KR20210110570A - 조혈 계통 세포를 제조하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

조혈 계통 세포를 제조하기 위한 방법 및 시스템 Download PDF

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치앙 펑
미아오윈 장
쉬지앙 루
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Abstract

한 측면에서, 치료제를 위한 세포 공급원으로서 사용될 수 있는 인간 만능성 줄기 세포(hPSC)로부터 시험관 내에서 생성된 자연 살해 세포와 같은 조혈 계통 세포가 본원에서 제공된다. 이를 제조하고 사용하기 위한 방법 및 조성물도 제공된다

Description

조혈 계통 세포를 제조하기 위한 방법 및 시스템
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2018년 10월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/749,947호에 기초한 우선권 및 이익을 주장하고, 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
분야
본 개시내용은 일반적으로, 예를 들어 인간 만능성 줄기 세포로부터 시험관 내에서 조혈 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
배아 발달의 매우 초기 단계부터 시작하여, 조혈은 모든 혈액 세포 구성 요소를 형성하는 다단계 과정이다. 건강한 성인은 정상적인 신체 기능을 유지하기 위해 하루에 1011 내지 1012개의 혈액 세포를 생성하여야 한다. 적혈구(RBC) 및 혈소판 수혈은 생명을 구한다. 골수, 탯줄 또는 말초 혈액으로부터 조혈 줄기 세포(HSC)의 이식은 혈액 악성 종양 및 기타 장애의 치료를 위해 수년 동안 임상적으로 널리 사용된다. 보다 최근에는, 수지상 세포(DC), T 림프구(T 세포) 및 NK 세포와 같은 다른 중요한 조혈 세포가 최근의 면역 종양학의 성공으로 인해 큰 관심을 끌고 있다.
줄기 세포, 특히 만능성 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)는 우리 몸의 모든 세포 유형이 될 수 있다. 원하는 계통의 고품질 세포를 제조하기 위한 강력한 공정 개발은 이 새로운 기술의 잠재력을 실현하기 위한 첫 번째 단계이다. PSC의 중배엽 조혈 계통으로의 계통 특이적 분화가 광범위하게 조사되었다(Ivanovs et al. 2017; Wahlster and Daley 2016). 이를 위해, 다음과 같은 4개의 방법이 다양한 수준의 성공에 적용되었다. (1) 사이토카인 유도 및 피더(feeder) 세포와의 공동 배양(종종 뮤린 골수 간질 구획으로부터 유래됨)(Choi, Vodyanik and Slukvin 2008); (2) 배아체(EB: embryoid body)의 형성 및 사이토카인 유도(Daley 2003; Lu et al. 2007); (3) 2D 배양에서 직접적인 사이토카인 유도(Feng et al. 2014; Salvagiotto et al. 2011); 및 (4) 계통 특이적 마스터 전사 인자의 이소성 발현에 의한 강제 유도(Sugimura et al. 2017; Ebina and Rossi 2015).
골수 유래 간질 세포와의 공동 배양은 PSC의 시험관내 조혈 분화를 위한 인기있는 방법이었다. 적혈구(Lu et al. 2008), 거핵구(Lu et al. 2011), 및 림프구(Ditadi et al. 2015)와 같은 조혈 세포의 시험관내 성숙에서 더 나은 성공을 거두었다. 그러나, 이종 기원의 피더 세포의 정의되지 않은 특성 및 제한된 확장 가능성으로 인해 이 방법은 향후 치료제 제조에 적합하지 않을 것이다.
다양한 형식의 PSC 배양에서 자발적 또는 강제 응집을 통한 EB 형성 방법은 조혈 분화를 포함한 계통 특이적 분화를 위해 아마도 가장 널리 사용되는 방법일 것이다. 자발적 EB 형성은 균일한 크기의 EB 형성이 필요하지 않은 소규모 연구에만 적합하다. 따라서, 상기 형성은 분화 효율이 낮고 재현성이 떨어진다는 문제가 존재한다. AggraWell(Stemcell Technology)과 같은 장치를 사용하여 EB를 강제로 응집시키면, 원하는 크기로 EB를 형성할 수 있다(Ng et al. 2008). 그러나, 이러한 장치는 대규모 제조 공정 시스템에 채택될 가능성이 작다. 또한, 특정 PSC 세포주가 EB의 초기 형성 후에도 완전한 분해 및 상당한 세포 사멸을 보인 여러 사례가 관찰되었으며(데이터 미공개), 이것은 고정 의존성 2D로부터 고정 독립성 3D 조건에 적응할 수 있는 능력에 대한 세포주의 큰 변화를 시사한다.
인간 콜라겐 IV와 같은 특정 매트릭스에서 2D 부착된 PSC의 직접 조혈 유도는 최근 몇 년 동안 성공적으로 확립되었다(Feng et al. 2014). 그러나, 상업적으로 가치있는 대규모 생산을 달성하기 위해서는 매우 넓은 표면적이 필요할 것이다. 이론적으로는 다층 평판 배양 표면을 가진 생물 반응기를 사용하여 가능하지만, 층 사이의 좁은 공간이 있는 넓은 면적에 PSC를 균일한 밀도로 시딩하고, 샘플링하고, pH 및 가스 교환을 제어하고, 공급하고, 수거하는 것과 같은 여러 기술적 및 조작상의 장애가 존재한다. 이들 모두는 필연적으로 세포 제조에 훨씬 더 높은 비용을 초래할 것이다.
따라서, 치료 목적에 적합한 규모로 PSC로부터 조혈 세포를 제조하기 위한 실행 가능한 기술에 대한 필요성이 존재한다.
본 개시내용은 특히 다양한 조혈 계통 세포를 시험관 내에서 생산하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본원은 다음을 포함하는 조혈 계통 세포를 시험관 내에서 생산하는 방법을 제공한다:
(a) 제1 배양 배지에서 만능성 줄기 세포(PSC)를 포함하는 복수의 제1 구체를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 구체는 직경이 약 60-150 마이크로미터, 약 70-120 마이크로미터 또는 약 80-100 마이크로미터인 평균 크기를 갖고; 바람직하게는 제1 구체는 구체 크기를 모니터링하면서 3차원(3D) 구체 배양으로부터 생성되는 것인 단계;
(b) PSC의 분화를 유도하기 위해 제2 배양 배지에서 복수의 제1 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 내피 세포(HEC: hemogenic endothelial cell)를 포함하는 복수의 제2 구체를 생성하는 단계;
(c) HEC의 분화를 유도하기 위해 제3 배양 배지에서 복수의 제2 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 전구 세포(HPC: hematopoietic progenitor cell)를 포함하는 복수의 제3 구체를 생성하는 단계;
(d) HPC가 복수의 제3 구체로부터 방출되도록 하여 HPC의 실질적으로 단일 세포의 현탁액을 얻는 단계; 및
(e) 선택적으로, HPC의 실질적으로 단일 세포의 현탁액을 공통 적혈구/거핵구 전구 세포, 적혈구, 거핵구, 혈소판, 공통 림프성 전구 세포, 림프 계통 세포, 림프구(예를 들어, T 림프구), 자연 살해(NK) 세포, 공통 골수성 전구 세포, 공통 과립단핵구성 전구 세포, 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포로 추가로 분화시키는 단계.
또 다른 측면에서, 다음을 포함하는, NK 세포와 같은 림프 계통 세포를 시험관 내에서 생산하는 방법이 제공된다:
(a) 제1 배양 배지에서 만능성 줄기 세포(PSC)를 포함하는 복수의 제1 구체를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 구체는 직경이 약 60-150 마이크로미터, 약 70-120 마이크로미터 또는 약 80-100 마이크로미터인 평균 크기를 갖고; 바람직하게는 제1 구체는 구체 크기를 모니터링하면서 3차원(3D) 구체 배양으로부터 생성되는 것인 단계;
(b) PSC의 분화를 유도하기 위해 제2 배양 배지에서 복수의 제1 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 내피 세포(HEC)를 포함하는 복수의 제2 구체를 생성하는 단계;
(c) 복수의 제2 구체를 효소적으로 분리하여 HEC의 실질적으로 단일 세포의 현탁액을 얻는 단계;
(d) HEC의 실질적으로 단일 세포를 생체내 조혈 니치(hematopoietic niche)를 모방하는 스캐폴드에 시딩하는 단계; 및
(e) 스캐폴드에서 HEC를 배양하고 림프 계통 세포로 분화시키는 단계.
추가의 측면에서, 다음을 포함하는, NK 세포와 같은 림프 계통 세포를 시험관 내에서 생산하는 방법이 제공된다:
(a) 제1 배양 배지에서 만능성 줄기 세포(PSC)를 포함하는 복수의 제1 구체를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 구체는 직경이 약 60-150 마이크로미터, 약 70-120 마이크로미터 또는 약 80-100 마이크로미터인 평균 크기를 갖고; 바람직하게는 제1 구체는 구체 크기를 모니터링하면서 3차원(3D) 구체 배양으로부터 생성되는 것인 단계;
(b) PSC의 분화를 유도하기 위해 제2 배양 배지에서 복수의 제1 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 내피 세포(HEC)를 포함하는 복수의 제2 구체를 생성하는 단계; 및
(c) 림프 계통 세포가 제2 구체로부터 방출되도록 허용하면서, 스캐폴드가 없는 제3 배양 배지에서 제2 구체 내의 HEC를 배양하고 림프 계통 세포로 분화시키는 단계.
다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 PCS는 바람직하게는 인간으로부터의 배아 줄기 세포 또는 유도 만능성 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, PCS는 Oct-4 발현에 대해 적어도 95% 양성이다.
일부 실시양태에서, 3D 구체 배양은 바람직하게는 연속 교반 하에서 스피너 플라스크 또는 교반 탱크 생물 반응기에서 배양하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 배양 배지는 약 1-10 ng/mL의 TGF-β, 약 10-500 ng/mL의 bFGF 및 약 1-5 μM의 Y27632로 보충된 PSC 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, PSC 배양 배지는 NutriStem®, mTeSR™1, mTeSR™2, TeSR™-E8™ 또는 3D 현탁 배양에 적합한 다른 배양 배지이다.
일부 실시양태에서, 제2 배양 배지는 각각 바람직하게는 약 25 내지 약 50 ng/mL의 농도로 BMP4, VEGF 및 bFGF로 보충되고, 선택적으로 각각 바람직하게는 약 1-10, 약 2-5, 또는 약 3 μM의 농도로 CHIR99012 및/또는 SB431542로 보충된 PSC 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, PSC 배양 배지는 NutriStem®, mTeSR™1, mTeSR™2, TeSR™-E8™ 또는 3D 현탁 배양에 적합한 다른 배양 배지이다. 일부 실시양태에서, 제2 배양 배지는 (i) 제1 기간(예를 들어, 1일차 및 2일차) 동안 BMP4, VEGF 및 bFGF, (ii) 제2 기간(예를 들어, 3일차) 동안 BMP4, VEGF, bFGF 및 CHIR99012, (iii) 제3 기간(예를 들어, 4일차) 동안 BMP4, VEGF, bFGF, CHIR99012 및 SB431542, (iv) 제4 기간(예를 들어, 5일차) 동안 BMP4, VEGF, bFGF 및 SB431542, 및 (v) 제5 기간(예를 들어, 6일차) 동안 BMP4, VEGF 및 bFGF로 보충될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 배양 배지에서의 상기 배양은 제1 기간 내지 제3 기간(예를 들어, 1일차 내지 4일차) 동안 저산소 상태(약 5% 산소), 이어서 제4 기간 및 제5 기간(예를 들어, 5일차 및 6일차) 동안 약 20%의 정상 산소 농도 하에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 제3 배양 배지는 TPO, SCF, Flt3L, IL-3, IL-6, IL-7, IL-15, SR1, sDLL-1, OSM 및/또는 EPO 중 하나 이상으로 보충된 조혈 기초 배지이다. 일부 실시양태에서, 조혈 기초 배지는 StemSpan™-ACF, PRIME-XV®, PromoCell® 조혈 전구세포 확장 배지 DXF 및 조혈 줄기 세포 확장에 적합한 다른 배양 시스템이다.
일부 실시양태에서, 단계 (e)는 TPO, SCF, Flt3L, IL-3, IL-6, IL-7, IL-15, SR1, sDLL-1, OSM 및/또는 EPO 중 하나 이상으로 보충된 조혈 기초 배지에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 조혈 기초 배지는 StemSpan™-ACF, PRIME-XV®, PromoCell® 조혈 전구세포 확장 배지 DXF 및 계통 특이적 확장 및 성숙에 적합한 다른 배양 배지이다.
또한, 본원에 개시된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생산된 복수의 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 및 다른 면역 질환을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체 또는 질환 항원에 대한 다른 수용체를 발현하도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 림프 계통 세포이다.
본원에 개시된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생산된 복수의 세포를 포함할 수 있는, 입양 세포 요법용 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 암 또는 다른 면역 질환의 치료를 위해 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체 또는 질환 항원에 대한 다른 수용체를 발현하도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 림프 계통 세포이다.
추가의 측면은 암 또는 다른 면역 질환의 치료를 위해 본원에 개시된 방법 중 어느 하나를 사용하여 생산된 세포에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체 또는 질환 항원에 대한 다른 수용체를 발현하도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 림프 계통 세포이다.
또한, 본원에 개시된 배양 배지 조성물이 제공된다.
도 1A-1E는 3D 조혈 분화에 적합한 만능성 줄기 세포의 형태 및 특성화를 보여준다. 도 1A는 일반적인 스피너 플라스크 스타일 생물 반응기의 이미지이다. 도 1B는 저배율(40X)에서 PSC 세포 구체의 이미지이다. 도 1C는 고배율(100X, 스케일 바 = 200 uM)의 PSC 세포 구체의 이미지이다. 도 1D는 미분화된 PSC에서 Oct-4 발현에 대한 대표적인 유세포 분석기 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1E는 정상적인 여성 핵형을 보여주는 대표적인 핵형 분석을 제공한다.
도 2는 3D 구체 조건 하에서 단계별 조혈 유도 과정에 대한 개략적 설명이다.
도 3a-3c는 분화의 처음 6일 동안 HEC 집단을 특성화한 것이다. 도 3a는 시작 구체 크기가 HEC 분화 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다. 도 3b는 HEC 마커 CD31, CD144, CD34, 조혈 마커 CD43, CD4i1 CD235a 및 CD45의 시간 의존적 발현 및 Oct-4의 만능성 마커의 손실을 나타내는 유세포 분석 데이터이다. 도 3c는 분화 6일차에 HEC로부터의 HE 관련 표면 마커 발현의 정량적 프로파일링을 제시하는 그래프이다.
도 4a-4i는 세포 구체의 단계 의존적 형태를 묘사한 것이다. 도 4a는 미분화 PSC의 구체 형태의 이미지이다. 도 4b는 3일차 구체의 이미지이다. 도 4c는 6일차 구체의 이미지이다. 도 4d는 9일차 구체의 이미지이다. 도 4e는 12일차 구체의 이미지이다. 도 4f는 15일차 구체의 이미지이다. 도 4g는 큰 구체 사이에서 방출된 HPC를 보여주는 100X 배율의 15일차 구체의 이미지이다. 도 4h는 19일차 구체의 이미지이다. 도 4i는 22일차 구체의 이미지이다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 이미지는 40X 배율에서 찍은 것이다.
도 5는 상이한 분화 단계에서 구체의 HEC 계통 특이적 마커 발현의 조직학 및 면역 형광을 묘사하는 이미지를 포함한다. 맨 윗줄: 분화의 0, 6, 9, 14 및 23일차의 구체의 단면; 두 번째 줄: 분화의 0, 6, 9, 14 및 23일차에 구체의 단면에서의 HEC 마커 CD31(녹색) 발현 - 세포 핵은 DAPi(파란색)로 염색됨; 세 번째 줄: 분화의 0, 6, 9, 14 및 23일차에 구체의 단면에서의 HEC 마커 CD34(녹색) 발현 - 세포 핵은 DAPi(파란색)로 염색됨; 맨 아래 줄: 분화 0, 6, 9, 14 및 23일차에 구체의 단면에서의 조혈 마커 CD43(녹색) 발현 - 세포 핵은 DAPi(파란색)로 염색됨. 모든 이미지는 100X 배율에서 찍은 것이다.
도 6a-6e는 분리된 구체 세포에서 시간 의존적 계통 특이적 마커 발현을 예시한다. 도 6a는 실험 Cond. A 및 Cond. B로부터 세포 구체에서 CD31의 유세포 분석기 분석을 묘사한 그래프이다. 도 6b는 실험 Cond. A 및 Cond. B로부터 세포 구체에서 CD34의 유세포 분석기 분석을 묘사한 그래프이다. 도 6c는 실험 Cond. A 및 Cond. B로부터 세포 구체에서 CD43의 유세포 분석기 분석을 묘사한 그래프이다. 도 6d는 실험 Cond. A 및 Cond. B로부터 세포 구체에서 CD235a의 유세포 분석기 분석을 묘사한 그래프이다. 도 6e는 실험 Cond. A 및 Cond. B로부터 세포 구체에서 CD45의 유세포 분석기 분석을 묘사한 그래프이다.
도 7a 및 7b는 3D 배양된 구체로부터 HPC의 시간 의존적 방출량을 도시한 것이다. 도 7a는 9일차로부터 23일차까지 실험 Cond. A 및 Cond. B로부터 HPC의 일일 수집 횟수를 나타내는 표이다. 도 7b는 두 조건 모두에서 HPC 수집 횟수를 보여주는 그래프이다.
도 8A-8E는 3D 구체로부터 방출된 수집된 HPC에서 조혈 계통 특이적 마커 발현을 도시한 것이다. 도 8A는 왼쪽에서 오른쪽으로 다음과 같은 쌍을 이룬 마커 발현 프로파일에 대해 9일차에 수집된 HPC의 대표적인 유세포 분석기 분석을 포함한다: CD31/CD43; CD34/CD45; CD34/CD133; CD41/CD235a; CD45/CD235a 및 CD41/CD45. 도 8B는 구체 분화의 상이한 날에 수집된 HPC의 CD31, CD43 단일 및 조합된 발현 프로파일을 보여주는 그래프이다. 도 8C는 구체 분화의 상이한 날에 수집된 HPC의 CD34 및 CD45 단일 또는 조합된 발현 프로파일을 보여주는 그래프이다. 도 8D는 구체 분화의 상이한 날에 수집된 CD41, CD235a 및 CD45 발현 프로파일을 보여주는 그래프이다. 도 8E는 구체 분화의 상이한 날에 수집된 HPC의 CD41/CD235a, CD45/CD235a 및 CD41/CD45 조합 발현 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 9A-9L은 22일차 또는 분화시에 분리된 구체로부터 정제된 CD34+ 세포의 CFU 형성 능력을 예시한 것이다. 도 9A는 CD34+(왼쪽), CD34-CD45+(중앙) 및 CD34-CD45- 세포의 CFU 형성 능력의 전체 배양도이다. 도 9B는 CD34+, CD34-CD45+ 및 CD34-CD45- 세포로부터의 콜로니 형성 단위(CFU)의 수 및 표현형을 나타내는 그래프이다. 도 9C는 CD34+ 세포에서 CD133의 발현을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 도 9D는 큰 버스트 BFU-E의 이미지이다. 도 9E는 큰 CFU-E의 이미지이다. 도 9F는 CFU-E 및 CFU-M의 이미지이다. 도 9G는 큰 빨간색 CFU-믹스 콜로니의 이미지이다. 도 9H는 작은 CFU-E의 이미지이다. 도 9I는 빨간색 CFU-믹스의 이미지이다. 도 9J는 CFU-G의 이미지이다. 도 9K는 CFU-M 및 CFU-G의 이미지이다. 도 9L은 CFU-M의 이미지이다. 모든 현미경 이미지는 40X 배율에서 찍은 것이다.
