疫治療の重要な要素である。
３Ｄ球体中のＣＤ３４＋造血幹細胞の単離、特徴づけ
球体から本発明者らのシステム中の培地への大量のＨＰＣの放出は、３Ｄ球体構造体の内部での非常に活発で動的な造血を明確に示す。したがって、本発明者らは、複能性造血幹細胞（ＨＳＣ）がこれらの球体の内側で生成され得ると推測している。種々の分化日数で、細胞球体を単一細胞に解離し、ＣＤ３４＋および他の細胞を分析した。表１Ａに示すように、条件ＡおよびＢの両方において有意な細胞の拡大が認められた。０日目の２０×１０６個のｈｉＰＳＣから開始して、それぞれ、１７３×１０６個（条件Ａ）および２８８×１０６個（条件Ｂ）の球体細胞が８日目に得られ、５０×１０６個（条件Ａ）および１８３×１０６個（条件Ｂ）の細胞が２３日目に得られた。これらの細胞のうちで、条件Ａ由来の約１０％および条件Ｂ由来の２２％がＣＤ３４＋造血幹細胞であった。種々の分析のために全過程中で相当数の球体が取り出されたので、解離した球体から採取した実際の細胞数は、有意により多いはずである。これらの結果は、この新規の３Ｄ球体環境が造血細胞の健康な長期の増殖および分化を支持するのに妥当であることを実証している。
ＣＤ３４＋細胞の造血系統潜在力を定量的に評価するために、２２日目の条件Ａおよび条件Ｂ由来の解離された単一細胞を、ＣＤ３４＋集団およびＣＤ３４－集団に分離した。ＣＤ３４－画分を、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋集団およびＣＤ３４－ＣＤ４５－集団にさらに分離した。表１Ｂに示すように、解離した球体細胞は、長期間の解離過程後に依然として生存していた。条件ＢにおけるＣＤ３４＋集団の収率がより高く、ＨＰＣの放出数も最も高かった（図７Ａ～７Ｂを参照のこと）。
ＣＤ３４－画分と対照的に、ＣＤ３４＋画分の細胞は、コロニー形成能力が増加した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＣＤ３４＋画分のフローサイトメーター分析により、１４％の集団もＣＤ１３３＋であったことが実証され（図９Ｃ）、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋移植可能ＨＳＣ亜集団の存在が確認された（Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）。図９Ｄ～９Ｉに示すように、ＢＦＵ－Ｅ（図９Ｄ）およびＣＦＵ－Ｅ（図９Ｅ、９Ｆ、および９Ｈ）の両方の相当数の赤色および赤色を含む混色のコロニー（図９Ｇおよび９Ｉ）がＣＤ３４＋細胞から生成された。また、ＣＦＵ－Ｇ（図９Ｊ）、ＣＦＵ－Ｍ（図９Ｋおよび９Ｌ）などの骨髄系系統のコロニーが認められた。ＣＦＵ培養物中の多数の巨大な赤色を含む混色のコロニーは、より後期の分化段階での分化した球体の内側のＨＳＣの存在を強く示す。また、ヒト化マウスで長期間移植可能な長期ＣＤ３４＋細胞を、本明細書中に開示の方法を使用して生成することができる。
実施例２：特異的造血系統の産生および特徴づけ
以前に報告されているように、ＮＫおよびリンパ系系統の他の細胞のインビトロ分化には、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達リガンドＤＬＬ－１／４を過剰発現する支持細胞との共培養を必要とすることが示されている（Ｗａｔａｒａｉ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７；Ｄｉｔａｄｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。本発明者らは、ここに、定義された無血清で支持細胞を含まない条件下でヒトＰＳＣからほとんど純粋なＮＫ細胞集団を頑強に生成するための新規の拡大縮小可能な３Ｄシステムを示す。本発明者らの発見は、ＮＫ細胞だけでなく、その上、リンパ系および造血系統の他の細胞型の大規模製造の開発における進歩したテクノロジーを示す。さらに、本明細書中で実証するように、本発明者らの３Ｄ造血分化システムは、全ての利用可能な多能性幹細胞（ＰＳＣ）分化法とは異なり、免疫腫瘍学治療のためのＮＫ細胞およびＴ細胞などの既製の免疫細胞製品の工業規模の製造に適切である。
造血前駆体からの血小板およびＲＢＣの形成
以前に報告されているように、採取したＨＰＣの１つの重要な潜在的用途は、巨核球および血小板の大規模製造である（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｔｈｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）。８～１０日目に採取したＨＰＣを、以前に公開されているＭＫ促進培地（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）で５～７日間培養した。図１０Ａに示すように、前血小板（白色の矢印によって示す）の有意な形成が、ＭＫ促進培地中での３日間のインキュベーション後に認められた。ＭＫ培地中の血小板を以前に記載のように採取し（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）、血小板上（図１０Ｂ中のゲートＰ１に示す）およびＭＫ上（図１０Ｂ中のゲートＰ２）の両方のＭＫ特異的ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現について分析した。ＣＤ４１ａ＋ＣＤ４２ｂ＋巨核球の百分率は８３．４％に到達し、６６．２％のＣＤ４１＋ＣＤ４２＋血小板も得られた（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。これは、２Ｄ培養システムにおいて類似の様式で誘導された血小板が完全に機能し、血液循環中のヒト血小板と類似の超微細構造の形態を示したという以前の報告によって確認された（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）。本発明者らの３Ｄ球体システムから誘導されたＭＫは、等価な特徴を示す。結論として、完全な３Ｄ培養システム下での巨核球および血小板の生成は、本発明者らおよび多数の他の研究所によって報告された２Ｄシステムよりも、拡大縮小性だけでなく、インビボ循環を模倣した剪断力が常に存在することに起因する関連機能に対して大きな利点を有する。
図８に示すように、８～１０日目に採取した早期ＨＰＣは主にＣＤ２３５ａ＋であり、赤血球系系統であることを示していた。本発明者らは、これらのＣＤ２３５ａ＋ＨＰＣをＣＦＵ形成培地にプレーティングした場合に非常に巨大なＣＦＵ－ｅコロニーが形成されたことを認め（図１０Ｅ）、ＣＤ２３５ａ＋ＨＰＣが輸血のためか標的薬物担体（Ｒｕｂｉｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡによって現在開発中の新規のテクノロジー）として使用することができるデザイナーＲＢＣの大規模製造に適切であることを示唆している。
早期ＨＰＣからのＣＤ５６＋ＮＫの誘導および特徴づけ