도 10a-10e는 3D 구체에서 방출된 HPC가 거핵구 및 적혈구 잠재력을 모두 가지고 있음을 보여준다. 도 10a는 광범위한 혈소판 전구체 형성(화살표로 표시됨)을 보여주는, MK 특이적 배양에서 HPC 유래 거핵구의 현미경 이미지를 포함한다. 도 10b는 MK(P2) 및 혈소판(P1) 풍부 집단에 대한 전방 및 측방 산점도이다. 도 10c는 게이트 P2의 MK가 83.4% CD41+CD42+임을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 도 10d는 66.2% CD41+CD42+를 보여주는, P1에서의 혈소판의 유세포 분석 데이터이다. 도 10e는 10일차에 구체로부터 방출된 HPC로부터 유래된 큰 확장 적혈구 콜로니의 형태 이미지를 포함한다(40X 배율).
도 11a-11d는 8일차에 방출된 초기 HPC로부터 CD56+high NK 세포의 유도를 도시한 것이다. 도 11a는 NK 분화를 시작하기 전의 HPC를 특성화하는 그래프이다(HPC-A: 8일차; HPC-B: 11일차; HPC-C: 18일차). 도 11b는 NK 분화 배양에서 CD56+high NK 세포를 특성화하는 유세포 분석 데이터를 포함한다. 도 11c는 배지 #1에서 NK 분화의 시간 의존적 CD56 발현을 나타내는 그래프이다. 도 11d는 배지 #2에서 NK 분화의 시간 의존적 CD56 발현을 나타내는 그래프이다.
도 12A-12D는 시험관 내에서 iPS-NK 세포를 특성화한 것이다. 도 12A는 일반적인 HPC 형태의 이미지(400X 배율)이다. 도 12B는 30일차에 방출된 iPS-NK 세포의 형태를 보여주는 이미지(400X 배율)이다. 도 12C는 다음의 전방 및 측방 산점도를 포함한다: iPS-NK 세포(왼쪽 상단); CD56+ iPS-NK 세포에서의 TCR 발현(중앙 상단); TCR 항체에 대한 PBMC 양성 대조군(오른쪽 상단); CD56+ iPS-NK 세포에서의 CD3 발현(왼쪽 하단); CD3 항체에 대한 PBMC 양성 대조군(중앙 하단), iPS-NK 세포에서의 CD19 발현(오른쪽 하단). 도 12D는 다음의 전방 및 측방 산점도를 포함한다: CD56+ iPS-NK 세포는 NKG2D+(왼쪽 상단), NKp44+(왼쪽 중앙); 및 NKp46+(왼쪽 하단)임; 49.2% CD56+ iPS-NK 세포는 KIR2DS4+(오른쪽 상단), 31.8% CD56+ iPS-NK 세포는 KIR2DL1/DS1+(오른쪽 중앙)임; CD56+ iPS-NK 세포는 KIR3DL1/DS1-(오른쪽 하단)임.
도 13은 K562 표적 세포에 대한 iPS-NK 세포의 세포 독성 활성을 보여주는 유세포 분석 데이터를 포함한다. 맨 윗줄: K562 세포 단독 대조군; 두 번째 줄: 12.5:1의 E:T 비율; 세 번째 줄: 25:1의 E:T 비율; 맨 아래 줄: 50:1의 E:T 비율. 왼쪽 열: 표적 세포(P1) 및 이펙터 세포(P2)의 전방 및 측방 산란 프로파일; 왼쪽에서 두 번째 열: K562(양성) 및 NK(음성)의 GFP 히스토그램; 오른쪽에서 두 번째 열: GFP+ K562(게이트 M2)에서 죽은 세포의 비율.
도 14는 인간 iPS-NK 세포의 80% 초과의 세포가 CD56+CD8+ 이펙터 세포임을 보여준다. 패널 A는 CD56+ 인간 iPS-NK 세포가 CD3을 발현하지 않음을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 패널 B는 CD56+ iPS-NK 세포의 80%가 CD8 항원을 발현하지만 CD4 항원은 발현하지 않음을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 패널 C는 상이한 배치로부터의 CD56+ iPS-NK 세포 중 80% 초과의 세포가 CD8 항원을 발현하지만 CD3 항원은 발현하지 않음을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 패널 D는 상이한 배치로부터의 CD56+ iPS-NK 세포 중 80% 초과의 세포가 CD8 항원을 발현하지만 TCR 항원은 발현하지 않음을 보여주는 유세포 분석 데이터이다.
도 15a-15d는 피더가 없는 조건 하에서 인간 iPS-NK 세포 확장을 도시한 것이다. 수집된 iPS-NK 세포/전구세포의 총 5개의 서로 상이한 배치가 본 발명자들의 새로 개발된 피더가 없는 정의된 배지를 사용하여 시험관 내에서 확장되었다. 도 15a는 3.83의 평균 증가 배수로 세포 수가 2.4 내지 5.6배 증가한 것을 보여주는 그래프이다. 도 15b는 CD56+ 세포 확장 전의 평균 37.8%로부터 CD56+ 세포 확장 후의 평균 95.2%까지 NK 집단의 유의한 농축이 달성되었음을 보여주는 그래프이고, 여기서 최고 순도는 99%에 도달하였다. 도 15c는 확장 전의 iPS-NK 세포에서 CD56/NKG2D, CD56/NKP44 및 CD56/NKP46의 대표적인 공동 발현을 예시하는 유세포 분석 데이터를 포함한다. 도 15d는 확장 후의 iPS-NK 세포에서 CD56/NKG2D, CD56/NKP44 및 CD56/NKP46의 대표적인 공동 발현을 보여주는 유세포 분석 데이터를 포함한다.
도 16A-16G는 500 ml 생물 반응기에서 NK 세포 계통 특이적 분화를 예시한 것이다. 도 16A는 30 ml 및 500 ml 생물 반응기 둘 모두로부터 3일차 및 5일차 구체에서 조혈 내피 마커 CD31, CD144, CD34의 효율적인 유도를 보여주는 그래프이다. 3일차 및 5일차 구체에서 초기 조혈 마커 CD43의 유도가 또한 유사하고; 도 16B는 500 ml 생물 반응기(빨간색 선)로부터 수집된 세포에서 NK 마커 CD56의 발현이 3개의 개별 30 ml 생물 반응기로부터 수집한 세포와 매우 유사한 패턴을 나타냄을 보여주는 그래프이다. 도 16C는 500 ml 생물 반응기에서 수집한 iPS-NK 세포가 균질한 NK 세포 형태를 나타냄을 보여주는 이미지이다. 도 16D는 500 ml로부터 수집된 90% 초과의 iPS-NK 세포가 CD56+이고 이들 세포가 또한 NKG2D를 발현함을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 도 16E는 500 ml로부터 수집된 90% 초과의 iPS-NK 세포가 CD56+이고 이들 세포가 또한 NKp46을 발현함을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 도 16F는 500 ml로부터 수집된 90% 초과의 iPS-NK 세포가 CD56+이고 이들 세포가 또한 NKp44를 발현 함을 보여주는 유세포 분석 데이터이다. 도 16G는 500 ml로부터 수집된 90% 초과의 iPS-NK 세포가 CD56+이고 이들 세포가 또한 KIR을 발현함을 보여주는 유세포 분석 데이터이다.
도 17은 현재 개시된 3D 조혈 분화 플랫폼으로부터 생성된 CD3+ T 림프구를 보여준다. 2개의 개별 생물 반응기로부터 수집된 세포에서 T 세포 마커 CD3 및 NK 세포 마커 CD56/NKG2D의 발현이 표시된다. 패널 A 및 C: 생물 반응기 #1 및 #2로부터 수집된 64.5% 및 61.7%의 세포는 각각 CD3+CD8-이다. 패널 B 및 D: 생물 반응기 #1 및 #2로부터 수집된 세포의 61.5% 및 77%는 각각 CD56-NKG2D-이다.
도 18은 인간 iPS-NK가 정상 세포가 아닌 K562 암 세포를 선택적으로 죽인다는 것을 보여준다. 녹색 형광 표지된 K562 암세포 또는 정상 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 iPS-NK 세포와 1:1의 비율로 혼합하고, 2시간 인큐베이팅한 후 유세포 분석기로 세포 독성 효과를 측정하였다. 패널 A: PBMC와 혼합하기 전의 iPS-NK 세포. 패널 B: iPS-NK 세포와 혼합하기 전의 PBMC. 패널 C: iPS-NK 세포와 PBMC를 서로 혼합한 지 2시간 후의 iPS-NK 세포 및 PBMC, 여기서 PBMC는 온전한 상태로 유지되었다. 패널 D: K562 세포와 혼합하기 전의 iPS-NK 세포. 패널 E: iPS-NK 세포와 혼합하기 전의 K562 세포. 패널 F: iPS-NK 세포와 K562 세포를 서로 혼합한 지 2시간 후의 iPS-NK 세포 및 K562 세포, 여기서 80% 초과의의 K562 세포가 사멸되었다.
한 측면에서, 세포 요법에 대한 수요를 충족시키기 위해 산업적 규모로 조혈 세포를 제조하는 데 적합한 새로운 방법이 본원에서 제공된다. 3D 배양에서 PSC로 시작하여, 이러한 세포는 먼저 조혈 세포 계통뿐만 아니라 내피 세포 계통이 될 이중 잠재력을 가진 중간 집단인 조혈 내피 세포(HEC)로 분화될 수 있다(Ditadi et al. 2015; Feng et al. 2014; Swiers et al. 2013). 조혈 수임(hematopoietic commitment) 및 확장에 적합한 조건으로 전환한 후, 상당한 수의 조혈 전구 세포(HPC)가 3D 구체로부터 방출될 수 있다. 다양한 확장 단계에서 전구세포를 수집하고, 그의 표현형 및 기능을 분석하고, 냉동 보존할 수 있다. 전체 제조 공정은 시판되는 일회용 교반 탱크 생물 반응기 또는 다른 대규모 세포 제조 장치에 쉽게 적용할 수 있는 3D 현탁 배양 조건 하에서 개발된다. 본 명세서에 개시된 방법은 공정 동안 언제든지 세포 샘플링 및 수집에 쉽게 이용할 수 있어 매우 효율적이고 재현 가능하다. 이 시스템은 HEC, 조혈 줄기/전구 세포, 적혈구/거핵구 전구 세포, 골수성 전구 세포, 림프 전구 세포뿐만 아니라, 성숙한 적혈구, 혈소판, T 림프구 및 NK 세포와 같은 다양한 분화 단계 및 상이한 계통의 세포를 제조하기 위해 맞춤화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 PSC 구체를 잘 제어된 단계적 방식으로, 먼저 높은 백분율의 HEC를 포함하는 구체로 효율적으로 전환할 수 있는 고도로 재현 가능하고 확장 가능한 세포 제조 플랫폼 기술이 제공된다. HEC가 풍부한 구체는 모든 조혈 계통 잠재력을 가진 다량의 HPC를 방출할 수 있는 높은 조혈 활성을 포함하는 구체로 후속 전환될 수 있다. 이러한 HPC는 거핵구/혈소판 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 조혈 계통 세포로 강력하게 분화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 PSC로부터 유래된 이러한 NK 세포는 암 면역 요법을 위한 기성품으로 사용될 수 있다.
중요하게는, 본원에 개시된 방법을 사용하여, 세포는 다양한 형태의 일회용 생물 반응기에 쉽게 채택될 수 있는 어떠한 피더 세포 또는 담체없이 정의된 3D 현탁 배양 조건 하에서 처리된다. 둘째로, 본 명세서에 개시된 3D 배양 방법 및 시스템은 다양한 조혈 세포를 제조하는데 사용될 수 있다. 셋째로, 본원에서 개시된 3D 배양 방법 및 시스템은 HPC가 구체로부터 자연적으로 방출되어 높은 생존력 및 기능성을 가진 세포 수집을 가능하게 하므로 공정 친화적이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 3D 배양 방법 및 시스템은 투입 대 산출 비율(PSC:HPC)이 적어도 1:5, 1:10, 적어도 1:20, 적어도 1:30, 또는 약 1:31인 것으로 추정된다. 예를 들어, 1:31의 PSC:HPC 비율을 사용하면, 작업 부피가 3리터인 단일 생물 반응기에서 최대 5.6 x 1010개의 HPC를 제조할 수 있다. 이 플랫폼의 단순성은 상이한 계통의 세포를 제조하는 데 필요한 임의의 시스템 수정을 위한 견고한 기반을 제공한다. 또한, 상기 3D 플랫폼의 확장성으로 인해, 자가 요법과 동종이계(allogeneic therapies) 요법 둘 모두를 위한 세포를 대규모로 제조하는 것이 바람직한 옵션이 된다.
정의
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어가 여기서 수집된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 용어 "실질적으로"는 50% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 초과를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "복수의"는 1 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 초과, 예를 들어 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 그 초과, 또는 그 사이의 임의의 정수를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 주어진 실시양태에 존재하지만 특정되지 않은 요소를 포함할 여지가 있는 조성물, 방법 및 이들의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "필수적으로 이루어지는"은 주어진 실시양태에 필요한 요소를 지칭한다. 이 용어는 본 발명의 실시양태의 기본적이고 신규하거나 기능적인 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 요소의 존재를 허용한다.
용어 "이루어지는"은 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 조성물, 방법 및 각각의 구성 요소를 지칭하며, 이는 그에 대한 실시양태의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 배제한다.
용어 "배아 줄기 세포"(ES 세포 또는 ESC)는 세포주로서 연속적으로 계대된 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 만능성 세포를 지칭한다. ES 세포는 정자 또는 DNA에 의한 난자의 수정, 핵 이식, 단성 생식 등으로부터 유래될 수 있다. 용어 "인간 배아 줄기 세포"(hES 세포)는 인간 ES 세포를 지칭한다. ESC의 생성은 미국 특허 제5,843,780호; 제6,200,806호에 개시되어 있고, 체세포 핵 이식으로부터 유래된 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 얻은 ESC는 미국 특허 제5,945,577호; 제5,994,619호; 제6,235,970호에 기재되어 있으며, 이들 특허는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 배아 줄기 세포의 구별되는 특징은 배아 줄기 세포 표현형을 규정한다. 따라서, 세포가 다른 세포와 구별될 수 있도록 배아 줄기 세포의 고유한 특징 중 하나 이상을 보유하는 경우, 세포는 배아 줄기 세포의 표현형을 갖는다. 예시적인 구별되는 배아 줄기 세포 특징은 비제한적으로 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 핵형, 특정 배양 조건에 대한 반응성 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "만능성"은 상이한 조건 하에서 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 분화하고 바람직하게는 3개의 모든 생식 세포층의 특징적인 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능성 세포는 주로, 예를 들어 누드 마우스 기형종 형성 분석을 사용하여 하나 초과의 세포 유형, 바람직하게는 3개의 생식층 모두로 분화하는 능력을 특징으로 한다. 이러한 세포에는 hES 세포, 인간 배아 유래 세포(hEDC) 및 성체 유래 줄기 세포가 포함된다. 만능성 줄기 세포는 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 만능성 줄기 세포는 유전적으로 변형되지 않는다. 유전적으로 변형된 세포는 그 식별을 용이하게 하기 위해 형광 단백질과 같은 마커를 포함할 수 있다. 만능성은 또한 배아 줄기(ES) 세포 마커의 발현에 의해서도 입증되지만, 만능성에 대한 선호되는 시험은 세 가지 생식층 각각의 세포로 분화할 수 있는 능력을 입증하는 것이다. 단순히 상기 세포를 배양한다고해서 그 자체로 만능성이 되는 것은 아니라는 점에 유의하여야 한다. 재프로그래밍된 만능성 세포(예를 들어, 그에 대한 용어가 본원에 정의된 iPS 세포)는 또한 일반적으로 배양에서 단지 제한된 수의 분열 능력을 갖는 1차 모세포에 비해 성장 잠재력의 손실없이 연장된 계대배양 능력의 특징을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "iPS 세포" 및 "유도 만능성 줄기 세포"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 예를 들어, 하나 이상의 유전자의 강제 발현을 유도함으로써 비-만능성 세포, 일반적으로 성체 체세포로부터 인위적으로 유래된(예를 들어, 유도된 또는 완전한 역전에 의해) 만능성 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재프로그래밍"은 핵의 발달 시계가 재설정되도록 체세포의 분화 상태를 변경하거나 역전시키는, 예를 들어 초기 배아 세포 핵의 유전자 프로그램을 수행하여 배아 발달에 필요한 모든 단백질을 만들도록 성체 분화 세포핵의 발달 상태를 재설정하는 과정을 의미한다. 본원에서 개시되는 바와 같은 재프로그래밍은 체세포의 분화 상태를 만능성 또는 전능성 세포로 완전히 역전시키는 것을 포함한다. 재프로그래밍은 일반적으로 접합체가 성체로 발달함에 따라 세포 분화 동안 발생하는 핵산 변형(예를 들어, 메틸화), 염색질 축합, 후성적 변화, 게놈 각인 등의 유전 가능한 패턴 중 적어도 일부의 변경, 예를 들어 역전을 포함한다.
용어 "재생" 또는 "자기 재생" 또는 "증식"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 장기간, 및/또는 수개월에서 수년에 걸쳐 동일한 비-전문화된 세포 유형으로 분열함으로써 스스로를 재생하는 줄기 세포의 능력을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 예에서, 증식은 단일 세포를 두개의 동일한 딸 세포로 반복적으로 분열함으로써 세포를 확장하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배양" 또는 "배양하기"는 세포 생존력 및/또는 증식을 유지하기 위한 시험관내 실험 절차를 지칭한다.
용어 "담체가 없는 3차원 구체" 배양 또는 배양하기는 세포가 어떠한 담체 없이도 스스로 구체를 형성할 수 있도록 비부착 조건에서 세포를 배양하는 기술을 의미한다. 부착성을 갖는 세포를 배양하는 종래의 방법은 페트리 접시(2차원 배양)와 같은 용기의 평면에서 세포를 배양하는 것을 특징으로 한다. 이와 대조적으로, 3차원 배양 방법에서는, 세포에 부착 신호가 제공되지 않으며, 배양은 주로 세포-세포 접촉에 의존한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "담체" 또는 "마이크로담체"는 현탁 세포 배양을 위한 부착 표면을 제공하도록 설계된 플라스틱, 세라믹 또는 기타 물질, 예를 들어, 젤라틴 또는 하이드로겔로 제조된 고체 구형 비드를 지칭한다. 섬유질 구조와 같은 다른 형태 또는 모양을 가진 담체도 보고되었다.
용어 "스캐폴드"는 바람직한 세포 상호작용을 유발하여 조직 조작 및 재생을 위한 새로운 기능성 조직의 형성에 기여하도록 설계된 고체 또는 반고체 물질을 의미한다. 일부 실시양태에서, 세포는 종종 3차원 조직 형성을 지원할 수 있는 이러한 구조에 시딩된다. 스캐폴드는 천연 조직의 세포외 매트릭스를 모방하고, 생체내 환경을 재현하며, 세포가 그 자신의 미세 환경에 영향을 미칠 수 있도록 한다. 스캐폴드는 일반적으로 다음 목적 중 적어도 하나를 제공한다: 세포 부착 및 이동의 허용, 세포 및 생물 의학 인자의 전달 및 유지, 필수 세포 영양소 및 발현 산물의 확산 허용, 세포의 행동을 변경하는 특정 기계적 및 생물학적 영향의 발휘. 조직 재건의 목표를 달성하기 위해, 스캐폴드는 특정 요구 사항을 충족하여야 한다. 세포 시딩 및 확산을 용이하게 하려면 높은 다공성 및 적절한 기공 크기가 필요하다. 스캐폴드 재료는 생체적합성이어야 한다. 일부 실시양태에서, 생분해성 물질이 사용되었다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 효소 처리에 의해, 또는 pH 및/또는 온도 등과 같은 물리적 조건의 변화에 의해 용해됨으로써, 스캐폴드 내의 세포의 회수 또는 수집을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다공성 스캐폴드는 또한 최적의 세포 분화 및 제조를 위한 담체로서 사용될 수 있다. 기공 크기, 강성, 세포외 매트릭스의 함량 및 모양과 같은 스캐폴드의 물리적 특징은 조직, 비제한적인 예를 들어 뼈, 심장, 간 및 피부 조직의 최적 성장을 위해 맞춤화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 NK 세포, T 림프구 등과 같은 계통을 촉진하기 위해 생체내 니치를 모방하도록 선택될 수 있다.
용어 "구체" 또는 "구상체(spheroid)"는 3차원 구체 또는 실질적으로 구체인 세포 집괴체(agglomerate) 또는 응집체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 세포가 살아있는 조직에서 이동하는 방식과 유사하게 세포가 구상체 내에서 이동하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 가장 일반적인 유형의 ECM은 기저막 추출물 또는 콜라겐이다. 일부 실시양태에서, 세포가 배지에 현탁되어 성장하는 매트릭스가 없는 또는 스캐폴드가 없는 구상체 배양이 또한 사용될 수 있다. 이는 연속적인 스피닝에 의해 또는 접착력이 낮은 플레이트를 사용하여 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 구체는 단일 배양 또는 공동 배양 기술, 예를 들어 현적 배양(hanging drop), 회전 배양, 강제 부유, 교반 또는 오목 플레이트 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 모두 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Breslin et al., Drug Discovery Today 2013, 18, 240-249; Pampaloni et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 839-845; Hsiao et al., Biotechnol. Bioeng. 2012, 109, 1293-1304; 및 Castaneda et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2000, 126, 305-310] 참조). 일부 실시양태에서, 구체의 크기는 3D 배양 동안 성장할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "피더가 없는"은 언급된 조성물이 첨가된 피더 세포를 함유하지 않는 상태를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "피더 세포"는 PS 세포와 함께 공동 배양되고 PS 세포에 대한 지원을 제공하는 비-PS 세포를 의미한다. 지원은 하나 이상의 성장 인자를 생성함으로써 PS 세포 배양의 성장 및 유지를 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 피더 세포의 예는 뮤린 섬유모세포, 인간 섬유모세포와 같은 결합 조직의 표현형을 갖는 세포를 포함할 수 있다.
용어 "배양 배지"는 "배지"와 상호 교환 가능하게 사용되며, 세포 증식을 허용하는 임의의 배지를 지칭한다. 적절한 배지는 최대 증식을 촉진할 필요는 없고, 측정 가능한 세포 증식만 촉진하면 충분하다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 세포를 만능성 상태로 유지한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 세포(예를 들어, 만능성 세포)가 예를 들어 HEC 및 HPC로 분화하도록 촉진한다. 본 명세서에서 사용되는 몇 가지 예시적인 기초 배지는 다음을 포함한다: DMEM/F-12(둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)/영양소 혼합물 F-12; Thermo Fisher Scientific에서 입수 가능), bFGF 또는 TGFβ를 포함하지 않는 성장 인자가 없는 NutriStem® 배지(GF-free NutriStem®, Biological Industries에서 입수 가능), NutriStem® hPSC XF Medium®(Biological Industries), mTeSR™1(STEMCEFF Technologies Inc.), mTeSR™2(STEMCEFF Technologies Inc.), TeSRTM-E8TM(STEMCELL Technologies Inc.), StemSpanTM-ACF(STEMCELL Technologies Inc.), PRIME-XV®(Irving Scientific) 및 PromoCell® 조혈 전구세포 확장 배지 DXF(PromoCell GmbH). 각각은 다음 중 하나 이상으로 보충될 수 있다: 적합한 완충제(예를 들어, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)), 화학적으로 정의된 보충제, 예를 들어 N2(0.1-10%, 예를 들어 1%) 및 B27(0.1-10%, 예를 들어, 1%) 무혈청 보충제(Thermo Fisher Scientific에서 입수 가능), 페니실린/스트렙토마이신과 같은 항생제(0.1-10%, 예를 들어, 1%), MEM 비필수 아미노산(비필수 아미노산으로 보충되면 MEM을 비필수 아미노산 용액으로 만드는, 배양 세포의 성장에 필수적인 균형 잡힌 염 용액, 아미노산 및 비타민으로 이루어진 이글 최소 필수 배지(MEM)), 글루코스(0.1-10%, 예를 들어, 0.30%), L-글루타민(예를 들어, GlutaMAX™), 아스코르브산 및/또는 DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-1-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르). 분화 유도 인자, 예를 들어 헤파린, 골 형성 단백질 4(BMP4), 온코스타틴 M(OSM), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 트롬보포이에틴(TPO), 줄기 세포 인자(SCF), 가용성 델타-유사 단백질 1(sDLL-1), 에리트로포이에틴(EPO), FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드(Flt3L), 인터류킨(IL)-3, IL-6, IL-9, IL-7, IL-15, Y27632, CHIR99021, SB431542, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 StemRegenin 1(SR1)이 또한 배지에 첨가될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분화된 세포"는 체세포 계통으로 분화하는 과정에 있거나 말단 분화된 세포를 의미한다. 세포 개체 발생의 맥락에서, 형용사 "분화된" 및 "분화하는"은 비교되는 세포보다 발달 경로에서 더 아래로 진행된 "분화된 세포"를 의미하는 상대적인 용어이다. 따라서, 줄기 세포는 계통이 제한된 전구 세포(예를 들어, 중배엽 줄기 세포)로 분화할 수 있으며, 이는 다시 경로 아래에서 다른 유형의 전구 세포(예를 들어, 조혈 전구 세포)로 분화할 수 있고, 이어서 특정 조직 유형에서 특징적인 역할을 하고 추가로 증식 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 최종 단계의 분화된 세포로 분화할 수 있다.
용어 "농축" 및 "농축된"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 한 유형의 세포의 수율(분획)이 출발 배양액 또는 제제 내의 해당 유형의 세포 분획에 비해 적어도 10% 증가함을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작용제"는 소분자, 핵산, 폴리펩타이드, 펩타이드, 약물, 이온 등(이에 한정되지 않음)과 같은 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 작용제는 비제한적으로 합성 및 자연 발생 단백질성 및 비단백질성 엔티티를 포함하는 임의의 화학물질, 엔티티 또는 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩타이드, 앱타머, 핵산 올리고머, 아미노산, 또는 탄수화물, 비제한적인 예를 들어 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지단백질, 앱타머, 및 이들의 변형 및 조합물 등이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족, 또는 헤테로사이클릴 모이어티, 예를 들어 마크로라이드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 이의 유사체를 포함한다. 화합물은 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 알려져 있거나, 또는 다양한 화합물의 라이브러리에서 선택될 수 있다.
용어 "소분자"는 다중 탄소-탄소 결합 및 1500 달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 화합물을 의미한다. 전형적으로, 이러한 화합물은 단백질과의 구조적 상호작용, 예를 들어 수소 결합을 매개하는 하나 이상의 작용기를 포함하고, 전형적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 하이드록실 또는 카르복실기, 및 일부 실시양태에서 적어도 2개의 작용성 화학기를 포함한다. 소분자 작용제는 하나 이상의 화학적 작용기 및/또는 헤테로원자로 치환된 사이클릭 탄소 또는 헤테로사이클릭 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "마커"는 세포의 특징 및/또는 표현형을 설명하기 위해 사용된다. 마커는 관심 있는 특징을 포함하는 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 마커는 특정 세포에 따라 다를 것이다. 마커는 특정 세포 유형의 세포 또는 상기 세포 유형에 의해 발현되는 분자의 형태학적, 기능적 또는 생화학적(효소적) 특징이다. 바람직하게는, 이러한 마커는 단백질이고, 보다 바람직하게는 항체 또는 관련 기술 분야에서 이용 가능한 다른 결합 분자에 대한 에피토프를 보유한다. 그러나, 마커는 단백질(펩타이드 및 폴리펩타이드), 지질, 폴리사카라이드, 핵산 및 스테로이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 세포에서 발견되는 임의의 분자로 구성될 수 있다. 형태학적 특징 또는 특질의 예는 모양, 크기, 및 핵 대 세포질 비율을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 기능적 특징 또는 특질의 예에는 특정 기질에 부착하는 능력, 특정 염료를 도입하거나 배제하는 능력, 특정 조건 하에서 이동하는 능력, 및 특정 계통을 따라 분화하는 능력이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 마커는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 이용 가능한 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 마커는 또한 형태학적 특징의 부재 또는 단백질, 지질 등의 부재일 수 있다. 마커는 폴리펩타이드의 존재 및 부재 및 다른 형태학적 특징의 일군의 고유한 특징의 조합일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 단리된 세포 집단에 대한 용어 "단리된 집단"은 혼합된 또는 이종 세포 집단으로부터 제거 및 분리된 세포 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 집단은 세포가 그로부터 단리되거나 농축되는 이종 집단과 비교할 때 실질적으로 순수한 세포 집단이다.
특정 세포 집단과 관련하여 용어 "실질적으로 순수한"은 전체 세포 집단을 구성하는 세포와 관련하여 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 순수한 세포의 집단을 의미한다. 확정적 내배엽 세포의 집단과 관련하여 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된"이라는 용어는 본원에서 용어에 의해 정의된 바와 같은 확정적 내배엽 세포 또는 그의 자손체가 아닌 세포를 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만으로 또는 1%보다 작은 수치 미만으로 함유하는 세포의 집단을 의미한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 확정적 내배엽 세포의 집단을 확장하는 방법을 포함하며, 여기서 확장된 확정적 내배엽 세포 집단은 확정적 내배엽 세포의 실질적으로 순수한 집단이다. 이와 유사하게, 만능성 줄기 세포의 "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된" 집단은 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만을 함유하는 세포 집단을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "조혈 계통 세포"는 PSC로부터 시험관 내에서 분화된 세포 및/또는 이들의 자손체를 지칭하고, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 혈관모세포, 조혈 내피 세포(HEC), 조혈 줄기 세포, 조혈 전구 세포(HPC), 적혈구/거핵구 전구 세포, 적혈구, 거핵구, 혈소판 및 림프 계통 세포. 용어 "림프 계통 세포"는 다음 중 하나 이상을 포함한다: 림프 전구 세포, 림프구(예를 들어, T 림프구), 자연 살해(NK) 세포, 골수성 전구 세포, 과립단핵구성 전구 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포.
"조혈 내피 세포"는 조혈 잠재력을 획득하고 다계통 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성할 수 있는, PSC로부터 시험관 내에서 분화된 세포를 지칭한다. HEC에 대한 인간 마커에는 CD31, CD144, CD34 및 CD184가 포함된다.
"조혈 전구 세포"는 유사 분열 상태로 남아 있고 더 많은 전구 세포 또는 전구체 세포를 생성할 수 있거나 또는 최종적으로 조혈 세포 계통으로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. HPC에 대한 인간 마커는 CD31, CD34, CD43, CD133, CD235a, CD41 및 CD45를 포함하며, 여기서 CD41+는 거핵구 전구 세포, CD235a+ 적혈구 전구 세포, CD34+CD45+ 초기 림프/골수성 계통 전구 세포, CD56+ NK 계통 전구 세포 및 CD34+CD133+ 조혈 줄기 세포를 나타낸다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 다음을 포함하는 목적을 위한 물질의 투여를 의미한다: (i) 질환 또는 병태를 예방하는 것, 즉 질환 또는 병태의 임상 증상이 발생하지 않게 하는 것; (ii) 질환 또는 병태를 억제하는 것, 즉 임상 증상의 발생을 억제하는 것; 및/또는 (iii) 질환 또는 병태의 완화, 즉 임상 증상의 퇴행을 유발하는 것.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예는 흑색종, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암의 보다 특정한 예는 편평 세포 암(예를 들어, 상피 편평 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁 내막암 또는 자궁암, 타액선 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 및 두경부암을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질환 항원"은 질환과 관련된 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 거대분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원은 예를 들어 특정 면역 세포의 활성화 및/또는 항체 생성을 포함하는 면역 반응을 촉발할 수 있는 분자이다. T 세포 수용체는 또한 항원을 인식하였다(그의 펩타이드 또는 펩타이드 단편이 MHC 분자와 복합체화된 항원임에도 불구하고). 거의 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함한 모든 거대분자가 항원이 될 수 있다. 항원은 또한 게놈 재조합체 또는 DNA에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 유도할 수 있는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA는 "항원"을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 항원은 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 코딩될 필요가 없고, 또한 항원은 유전자에 의해 코딩될 필요가 전혀 없다. 일부 실시양태에서, 항원은 합성될 수 있거나, 생물학적 샘플, 예를 들어 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체로부터 유래될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "종양 항원"은 또는 상호 교환 가능하게 "암 항원"은 암, 예를 들어 종양 관련 항원을 비롯하여, 암 세포 또는 면역 반응을 촉발할 수 있는 종양 미세환경에 존재하거나 이와 관련되는 임의의 분자를 포함한다.
"종양 관련 항원"(TAA)은 숙주에서 면역 반응을 촉하는 종양 세포에서 생성되는 항원 물질이다. 종양 항원은 진단 시험을 통해 종양 세포를 확인하는 데 유용한 종양 마커이며, 암 요법에 사용할 수 있는 잠재적 후보이다. 일부 실시양태에서, TAA는 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비호지킨(Hodgkin) 림프종, 비호지킨스 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁 경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암으로부터 유래될 수 있다. TAA는 환자마다 특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, TAA는 p53, Ras, 베타-카테닌, CDK4, 알파-액티닌-4, 티로시나제, TRP1/gp75, TRP2, gplOO, 멜란-A/MART 1, 강글리오사이드, PSMA, HER2, WT1, EphA3, EGFR, CD20, MAGE, BAGE, GAGE, NY-ESO-1, 텔로머라제, 서비빈, 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
본 개시내용의 다양한 측면은 아래에서 보다 상세히 설명된다. 추가의 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 제시된다.
만능성 줄기 세포
다양한 실시양태에서, 조혈 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC), 인간 단성 생식 줄기 세포(hpSC), 핵 이식 유래 줄기 세포 및 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 인간 만능성 줄기 세포(hPSC)로부터 생산될 수 있다. 이러한 hPSC를 얻는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져있다.
만능성 줄기 세포는 기능적으로 다음과 같은 줄기 세포로서 정의된다: (a) 면역 결핍(SCID) 마우스에게 이식될 때 기형종을 유도할 수 있음; (b) 세 가지 생식층(예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포 유형) 모두의 세포 유형으로 분화할 수 있음; 및 (c) 배아 줄기 세포의 하나 이상의 마커(예를 들어, OCT4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, NANOG, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1 등)를 발현함. 특정 실시양태에서, 만능성 줄기 세포는 OCT4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다. 예시적인 만능성 줄기 세포는 예를 들어 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 생성된다. 예시적인 만능성 줄기 세포는 배반포기 배아의 ICM으로부터 유래된 배아 줄기 세포뿐만 아니라, 난할기 또는 상실기 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래된 배아 줄기 세포(선택적으로 배아의 나머지를 파괴하지 않음)를 포함한다. 이러한 배아 줄기 세포는 수정에 의해 또는 체세포 핵 이식(SCNT), 단성 생식 및 동정 생식을 포함하는 무성 수단에 의해 생성된 배아 물질로부터 생성될 수 있다. 추가의 예시적인 만능성 줄기 세포는 인자의 조합(본 명세서에서 재프로그래밍 인자로 지칭됨)을 발현함으로써 체세포를 재프로그래밍하여 생성된 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)를 포함한다. iPSC는 태아, 출생 후, 신생아, 청소년 또는 성인 체세포를 사용하여 생성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 체세포를 만능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는 데 사용될 수 있는 인자는 예를 들어 OCT4(때로는 OCT3/4로 지칭됨), SOX2, c-Myc 및 Klf4의 조합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 체세포를 만능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자는 예를 들어 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 적어도 2개의 재프로그래밍 인자가 체세포에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 적어도 3개의 재프로그래밍 인자가 체세포에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 적어도 4개의 재프로그래밍 인자가 체세포에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 추가의 재프로그래밍 인자가 확인되고, 체세포를 만능성 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위해 단독으로 또는 하나 이상의 공지된 재프로그래밍 인자와 조합하여 사용된다. 유도 만능성 줄기 세포는 기능적으로 정의되며, 임의의 다양한 방법(통합 벡터, 비통합 벡터, 화학적 수단 등)을 사용하여 재프로그래밍된 세포를 포함한다. 만능성 줄기 세포는 유전자 변형되거나 또는 다른 방식으로 변형되어 수명, 효능, 회귀(homing)를 증가시키거나, 동종면역(alloimmune) 반응을 억제 또는 감소시키거나, 그러한 만능성 세포로부터 분화된 세포에서 원하는 인자를 전달할 수 있다.
유도 만능성 줄기 세포(iPS 세포 또는 iPSC)는 체세포에서 재프로그래밍 인자의 단백질 형질도입에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 재프로그래밍 단백질이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포 내로 형질도입된다. 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 재프로그래밍 단백질이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포 내로 형질도입된다. 다른 실시양태에서, 적어도 4개의 재프로그래밍 단백질이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포 내로 형질도입된다.
만능성 줄기 세포는 모든 종으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 마우스, 비인간 영장류의 여러 종, 및 인간에서 배아 줄기 세포가 성공적으로 유도되었으며, 많은 추가의 종으로부터 배아 줄기 유사 세포가 생성되었다. 따라서, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 인간, 비인간 영장류, 설치류(마우스, 래트), 유제류(소, 양 등), 개(애완견 및 야생 개), 고양이(애완 고양이 및 사자, 호랑이, 치타와 같은 야생 고양이), 토끼, 햄스터, 사막쥐(gerbil), 다람쥐, 기니 피그, 염소, 코끼리, 팬더(자이언트 팬더 포함), 돼지, 너구리, 말, 얼룩말, 해양 포유동물(돌고래, 고래 등) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 배아 줄기 세포 및 배아 유래 줄기 세포를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종은 멸종 위기 종이다. 특정 실시양태에서, 종은 현재 멸종된 종이다.
유사하게, iPS 세포는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 이들 iPS 세포는 마우스 및 인간 세포를 사용하여 성공적으로 생성되었다. 또한, iPS 세포는 배아, 태아, 신생아 및 성인 조직을 사용하여 성공적으로 생성되었다. 따라서, 임의의 종의 공여자 세포를 사용하여 쉽게 iPS 세포를 생성할 수 있다. 따라서, 인간, 비인간 영장류, 설치류(마우스, 래트), 유제류(소, 양 등), 개(애완견 및 야생 개), 고양이(애완 고양이 및 사자, 호랑이, 치타와 같은 야생 고양이), 토끼, 햄스터, 염소, 코끼리, 팬더(자이언트 팬더 포함), 돼지, 너구리, 말, 얼룩말, 해양 포유동물(돌고래, 고래 등) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 종으로부터 iPS 세포를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종은 멸종 위기 종이다. 특정 실시양태에서, 종은 현재 멸종된 종이다.