ＮＫ細胞は、次世代のがん免疫治療において非常に重要な役割を果たすことができる。現在、自家採取した末梢血球からの増幅によって大量のＮＫ細胞を得ることは技術的に困難である。本発明者らは、本発明者らの３Ｄ分化システムにおいて生成された造血前駆体をＮＫ細胞に効率良く分化することができることをここに実証した。８日目（ＨＰＣ－Ａと命名）、１１日目（ＨＰＣ－Ｂ）、および１８日目（ＨＰＣ－Ｃ）から採取したＨＰＣを、ＮＫ細胞の分化および成熟のために調合した２つの培地（番号１および番号２）中でさらに２１日間培養した。図１１Ａに示すように、異なる分化時間で採取されたこれらのＨＰＣは、以下の特徴的な造血表面マーカープロフィールを示した：およそ６０～７０％および４０％のＨＰＣｓ－ＡがＣＤ３４およびＣＤ４５をそれぞれ発現した；ＣＤ３４の発現は依然として類似していたが、ほぼ１００％のＨＰＣｓ－ＢはＣＤ４５に陽性であった；ＣＤ３４発現はＨＰＣｓ－Ｃにおいて辛うじて検出可能であったが、その１００％がＣＤ４５を発現し、造血細胞に成熟したことを示していた。また、異なる分化時間で採取した３つ全てのＨＰＣ集団の約３０％が低レベルのＣＤ５６を発現することが認められ、これは図８Ｃに示した結果と一致している。両方の培地中での培養後、ＣＤ５６ｌｏｗ細胞は、３つ全てのＨＰＣ採集物について、６日目から１３日目までに徐々に喪失した。さらに、２１日目の培地１中に、ＣＤ５６＋細胞はＨＰＣ－Ａ、ＨＰＣ－Ｂ、およびＨＰＣ－Ｃから出現しなかった（図１１Ｃ）。対照的に、特にＨＰＣｓ－Ａの２１日間の培養後に、培地番号２中に相当数のＣＤ５６ｈｉｇｈ細胞が再度出現し、これらに由来するＣＤ５６ｈｉｇｈの特徴的な細胞集団が認められた（図１１Ｄ）。この再度出現したＣＤ５６＋集団は、ＨＰＣ前駆物質よりも高いレベルのＣＤ５６を発現し（図１１Ｂ、日目ＨＰＣ対８＋２１日目培地番号２）、これはＮＫ系統のＣＤ５６＋ｈｉｇｈ細胞の生成を示していた。
血清および支持細胞を含まない条件下での純粋なＮＫ細胞の生成のための３Ｄ球体の３Ｄ足場との統合
以前の研究において胸腺の３Ｄ構造がＴリンパ球発生に最適な環境を提供することが示唆されている（Ｍｏｈｔａｓｈａｍｉ ａｎｄ Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ ２００６）。無血清かつ支持細胞を含まない条件下でのＮＫの分化および生成を改良するために、６日目のＨＥＣを、ＮＫ特異化を促進するためのインビボニッチを模倣する３Ｄ足場に播種した。優れたＨＥＣの成長および分化が足場の内側に認められ、多数の細胞が１６日目から放出された。１０日間で最初に播種した２×１０６個のＨＥＣからおよそ１０×１０６個の細胞が回収された。図１２Ａ～１２Ｄに示すように、足場から放出された細胞は、典型的な丸形のＨＰＣから非常に特徴的な形態を示した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。フローサイトメトリー分析の前方および側方散乱プロットは、放出された細胞が高度に均一であることを示している（図１２Ｃ、左上）。これらの細胞のうちの９６％超はＣＤ５６＋ｈｉｇｈであり（図１２Ｃおよび１２Ｄ）、純粋なＮＫ集団を示していた。ＰＢＭＣ中のＴリンパ球（右上）と異なり、放出されたＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現せず（図１２Ｃ、中央の上）、汎Ｔ細胞マーカーＣＤ３も発現せず（図１２Ｃ、左下）、一方、かなりの割合のＰＢＭＣはＣＤ３抗原を発現した（中央の下）。さらに、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９は、ｈｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞中に検出されなかった（図１２Ｃ、右下）。ＮＫＧ２Ｄは、ヒトＮＫ細胞上に発現されるＣ型レクチン様受容体のＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーに属する膜貫通タンパク質である（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．１９９１）。ＮＫｐ４４（Ｖｉｔａｌｅ ｅｔ ａｌ．１９９８）およびＮＫｐ４６（Ｓｉｖｏｒｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）は、ヒトにおけるＮＫ活性の誘発に関与するＮＫ特異的表面分子である。本発明者らは、ｈｉＰＳＣ－ＣＤ５６＋ｈｉｇｈ細胞がＮＫＤ２Ｇ＋（９６％）、ＮＫｐ４４＋（９５％）、およびＮＫＰ４６＋（９０．９％）であることを実証した（図１２Ｄ、左のパネル）。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）（Ｉ型膜貫通糖タンパク質のファミリー）は、ＮＫ細胞および少数のＴ細胞の原形質膜上に発現される（Ｙａｗａｔａ ｅｔ ａｌ．２００２；Ｂａｓｈｉｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２００６）。ＫＩＲは、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ分子との相互作用によってこれらの細胞の殺滅機能を調節する。種々の百分率のＣＤ５６＋細胞がＫＩＲ２ＤＳ４＋（４９．２％）およびＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１＋（３１．８％）であり、これらのＣＤ５６＋細胞のほとんど全てがＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＳ１－であり（９７％、図１２Ｄ、右のパネル）、本発明者らの３Ｄシステムにおいて生成されたｈｉＰＳＣ－ＮＫ集団のＫＩＲ型が多様であることが示された。これらの所見は、これらのＣＤ５６＋ｈｉｇｈ細胞が真正のＮＫ細胞であることを実証している。
Ｋ５６２標的細胞に対するｉＰＳ－ＮＫの細胞傷害活性
図１３中の左の縦列から示されるように、ＮＫエフェクター細胞（Ｐ２）は、標的Ｋ５６２細胞とは非常に異なる前方／側方散乱プロフィールを有する。Ｋ５６２細胞はＧＦＰ＋である一方で、ｉＰＳ－ＮＫ細胞はＧＦＰ－である（中央の縦列中に示す）。下から２番目の横列に示すように、エフェクターＮＫ細胞との２時間のインキュベーション後、ほとんど全ての標的ＧＦＰ＋Ｋ５６２細胞は、Ｅ：Ｔ比とは無関係にｉＰＳ－ＮＫ細胞によって破壊された。左の縦列に示すように、少量の残存Ｋ５６２細胞はほとんど生育不能である。この結果により、本発明者らがこの新規のテクノロジープラットフォームから生成したｉＰＳ－ＮＫ細胞がＮＫ細胞の全ての細胞マーカーを共有するだけでなく、潜在的な標的細胞を致命的な効率で死滅させることができることが確認される。
ＲＮＡｓｅｑ分析によりヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞が真正のＮＫ細胞であることを確認する
概要：ＲＮＡｓｅｑ分析を比較することにより、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞を初代ヒトＮＫ細胞と比較し、結果から、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞がヒト初代ＮＫ細胞に組み立てられたことが確認される。