유도 만능성 줄기 세포는 임의의 발달 단계의 실질적으로 모든 체세포를 시작점으로 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 세포는 배아, 태아, 신생아, 청소년 또는 성인 공여자로부터 유래할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 체세포는 섬유모세포, 예를 들어 피부 샘플 또는 생검에 의해 수득된 진피 섬유모세포, 활막 조직으로부터의 활막 세포, 포피 세포, 뺨 세포 또는 폐 섬유모세포를 포함한다. 피부 및 뺨은 쉽게 구할 수 있고 쉽게 얻을 수 있는 적절한 세포의 공급원을 제공하지만, 실질적으로 임의의 세포를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 체세포는 섬유모세포가 아니다.
유도 만능성 줄기 세포는 체세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 발현하거나 발현을 유도함으로써 생성될 수 있다. 체세포는 진피 섬유모세포, 활막 섬유모세포 또는 폐 섬유모세포와 같은 섬유모세포, 또는 비섬유모세포성 체세포일 수 있다. 체세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 재프로그래밍 인자의 발현 유발(예를 들어, 바이러스 형질도입, 통합 또는 비통합 벡터 등) 및/또는 상기 인자와의 접촉(예를 들어, 단백질 형질도입 도메인, 전기천공, 미세주입, 양이온성 양친매체, 세제 투과성을 갖는 지질 이중층과의 융합 등을 사용하여)을 통해 재프로그래밍될 수 있다. 재프로그래밍 인자는 OCT3/4, SOX2, NANOG, LIN28, C-MYC 및 KLF4로부터 선택할 수 있다. 재프로그래밍 인자의 발현은 체세포를 적어도 하나의 작용제, 예를 들어 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 유기 소분자와 접촉시킴으로써 유도될 수 있다.
추가의 예시적인 만능성 줄기 세포는 인자의 조합("재프로그래밍 인자")을 발현하거나 유도하여 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성된 유도 만능성 줄기 세포를 포함한다. iPS 세포는 세포 은행에서 얻을 수 있다. iPS 세포의 제조는 분화된 세포 생산의 초기 단계일 수 있다. iPS 세포는 조직 일치 조혈 세포 생성을 목표로 특정 환자 또는 일치 공여자로부터의 물질을 사용하여 특이적으로 생성될 수 있다. iPSC는 의도된 수여자에서 실질적으로 면역원성이 아닌 세포, 예를 들어 자가 세포로부터 또는 의도된 수여자와 조직 적합성이 있는 세포로부터 생산될 수 있다.
체세포는 또한 조합 방법을 사용하여 재프로그래밍될 수 있고, 여기서 재프로그래밍 인자가 발현되고(예를 들어, 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 사용하여), 재프로그래밍 인자의 발현이 유도된다(예를 들어, 유기 소분자를 사용하여). 예를 들어, 재프로그래밍 인자는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 체세포에서 발현될 수 있다. 또한, 재프로그래밍 인자는 에피솜 플라스미드와 같은 비통합 벡터를 사용하여 체세포에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Yu et al., Science. 2009 May 8; 324(5928):797-801]을 참조하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 재프로그래밍 인자가 비통합 벡터를 사용하여 발현될 때, 인자는 벡터에 의한 체세포의 전기천공, 형질감염 또는 형질전환을 사용하여 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 마우스 세포에서 통합 바이러스 벡터를 사용한 네 가지 인자(OCT3/4, SOX2, C-MYC 및 KLF4)의 발현은 체세포를 재프로그래밍하기에 충분하다. 인간 세포에서, 통합 바이러스 벡터를 사용한 네 가지 인자(OCT3/4, SOX2, NANOG 및 LIN28)의 발현은 체세포를 재프로그래밍하기에 충분하다.
재프로그래밍 인자가 세포에서 발현되면, 세포를 배양할 수 있다. 시간이 지남에 따라, ES 특징을 가진 세포가 배양 접시에 나타난다. 세포는 예를 들어 ES 형태를 기초로 하거나, 선택 가능하거나 검출 가능한 마커의 발현에 기초하여 선택되고 계대 배양될 수 있다. 세포는 ES 세포와 유사한 세포(이들은 iPS 세포로 추정됨)의 배양물을 생성하기 위해 배양될 수 있다.
iPS 세포의 만능성을 확인하기 위해, 세포는 하나 이상의 만능성 분석에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 세포는 ES 세포 마커의 발현에 대해 시험될 수 있고; 세포는 SCID 마우스에 이식될 때 기형종을 생성하는 능력에 대해 평가될 수 있고; 세포는 세 가지 생식층 모두의 세포 유형을 생산하는 분화 능력에 대해 평가될 수 있다. 만능성 iPSC가 수득되면, 이것은 본 명세서에 개시되는 세포 유형을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
hPSC를 얻는 또 다른 방법은 단성 생식이다. "단성 생식"("단성 생식적으로(parthenogenically) 활성화된" 및 "단성 발생적으로(parthenogenetically) 활성화된"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용됨)은 정자의 침투 없이 난모세포의 활성화가 일어나는 과정을 지칭하고, 모든 자성 기원의 DNA를 포함하는 난모세포 또는 배아 세포, 예를 들어 할구의 활성화에 의해 얻어지는 내부 세포 덩어리 및 영양외배엽을 포함하는 초기 단계 배아의 발생을 지칭한다. 관련 측면에서, "반수성체"는 상기 활성화에 의해 얻은 생성된 세포를 지칭한다. 또 다른 관련 측면에서, "배반포"는 외부 영양막 세포 및 내부 세포 덩어리(ICM)로 이루어진 속이 빈 구형의 세포를 포함하는 난할 단계의 수정된 또는 활성화된 난모세포를 지칭한다. 추가의 관련 측면에서, "배반포 형성"은 난모세포 수정 또는 활성화 후에, 외부 영양막 세포 및 ICM으로 이루어진 속이 빈 구형의 세포로 발생하기에 충분한 시간(예를 들어, 5 내지 6일) 동안 난모세포를 배지에서 후속 배양하는 과정을 지칭한다.
hPSC를 얻는 또 다른 방법은 핵 이식을 통한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "핵 이식"은 공여자 세포 또는 공여자 세포로부터의 DNA를, 적절한 수여자 세포, 전형적으로 그의 내인성 핵 DNA를 제거하거나 불활성화하기 위해 이식 또는 융합 전에, 동안 또는 후에 처리되는 동일하거나 상이한 종의 난모세포로 융합하거나 이식하는 것을 지칭한다. 핵 이식에 사용되는 공여자 세포는 배아 및 분화된 세포, 예를 들어 체세포 및 생식 세포를 포함한다. 공여자 세포는 증식 세포 주기(G1, G2, S 또는 M) 또는 비증식 주기(G0 또는 휴지기)에 있을 수 있다. 바람직하게는, 공여자 세포 또는 공여자 세포로부터의 DNA는 증식하는 포유동물 세포 배양물, 예를 들어 섬유모세포 세포 배양물로부터 유래된다. 공여자 세포는 선택적으로 트랜스제닉 세포일 수 있고, 즉, 하나 이상의 유전자 부가, 치환, 또는 결실 변형을 포함할 수 있다.
hPSC를 얻는 또 다른 방법은 유도 만능성 줄기 세포를 얻기 위해 세포를 재프로그래밍하는 것이다. 문헌 [Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007)]은 배아 또는 ES(배아 줄기) 세포를 사용하지 않고 분화된 세포를 재프로그래밍하고, ES 세포와 유사한 만능성 및 성장 능력을 가진 유도성 만능성 줄기 세포를 확립하는 방법을 개시하고 있다. 분화된 섬유모세포를 위한 핵 재프로그래밍 인자는 다음 네 가지 유전자의 산물을 포함한다: Oct 패밀리 유전자; Sox 패밀리 유전자; Klf 패밀리 유전자; 및 Myc 패밀리 유전자.
세포의 만능성 상태는 바람직하게는 적절한 조건 하에서 세포를 배양함으로써, 예를 들어 섬유모세포 피더층 또는 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하는 또 다른 피더층 또는 배양물에서 배양함으로써 유지된다. 이러한 배양된 세포의 만능성 상태는 다양한 방법, 예를 들어 (i) 만능성 세포의 특징적인 마커의 발현을 확인하는 것; (ii) 만능성 세포의 유전자형을 발현하는 세포를 포함하는 키메라 동물의 생산; (iii) 생체 내에서 상이한 분화된 세포 유형의 생산과 함께 동물, 예를 들어 SCID 마우스 내로의 세포의 주입; 및 (iv) 시험관 내에서 배아체 및 다른 분화된 세포 유형으로의 세포의 분화(예를 들어, 피더층 또는 LIF의 부재 하에 배양될 때)의 관찰에 의해 확인될 수 있다.
본 개시내용에서 사용되는 세포의 만능성 상태는 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, 세포는 특징적인 ES 세포 마커의 존재 또는 부재에 대해 시험될 수 있다. 인간 ES 세포의 경우, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60, TRA-1-81 및 OCT 4를 포함하는 이러한 마커의 예가 상기에서 확인되었으며, 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
또한, 적합한 동물, 예를 들어 SCID 마우스에 세포를 주입하고 분화된 세포 및 조직의 생성을 관찰함으로써 만능성을 확인할 수 있다. 만능성을 확인하는 또 다른 방법은 대상 만능성 세포를 사용하여 키메라 동물을 생성하고 도입된 세포가 상이한 세포 유형에 기여하는 것을 관찰하는 것이다.
만능성을 확인하는 또 다른 방법은 분화에 유리한 조건(예를 들어, 섬유모세포 피더층의 제거)에서 배양할 때 배아체 및 다른 분화된 세포 유형으로의 ES 세포 분화를 관찰하는 것이다. 이 방법이 이용되었고, 대상 만능성 세포가 조직 배양에서 배아체 및 상이한 분화된 세포 유형을 발생시키는 것이 확인되었다.
hPSC는 조혈 계통 세포 유도가 필요할 때까지 통상적인 계대배양에 의해 만능성 상태로 배양물에서 유지될 수 있다.
조혈 세포를 생성하기 위한 3D 매트릭스 및 담체가 없는 구체 배양
조혈 줄기 세포(HSC)는 모든 조혈 계통의 세포를 생성한다. PSC로부터 조혈 세포를 만드는 방법에 대한 상당한 진전이 있었다. 그러나, 대규모 산업적 제조에 적합한 공정은 여전히 이용 불가능하며, 이는 줄기 세포를 임상 용도로 전환하는 데 명백한 장애물이다.
일부 실시양태에서, 인간 PSC를 HEC 및 HPC로 전환하기 위한 고도로 재현 가능하고 확장 가능하며 정의된 3D 구체 분화 시스템이 본원에서 제공되며, 이는 다시 MK/혈소판, RBC 및 NK 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는 조혈 세포의 거의 모든 계통으로 강력하게 분화될 수 있다.
이전에 보고된 방법과 비교하여, 본원에서 개시된 3D 구체 시스템은 비제한적으로, 다음과 같은 기술적 측면에서 상당한 이점을 가지고 있다:
(1) 분화 시작시 잘 제어된 PSC 구체 크기 - 이는 고효율 및 작은 가변성을 가진 중배엽 계통에 대한 인간 PSC의 균질한 사양에 중요하다. 바람직한 구체 크기의 균일성은 산소, 영양소 및 분화 유도 인자/분자가 구체의 중심 코어를 관통하도록 허용하고, 순수한 계통 특이적 집단을 생성하기 위한 동기화된 분화 과정을 유도할 수 있으며, 이것은 자연적으로 형성된 배아체(EB) 및 다른 소위 오가노이드(organoid) 시스템에는 결여된 것이다. 본 개시내용의 시스템은 구체 크기 최적화 노력은 최소화하면서 상이한 hESC 또는 iPSC 라인으로부터 HEC, HPC 및 조혈 세포의 생산에 적합하다;
(2) 본 개시내용의 3D 구체 플랫폼에는 피더 세포, 혈청, 정의되지 않은 매트릭스 또는 담체가 필요하지 않으므로, 상기 플랫폼은 잠재적인 임상 적용을 위해 cGMP 준수 세포 제조에 친화적으로 적용 가능하다;
(3) PSC 확장 및 분화의 전체 과정은 3D 현탁 배양 조건 하에 있으며, 이는 임의의 원하는 작업 부피에서 상업적으로 이용 가능한 일회용 생물 반응기로 쉽게 확대될 수 있다:
(4) HPC는 효소에 의한 해리와 같은 어떠한 처리도 시행하지 않으면서 자연적으로 및 자동으로 단일 세포로 현탁액에 방출될 수 있다. 방출된 HPC는 높은 생존력을 유지하여, 부피 감소, 여과, 냉동 보존 및 필요한 경우 농축/고갈과 가은 하류 공정에 대한 높은 내성을 유지할 수 있다;
(5) 중간엽 줄기 세포(MSC), 내피 세포 및 평활근 세포와 같은 기타 중배엽 계통 부산물은 본 개시내용의 3D 구체 플랫폼으로부터 얻을 수 있다.
세포 배양 표면을 변형하여 세포가 그 표면에 부착되는 것을 방지함으로써 3D 배양 형성을 촉진하는 강제 부유 방법; 현탁액에서 세포 성장을 지지하는 현적 방법; 및 3D 구상체를 형성하기 위해 세포가 서로 부착하도록 촉진하는 교반/회전 시스템을 포함하는 다양한 3D 구체 배양 절차를 사용할 수 있다.
3D 구상체를 생성하는 한 가지 방법은 표면을 변형하여 혈관 표면에 부착되는 것을 방지함으로써 세포의 강제 부유를 유발하는 것이다. 이것은 세포-세포 접촉을 촉진하고, 이에 의해 다세포 구체 형성이 촉진된다. 예시적인 표면 변형은 폴리-2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(폴리-HEMA) 및 아가로스를 포함한다.
3D 구상체 생산을 위한 현적 방법은 트레이의 웰에 피펫팅된 단일 세포 현탁액의 작은 분취량(일반적으로 20 ml)을 사용한다. 강제 부유와 유사하게, 시딩 현탁액의 세포 밀도(예를 들어, 50, 100, 500개 세포/웰)는 필요한 구상체 크기에 따라, 관련되는 바와 같이 변경될 수 있다. 세포 시딩 후, 트레이는 뒤집어지고, 세포 현탁액의 분취량은 표면 장력으로 인해 제자리에 유지되는 매달린 방울로 변한다. 세포는 액체-공기 경계면에서 방울의 끝 부분에 축적되고, 증식할 수 있다.
3D 구상체 생산을 위한 교반 기반 접근법은 (i) 스피너 플라스크 생물 반응기 및 (ii) 회전 배양 시스템이라는 두 가지 범주로 느슨하게 배치될 수 있다. 이러한 방법의 일반적인 원리는 세포 현탁액을 용기에 넣고, 현탁액을 계속 움직이게 하는 것으로서, 다시 말하면, 현탁액을 부드럽게 교반하거나 용기를 회전시키는 것이다. 현탁된 세포의 연속적인 움직임은 세포가 용기 벽에 달라 붙지 않지만, 세포-세포 상호작용을 형성함을 의미한다. 스피너 플라스크 생물 반응기(전형적으로 "스피너"로 알려짐)는 세포 현탁액을 보관하는 용기 및 세포 현탁액이 연속적으로 혼합되도록 하는 교반 요소를 포함한다. 회전하는 세포 배양 생물 반응기는 스피너 플라스크 생물 반응기와 유사한 수단에 의해 기능하지만, 세포 현탁액 움직임을 유지하기 위해 교반 바/막대를 사용하는 대신에 배양 용기 자체가 회전한다.
일부 실시양태에서, 스피너 플라스크 기반 3D 구체 배양 프로토콜이 본원에서 제공된다. 복수의 hPSC는 피더 세포 및 매트릭스의 부재 하에 규정된 배양 배지가 존재하는 스피너 플라스크에서 실질적으로 균일한 구체로서 연속적으로 배양될 수 있다. 배양 배지는 hiPSC 및 hES와 같은 hPSC의 성장 및 확장을 지지하도록 설계된 임의의 규정된, 이종이 없는(xeno-free) 무혈청 세포 배양 배지일 수 있다. 한 예에서, 배지는 NutriStem® 배지(Biological Industry)이다. 일부 실시양태에서, 배지는 mTeSR™1, mTeSR™2, TeSR™-E8™ 배지(StemCell Technologies) 또는 다른 줄기 세포 배지일 수 있다. 배지는 Rho 관련 코일드 코일(coiled-coil) 함유 단백질 키나아제(ROCK)의 소분자 억제제, 예를 들어 Y27632 또는 다른 ROCK 억제제, 예를 들어 티아조비빈, ROCK II 억제제(예를 들어, SR3677) 및 GSK429286A로 보충될 수 있다. 상기 현탁 배양 시스템을 사용하면, hPSC 배양액을 연속적으로 계대배양하고, 적어도 10회의 계대배양 동안 지속적으로 확장할 수 있다. 3D-hiPSC 구체의 일반적인 계대배양 간격은 약 3 내지 6일일 수 있으며, 이 때 구체는 직경이 약 230 내지 260 μm 크기로 성장할 수 있다. 구체 크기는 배양액의 분취량을 취하고, 예를 들어 현미경을 사용하여 관찰함으로써 모니터링할 수 있다. 이어서, 구체는 예를 들어 일차 및 줄기 세포주 및 조직의 분리를 위한 단백질 분해 및 콜라겐 분해 활성을 갖는 효소를 사용하여 단일(또는 실질적으로 단일의) 세포로 분리될 수 있다. 한 예에서, 효소는 아큐타제(Accutase)®(Innovative Cell Technologies, Inc), TrypLE(Thermo Fisher) 또는 트립신/EDTA이다. 그 후, 분리된 세포는 예를 들어 60-70 RPM에서의 연속 교반 하에 스피너 플라스크에서 구체를 재형성하기 위해 재응집될 수 있다. 구체는 적어도 3-5회 반복된 계대배양 후에 높은 만능성 마커 발현(OCT4) 및 정상 핵형과 함께 균일한 구조를 유지하면서 점차적으로 크기가 증가하였다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "계대배양"은 단일 세포로부터 바람직한 크기의 구체로 성장한 세포 구체 배양물을 의미하는 것으로 이해되며, 이때 구체는 단일 세포로 분리되고, 다음 계대배양을 위해 다시 시딩된다. 계대배양은 3D-hiPSC 구체의 경우 약 3-6일이 걸리거나, hPSC의 유형 및 배양 조건에 따라 더 길거나 짧을 수 있다. 충분한 양의 3D-hPSC 구체가 얻어지면, 이들은 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이 3D 구체 분화에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, hiPSC 세포는 NutriStem® hPSC XF 배지(Biological Industries USA)에서 라미닌(Laminin) 521 또는 라미닌 511과 같은 매트릭스 상에서 배양될 수 있다. 융합성(confluent) 미분화 hiPSC를 아큐타제® 또는 TripLE를 사용하여 계대배양하고, 1 μM의 Y27632로 보충된 NutriStem®에 1 cm2당 6-8 x 104개의 밀도로 감소된(1/2) 농도의 매트릭스로 코팅된 표면 상에 시딩하고, 3-7일 동안 배양할 수 있다. HiPSC는 상기 조건에서 3-5회의 계대배양 동안 또는 필요한 만큼의 계대배양 동안 확장될 수 있다. hiPSC의 미분화 상태는 유세포 분석(95% 초과의 Oct-4 양성)에 의해 Oct-4의 발현 수준으로 정량될 수 있다.
3D 현탁 배양을 시작하기 위해, 융합성 미분화 hiPSC는 아큐타제 또는 TripLE에 의해 분리될 수 있고, Y27632(약 1 μM)로 보충된 NutriStem®에, 예를 들어 1 x 106개의 세포/mL의 밀도로 스피너 플라스크에 시딩되었다. 세포는 30 mL의 스피너 플라스크(Abel Biott)에서 50-80 RPM의 교반 속도로 48시간 동안 중단없이 배양될 수 있다. 시딩 후 48시간이 지나면, 작은 샘플을 채취할 수 있으며, 현미경으로 형태 및 구체 크기를 조사할 수 있다. 구체 크기가 직경 250 - 300 마이크로미터에 도달할 때까지 배지를 주기적으로 새로운 배지로 교체할 수 있다. 계대배양을 위해, hiPSC 구체를 PBS(Mg-, Ca-)로 세척한 다음, 아큐타제 또는 TripLE과 같은 효소로 분리할 수 있다. 이어서, 분리된 hiPSC 단일 세포는 조혈 분화의 확장 또는 개시를 위해 원하는 밀도로 시딩될 수 있다.
hPSC로부터 HEC 및 조혈 계통을 생성하기 위해, 현탁액 내의 3D-hPSC 구체를 규정된 성장 인자 및 소분자를 사용하여 단계적인 방식으로 직접 유도할 수 있다(도 2). 일부 실시양태에서, 이것은 3D 스피너 플라스크 또는 다른 3D 구체 배양 방법에서 수행될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 연속적인 3D 구체 배양은 여러 분리/재응집 단계로 통합될 수 있지만, 성장 인자 및 소분자는 분화를 유도하기 위해 상이한 단계에서 첨가될 수 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, hPSC(예를 들어, hiPSC)는 원하는 구체 크기가 될 때까지 약 6-24시간 또는 약 12시간 동안 Y27632(약 1 μM)로 보충된 HEC 유도 배지 M1(예를 들어, NutriStem®, mTeSR™1, mTeSR™2, TeSR™-E8™ 또는 3D 현탁 배양에 적합한 다른 배양 배지)에서 원하는 밀도(예를 들어, 세포 크기에 따라 0.5-1.5 x 106개의 세포/ml)로 단일 세포로 시딩될 수 있다. 전형적인 구체 크기는 시딩 밀도에 따라 직경이 60-150 마이크로미터, 약 70-120 마이크로미터 또는 약 80-100 마이크로미터일 수 있다. 이론에 매이기를 바라지 않으면서, 구체 크기는 기하학적 구조, 세포 대 세포 접촉, 및 구체 외부에서 구배를 형성할 수 있는 영양분 및 성장 인자에 대한 접근성으로 인해 HEC 분화에 영향을 미칠 수 있다고 생각된다. 일부 실시양태에서, 구체 크기는 예를 들어 현미경을 사용하여, HEC 분화를 시작하기 전에 직경이 약 60-110 마이크로미터, 약 70-100 마이크로미터 또는 약 80-90 마이크로미터 범위에 있도록 모니터링될 수 있다.
HEC 분화를 시작하기 위해, M1을 제거하고, 약 10-100, 약 25-50, 또는 약 30-40 ng/mL의 농도로 BMP4, VEGF 및 bFGF로 보충된 HEC 유도 배지 M2(예를 들어, 성장 인자가 없는 NutriStem® hPSC XF 배지®, mTeSR™1, mTeSR™2, TeSR™-E8™ 또는 3D 현탁 배양에서 중배엽 분화의 촉진에 적합한 다른 배양 배지)로 교체할 수 있다. M2 내의 HiPSC 구체는 저산소 상태(약 5% 산소)에서 약 1-10일 또는 3-8일 또는 4일 동안 배양한 다음, 약 20%의 정상 산소 농도에서 추가로 약 1-5일 또는 약 2일 동안 배양할 수 있다. 이론에 매이기를 바라지 않으면서, 저산소 상태는 초기 배아 발달 상태를 모방하여 분화를 유도할 수 있다고 생각된다.
소분자 CHIR99021은 세포가 저산소 상태에서 일정 시간(예를 들어, 1-5일)을 보낸 후, 약 1-10, 약 2-5, 또는 약 3 μM로 첨가될 수 있다. 소분자 SB431542는 CHIR99021과 함께 또는 그 후에(예를 들어, CHIR99021 첨가 후 0-3일에), 약 1-10, 약 2-5, 또는 약 3 μM로 첨가될 수 있다. 도 2에 제시된 예에서, CHIR99021은 3일차 및 4일차에 첨가되며, SB431542는 4일차 및 5일차에 첨가된다. 그 후, CHIR99021 및 SB431542를 배양 배지에서 제거할 수 있다.
HEC 분화의 후기 단계(예를 들어, 6일 또는 그 후) 동안, 세포 구체는 효소(예를 들어, 37℃에서 15-30분 동안 아큐타제®, TrypLE 또는 트립신/EDTA) 처리에 의해 실질적으로 단일 세포 현탁액으로 분리될 수 있다. HEC 특이적 표면 마커 CD31, CD144(VE-카드헤린), CD34 및 CD43의 발현은 유세포 분석을 사용하여 분석할 수 있다. HEC의 실질적으로 단일 세포는 생체내 조혈 니치를 모방하는 스캐폴드에 시딩될 수 있다. 니치는 세포 운명을 제어하는 주요 조절 신호를 나타내는 매트릭스, 스캐폴드 및 배양 기질과 같은 생체 물질의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 모방할 수 있다. 생체 물질은 천연, 반합성 및 합성 생체 물질 및/또는 이들의 혼합물일 수 있다. 스캐폴드에 적합한 합성 물질은 다공성 고체, 나노 섬유 및 하이드로겔, 예를 들어, 키토산, 폴리락트산, 폴리스티렌, 자가 조립 펩타이드를 포함하는 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 포스페이트로 구성된 하이드로겔, 폴리에틸렌 글리콜 푸마레이트, 폴리아크릴아마이드, 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리셀룰로오스 아세테이트, 및/또는 이들의 공중합체로부터 선택되는 중합체를 포함한다(예를 들어, 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Saha et al., 2007, Curr. Opin. Chem. Biol. 11(4): 381-387; Saha et al., 2008, Biophysical Journal 95: 4426-4438; Little et al., 2008, Chem. Rev. 108, 1787-1796; Carletti et al., Methods Mol Biol.2011; 695: 17-39; Geckil et al., Nanomedicine (Lond). 2010 April; 5(3): 469-484] 참조). 일단 시딩되면, 세포는 스캐폴드 내에서 적절한 배지 및 적절한 성장 인자의 존재 하에 배양되어, 바람직한 림프 계통 세포, 예를 들어 림프구(예를 들어, T 림프구), 자연 살해(NK) 세포, 공통 골수성 전구 세포, 공통 과립단핵구성 전구 세포, 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포로 분화할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 바람직한 림프 계통 세포에 따라 적합한 배지 및 적합한 성장 인자의 선택을 알고 있을 것이다.
대안적으로, (효소에 의한 분리 없이) HEC 함유 구체는 조혈 전구 세포(HPC)로의 분화 및 확장을 유도하기 위한 조혈 수임 및 확장 배지 M3(기초 배지, 예를 들어 StemSpan™-ACF(STEMCELL Technologies Inc.), PRIME-XV®(Irving Scientific), PromoCell® 조혈 전구 세포 확장 배지 DXF(PromoCell GmbH) 및 3D 현탁 배양에서 조혈 줄기 세포 확장에 적합한 다른 배양 시스템)으로 이동할 수 있다. M3는 1단계 확장의 약 3-10일, 약 4-8일 동안 또는 약 5일 동안 TPO(10-25 ng/ml), SCF(10-25 ng/ml), Flt3L(10-25 ng/ml), IL-3(2-10 ng/ml), IL-6(2-10 ng/ml), SR1(0.75 μM), OSM(2-10 ng/ml), 및 EPO(2 U/ml) 중 하나 이상으로 보충될 수 있다. HPC는 구체로부터 자동적으로(구체의 효소에 의한 분리 없이) 방출될 수 있다.
추가의 분화 및 확장은 조혈 분화/확장 배지 M4(기초 배지, 예를 들어 StemSpan™-ACF(STEMCELL Technologies Inc.), PRIME-XV®(Irving Scientific), PromoCell® 조혈 전구 세포 확장 배지 DXF(PromoCell GmbH) 및 3D 현탁 배양에서 거핵구, 적혈구, 골수 및 림프 계통의 다양한 조혈 세포의 계통 특이적 확장 및 성숙에 적합한 다른 배양 시스템)에서 달성될 수 있다. M4는 상기 2단계 확장(최대 40일 또는 그 초과) 동안 TPO(10-25 ng/ml), SCF(10-25 ng/ml), Flt3L(10-25 ng/ml), IL-3(2-10 ng/ml), IL-6(2-10 ng/ml), SR1(0.75 μM), OSM(2-10 ng/ml), 및 EPO(3 U/ml) 중 하나 이상으로 보충될 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 상이한 세포 유형, 예를 들어 공통 적혈구/거핵구 전구 세포, 적혈구, 거핵구, 혈소판, 공통 림프성 전구 세포, 림프 계통 세포, 림프구(예를 들어, T 림프구), 자연 살해(NK) 세포, 공통 골수성 전구 세포, 공통 과립단핵구성 전구 세포, 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포, 또는 이들 중 임의의 2개 이상의 혼합물로의 분화를 촉진하기 위해 상이한 배지 및 성장 인자가 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
배지는 분화하는 동안 매일 변경될 수 있다. 제1 배지로부터 제2 배지로 전환할 때, 제2 배지에 대한 점진적인 적응은 제1 배지와 제2 배지의 일련의 희석을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 제1 배지 100%로부터 제2 배지 100%로의 점진적 적응은 제1 배지 및 제2 배지를 75%:25%, 50%:50% 및 25%:75%로 순차적으로 사용한 중간 배양을 포함할 수 있으며, 여기서 세포는 각각의 배지 조성물에서 2-6일 동안 유지된다. 또한, 다른 희석 시리즈도 사용할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 다양한 목적을 위해 세포 요법에 사용될 수 있는 hPSC, 특히 HEC 및 조혈 세포로부터 바람직한 세포를 생성하기 위한 새롭고 효율적이며 정의된 3D 구체 플랫폼이 제공된다.
조혈 세포의 사용
중요하게는, 본원에서 입증된 바와 같이, 본 개시내용의 3D PSC 분화 시스템으로 생성된 HPC는 모든 혈액 계통, 특히 CD34+ 집단의 다중 세포 유형을 형성하는 능력을 보유하며, 이는 다능성 HSC의 특징과 유사한 다중 유형의 CFU를 강력하게 생성할 수 있다. 또한, 특정 조건 하에서 배양한 후, MK 및 적혈구 세포에 대한 공통 전구 세포를 나타낼 수 있는 CD235a+CD41+ 이중 양성 HPC는 각각 MK/혈소판 및 적혈구 세포를 우선적으로 생성하였다. 인간 PSC 유래 MK/혈소판 및 RBC는 수혈 요법에 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 치료 단백질의 담체 역할도 할 수 있다. 이 목표를 달성하기 위해, 마스터 PSC 뱅크는 상처 부위 또는 종양 등에서 활성화될 때 치료 단백질을 방출할 수 있는 MK/혈소판의 제조를 위한 치료 단백질을 발현하도록 조작될 수 있다. 혈소판 α-과립 신호 서열이 특성화됨에 따라, 재조합 융합 치료 단백질을 코딩하는 유전자가 PSC에 도입될 수 있다. MK 세포로 분화한 후, 이들 단백질은 α-과립으로 패키징되고, 치료 목적을 달성하기 위해 바람직한 부위에서 방출된다. 이러한 단백질에는 손상 부위에서의 국소 전달에 의한 혈우병 치료를 위한 인자 VIII; 당뇨병성 궤양 및 화상의 치료에서와 같이 피브린에 의한 상처 치유 반응의 촉진을 위한 에리트로포이에틴; 및 인슐린 유사 성장 인자 1, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 항-혈관 형성/항-종양 단백질을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이와 유사하게, 범용 RhD 음성 O형 RBC를 제조하기 위한 조작된 마스터 PSC 뱅크를 사용하여, 치료 단백질, 예를 들어 항원 특이적 면역 내성 유도에 관여하는 단백질을 발현하는 범용 RBC를 생성할 수 있다. 그의 표면이나 세포 내부에 특정 항원을 발현하는 범용 적혈구는 매우 민감한 개체에게 이식될 수 있다. RBC가 순환하고 노화되고 제거됨에 따라, 자가면역을 억제하기 위한 면역계의 천연 메카니즘을 사용하여 특정 항원이 프로세싱될 것이다.
림프 계통 잠재력의 획득은 배아 내에서 난황낭의 원시적 조혈과는 대조적으로, 대동맥-생식선-중신(AGM: aorta-gonad-mesonephros) 영역 내에서 확정적 조혈의 중요한 지표로 오랫동안 간주되어 왔다(Park et al. 2018). 본원의 실시예에서 제시되는 바와 같이, 본 개시내용의 3D 분화 PSC 구체로부터 수득된 HPC는 CD56+high NK 세포를 생성하였으며, 이는 본 개시내용의 정의된 시스템이 확정적 조혈의 발달을 지지함을 시사한다. 여러 이전 보고서가 림프 세포의 생성을 보여주었지만, 이러한 연구의 대부분은 피더 세포 및/또는 혈청을 사용하였고(de Pooter and Zuniga-Pflucker 2007; D'Souza et al. 2016; Zeng et al. 2017; Ditadi et al. 2015), 이는 잠재적 인 임상 적용을 제한한다.
따라서, 본 개시내용의 또 다른 중요한 기술적 진보는 혈청 및 피더가 없는 3D 조건에서 순수한 진성 NK 세포의 생성이다. 이것은 암 면역요법을 위한 종양 특이적 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 운반할 수 있는 PSC(예를 들어, hESC 및 iPSC)로부터 임상적으로 관련된 용량의 NK 세포를 제조하는 것을 가능하게 한다. 조작된 CAR-T 세포를 이용한 입양 세포 요법은 B 세포 악성 종양 환자를 치료하는 데 임상적으로 성공한 것으로 밝혀졌다(Grupp et al. 2013; Kochenderfer et al. 2010). 그러나, CAR-T 세포는 동종 T 세포의 주입으로 심각한 이식편 대 숙주 질환(GVHD)의 위험이 발생할 수 있으므로, 자가 T 세포 제조 과정 및 수혈로 인해 심각한 제한이 있다(Mehta and Rezvani 2018). T 세포 및 B 세포와는 달리, NK 세포는 재배열된 항원 특이적 수용체를 발현하지 않는다. NK 세포 수용체는 생식세포(germline) 코딩되고, 표적 세포의 그의 특이적 리간드와 결합할 때 활성화 또는 억제 기능을 갖는다. KIR은 HLA 클래스 I 분자를 인식하는 가장 많이 연구된 NK 세포 수용체이다. NKG2A, -B, -C, -D, -E 및 -F와 같은 다른 수용체는 비고전적인 HLA 클래스 I 분자(HLA-E)를 인식한다. 건강한 세포는 억제 NK 수용체를 통해 그의 표면에 있는 "자기" HLA 분자를 인식함으로써 NK 세포로부터 보호된다(Lanier 2001; Yokoyama 1998). 종양 또는 바이러스에 감염된 세포는 T 세포에 의한 공격을 피하기 위해 위장으로서 그의 HLA 분자를 종종 하향조절하거나 상실한다(Costello, Gastaut and Olive 1999; Algarra et al. 2004). 자가 NK 세포 입양 요법은 초기 임상 조사를 통해 암 치료에 효과가 없는 것으로 입증되었다(Burns et al. 2003; deMagalhaes-Silverman et al. 2000). 그러나, HSC 이식(Ruggeri et al. 2002) 및 암 요법(Bachanova et al. 2014)에서 동종 반응성 NK 세포의 임상적 이점은 유망한 결과를 보여주었다. 따라서, CAR-NK 세포는 동종 세포 요법을 위해 CAR-T보다 우수한 선택으로 생각된다.
그러나, CAR-NK의 발전은 제한된 NK 세포 공급원으로 인해 저지되었다. NK 세포는 말초 혈액(PB), 골수(BM) 및 제대혈(CB)로부터 수집될 수 있다. 이 과정은 번거롭고, 공여자에게 원치 않는 건강상 위험을 초래할 수 있다(Winters 2006; Yuan et al. 2010). 수집된 NK 세포는 확장 능력이 제한되어 있으며, 소량의 T 세포 또는 B 세포에 의한 오염으로 인해 GVHD가 발생할 수 있다. CB로부터 수집한 NK 세포는 진행중인 임상 시험에 사용되었지만, GMP 등급의 인공 항원 제시 세포와 공동 배양하여 크게 확장되어야 한다(Shah et al. 2013). 세포주 NK-92는 여러 CAR-NK 임상 시험(중국에서 시행됨)에서 사용된다. NK-92 세포주는 NK 세포 림프종 환자로부터 유래되었다. 이 세포는 EBV 양성일 수 있으며, 림프종에서 발견되는 여러 세포 유전학적 이상을 가지고 있다(MacLeod et al. 2002). 따라서, NK-92 유래 CAR-NK 세포는 환자에게 주입하기 전에 방사선을 조사해야 하며, 이는 그의 생체 내에서의 지속성 및 기능에 부정적인 영향을 끼친다(Schonfeld et al. 2015). 인간 PSC(hESC 및 iPSC 둘 모두)는 NK 세포를 생성할 수 있는 것으로 입증되었다(Knorr et al. 2013; Li et al. 2018; Zeng et al. 2017). 초기에 보고된 연구는 스핀 EB 생성(Knorr et al. 2013; Li et al. 2018)에 의존하였으며, 이는 규모 확대 공정에 적합하지 않다. 이종 기원(xeno-origin) 피더 세포가 PSC 배양(Knorr et al. 2013). 및 NK 분화(Zeng et al. 2017)에 사용되었다. 본 발명자들이 새로 개발한 3D NK 제조 공정은 3D 구체 분화를 장기 구조의 미세 환경을 모방한 3D 스캐폴드와 조합한 것으로서, 이전에 보고된 공정에 비해 다음과 같은 상당한 이점이 있다: (1) 규모 확대에 대한 제한 없음; (2) 본 발명자들의 NK-특이적 배양 배지는 혈청 및 피더가 없는 것으로 규정됨; (3) NK 집단은 T 세포 및 B 세포로 오염되지 않고 순수함. 본 발명자들은 또한 HLA 클래스 I 분자(A, B, C)를 발현하지 않지만 비고전적인 클래스 I 분자 HLA-E를 발현하는 hiPSC 라인을 확립하였다. NK 맞춤형 CAR을 이러한 hiPSC 라인으로 조작하여 마스터 PSC 뱅크를 구축함으로써, 진정한 기성 치료 제품을 위한 범용 CAR-NK 세포를 생성할 수 있다.