ｉＰＳ－ＮＫ細胞が真のヒトＮＫ細胞であるかどうかを調査するために、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑ発現プロフィールを、異なるタイプのヒト免疫細胞を用いた２つの公的に入手可能な高品質のＲＮＡｓｅｑデータセットと比較した。データセット１（Ｒａｃｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１７）は、３つの研究から構築されたヒト血液由来の選別された免疫細胞（Ｂ細胞、ＣＤ４、ＣＤ８、単球、好中球、および ＮＫ細胞を含む）の参照遺伝子発現プロフィールを含む（Ｒａｃｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１７）。データセット２（Ｃａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１１８１６５で利用可能）は、８人の健康なドナー由来の２５種の血球型の１６６種のヒト試料を用いた選別免疫細胞の参照遺伝子発現プロフィールを含む（Ｃａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１１８１６５で利用可能）。ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の生データのカウント数（ｉＰＳ－ＮＫ３、ｉＰＳ－ＮＫ８、およびｉＰＳ－ＮＫ１２）を、ヒトゲノムバージョンｈ１９に基づいてＴＰＭ（１００万リードあたりの転写物数）に変換した。適合した固有遺伝子記号に基づいてヒトｉＰＳ－ＮＫデータと参照データとの間で発現プロフィールを組み合わせ、全試料にわたる総強度によって正規化した。異なる免疫細胞型の細胞マーカーは、Ｒａｃｌｅ ｅｔ ａｌ．に由来する。基準データベース中の１０００個の最も変動する遺伝子を使用して、ピアソン相関によって任意の２つの試料の類似性を計算した。遺伝子発現プロフィールおよび相関のヒートマップを、ＴＭｅｖを用いて可視化した。
特異的細胞マーカーの発現分析および大域発現プロフィールの類似性に基づいて、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞をヒト初代ＮＫ細胞にアセンブリした。（データセット１：ヒトｉＰＳ－ＮＫの自己に対する平均相関：０．８９、初代ＮＫ細胞に対する平均相関：０．５３、他の細胞型に対する平均相関：０．３１；データセット２：ヒトｉＰＳ－ＮＫの自己に対する平均相関：０．８９１、ナイーブＮＫに対する平均相関：０．２８３、活性化ＮＫに対する平均相関：０．２２９、他の細胞型に対する平均相関：０．０８２）。しかしながら、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の３つのバッチはいくらかのばらつきを示し、ｉＰＳ－ＮＫ３試料（約９５％ＣＤ５６＋細胞）は初代ヒトＮＫ細胞と厳密に適合し、一方で、ｉＰＳ－ＮＫ８およびｉＰＳ－ＮＫ１２の試料は、両方の参照データセット（ＣＤ１４、ＣＤ３３、およびＣＳＦ１Ｒの典型的なマーカーなど）と比較して、マクロファージおよび単球のいくつかのマーカーを発現した。これらのマクロファージ／単球の特徴は、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞のこれら２つのバッチの純度（ｉＰＳ－ＮＫ８試料およびｉＰＳ－ＮＫ１２試料についてそれぞれ８７％および７５％ＣＤ５６＋）と一致する。まとめると、これらの結果は、比較分析に基づいて２つの異なる公的なＲＮＡｓｅｑデータセット非常に一貫しており、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞が真正のＮＫ細胞であることが確認される。
高百分率（８０％超）のヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞がＣＤ５６＋ＣＤ８＋エフェクター細胞である
概要：本発明者らは、本発明者らのテクノロジープラットフォームを用いて生成されたヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の８０％超がＣＤ５６＋ＣＤ８＋であり、細胞傷害性エフェクター細胞の存在を強く示すことを予想外に発見した。
ヒト末梢血においてＮＫ細胞の異なるサブセットが報告されている。末梢血ＮＫ細胞の大部分はＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋細胞であるのに対して、リンパ節内在性ＮＫ細胞は主にＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６－ＮＫ細胞である（Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．２０１４）。本発明者らの３ＤインビトロヒトｉＰＳ分化システムを使用して、本発明者らは、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の９５％超がＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６－であることを発見した。これらの結果は、本発明者らの造血細胞の球体がインビボでのリンパ節組織に類似しており、ＮＫ細胞の分化および発生に理想的なニッチ環境を提供している可能性があることを示唆している。
ヒト末梢血ＮＫ細胞のおよそ３０％がＣＤ８マーカーを発現する（Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。図１４に示すように、驚いたことに、本発明者らの３Ｄ ＨＳＣ分化システムによって誘導されたヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の８０％超がＣＤ５６＋ＣＤ８＋であることが発見された。ＣＤ５６＋ＣＤ８＋ヒトＮＫ細胞がＣＤ５６＋ＣＤ８－サブセットＮＫ細胞より高い細胞溶解機能を示すことが以前の報告によって確認されている（Ａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。ＣＤ８＋ＮＫ細胞の頻度の高さは、ＨＩＶ感染の疾患進行の遅延に関連する（Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｒｕｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１０）。これらの結果は、本発明者らの３Ｄ分化プラットフォームが高細胞溶解性ＣＤ５６＋ＣＤ８＋サブセットＮＫ細胞を優先的に生成することを実証している。主にＣＤ５６＋ＣＤ８＋のＮＫ細胞を養子移入すると、抗がん治療または抗ウイルス感染治療の臨床結果が良好になり得る。
支持細胞を含まない条件下でインビトロ拡大すると、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の収量および純度が高くなる
概要：バイオリアクターから採取したｉＰＳ－ＮＫ細胞の収率および純度を改善するために、本発明者らは、支持細胞を含まない定義された培養培地によって採取したＮＫをさらに拡大し、富化することができることを実証した。
末梢血または臍帯血由来のＮＫ細胞が十分ではないために、ドナー起源のＮＫ細胞は、細胞治療のための治療用量のヒトＮＫ細胞を生成するために拡大する必要がある。ドナーＮＫ細胞の効率的な拡大は、人工抗原提示細胞（ｉＡＰＣ）などの支持細胞の存在に依存する。２Ｄ条件下でのＮＫ系統特異的分化が不十分であるために、以前に報告されたヒトｉＰＳ由来ＮＫ細胞は、支持細胞依存性の拡大も必要である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ、２０１８）。改変されたがん支持細胞の使用は、煩雑なだけでなく、ＮＫ細胞集団中の望ましくない細胞の汚染リスクもある。
本明細書中に記載の３ＤバイオリアクターによるヒトｉＰＳ－ＮＫの分化および産生システムの優れた拡大縮小性に加えて、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の支持細胞を含まない拡大も調査した。結果は、図１５Ａ～１５Ｄに示すように、種々の分化段階で採取したヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の５つの異なるバッチが本明細書中に記載の支持細胞を含まない拡大システムを使用して約３～５倍に拡大されたことを実証している。より重要には、このシステムは、これらの細胞を拡大するだけでなく、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団を富化する。１～２週間の拡大後にＣＤ５６＋集団の４０％未満が９５％超のＣＤ５６＋細胞に到達するまで富化された。これらのデータは、異なる分化段階に由来するヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞／前駆体を支持細胞を含まない条件下でさらに拡大することができ、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純度を有意により高くすることができることを実証している。
３Ｄ造血分化プラットフォームからのＣＤ３＋Ｔリンパ球の生成
概要：ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞に加えて、本発明者らは、本発明者らのシステムを使用してＣＤ３＋ｉＰＳ－Ｔ細胞を効率良く生成することができることを実証し、このことは、本発明者らが本発明者らの３Ｄ球体培養システムにおいて表現型を確定させる持続性の造血ニッチ環境の再現に成功したことを強く示す。
Ｔリンパ球の系統特異的分化は技術的に困難である。ｈＥＳ／ｉＰＳ細胞からのＴリンパ球分化についてのほとんどの以前の報告は、支持細胞依存性の方法を使用していた。工業規模で純粋なＴリンパ球を生成するための拡大縮小可能な３Ｄバイオリアクターシステムを開発することは、今後の免疫腫瘍学治療に非常に魅力的である。いくらか修正を加えたｉＰＳ－ＮＫ細胞の生成のための同一のプラットフォームシステムを使用して、２つの個別の実験において比較的純粋な（６０％超）ＣＤ３ Ｔリンパ球様前駆体が生成された（図１７）。これらの結果は、以下の理由で重要である：（１）ＣＤ３－ＮＫ細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞の両方が同一のリンパ系共通前駆体に由来し得ること；（２）これらのリンパ系共通前駆体が本発明者らの３Ｄ分化システムにおいて造血分化を受けている球体中で効率的に生成されること；および（３）これらの後期球体内の造血は表現型が確定していること。Ｔリンパ球系統を好むように３Ｄ球体分化システムをさらに最適化すると、ｉＰＳ－Ｔ細胞の収量、純度、および機能性が有意に改善される。これらの結果は、この３Ｄ造血分化システムが、造血幹細胞が含まれる全ての造血系統細胞の製造に適応することができる多用途のプラットフォームテクノロジーであるという最初の主張をさらに確証する。
ヒトｉＰＳ－ＮＫはＫ５６２がん細胞を選択的に死滅させるが、正常細胞を死滅させない
概要：正常細胞およびがん細胞の両方に対するヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞のさらなる細胞傷害性分析により、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞ががん細胞を選択的に死滅させるが、正常細胞を死滅させないことを確認する。
Ｋ５６２がん細胞に対する強力な細胞傷害活性を上記で実証した。類似の抗がん細胞傷害効果が、ＯＣＩ－ＡＭＬ３およびＧＭＢ白血病細胞ならびにＢｘＰＣ－３膵臓がん細胞を用いて認められた。強力な細胞傷害活性を有するヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞が正常細胞とがん細胞を区別することができることを確認するために、蛍光標識した正常なヒト末梢血モノヌクレオチド細胞（ＰＢＭＣ）およびＫ５６２細胞を、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞と１：１の比で混合し、２時間インキュベートした。図１８に示すように、８０％を超えるＫ５６２細胞が死滅させられたのに対して、正常なヒトＰＢＭＣに対する明確な細胞傷害活性は認められず、ヒトｉＰＳ－ＮＫ細胞の細胞傷害特異性が異常な（がん）細胞に対しては実証されたが、正常細胞に対しては実証されなかった。
実施例３：５００ｍｌバイオリアクターにおけるＮＫ系統特異的分化の再現
概要：本発明者らの３Ｄ浮遊培養システムを工業的需要を満たすまで拡大縮小することができることを確認するために、本発明者らは、より小さな３０ｍＬバイオリアクターにおけるヒトｉＰＳ－ＮＫ系統特異的分化を５００ｍＬバイオリアクター中で再現することができることも実証した。
本開示の３Ｄ分化システムの主な長所のうちの１つは、その拡大縮小性にある。系統特異的分化を大容量のバイオリアクターで再現することができるかどうかを検証するために、並行ＮＫ系統特異的分化を、同一のｉＰＳ細胞を使用した小容量３０ｍｌおよび大容量５００ｍｌのバイオリアクターの両方において実施した。初期の血液生成内皮（ＨＥ）系統の誘導を確認するために、ＨＥマーカーであるＣＤ３１、ＣＤ１４４（ＶＥ－Ｃａｄ）、およびＣＤ３４、ならびに造血マーカーＣＤ４３を、分化３日目および５日目の球体において分析した。図１６Ａに示すように、ＣＤ３１およびＣＤ１４４の発現は、３日目では５００ｍｌバイオリアクター由来の球体より３０ｍｌバイオリアクター由来の球体で高かったが、両方のマーカーは、５日目には類似のレベル（６０～７０％）に到達した。３０ｍｌおよび５００ｍｌのバイオリアクター由来の球体中のＣＤ３４およびＣＤ４３の発現は、３日目および５日目において非常に類似していた。データから、５００ｍｌバイオリアクター中での血液生成内皮系統の誘導が３０ｍｌバイオリアクターとほとんど同一であることが確認される。
１つの５００ｍｌバイオリアクター由来のＣＤ５６＋ＮＫ細胞生成の動態を、３つの個別の３０ｍＬバイオリアクター由来の結果と比較した。図１６Ｂに示すように、５００ｍＬバイオリアクター中のＣＤ５６＋ＮＫ細胞の出現（実線で示す）は、３つ全ての３０ｍｌバイオリアクターと非常に類似している（４６日目に９０％超の細胞がＣＤ５６＋である）。４６日目に採取した細胞は均一なｉＰＳ－ＮＫ形態を示し（図１６Ｃ）、これらの細胞の大部分はＮＫ細胞特異的活性化受容体ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４６も発現する。これらの細胞の約２５％および３５％は、活性化受容体ＮＫＰ４４および抑制性受容体ＫＩＲに対してそれぞれ陽性である（図１６Ｄ～１６Ｇ）。これらの結果は、ＮＫ系統特異的分化過程を大型のバイオリアクター中で再現することができることを実証している。５００ｍＬを超える（例えば、１リットル、１０リットル、１００リットルなど）バイオリアクターを使用したｉＰＳ－ＮＫ細胞産生のさらなるスケールアップは、実現可能かつ実用的でもあると合理的に予想される。
実施例４：方法と材料
細胞株および試薬
この研究で使用した４つのヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株を、ＳｔｅｍＲＮＡ（商標）－ＮＭ再プログラミングキット（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、カタログ番号００－００７６）を使用して、ヒト正常皮膚線維芽細胞（ｈＮＤＦ）から生成した。ＨｉＰＳＣを、ＨＥＣおよび造血系統への分化を指示する前に、０．２５μｇ／ｃｍ２ ｉＭａｔｒｉｘ－５１１幹細胞培養基質（組換えラミニン－５１１）（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ＸＦ／ＦＦ（商標）培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）上で少なくとも１５回継代してコロニーとしてインビトロで成長させた。ＨｉＰＳＣを、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して細胞クランプとして継代するか、ＡｃｃｕｔａｓｅまたはＴｒｉｐＬＥによって単一細胞で継代した。ｈｉＰＳＣのゲノム安定性を確実にするために、Ｇバンド核型解析を、５継代毎の頻度で日常的に行った。正常な核型を有するｈｉＰＳＣのみをこの研究で使用した。