따라서, 재생 가능한 hPSC로부터 HEC 및 HPC를 생성하기 위한 강력하고 규정된 3D 구체 플랫폼 이외에, 그로부터 유래된 계통 특이적 조혈 세포가 본원에서 제공된다. 이 시스템은 대규모 생산 노력에 순응할 뿐만 아니라 피더 세포, 동물 혈청 및 매트릭스에 대한 의존성을 제거하여, cGMP 준수 세포 제조 프로토콜에 친화적으로 적용 가능하고 공정을 임상 번역에보다 쉽게 적용할 수 있도록 만든다. 단일 또는 통합된 다단계 생물 반응기를 사용하여, 임의의 조혈 세포를 주문형으로 제조할 수 있다. 이러한 기술적 진보를 위한 응용은 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이 제한이 없을 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 세포 조성물은 세포 요법에 사용될 수 있다. 세포 요법은 예를 들어 입양 세포 요법, CAR-T 세포 요법, 조작된 TCR T 세포 요법, 종양 침윤 림프구 요법, 항원 훈련된 T 세포 요법, 또는 강화된 항원 특이적 T 세포 요법으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 조성물은 약제학적으로 허용되는 양 및 약제학적으로 허용되는 조성물로 제제화될 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 활성 성분(예를 들어, 나노 입자의 생물학적 활성 단백질)의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 무독성 물질을 의미한다. 이러한 조성물은 일부 실시양태에서 염, 완충제, 보존제, 및 선택적으로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 일부 실시양태에서 적합한 보존제를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 일부 실시양태에서 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 제약 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물은 나노 입자의 멸균 수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이는 일부 실시양태에서 투여 대상체의 혈액과 등장성이다. 이 제제는 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 제제는 또한 비경구적으로 허용되는 무독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 예를 들어 암, 자가 면역 질환 및 감염성 질환의 치료를 포함하는 많은 치료적 유용성을 갖는다. 본원에서 설명되는 방법은 본원에서 설명되는 세포를 사용하여 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다. 또한, 대상체에서 암의 증상을 감소시키거나 개선하는 방법, 및 암의 성장을 억제하고/하거나 하나 이상의 암 세포를 죽이는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법은 본원에서 설명되는 약제학적 조성물을 투여하여 대상체에서 종양의 크기를 감소시키고/시키거나 암 세포의 수를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 암은 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 혈액암은 백혈병 또는 림프종이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "혈액암"은 조혈 또는 림프 조직의 종양, 예를 들어 혈액, 골수 또는 림프절에 영향을 미치는 종양을 지칭한다. 예시적인 혈액 악성 종양은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 백혈병(예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 모발 세포 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병(AMoL), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML), 청소년 골수단핵구성 백혈병(JMML) 또는 거대 과립 림프구성 백혈병), 림프종(예를 들어, AIDS 관련 림프종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종(예를 들어, 고전적인 호지킨 림프종 또는 결절성 림프구 우세 호지킨 림프종), 균상 식육종, 비호지킨 림프종(예를 들어, B-세포 비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷(Burkitt) 림프종, 소 림프구성 림프종(CLL/SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 면역 모세포성 거대 세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종 또는 외투 세포 림프종) 또는 T 세포 비호지킨 림프종(균상 식육종, 역형성 거대 세포 림프종 또는 전구체 T-림프모구성 림프종), 원발성 중추 신경계 림프종, 세자리(Sezary) 증후군, 발덴스트룀(Waldenstroem) 거대글로불린혈증), 만성 골수증식성 신생물, 랑게르한스(Langerhans) 세포 조직구증, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 골수이형성 증후군, 또는 골수이형성/골수 증식성 신생물.
일부 실시양태에서, 암은 고형암이다. 예시적인 고형암은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 항문 부위암, 자궁암, 결장암, 직장암, 신세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장암, 식도암, 흑색종, 카포시(Kaposi) 육종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 표피암, 자궁경부 편평 세포 암종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 질 암종, 연조직 육종, 요도암, 외음부 암종, 음경암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신우 암종, 척추 종양, 중추 신경계 신생물(CNS), 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 상기 암의 전이성 병변, 또는 이들의 조합.
일부 실시양태에서, 세포는 치료 또는 예방될 질환에 적절한 방식으로 투여된다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 상태, 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정된다. 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, "유효량" 또는 "치료량"이 표시될 때, 투여되는 약제학적 조성물의 정확한 양은 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 대상체의 연령, 체중 및 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물은 104 내지 109개의 세포/kg(체중), 예를 들어 105 내지 106개의 세포/kg(체중)(해당 범위 내의 모든 정수값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물은 상기 투여량으로 여러 번 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 설명되는 약제학적 조성물은 면역요법에서 설명되는 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
일부 실시양태에서, 세포는 대상체에게 비경구로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에게 정맥 내로, 피하, 종양 내에, 림프절 내에, 근육 내에, 피부 내에 또는 복강 내로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 또는 림프절에 직접 투여, 예를 들어 주사된다. 일부 실시양태에서, 세포는 주입(예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988]에 설명된 바와 같은) 또는 정맥내 푸시(intravenous push)로 투여된다. 일부 실시양태에서, 세포는 주사 가능한 데포 제제로 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간, 원숭이, 돼지, 개, 고양이, 소, 양, 염소, 토끼, 래트 또는 마우스이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 소아 대상체, 예를 들어 18세 미만, 예를 들어 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1세 미만, 또는 이보다 어린 연령의 대상체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 예를 들어 적어도 18세, 예를 들어 적어도 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80 또는 80-90세의 성인이다.
실시예
실시예 1: 모든 조혈 계통에 적합한 3D 구체 분화
hiPSC의 2D 현탁 배양으로부터 3D 현탁 배양으로의 전환
도 1a는 본 개시내용에 사용된 전형적인 소형 생물 반응기를 예시한 것이다. 작업 부피가 250 ml 내지 3 L인 스피너 플라스크는 보다 큰 규모의 실험에도 사용할 수 있다. 2D hiPSC 배양에서 3D 현탁 배양으로의 성공적인 전환은 도 1b 및 1c에 제시된 바와 같이 둥근 모양의 구체 형태의 hiPSC의 형성 및 후속 성장을 특징으로 한다. 3D 전환된 hiPSC의 만능성을 모니터링하기 위해, 만능성 마커 Oct-4의 발현을 유세포 분석법으로 측정하였다. 고품질 미분화 만능성 줄기 세포는 Oct-4 양성이다(≥95%, 도 1d). 3D 구체에서 배양된 hiPSC는 또한 정상적인 핵형을 가지고 있다(도 1E).
조혈 내피 및 조혈 계통으로의 hiPSC의 단계적 유도
hiPSC를 HEC 및 HPC로 유도하는 전략은 도 2에 제시되어 있다. 높은 수율 및 순수한 HEC 집단을 얻기 위해, Oct-4 발현에 대해 >95% 양성인 3D 전환된 hiPSC만을 사용하는 것이 매우 중요하다(도 1D 및 3b 참조). 각각의 개별 세포주에 대해, 먼저 HEC 유도가 시작될 때 최적의 구체 크기를 결정하는 것이 중요하다. 도 3a에 제시된 바와 같이, 하나의 hiPSC 라인의 대표적인 결과는 80-85 마이크로미터(직경)의 구체 크기에서 시작하는 것이 크기가 100 마이크로미터를 초과하는 구체보다 더 높은 HEC 생성 효율을 달성하였음을 보여주었다. 따라서, 이 연구에 나타난 대부분의 분화는 80-85 마이크로미터의 구체 크기에서 시작되었다.
HEC 생성의 효율성은 HEC 집단이 조혈 계통으로 분화할 수 있도록 보장하기 위해 전형적인 HEC 마커 CD31, CD144, CD34 및 CD184뿐만 아니라 조혈 마커 CD43의 발현에 의해 주로 모니터링되었다. 도 3b에 제시된 바와 같이, 분화 유도 전(0일차) 구체 세포는 CD31 및 CD34의 발현을 나타내지 않은 반면, 95%는 Oct-4 양성이었다. 3일차의 이른 시기에, 작지만 독특한 CD31+ 집단(31.2%)이 나타났고, CD34 발현(15.7%)이 뒤를 이었다. 이 시점에서 CD43 발현(2%)은 매우 낮았다. 이 단계에서 Oct-4 발현은 이미 2.9%로 현저히 감소하여 만능성의 손실을 확인하였다. HEC 집단은 일반적으로 분화하는 구체의 6일차에 최고 수준에 도달하였다. 도 3b에서 제시된 바와 같이, 현탁 구체에서 전체 집단 중 66%는 CD31 및 CD144(VE-카드헤린) 둘 모두에 대해 양성이었으며, 이 둘은 모두 HEC에 대한 마커이다. 또한, 도 3b 및 3c에 제시된 바와 같이, CD31+ 집단의 15.2%는 CD43+이었으며, 이는 HEC 집단의 조혈 계통에 대한 강한 초기 수임을 나타낸다. 또한, 상당한 CD34+ 집단(21.4%)이 CD31+ 집단에서 출현하였다. 또한, HEC의 일부도 CD235a(23.5%)를 발현하였지만, CD45 발현은 거의 발견되지 않았으며, 이는 조혈 전구 세포의 적혈구 계통에 대한 조기 수임을 나타낸다(Palis 2016). 또한, 대부분의 CD31+ HEC는 CD184+이었지만, 일부의 CD31- 세포도 CD184+이었다. 흥미롭게도, CD43+ 집단 중에서, 조혈 계통의 수임은 CD34 발현의 감소를 수반하는 것으로 보였다. 이러한 결과는 본 발명자들의 분화 과정이 후속 조혈 분화에 이상적인 고품질 HEC를 생성하는 데 매우 효율적임을 분명히 확인해준다.
3D 계통 특이적 조혈 분화의 형태학적 변화
3D 현탁 배양 공정의 주요 기술적 이점 중 하나는 긴 공정의 상이한 단계에서 샘플링하고 형태 학적 변화를 모니터링할 수 있다는 것이다. 3D 현탁 조건 하에서 전체 분화 과정 전체에 걸쳐 상당한 형태학적 변화가 관찰되었다. 미분화된 hiPSC 구체는 작은 범위의 크기 변화로 균일하게 둥근 모양이었다(도 4a). 분화 3일차의 이른 시기에, 대부분의 구체 내부에 공동 공간이 형성됨에 따라 크기 변화가 크게 증가하였다(도 4b). 6일차의 구체(도 4c)는 더 커졌다(크기 및 내부 공동). 6일 내지 9일차에, 많은 양의 현탁 세포가 배양 배지에 존재하였고, 이것은 구체로부터 HPC 방출의 시작을 나타낸다(도 4d). 훨씬 더 많은 양의 HPC가 도 4e 및 4f에 제시된 바와 같이 9일부터 15일차 이후까지 방출되었다. 더 높은 배율 이미지인 도 4g는 일반적인 부착되지 않은 둥근 HPC 형태를 보여준다.
현탁액에서 다량의 HPC를 자연적으로 자가 방출하는 것은 대규모 제조 동안 수집 공정을 개발하는 데 매우 유용하며, 이것은 정기적인 배지 보충을 통해 달성할 수 있다는 점을 강조하는 것이 중요하다. 현탁액 내의 HPC는 산업 규모 생산을 위해 고안된 원심분리 또는 접선 흐름 여과(TFF)와 같은 부피 감소 방법에 의해 쉽게 수집할 수 있다(Cunha et al. 2015).
상이한 분화 단계에서 3D 배양 구체 내의 HEC 마커의 조직학 및 면역형광 분석
조혈 분화의 상이한 단계에서 세포 구체 내부의 점진적인 형태학적 변화를 가시화하기 위해, 구체의 섹션을 헤마톡실린(도 5의 맨 윗줄) 또는 CD31, CD34 및 CD43에 대한 항체(도 5의 아래쪽 3줄)로 염색하였다. 미분화 hiPSC가 존재하는 0일차에, 세포 구체는 가장 뚜렷한 핵 염색 패턴으로 보다 조밀하였으며, 이는 전형적인 만능성 줄기 세포의 큰 핵 대 세포질 비율을 반영한다. CD31, CD34 및 CD43의 발현은 0일차에 발견되지 않았다. 6일차에 HEC 집단의 최고점에서, 모든 구체에서 상피(0일)로부터 중간엽 형태로의 확정적 전환이 관찰되었다. 모든 구체 내부 에는 강력한 CD31+ 집단이 존재하고, 이것은 hiPSC로부터 HEC로의 매우 효율적인 전환을 나타낸다. 이것은 CD34+ 세포의 존재 뿐만 아니라, 작지만 독특한 수의 CD43+ 세포에 의해 추가로 확인된다. 9일차에 구체는 내부에 공동이 형성되면서 크기가 커졌다. CD31 및 CD34의 발현은 전체 집단에서 높게 유지되었다. 구체 내부의 CD43+ 세포의 상대적으로 낮은 백분율은 대부분의 CD43+ 세포가 배지로 방출되었음을 나타낸다(도 5). 14일차에, 대부분의 구체에서 훨씬 더 큰 공동이 CD31+ 및 CD34+ 둘 모두인 더 조밀한 세포의 코어와 함께 존재하였다. 또한, CD43+ HPC가 구체 내부에 존재하였다. 평균 구체는 큰 공동과 함께 분화 23일차에 훨씬 더 커졌다. CD34 발현은 상기 단계에서 이러한 구체의 세포 코어 내부에서 매우 강하게 유지되었고, 이것은 강력한 장기간 조혈 분화를 나타낸다.
상이한 분화 단계에서 혈통 특이적 마커의 동적 변경
최적의 장기 조혈 분화 효율을 달성하기 위한 최상의 조건을 정의하기 위해, 3D 구체 조혈 분화를 많은 상이한 배지 조건 하에서 시험하였다(데이터는 표시되지 않음). 시험한 모든 조건 중에서, 본 발명자들은 본 연구에 적합한 두 가지 최상의 조건(Cond. A 및 Cond. B로 지정됨)을 확인하였다.
Cond. A 및 B 실험에 대한 시작 hiPSC 수는 20 x 106개 세포로서 동일하였다. 분화 0일부터 19일차까지, 세포 구체에서 계통 특이적 마커 CD31, CD34, CD43, CD235a 및 CD45의 발현을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 도 6a-6e에 나타낸 바와 같이, 실험 Cond. A와 B 사이에서 5개 마커 모두에서 발현 프로파일의 상당한 변화가 관찰되었다. Cond. A에서, 구체에서 CD31+, CD34+ 및 CD43+ 세포의 백분율은 Cond. B보다 유의하게 더 높았고, 이를 통해 Cond. A가 HEC 생성에서 더 높은 효율을 위해 최적임이 확인되었다(도 6a-6c). Cond. B의 구체 세포에서 CD34+ 및 CD31+의 백분율은 19일차에 분화의 후기 단계에서 Cond. A와 비슷하였다(도 6b). 전구 세포에서 CD235a의 발현은 적혈구 계통 잠재력을 구체화한다. CD235a+ 구체 세포의 백분율은 Cond. A에서 상당히 더 높았고, 8일차에 피크 수준에 도달하였다. 이와 대조적으로, CD235a의 발현은 Cond. B에서 분화 5일차에 구체 세포에서 완전히 억제되었다. 초기 조혈 기간 동안, 이전의 보고서는 Wnt 신호전달 경로를 조작하여 HEC에서 CD235a 발현을 억제하면 확정적 조혈을 부스팅하지만 원시적 조혈은 억제하는 것으로 제시한 바 있다(Sturgeon et al. 2014). 구체에서 CD45+ 세포의 백분율 세포는 12일차까지 낮았으며, Cond. A와 B 둘 모두에서 12일차에서 19일차까지 크게 증가하였다(도 6e). 종합적으로, 본 발명자들은 Cond. A가 구체에서 높은 백분율의 HEC를 생성하기 위한 최적의 조건이라고 결론내렸다. 도 6a-6e에 제시된 바와 같이, HPC는 Cond. A의 구체에서 일찍 수집된 HPC는 적혈구 및 거핵구 생성에 적합하였다. 대안적으로, Cond. B에서 원시적 조혈의 억제는 구체에서 초기 조혈을 확정적 표현형으로 유도할 수 있다. 표 1A 및 1B에 제시된 데이터와 함께, Cond. B에서의 구체는 훨씬 더 많은 총 세포수 및 훨씬 더 높은 백분율의 CD34+ 세포를 나타내고, 특히 분화 후기 단계에서 더 많은 HPC를 방출하였다. 이러한 관찰은 Cond. B가 CD34+CD133+ 조혈 줄기 세포(HSC) 와 같은 확정적 조혈 세포를 생산하기 위한 더 나은 선택임을 강력하게 나타낸다. 결론적으로, 본 발명자들은 상이한 제조 목적으로 선택할 수 있는 3D 구체 조혈 분화의 두 가지 조건을 확인하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
다량의 HPC의 방출 및 수집
도 4a-4i에 제시된 바와 같이, 상당한 수의 HPC가 3D 구체 조혈 분화 배양의 8일 내지 9일차에 시작하여 방출되었다. 방출된 HPC의 수는 9일차 이후부터 꾸준히 증가하였다. HPC는 실험 Cond. A 및 B로부터 매일 또는 격일로 수집되었고, 각각의 수집물에 대한 총 세포수는 도 7a 및 7b에 제시되었다. Cond. A에서, HPC의 총 수집물은 285.6 x 106개인 반면; Cond. B에서 HPC의 총 수집량은 624.14 x 106개에 달하였다. 9일과 10일차 둘 모두에서, Cond. A의 구체는 Cond. B의 구체보다 더 많은 HPC를 방출하였다. 그러나, 14일차부터 23일차까지, Cond. B의 구체는 Cond. A의 구체보다 훨씬 더 많은 HPC를 방출하였다. 구체로부터 HPC 방출의 이러한 역전된 경향은 도 5 및 6a-6e에 제시된 구체 세포의 조혈 계통 마커 발현 프로파일(CD31, CD34, CD43, CD235a, CD41 및 CD45)과 일치하며, 이는 두 가지 조건 하에서 원시적 조혈에 비해 확정적 조혈에 대한 분명한 선호도를 시사한다. 두 구체 세포 및 방출된 HPC에 대한 본 발명자들의 결과는 본 발명자들이 매우 효율적인 3D 조혈 분화 과정을 성공적으로 개발하였음을 분명히 보여준다. 최적화된 조건 하에서, 각각의 투입 hiPSC는 본 발명자들의 현재 프로토콜에서 최대 31개의 HPC를 생성할 수 있다. 1000 ml의 생물 반응기는 600-1000 x 106개의 미분화된 hiPSC을 수용할 수 있을 것이고, 25일의 생산 공정에 대한 예상 최종 HPC 산출량은 3.1 x 1010개의 세포에 도달할 수 있다.
수집된 HPC의 특성화
수집된 HPC의 조혈 계통 특이적 마커 발현을 유세포 분석에 의해 분석하였다. 도 8A에 제시된 바와 같이, 9일차에 대표적인 실험으로부터 수집된 HPC는 97.6% CD31+CD43+이었으며, 이것은 HEC 기원뿐만 아니라 조혈 계통에 대한 완전한 수임을 나타낸다. 또한, CD34+CD45+ HPC의 강력한 존재가 있었지만, 이 단계에서 CD133+ HPC는 존재하지 않았다. HPC의 높은 비율(68%)은 CD41+이었으며, 이것은 이전에 보고된 바와 같이 주로 거핵구 계통 잠재력을 나타낸다(Feng et al. 2014). HPC의 대부분은 거핵구/적혈구 계통(CD41+CD235a+)의 공통 전구 세포 또는 적혈구/골수성 계통의 공통 전구 세포(CD45+CD235a+)이었고, 이들 세포 중 극소수 만이 거핵구/골수성 공통 전구 세포(CD41+CD45+)이었다.
도 8B에 제시된 바와 같이, 다양한 분화 단계에서 수집된 HPC는 모두 CD31+CD43+로서, 이들의 높은 순도를 확인해주었다. CD34+CD45+ HPC는 골수 계통뿐만 아니라 림프 계통 세포, 예를 들어 NK 세포를 생성할 수 있는 다중 계통 잠재력을 보유한 것으로 생각된다(Knorr et al. 2013). 도 8C에 제시된 대표적인 한 실험에서, HPC에서의 CD34 및 CD45 둘 모두의 발현은 8일차부터 17일차까지 매일 추적되었으며, 8일부터 13일차까지 방출된 HPC 집단의 상당한 비율(>60%)은 CD34+CD45+이었고, 이들 세포는 14일차(34%)부터 17일차(2%)까지 점진적으로 감소하였다.
도 8D에 제시된 바와 같이, 초기(8일차 및 9일차) HPC는 주로 CD41+ 및 CD235a+이었지만, HPC 집단은 점진적으로 CD45+ HPC로 대체되었다. 이와 유사하게, CD41+CD235+ MK/적혈구 공통 전구 세포의 백분율은 8일차에 가장 높았고, 9일차부터 14일차까지 점진적으로 감소하였다. 흥미롭게도, CD45+CD235a+ 및 CD41+CD45+ HPC와 같은 다른 공통 전구 세포도 10일차 내지 14일차에서 관찰되었다.
본 발명자들의 결과는 본 발명자들의 새로운 공정이 림프구(NK 또는 T 세포) 또는 골수구(대식세포, 호중구 등) 둘 모두의 세포의 향후 제조에 적합한 다량의 가변 조혈 전구 세포를 생성할 수 있음을 보여준다. 이러한 세포는 CAR-NK 및 CAR-대식세포와 같은 차세대 면역 요법의 핵심 구성 요소이다.
3D 구체에서 CD34 + 조혈 줄기 세포의 단리, 특성화
본 발명자들의 시스템에서 구체로부터 배지로 대량의 HPC가 방출되는 것은 3D 구체 구조 내부에 강력하고 활발한 동적 조혈이 있음을 분명하게 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 만능성 조혈 줄기 세포(HSC)가 이러한 구체 내부에서 생성될 수 있다고 추측한다. 다양한 분화 일에, 세포 구체를 단일 세포로 분리하고, CD34+ 및 다른 세포를 분석하였다. 표 1a에 제시된 바와 같이, 유의한 세포 확장이 Cond. A 및 B 둘 모두에서 관찰되었다. 0일에 20 x 106개 hiPSC로부터 시작하여, 173 x 106(Cond. A) 및 288 x 106개(Cond B)의 구체 세포가 8일차에 수득되었으며, 23일차에 50 x 106(Cond. A) 및 183 x 106개(Cond. B)의 세포가 각각 수득되었다. 이들 세포 중에서, Cond. A로부터의 약 10% 및 Cond. B로부터의 22%가 CD34+ 조혈 줄기 세포이었다. 다양한 분석을 위해 전체 과정 동안 상당한 수의 구체가 제거되었기 때문에, 분리된 구체로부터 수집된 실제 세포 수는 상당히 더 높아야 한다. 이러한 결과는 상기 새로운 3D 구체 환경이 조혈 세포의 건강한 장기 성장 및 분화를 지지하기에 적합하다는 것을 보여준다.
CD34+ 세포의 조혈 계통 잠재력을 정량적으로 평가하기 위해, 22일차에 Cond. A 및 Cond. B로부터 분리된 단일 세포를 CD34+ 및 CD34- 집단으로 분리하였다. CD34- 분획은 CD34-CD45+ 및 CD34-CD45- 집단으로 추가로 분리되었다. 표 1B에 제시된 바와 같이, 분리된 구체 세포는 연장된 분리 과정 후에도 생존 가능한 상태를 유지하였다. CD34+ 집단의 더 높은 수율은 Cond. B로부터 달성되었고, 또한 가장 많은 수의 방출된 HPC를 생산하였다(도 7a-7b 참조).
CD34- 분획과 대조적으로, CD34+ 분획의 세포는 증가된 콜로니 형성 능력을 나타냈다(도 9A 및 9B). CD34+ 분획에 대한 유세포 분석기 분석은 집단의 14%가 또한 CD133+였음을 보여주었고(도 9C), 이것은 CD34+CD133+ 생착 가능한 HSC 하위 집단의 존재를 확인해주었다(Drake et al. 2011). 도 9D-9I에 도시된 바와 같이, BFU-E(도 9D) 및 CFU-E(도 9E, 9F 및 9H) 둘 모두의 상당한 수의 적색 또는 혼합 적색(도 9G 및 9I) 콜로니가 CD34+ 세포로부터 생성되었다. CFU-G(도 9J), CFU-M(도 9K 및 9L)과 같은 골수 계통의 콜로니도 관찰되었다. CFU 배양에서 많은 큰 혼합 적색 콜로니는 분화 후기 단계에서 분화된 구체 내부에 HSC가 존재함을 강력하게 나타낸다. 인간화된 마우스에서 장기간 생착될 수 있는 장기 CD34+ 세포는 또한 본원에 개시된 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
실시예 2: 특정 조혈 계통의 생산 및 특성화
NK 및 림프 계통의 다른 세포의 시험관내 분화는 이전에 보고된 바와 같이 Notch 신호전달 리간드 DLL-1/4를 과다발현하는 피더 세포와의 공동 배양을 필요로 하는 것으로 나타났다(Watarai et al. 2010; Zeng et al. 2017; Ditadi et al. 2015). 여기에서, 본 발명자들은 정의된 혈청 및 피더가 없는 조건 하에서 인간 PSC로부터 거의 순수한 NK 세포 집단을 강력하게 생성하는 새로운 확대 가능한 3D 시스템을 제시한다. 본 발명자들의 발견은 NK 세포뿐만 아니라 다른 세포 유형의 림프 및 조혈 계통의 대규모 제조 개발에 있어서 획기적인 기술을 나타낸다. 또한, 여기에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들의 3D 조혈 분화 시스템은 사용 가능한 모든 만능성 줄기 세포(PSC) 분화 방법과 다르며, 면역 종양 요법용 NK 및 T 세포와 같은 기성 면역 세포 제품의 산업 규모 제조에 적합하다.
조혈 전구 세포로부터 혈소판 및 RBC의 형성
수집된 HPC의 한 가지 중요한 잠재적인 응용은 이전에 보고된 바와 같이 거핵구 및 혈소판의 대규모 제조이다(Feng et al. 2014; Thon et al. 2014). 8-10일차에 수집된 HPC는 5-7일 동안 이전에 발표된 MK 촉진 배지(Feng et al. 2014)에서 배양되었다. 도 10a에 제시된 바와 같이, MK 촉진 배지에서 3일 동안 인큐베이팅한 후 프로혈소판(흰색 화살표로 표시됨)의 상당한 형성이 관찰되었다. MK 배지의 혈소판은 이전에 설명된 바와 같이 수집하고(Feng et al. 2014), 혈소판(도 10b에 게이트 P1에 표시됨) 및 MK(도 10b의 게이트 P2) 둘 모두에서 MK 특이적 CD41a 및 CD42b의 발현에 대해 분석되었다. CD41a+CD42b+ 거핵구 백분율은 83.4%에 도달하였고, 66.2%의 CD41+CD42+ 혈소판이 또한 수득되었다(도 10c 및 10d). 2D 배양 시스템에서 유사한 방식으로 유도된 혈소판이 완전히 기능하고 순환 중인 인간 혈소판과 유사한 초구조적 형태를 나타냈다는 것이 이전 보고서에 의해 확인되었다(Feng et al. 2014). 본 발명자들의 3D 구체 시스템에서 유도된 MK는 동등한 특성을 나타낸다. 결론적으로, 완전한 3D 배양 시스템에서 거핵구 및 혈소판의 생성은 확장성뿐만 아니라, 생체내 순환을 모방하는 전단력의 지속적인 존재로 인한 기능적 관련성 측면에서 본 발명자들 및 다른 많은 실험실에서 보고한 2D 시스템보다 큰 이점을 갖는다.
도 8에 제시된 바와 같이, 8-10일차에 수집된 초기 HPC는 주로 CD235a+이었고, 이것은 그의 적혈구 계통을 나타낸다. 본 발명자들은 이들 CD235a+ HPC가 CFU 형성 배지에 플레이팅되었을 때 매우 큰 CFU-e 콜로니의 형성을 관찰하였고(도 10e), 이것은 CD235a+ HPC가 수혈에 또는 표적 약물 담체로서(현재 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 Rubius Therapeutics에서 개발 중인 신기술로서) 사용할 수 있는 디자이너 RBC의 대규모 제조에 적합함을 시사한다.
초기 HPC로부터 CD56 + NK의 유도 및 특성화
NK 세포는 차세대 암 면역 요법에서 매우 중요한 역할을 수행할 수 있다. 현재, 자가 수집된 말초 혈액 세포를 증폭하여 다량의 NK 세포를 얻는 것은 기술적으로 어려운 일이다. 본 발명자들은 여기에서 본 발명자들의 3D 분화 시스템에서 생성된 조혈 전구 세포가 NK 세포로 효율적으로 분화될 수 있음을 입증하였다. 8일차(HPC-A로 지정됨), 11일차(HPC-B) 및 18일차(HPC-C)에 수집된 HPC를 NK 세포 분화 및 추가의 21일 동안의 성숙을 위해 제제화된 2개의 배지(#1 및 #2)에서 배양하였다. 도 11a에 제시된 바와 같이, 상이한 시간에 수집된 이들 HPC는 뚜렷한 조혈 표면 마커 프로파일을 나타냈고, HPC-A의 약 60-70% 및 40%가 각각 CD34 및 CD45를 발현하고; CD34의 발현은 유사하게 유지되었지만, 거의 100%의 HPC-B는 CD45에 대해 양성이었고; CD34 발현은 HPC-C에서 거의 검출되지 않은 반면에, 이들 중 100%는 CD45를 발현하여 조혈 세포에 대한 성숙을 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 상이한 시간에 수집된 3개의 모든 HPC 집단의 약 30%가 낮은 수준의 CD56을 나타냄을 관찰하였으며, 이는 도 8C에 제시된 결과와 일치한다. 두 배지에서 배양된 후, CD56low 세포는 3개의 모든 HPC 수집물에 대해 6일차부터 13일차까지 점진적으로 손실되었다. 또한, 21일차에 배지 1에서 HPC-A, HPC-B 및 HPC-C로부터 어떠한 CD56+ 세포는 나오지 않았다(도 11c). 이와 대조적으로, 상당한 수의 CD56high 세포는 21일동안 배양한 후 배지 #2에서 다시 출현하였고, 특히 HPC-A로부터 CD56high의 뚜렷한 세포 집단이 관찰되었다(도 11d). 상기 다시 출현된 CD56+ 집단은 그의 HPC 전구체보다 더 높은 수준의 CD56을 발현하였으며(도 11b, 8일 HPC vs 8일+21일 배지 #2), 이것은 NK 계통의 CD56+high 세포의 생성을 나타낸다.
혈청 및 피더가 없는 조건 하에서 순수한 NK 세포의 생성을 위한 3D 스캐폴드와 3D 구체의 통합
이전 연구는 흉선의 3D 구조가 T 림프구 발달을 위한 최적의 환경을 제공한다고 제안한다(Mohtashami and Zuniga-Pflucker 2006). 혈청 및 피더가 없는 조건 하에서 NK 분화 및 생성을 개선하기 위해, 6일차 HEC를 NK 특정화를 촉진하기 위해 생체내 니치를 모방한 3D 스캐폴드에 시딩하였다. 스캐폴드 내부에서 우수한 HEC 성장 및 분화가 관찰되었으며, 16일차부터 많은 수의 세포가 방출되었다. 초기에 시딩된 2 x 106개의 HEC로부터 약 10 x 106개의 세포가 10일 동안 수집되었다. 도 12A-12D에 제시된 바와 같이, 스캐폴드에서 방출된 세포는 전형적인 둥근 모양의 HPC와 매우 다른 형태를 나타냈다(도 12A 및 12B). 유세포 분석의 전방 및 측방 산점도는 방출된 세포가 매우 균질함을 보여준다(도 12C, 왼쪽 상단). 이들 세포의 96% 이상이 CD56+high이었고(도 12C 및 12D), 이것은 순수한 NK 집단을 나타낸다. PBMC의 T 림프구(오른쪽 상단)와 달리, 방출된 CD56+ NK 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하지 않았고(도 12C, 중앙 상단), pan T 세포 마커 CD3도 발현하지 않은 반면(도 12C, 왼쪽 하단), PBMC의 상당한 분획은 CD3 항원을 발현하였다(중앙 하단). 추가로, B 세포 마커 CD19는 hiPSC 유래 NK 세포에서 검출되지 않았다(도 12C, 오른쪽 하단). NKG2D는 인간 NK 세포에서 발현되는 C형 렉틴 유사 수용체의 CD94/NKG2 패밀리에 속하는 막 횡단 단백질이다(Houchins et al. 1991). NKp44(Vitale et al. 1998) 및 NKp46(Sivori et al. 1997)은 인간에서 NK 활성을 촉발하는 데 관여하는 NK 특이적 표면 분자이다. 본 발명자들은 hiPSC-CD56+high 세포가 NKD2G+(96%), NKp44+(95%) 및 NKP46+(90.9%)임을 입증하였다(도 12D, 왼쪽 패널). I형 막 횡단 당단백질의 패밀리인 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR)는 NK 세포의 원형질막 및 소수의 T 세포에서 발현된다(Yawata et al. 2002; Bashirova et al. 2006). 이들은 주요 조직 적합성(MHC) 클래스 I 분자와 상호작용함으로써 이러한 세포의 사멸 기능을 조절한다. CD56+ 세포의 다양한 백분율은 KIR2DS4+(49.2%) 및 KIR2DL1/DS1+(31.8%)이었으며, 거의 모든 상기 CD56+ 세포는 KIR3DL1/DS1-이었고(97%, 도 12D, 오른쪽 패널), 이것은 본 발명자들의 3D 시스템에서 생성된 hiPSC-NK 집단의 KIR 유형의 다양성을 나타낸다. 이러한 관찰은 상기 CD56+high 세포가 진정한 NK 세포임을 입증한다.
K562 표적 세포에 대한 iPS-NK의 세포 독성 활성
도 13의 왼쪽 열에서 볼 수 있는 바와 같이, NK 이펙터 세포(P2)는 표적 K562 세포와는 매우 상이한 전방/측방 산란 프로파일을 가지고 있다. K562 세포는 GFP+이고, iPS-NK 세포는 GFP-이다(가운데 열에 표시됨). 이펙터 NK 세포와 함께 2시간 동안 인큐베이팅한 후, 거의 모든 표적 GFP+ K562 세포가 두 번째 줄로부터 맨 아래 줄까지 표시된 바와 같이 E:T 비율에 관계없이 iPS-NK 세포에 의해 파괴되었다. 왼쪽 열에 표시된 바와 같이, 소량의 나머지 K562 세포는 대부분 생존 가능하지 않다. 이러한 결과는 본 발명자들이 상기 새로운 기술 플랫폼으로부터 생성한 iPS-NK 세포가 NK 세포의 모든 세포 마커를 공유할 뿐만 아니라, 매우 높은 효율성으로 잠재적 표적 세포를 죽일 수 있음을 확인해주는 것이다.
RNAseq 분석은 인간 iPS-NK 세포가 진정한 NK 세포임을 확인해 준다.
요약: 비교 RNAseq 분석에 의해, 인간 iPS-NK 세포를 1차 인간 NK 세포와 비교하였고, 그 결과, 인간 iPS-NK 세포가 인간 1차 NK 세포로 조립되었음을 확인하였다.
iPS-NK 세포가 진정한 인간 NK 세포인지의 여부를 조사하기 위해, 인간 iPS-NK 세포의 RNA-seq 발현 프로파일을 상이한 유형의 인간 면역 세포를 사용한 2개의 공개적으로 이용 가능한 고품질 RNAseq 데이터 세트에 대해 비교하였다. 데이터세트 1(Racle et al. 2017)은 B 세포, CD4, CD8, 단핵구, 호중구 및 NK 세포를 포함하는 세 가지 연구(Racle et al. 2017)에서 구축된, 인간 혈액으로부터의 분류된 면역 세포의 참조 유전자 발현 프로파일을 포함한다. 데이터세트 2(Calderon et al., www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE118165에서 이용 가능함)는 8명의 건강한 공여자로부터 25개 혈액 세포 유형의 166개의 인간 샘플을 사용하여 분류된 면역 세포의 참조 유전자 발현 프로파일을 포함한다(Calderon et al., www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE118165에서 확인 가능). 인간 iPS-NK 세포의 미처리 총수(raw count)(iPS-NK3, iPS-NK8 및 iPS-NK12)는 인간 게놈 버전 h19를 기반으로 하여 TPM(백만 리드당 전사체)으로 전환되었다. 발현 프로파일은 인간 iPS-NK 데이터 및 일치하는 고유한 유전자 기호를 기반으로 한 참조 데이터 사이에 조합되었으며, 모든 샘플에 걸쳐 총 강도로 정규화되었다. 상이한 유형의 면역 세포에 대한 세포 마커는 문헌 [Racle et al.]에 제시된 것이었다. 참조 데이터세트에서 가장 가변적인 1000개의 유전자를 사용하여 피어슨(Pearson) 상관관계에 의해 임의의 2개의 샘플의 유사성을 계산하였다. 유전자 발현 프로파일 및 상관관계의 히트맵을 TMev로 가시화하였다.
특정 세포 마커의 발현 분석 및 전반적인 발현 프로파일의 유사성을 기반으로, 인간 iPS-NK 세포는 인간 1차 NK 세포로 조립되었다(데이터세트 1: 인간 iPS-NK의 자기에 대한 평균 상관관계: 0.89, 인간 iPS-NK의 1차 NK 세포에 대한 평균 상관관계: 0.53, 인간 iPS-NK의 다른 세포 유형에 대한 평균 상관관계: 0.31; 데이터세트 2: 인간 iPS-NK의 자기에 대한 평균 상관관계: 0.891, 나이브 NK에 대한 평균 상관관계: 0.283, 활성화된 NK에 대한 평균 상관관계: 0.229, 다른 세포 유형에 대한 평균 상관관계: 0.082). 그러나, 인간 iPS-NK 세포의 3개의 배치는 약간의 변이를 보였고, iPS-NK3 샘플(약 95% CD56+ 세포)은 1차 인간 NK 세포와 거의 일치하는 반면, iPS-NK8 및 iPS-NK12의 샘플은 두 참조 데이터세트, 예를 들어 CD14, CD33 및 CSF1R의 전형적인 마커에 비해 대식세포 및 단핵구의 일부 마커를 발현하였다. 이러한 대식세포/단핵구 특징은 인간 iPS-NK 세포의 상기 2개의 배치의 순도와 일치한다(각각 iPS-NK8 및 iPS-NK12 샘플에 대해 87% 및 75% CD56+). 요약하면, 이러한 결과는 2개의 상이한 공개된 RNAseq 데이터 세트를 사용한 비교 분석을 기초로 할 때 매우 일관되며, 인간 iPS-NK 세포가 진정한 NK 세포임을 확인해주는 것이다.