組換えタンパク質ＢＭＰ４およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を、Ｈｕｍａｎｚｙｍｅから購入した。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ｓＤＬＬ－１を、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入した。ＥＰＯを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ）から購入した。小分子Ｙ２７６３２を、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ／Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌから購入した。ＣＨＩＲ９９０２１を、ＴＯＣＲＩＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。小分子ＳＢ４３１５４２を、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔから購入した。ＳＲ１を、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６のフローサイトメーター分析のための蛍光色素コンジュゲート抗体を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＣＤ１３３－ＡＰＣおよびＫＩＲ２ＤＳ４－ＰＥ、ＫＩＲ２ＤＬ１／ＤＳ１－ＰＥおよびＫＩＲ３ＤＬ１／ＤＳ１－ＰＥを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉから購入した。Ｏｃｔ－４ ＦＩＴＣを、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３の非コンジュゲートマウス抗ヒト抗体を、ＤＡＫＯ／Ａｇｉｌｅｎｔから購入した。
３Ｄ分化のためのｈｉＰＳＣの事前順化
ｈｉＰＳＣ細胞を、ラミニン５２１またはラミニン５１１などのマトリックスを含むＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＵＳＡ）で培養した。コンフルエントかつ未分化のｈｉＰＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）またはＴｒｉｐＬＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して継代し、１μＭのＹ２７６３２を補充したＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）中１ｃｍ２あたり６～８×１０４細胞の密度で低（１／２）濃度のマトリックスでコーティングした表面上に播種し、３～７日間培養した。ｈｉＰＳＣを、この条件で３～５回継代して拡大した。ｈｉＰＳＣの未分化状態を、フローサイトメトリー分析によってＯｃｔ－４の発現レベル（９５％超Ｏｃｔ－４陽性）を用いて定量する。３Ｄ浮遊培養を開始するために、コンフルエントな未分化のｈｉＰＳＣを、ＡｃｃｕｔａｓｅまたはＴｒｉｐＬＥによって解離し、スピナーフラスコに、Ｙ２７６３２（１μＭ）を補充したＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）中に、１×１０６細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞を、３０ｍｌスピナーフラスコ（Ａｂｅｌ Ｂｉｏｔｔ）中にて撹拌速度５０～８０で４８時間連続培養した。播種から４８時間後、少量の試料を取り出し、形態および球体サイズを試験した。球体サイズが直径２５０～３００マイクロメートルに到達するまで、定期的に培地を新鮮にした。継代のために、ｈｉＰＳＣ球体をＰＢＳ（Ｍｇ－、Ｃａ－）で洗浄し、次いで、ＡｃｃｕｔａｓｅまたはＴｒｉｐＬＥによって解離した。次いで、解離した単一のｈｉＰＳＣ細胞を、拡大または造血分化の開始のいずれかに望ましい密度で播種した。
ｈｉＰＳＣのＨＥＣおよび造血系統への段階的誘導
この新規の３Ｄ分化過程を、以下の４つの目的を達成するために特異的に開発した：（１）ＨＥＣ集団を一貫しかつ高い効率で生成するため；（２）ＨＥＣ中間体から造血系統へ効率的に移行させるため；（３）長期間の培養において強力なＣＤ３４＋集団を維持するため；および（４）全ての系統特異性を有する高品質のＨＰＣの採取を最大にするため。
効率的なＨＥＣ分化に最適な播種密度を決定するために、解離ｈｉＰＳＣの懸濁液を、ＨＥＣ誘導培地Ｍ１（Ｙ２７６３２を補充したＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標））中に３つの異なる密度（０．６７、１、および１．３３×１０６細胞／ｍｌ）で１２時間播種した。平均ｈｉＰＳＣ球体サイズを測定した。典型的な球体サイズは、播種密度に応じて直径８０～１５０マイクロメートルの間であった。ＨＥ分化を開始させるために、Ｙ２７６３２を含むＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）を除去し、ＨＥＣ誘導培地Ｍ２（ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを２５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で補充した（成長因子なしのＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地））で置き換えた。Ｍ２中のｈｉＰＳＣ球体を低酸素条件下（５％酸素）で４日間培養後、２０％の通常の酸素濃度でさらに２日間培養した。培地を毎日交換し、３日目および４日目に３μＭの小分子ＣＨＩＲ９９０２１を添加し、４日目および５日目に３μＭの小分子ＳＢ４３１５４２を添加した（図２を参照のこと）。ＨＥＣ分化６日目に、ＴｒｉｐＬＥにて３７℃で１５～３０分間処置することによって、細胞球体を単一細胞の懸濁液に解離した。ＨＥＣ特異的表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４（ＶＥ－カドヘリン）、ＣＤ３４、およびＣＤ４３の発現を、フローサイトメトリーを使用して分析した。ＨＥＣ分化が成功すると、３０～７０％のＣＤ３１＋細胞およびＣＤ１４４＋細胞、ならびに１５～３０％のＣＤ３４＋細胞および７．５～２０％のＣＤ４３＋細胞が得られる。ＨＥＣ含有球体を、造血拘束および拡大培地Ｍ３に移行することができる（図２）。
造血前駆体の放出、採取、および特徴づけ
ＨＥＣは、内皮系統または造血系統のいずれかになることができる二分化能の中胚葉中間体細胞集団である。本発明者らの新規に開発したプラットフォームにおいて造血系統の産出を最大にするために、ＴＰＯ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－３（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＲ１（０．７５μＭ）、ＯＳＭ（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＰＯ（２Ｕ／ｍｌ）を補充した造血拡大培地Ｍ３を、５日間の１期拡大のために使用した。ＴＰＯ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０～２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－３（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＲ１（０．７５μＭ）、ＯＳＭ（２～１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＥＰＯ（３Ｕ／ｍｌ）を補充した造血分化／拡大培地Ｍ４を、２期拡大（４０日間まで）に使用した。培地を毎日交換し、放出された前駆細胞を遠心分離によって培地から採取し、表面系統特異的マーカー（ＣＤ４１（巨核球前駆体）、ＣＤ２３５ａ（赤血球前駆体）、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋（初期リンパ系／骨髄系系統前駆体）、ＣＤ５６＋（ＮＫ系統前駆体）、およびＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋（造血幹細胞）など）について分析した。
３Ｄ細胞球体中のＨＥＣ集団の段階的誘導の形態分析および免疫蛍光分析
０日目から開始して、非分化ｈｉＰＳＣ球体および過程の種々の段階の分化球体を回収し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中にて４℃で１時間固定した。次いで、球体を洗浄し（ＰＢＳで１回）、ＯＣＴを用いて－２０℃で１時間包埋した。凍結球体を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９００クリオスタットによって厚さ１０～１５マイクロメートルの切片にした。切片を、正電荷のスライドガラス上にマウントし、最短で１時間室温で風乾した。球体切片を、新たに作製した冷却（４℃）４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳを使用して１０分間再度固定後、ＰＢＳで３回洗浄した。組織学的検査のために、スライドをヘマトキシリン溶液で３０秒間染色し、水道水でリンスし、水溶性封入液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）を用いてマウントした。球体の形態を、明視野顕微鏡下でのカラー画像化システムによって記録した。
免疫蛍光染色のために、検体をブロッキング溶液（ＤＡＫＯ／Ａｇｉｌｅｎｔ）にて室温で３０分間処理後、非コンジュゲート一次抗体（ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ブロッキング溶液にて１：５０～１００の比に希釈）を用いるか用いずに室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング溶液で１：２００または１：４００の比に希釈した適合するＡｌｅｘａ ４８８コンジュゲートロバ抗マウス抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回再度洗浄し、ＤＡＰｉを含む封入剤を用いてマウントした。細胞球体切片上のＨＥＣおよび／または造血マーカーの発現を、蛍光顕微鏡画像化システム（Ｎｉｋｏｎ，Ｅｃｌｉｐｓｅ）によって可視化した。
ＣＤ３４＋集団の精製および特徴づけ
種々の分化段階の細胞球体を回収し、ＣＤ３４＋集団富化のために単一の細胞に解離した。初期球体（１２日目まで）を、ＴｒｉｐＬＥのみと３７℃で１５分間～１時間インキュベートすることによって解離することができる。１２日目後の球体について、その後のＴｒｉｐＬＥでの解離に加えて、１ｍｇ／ｍｌの濃度のコラゲナーゼＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）との３７℃で３～２４時間のプレインキュベーションが必要である。解離の終了時に、細胞懸濁液を４０μｍメッシュの濾過器によって濾過して任意の大きな細胞クランプを除去した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ３４およびＣＤ４５マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、特異的細胞集団を富化した。ＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３－のＨＰＣ集団を、製造者の指示にしたがってＣＤ１３３マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって分離した。異なる画分の細胞を、フローサイトメトリーによってＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＣＤ１３３の発現について分析した。
複数の分化日数に球体から精製したＣＤ３４＋、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋、およびＣＤ３４－ＣＤ４５－集団を、造血コロニー形成アッセイのために使用した。簡潔に述べれば、３つの画分の各々由来の２，０００個の細胞を、１ｍｌ Ｍｅｔｈｃｕｌｔ Ｈ４４３６（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて混合し、２４ウェル超低接着性プレートに播種した。コロニーの成長を、２５日目まで顕微鏡で毎日観察することによってモニタリングした。造血コロニーの形態および量を、写真および手作業でのカウントによって記録した。
ＨＰＣからの巨核球（ＭＫ）系統特異的分化および血小板の生成
８日目から１０日目までの分化から放出されたＨＰＣを回収し、以前に報告されたように、ＭＫ系統を好む条件を使用してインビトロで培養した（Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｔｈｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）。超低接着性プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）培地に、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ－６、およびＩＬ－９、およびヘパリン（５Ｕ／ｍｌ）を補充した。培養の最初の３日間において５マイクロモル濃度のＹ－２７６３２を添加し、細胞を７％ＣＯ２中３９℃でインキュベートした。最初の４日間において、細胞密度を毎日モニタリングし、１０６細胞／ｍｌが維持されるように新鮮な培地を添加した。ＭＫ前駆体（ＭＫＰ）からのＭＫの成熟を、ＣＤ４１ａおよびＣＤ４２ｂの発現を分析することによってモニタリングした。前血小板の形態（図１２）が観察された時点で、血小板を３～５日間連続して回収し、ＣＤ４１ａ／ＣＤ４２ｂ発現について分析した。
インビトロでのＨＰＣのＮＫ系統特異的分化
８日目、１１日目、および１８日目の分化で放出されたＨＰＣを回収し、報告済みのＮＫ系統発生を好む条件（Ｋａｕｆｍａｎ ２００９；Ｋｎｏｒｒ ｅｔ ａｌ．２０１３）に修正を加えて使用してインビトロで培養した。１０％ＦＢＳ、ＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ－３（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｓＤＬＬ－１（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＯＳＭ（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびヘパリン（３Ｕ／ｍＬ）を補充した２つの異なる基本培地を比較のために使用した。全ての細胞を、超低接着性表面内で２×１０６細胞／ｍｌの密度で培養した。培地を一日おきに交換し、ＮＫ系統マーカーＣＤ５６の発現を、２５日目までモニタリングした。細胞足場を使用したＮＫ系統発生のために、６日目の球体から採取した２～４×１０６個のＨＥＣを、製造者の指示にしたがってＣｅｌｌ－Ｍａｔｅ ３Ｄ μＧｅｌ ４０キット（ＢＲＴＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にロードした。ロードされた足場を、ＩＬ－３（２～１０ｎｇ、最初の５日間のみ）、ＩＬ－７（５～２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－１５（５～２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１０～１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０～１００ｎｇ／ｍｌ）、ｓＤＬＬ－１（２０～１００ｎｇ／ｍｌ）、およびヘパリンを補充した無血清バージョンのＮＫ促進培地中で懸濁培養した。培地を一日おきに交換した。懸濁液中の足場から放出された細胞を、ＮＫ特異的マーカーＣＤ５６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲｓ、ＴＣＲ、ＣＤ３、およびＣＤ１９について５０日目までモニタリングした。
Ｋ５６２赤白血病細胞に対するヒトｉＰＳ由来ＮＫ細胞の細胞傷害性
ＮＫ細胞の細胞傷害活性の定量のための試薬キットを、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。簡潔に述べれば、標的細胞（Ｔ）であるＫ５６２ ＧＦＰ細胞を解凍し、細胞生存率を測定した（９２％超）。完全培地（付属品）でＫ５６２の濃度を１×１０５細胞／ｍｌに調整する。ＮＫ培養物から採取したｉＰＳ－ＮＫを、精製せずにエフェクター細胞（Ｅ）として直接使用した。エフェクター細胞の濃度を完全培地で５×１０６／ｍｌに調整する。１２×７５ｍｍの培養管中に、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ）を含むか含まないエフェクター細胞を標的細胞とそれぞれＴ：Ｅ比１：５０、１：２５、および１：１２．５で混合し、Ｋ５６２細胞のみを対照として使用した。全ての管をボルテックスし、管を１２０ｇで２～３分間遠心分離した。管をＣＯ２インキュベーター中で１２０分間インキュベートする。５０ｍｌ ＤＮＡ染色液を各管に添加し、ボルテックスし、氷上で５分間インキュベートする。ＤＮＡ染色液の添加後３０分以内に、ＧＦＰおよびＰＥのフローチャネルを使用して細胞懸濁液を測定する。
均等物
本開示は、とりわけ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系およびその使用を提供する。本開示の特定の実施形態を考察しているが、上記実施形態は、例示であり、本発明を制限しない。本明細書を精査すれば、本開示の多数の変形形態が当業者に明らかとなる。本開示の全ての範囲は、特許請求の範囲の均等物の全範囲を伴う特許請求の範囲およびかかる変形形態を伴う明細書を参照することによって決定されるものとする。
参照による組み込み
本明細書中で言及した全ての刊行物および特許は、各々の刊行物または特許が参考として援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が本明細書中で参考として援用される。
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本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
造血系統細胞のインビトロ産生のための方法であって、
（ａ）第１の培養培地中に多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む複数の第１の球体を提供することであって、前記第１の球体が、直径約６０～１５０マイクロメートル、約７０～１２０マイクロメートル、または約８０～１００マイクロメートルの平均サイズを有し；好ましくは、前記第１の球体を、球体サイズをモニタリングしながら三次元（３Ｄ）球体培養から生成する、提供すること；
（ｂ）第２の培養培地中の前記複数の第１の球体を３Ｄ球体培養して前記ＰＳＣの分化を誘導し、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）を含む複数の第２の球体を生成すること；
（ｃ）第３の培養培地中の前記複数の第２の球体を３Ｄ球体培養して前記ＨＥＣの分化を誘導し、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む複数の第３の球体を生成すること；
（ｄ）前記ＨＰＣを前記複数の第３の球体から放出させてＨＰＣの実質的に単一の細胞の懸濁液を得ること；および
（ｅ）必要に応じて、前記ＨＰＣの実質的に単一の細胞の懸濁液を、赤血球系／巨核球性共通前駆細胞、赤血球、巨核球、血小板、リンパ系共通前駆細胞、リンパ系系統細胞、リンパ球（Ｔリンパ球など）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、骨髄性共通前駆細胞、顆粒球単球共通前駆細胞、単球、マクロファージ、および／または樹状細胞へさらに分化させること；
を含む、方法。
（項目２）
リンパ系系統細胞のインビトロ産生のための方法であって、
（ａ）第１の培養培地中に多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む複数の第１の球体を提供することであって、前記第１の球体が、直径約６０～１５０マイクロメートル、約７０～１２０マイクロメートル、または約８０～１００マイクロメートルの平均サイズを有し；好ましくは、前記第１の球体を、球体サイズをモニタリングしながら三次元（３Ｄ）球体培養から生成する、提供すること；
（ｂ）第２の培養培地中の前記複数の第１の球体を３Ｄ球体培養して前記ＰＳＣの分化を誘導し、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）を含む複数の第２の球体を生成すること；
（ｃ）前記複数の第２の球体を酵素的に解離させてＨＥＣの実質的に単一の細胞の懸濁液を得ること；
（ｄ）前記ＨＥＣの実質的に単一の細胞を、インビボ造血ニッチを模倣する足場に播種すること；および
（ｅ）前記足場中で、前記ＨＥＣを培養し、リンパ系系統細胞に分化させること；
を含む、方法。
（項目３）
リンパ系系統細胞のインビトロ産生の方法であって、
（ａ）第１の培養培地中に多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む複数の第１の球体を提供することであって、前記第１の球体が、直径約６０～１５０マイクロメートル、約７０～１２０マイクロメートル、または約８０～１００マイクロメートルの平均サイズを有し；好ましくは、前記第１の球体を、球体サイズをモニタリングしながら三次元（３Ｄ）球体培養から生成する、提供すること；
（ｂ）第２の培養培地中の前記複数の第１の球体を３Ｄ球体培養して前記ＰＳＣの分化を誘導し、血液生成内皮細胞（ＨＥＣ）を含む複数の第２の球体を生成すること；および
（ｃ）足場を含まない第３の培養培地中で、前記第２の球体中の前記ＨＥＣを培養し、前記リンパ系系統細胞に分化させ、一方で、前記リンパ系系統細胞を前記第２の球体から放出させること；
を含む、方法。
（項目４）
前記ＰＣＳが、好ましくはヒト由来の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ＰＣＳが、Ｏｃｔ－４発現について少なくとも９５％陽性である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
各３Ｄ球体培養工程が、好ましくは連続的な攪拌下で、スピナーフラスコまたは攪拌タンクバイオリアクター中で培養することを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記第１の培養培地が、約１～１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β、約１０～５００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、および約１～５μＭのＹ２７６３２を補充したＰＳＣ培養培地である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ＰＳＣ培養培地が、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）、ｍＴｅＳＲ（商標）１、ｍＴｅＳＲ（商標）２、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、または３Ｄ浮遊培養に適切な他の培養培地である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第２の培養培地が、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを、各々で好ましくは、約２５～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で補充し、必要に応じて、ＣＨＩＲ９９０１２および／またはＳＢ４３１５４２を、各々で好ましくは、約１～１０、約２～５、または約３μＭの濃度で補充したＰＳＣ培養培地である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＰＳＣ培養培地が、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）、ｍＴｅＳＲ（商標）１、ｍＴｅＳＲ（商標）２、ＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）、または３Ｄ浮遊培養に適切な他の培養培地である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記第２の培養培地に、（ｉ）第１の期間（例えば、１日目および２日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦ、（ｉｉ）第２の期間（例えば、３日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＣＨＩＲ９９０１２、（ｉｉｉ）第３の期間（例えば、４日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＣＨＩＲ９９０１２、およびＳＢ４３１５４２、（ｉｖ）第４の期間（例えば、５日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＳＢ４３１５４２、ならびに（ｖ）第５の期間（例えば、６日目）についてはＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦを補充している、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記第２の培養培地中で前記培養することは、低酸素条件（約５％酸素）下で前記第１の期間～前記第３の期間（例えば、１日目～４日目）、その後、約２０％の通常の酸素濃度で前記第４の期間および前記第５の期間（例えば、５日目および６日目）である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記第３の培養培地が、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＲ１、ｓＤＬＬ－１、ＯＳＭ、および／またはＥＰＯの１またはそれより多くを補充した造血基本培地である、項目１または３に記載の方法。
（項目１４）
前記造血基本培地が、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）造血前駆体拡大培地ＤＸＦ、および造血幹細胞拡大に適切な他の培養系である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
工程（ｅ）が、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＲ１、ｓＤＬＬ－１、ＯＳＭ、および／またはＥＰＯの１またはそれより多くを補充した造血基本培地中で培養することを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１６）
前記造血基本培地が、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）－ＡＣＦ、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ（登録商標）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）造血前駆体拡大培地ＤＸＦ、および系統特異的な拡大および成熟に適切な他の培養培地である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記リンパ系系統細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および／またはマクロファージである、項目２または３に記載の方法。
（項目１８）
養子細胞療法のための組成物であって、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して産生された複数の細胞を含み、好ましくは、前記細胞が、がんまたは他の免疫疾患の処置のためのキメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または疾患抗原の他の受容体を発現するように操作されており、より好ましくは、前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および／またはマクロファージである、組成物。
（項目１９）
がんまたは他の免疫疾患の処置のための項目１～１７のいずれか一項に記載の方法を使用して産生された細胞であって、好ましくは、前記細胞が、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または疾患抗原の他の受容体を発現するように操作されており、より好ましくは、前記細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、および／またはマクロファージである、細胞。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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