높은 백분율(>80%)의 인간 iPS-NK 세포는 CD56+CD8+ 이펙터 세포이다.
요약: 본 발명자들은는 예기치 않게 본 발명자들의 기술 플랫폼을 사용하여 생성된 인간 iPS-NK 세포 중 80% 초과의 세포가 CD56+CD8+라는 사실을 발견하였고, 이것은 세포 독성 이펙터 세포의 강력한 존재를 나타낸다.
NK 세포의 상이한 하위 세트가 인간 말초 혈액에서 설명되었다. 말초 혈액 NK 세포의 대부분은 CD56dimCD16+ 세포인 반면, 림프절 상주 NK 세포는 주로 CD56brightCD16- NK 세포이다(Ahmad et al. 2014). 본 발명자들의 3D 시험관내 인간 iPS 분화 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 인간 iPS-NK 세포가 95% 초과의 CD56brightCD16-임을 발견하였다. 이러한 결과는 본 발명자들의 조혈 세포 구체가 NK 세포 분화 및 발달을 위한 이상적인 니치 환경을 제공하는 생체내 림프절 조직과 유사할 가능성이 있음을 시사한다.
인간 말초 혈액 NK 세포의 약 30%가 CD8 마커를 발현한다(Ahmad et al. 2014; Addison et al. 2005). 도 14에 제시된 바와 같이, 본 발명자들의 3D HSC 분화 시스템에 의해 유도된 인간 iPS-NK 세포 중 80% 초과의 세포가 CD56+CD8+라는 것이 놀랍게도 발견되었다. CD56+CD8+ 인간 NK 세포가 CD56+CD8- 하위 세트 NK 세포보다 더 높은 세포 용해 기능을 보인다는 이전 보고서에 의해 확인되었다(Addison et al. 2005). 높은 빈도의 CD8+ NK 세포는 HIV 감염의 보다 느린 질환 진행과 관련이 있다(Ahmad et al. 2014; Rutjens et al. 2010). 이러한 결과는 본 발명자들의 3D 분화 플랫폼이 세포 독성이 높은 CD56+CD8+ 하위 세트 NK 세포를 우선적으로 생성한다는 것을 보여준다. 주로 CD56+CD8+ NK 세포의 입양 전이는 항암 또는 항바이러스 감염 요법에 대한 더 나은 임상 결과로 해석될 수 있다.
피더가 없는 조건 하에서의 시험관내 확장을 통해 인간 iPS-NK 세포의 높은 수율 및 순도를 얻을 수 있다.
요약: 생물 반응기로부터 수집한 iPS-NK 세포의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 본 발명자들은 수집한 NK가 피더가 없는 정의된 배양 배지를 통해 추가로 확장되고 농축될 수 있음을 입증하였다.
말초 혈액 또는 제대혈로부터 충분한 NK 세포가 부족하기 때문에, 세포 요법을 위한 치료 용량의 인간 NK 세포를 생성하려면 공여자 제공 NK 세포를 확장해야 한다. 공여자 NK 세포의 효율적인 확장은 인공 항원 제시 세포(iAPC)와 같은 피더 세포의 존재에 달려 있다. 2D 조건 하에서 낮은 NK 계통 특이적 분화로 인해, 이전에 보고된 인간 iPS 유래 NK 세포 역시 피더 의존적 확장이 필요하다(Li et al, 2018). 변형된 암 피더 세포의 사용은 번거로울 뿐만 아니라, NK 세포 집단에서 원치 않는 세포로 오염될 위험이 있다.
본원에서 설명되는 3D 생물 반응기 인간 iPS-NK 분화 및 생산 시스템의 우수한 확장성에 더하여, 인간 iPS-NK 세포의 피더 부재 하에서의 확장도 조사되었다. 결과는 도 15a-15d에 제시된 바와 같이, 다양한 분화 단계에서 수집된 인간 iPS-NK 세포의 5개의 상이한 배치가 현재 설명된 피더가 없는 확장 시스템을 사용하여 약 3배 내지 5배 확장되었음을 입증한다. 더 중요한 것은 상기 시스템이 이들 세포를 확장할 뿐만 아니라, CD56+ NK 세포 집단을 풍부하게 한다는 것이다. CD56+ 집단의 40% 미만이 1 내지 2주 확장 후에 95% 초과의 CD56+ 세포에 도달하도록 농축되었다. 이러한 데이터는 상이한 분화 단계로부터의 인간 iPS-NK 세포/전구 세포가 피더가 없는 조건 하에서 추가로 확장되어 유의하게 더 높은 순도의 CD56+ NK 세포를 생성할 수 있음을 보여준다.
3D 조혈 분화 플랫폼으로부터 CD3+ T 림프구의 생성
요약: 인간 iPS-NK 세포 이외에, 본 발명자들은 본 발명자들의 시스템이 CD3+ iPS-T 세포를 효율적으로 생성하는 데 사용될 수 있음을 입증했으며, 이는 본 발명자들이 3D 구체 배양 시스템에서 명확한 표현형으로 오래 지속되는 조혈 니치 환경을 성공적으로 재현하였음을 강력하게 나타낸다.
T 림프구의 계통 특이적 분화는 기술적으로 어려운 문제이다. hES/iPS 세포로부터의 T 림프구 분화에 대한 대부분의 이전 보고서는 피더 의존적 방법을 사용하였다. 산업적 규모로 순수 T 림프구를 생성하기 위해 확장 가능한 3D 생물 반응기 시스템을 개발하는 것은 미래의 면역 종양 요법에 매우 매력적이다. 약간의 변형이 있는 iPS-NK 세포의 생성을 위해 동일한 플랫폼 시스템을 사용하여, 비교적 순수한(> 60%) CD3 T 림프구 유사 전구 세포가 2개의 별개의 실험에서 생성되었다(도 17). 이러한 결과는 다음과 같은 이유로 중요하다: (1) CD3- NK 세포와 CD3+ T 세포 둘 모두 동일한 공통 림프 전구 세포로부터 유래할 수 있고; (2) 이러한 공통 림프 전구 세포는 본 발명자들의 3D 분화 시스템에서 조혈 분화를 겪고 있는 구체에서 효율적으로 생성되고; (3) 이러한 후기 단계의 구체 내에서의 조혈은 확정적 표현형이다. T 림프구 계통을 선호하는 3D 구체 분화 시스템에 대한 추가의 최적화는 iPS-T 세포의 수율, 순도 및 기능을 크게 향상시킬 것이다. 이러한 결과는 상기 3D 조혈 분화 시스템이 조혈 줄기 세포를 포함한 모든 조혈 계통 세포를 제조하는 데 적용할 수 있는 다목적 플랫폼 기술이라는 초기 주장을 추가로 확인해 주는 것이다.
인간 iPS-NK는 정상 세포가 아닌 K562 암 세포를 선택적으로 죽인다.
요약: 정상 세포와 암 세포 둘 모두에 대한 인간 iPS-NK 세포의 추가의 세포 독성 분석은 인간 iPS-NK 세포가 정상 세포가 아닌 암 세포를 선택적으로 죽인다는 것을 확인해 준다.
K562 암세포에 대한 강력한 세포 독성 활성이 위에서 입증되었다. OCI-AML3 및 GMB 백혈병 세포 및 BxPC-3 췌장암 세포에서 유사한 항암 세포 독성 효과가 관찰되었다. 강한 세포 독성 활성을 가진 인간 iPS-NK 세포가 정상 세포와 암 세포를 구별할 수 있는지 확인하기 위해, 형광 표지된 정상 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 K562 세포를 인간 iPS-NK 세포와 1:1의 비율로 혼합하고, 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 도 18에 제시된 바와 같이, K562 세포 중 80% 초과의 세포가 사멸된 반면, 정상 인간 PBMC에 대한 명백한 세포 독성 활성은 관찰되지 않았으며, 이것은 정상 세포가 아닌 비정상(암) 세포에 대한 인간 iPS-NK 세포의 세포 독성 특이성을 입증한다.
실시예 3: 500 ml 생물 반응기에서의 NK 계통 특이적 분화의 재현
요약: 본 발명자들의 3D 현탁 배양 시스템이 산업적 요구를 충족하도록 규모가 확대될 수 있음을 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 보다 작은 30 mL 생물 반응기에서의 인간 iPS-NK 계통 특이적 분화가 500 mL 생물 반응기에서 재현될 수 있음을 입증하였다.
현재 개시된 3D 분화 시스템의 주요 강점 중 하나는 그의 규모 확대성이다. 계통 특이적 분화가 대용량 생물 반응기에서 재현될 수 있는지의 여부를 확인하기 위해, 동일한 iPS 세포를 사용하여 30 ml의 소형 및 500 ml의 대형 생물 반응기 둘 모두에서 병렬 NK 계통 특이적 분화를 수행하였다. 초기 단계에서 조혈 내피(HE) 계통의 유도를 확인하기 위해, HE 마커 CD31, CD144(VE-Cad), 및 CD34 및 조혈 마커 CD43을 분화 3일차 및 5일차에 구체에서 분석하였다. 도 16A에 제시된 바와 같이, CD31 및 CD144 발현은 3일차에 500 ml 생물 반응기의 구체보다 30 ml 생물 반응기의 구체에서 더 높았지만, 두 마커 모두 5일차에 유사한 수준(60-70%)에 도달하였다. 30 ml 및 500 ml 생물 반응기의 구체에서 CD34 및 CD43의 발현은 3일차 및 5일차에 매우 유사하였다. 데이터는 500 ml 생물 반응기에서 조혈 내피 계통의 유도가 3 0ml 생물 반응기에서의 유도와 거의 동일하다는 것을 확인해 준다.
하나의 500 ml 생물 반응기에서 생성된 CD56+ NK 세포의 동역학을 3개의 개별 30 ml 생물 반응기의 결과와 비교하였다. 도 16B에 제시된 바와 같이, 500 mL 생물 반응기(실선으로 표시됨)에서 CD56+ NK 세포의 출현은 3개의 30 ml 생물 반응기 모두에서 나타나는 것과 매우 유사하다(90% 초과의 세포는 46일차에 CD56+임). 46일차에 수집된 세포는 균질한 iPS-NK 형태를 나타냈고(도 16C), 이들 세포의 대부분은 또한 NK 세포 특이적 활성화 수용체 NKG2D 및 NKp46도 발현한다. 이들 세포의 약 25% 및 35%는 각각 수용체 NKP44 및 억제 수용체 KIR 활성화에 대해 양성이다(도 16D-16G). 이러한 결과는 NK 계통 특이적 분화 과정이 더 큰 생물 반응기에서 재현될 수 있음을 보여준다. 500 mL보다 큰 생물 반응기, 예를 들어, 1리터, 10리터, 100리터 등을 사용하는 iPS-NK 세포의 추가의 규모 확대 생산이 또한 실현 가능하고 실용적일 것으로 예상된다.
실시예 4: 방법 및 재료
세포주 및 시약
본 연구에서 사용된 4개의 인간 유도 만능성 줄기 세포(hiPSC) 계통은 StemRNA™-NM 재프로그래밍 키트(Stemgent, Cat # 00-0076)를 사용하여 인간 정상 진피 섬유모세포(hNDF)로부터 생성되었다. HiPSC는 0.25 μg/cm2 iMatrix-511 줄기 세포 배양 기질(재조합 라미닌-511)(ReproCell) NutriStem® XF/FFTM 배지(Biological Industries)에서 HEC 및 조혈 계통으로의 유도 분화 전에 적어도 15회의 계대배양 동안 콜로니로서 시험관 내에서 성장하였다. HiPSC는 베르센(Versene)(Thermo Fisher)을 사용하여 세포 덩어리로서 계대배양되거나 아큐타제 또는 TripLE에 의해 단일 세포로서 계대배양되었다. hiPSC의 게놈 안정성을 보장하기 위해, G-밴딩 핵형 분석을 5회의 계대배양마다 일상적으로 수행하였다. 이 연구에서는 정상 핵형을 가진 hiPSC만을 사용하였다.
재조합 단백질 BMP4 및 온코스타틴 M(OSM)은 휴먼자임(Humanzyme)으로부터 구입하였다. VEGF, bFGF, TPO, SCF, IL-3, IL-6, IL-9, IL-7, IL-15, sDLL-1은 페프로테크(Peprotech)로부터 구입하였다. EPO는 이바이오사이언스(eBioscience)(Thermal Fisher)로부터 구입하였다. 소분자 Y27632는 스템젠트(Stemgent)/레프로셀(Reprocell)로부터 구입하였다. CHIR99021은 토크리스 바이오사이언스(TOCRIS Bioscience)에서 구입하였다. 소분자 SB431542는 리에이전트 다이렉트(Reagent Direct)로부터 구입하였다. SRI는 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)로부터 구입하였다.
CD31, CD144, CD34, CD43, CD235a, CD41a, CD42b, CD56, CD16, CD19, CD45, CD3, TCR, NKG2D, NKp44, NKp46의 유세포 분석기 분석을 위한 플루오로크롬 접합 항체는 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)로부터 구입하였다. CD133-APC 및 KIR2DS4-PE, KIR2DL1/DS1-PE 및 KIR3DL1/DS1-PE는 밀테니이(Miltenyi)로부터 구입하였다. Oct-4 FITC는 셀 시그널링(Cell Signaling)으로부터 구입하였다. CD31, CD34, CD43의 비접합된 마우스 항-인간 항체는 다코(DAKO)/애질런트(Agilent)로부터 구입하였다.
3D 분화를 위한 hiPSC의 사전 컨디셔닝
HiPSC 세포는 NutriStem® hPSC XF 배지(Biological Industries USA)에서 라미닌 521 또는 라미닌 511과 같은 매트릭스에서 배양되었다. 융합성 미분화 hiPSC를 아큐타제(Innovative Cell Technologies, Inc) 또는 TripLE(Thermo Fisher)를 사용하여 계대배양하고, 1 μM의 Y27632로 보충된 NutriStem®에서 cm2당 6-8 x 104개 세포의 밀도로 감소(1/2)된 매트릭스 농도로 코팅된 표면에 시딩하고, 3-7일 동안 배양하였다. HiPSC는 상기 조건에서 3-5회의 계대배양 동안 확장되었다. hiPSC의 미분화 상태는 유세포 분석기 분석에 의해 Oct-4의 발현 수준(95% 초과의 Oct-4 양성)으로 정량된다. 3D 현탁 배양을 시작하기 위해, 융합성 미분화 hiPSC를 아큐타제 또는 TripLE로 분리하고, Y27632(1 μM)로 보충된 NutriStem®에서 1 x 106개 세포/ml의 밀도로 스피너 플라스크에 시딩하였다. 세포를 30 ml 스피너 플라스크(Abel Biott)에서 50-80의 교반 속도로 48시간 동안 중단 없이 배양하였다. 시딩 48시간 후, 작은 샘플을 채취하여 형태 및 구체 크기를 조사하였다. 구체 크기가 250 - 300마이크로미터의 직경에 도달할 때까지 주기적으로 새 배지를 교체하였다. 계대배양를 위해, hiPSC 구체를 PBS(Mg-, Ca-)로 세척한 다음, 아큐타제 또는 TripLE로 분리하였다. 분리된 hiPSC 단일 세포를 조혈 분화의 확장 또는 개시를 위해 원하는 밀도로 시딩하였다.
hiPSC의 HEC 및 조혈 계통으로의 단계적 유도
상기 새로운 3D 분화 공정은 다음과 같은 4가지 목표를 달성하기 위해 특별히 개발되었다: (1) HEC 집단의 일관된 고효율 생성; (2) HEC 중간체로부터 조혈 계통으로의 효율적인 전환; (3) 장기간 배양에서 강력한 CD34+ 집단의 유지; 및 (4) 모든 계통 특이성을 가진 고품질 HPC 수집의 최대화.
효율적인 HEC 분화를 위한 최적의 시딩 밀도를 결정하기 위해, 분리된 hiPSC 현탁액을 HEC 유도 배지 M1(Y27632로 보충된 NutriStem®)에서 12시간 동안 3개의 상이한 밀도(0.67, 1 및 1.33 x 106개 세포/ml)로 시딩하였다. 평균 hiPSC 구체 크기를 측정하였다. 전형적인 구체 크기는 시딩 밀도에 따라 80-150마이크로미터 사이의 직경이었다. HE 분화를 개시시키기 위해, Y27632가 포함된 NutriStem®을 제거하고, 25-50 ng/ml의 농도 범위에서 BMP4, VEGF 및 bFGF로 보충된 HEC 유도 배지 M2(성장 인자가 없는 NutriStem® hPSC XF 배지)로 교체하였다. M2의 HiPSC 구체를 저산소 조건(5% 산소) 하에서 4일 동안 배양한 후, 20%의 정상 산소 농도에서 추가로 2일 동안 배양하였다. 배지를 매일 교체하고, 소분자 CHIR99021을 3일차 및 4일차에 3 mM로 첨가하고, 소분자 SB431542를 4일차 및 5일차에 3 mM로 첨가하였다(도 2 참조). HEC 분화 6일차에, 37℃에서 15-30분 동안 TripLE로 처리하여 세포 구체를 단일 세포 현탁액으로 분리시켰다. HEC 특이적 표면 마커 CD31, CD144(VE-카드헤린), CD34 및 CD43의 발현은 유세포 분석을 사용하여 분석되었다. 성공적인 HEC 분화는 30-70% CD31+ 및 CD144+ 세포뿐만 아니라, 15-30% CD34+ 및 7.5-20% CD43+ 세포를 생성한다. HEC 함유 구체는 조혈 수임 및 확장 배지 M3으로 전환될 수 있다(도 2).
조혈 전구 세포 방출, 수집 및 특성화
HEC는 내피 또는 조혈 계통이 될 수 있는 이중 효능 중배엽 중간체 세포 집단이다. 본 발명자들의 새로 개발된 플랫폼에서 조혈 계통 생산량을 극대화하기 위해, TPO(10-25 ng/ml), SCF(10-25 ng/ml), Flt3L(10-25 ng/ml), IL-3(2-10 ng/ml), IL-6(2-10 ng/ml), SR1(0.75 μM), OSM(2-10 ng/ml) 및 EPO(2 U/ml)로 보충된 조혈 확장 배지 M3을 5일 동안의 1단계 확장에 사용하였다. TPO(10-25 ng/ml), SCF(10-25 ng/ml), Flt3L(10-25 ng/ml), IL-3(2-10 ng/ml), IL-6(2-10 ng/ml), SR1(0.75 μM), OSM(2-10 ng/ml), 및 EPO(3 U/ml)로 보충된 조혈 분화/확장 배지 M4를 2단계 확장(최대 40일)에 사용하였다. 배지를 매일 교체하고, 방출된 전구 세포를 원심분리에 의해 배지로부터 수집하고, CD41(거핵구 전구 세포), CD235a(적혈구 전구 세포), CD34+CD45+(초기 림프/골수 계통 전구 세포), CD56+(NK 계통 전구 세포) 및 CD34+CD133+(조혈 줄기 세포)와 같은 표면 계통 특이적 마커에 대해 분석하였다.
3D 세포 구체에서 HEC 집단의 단계적 유도에 대한 형태학적 및 면역 형광 분석
0일차부터 시작하여, 미분화된 hiPSC 구체 및 다양한 공정 단계에서 분화된 구체를 수집하고, PBS 중의 4% 파라포름알데하이드에 4℃에서 1시간 동안 고정하였다. 그 다음, 구체를 세척하고(PBS로 1회), OCT로 -20℃에서 1시간 동안 포매시켰다. 동결된 구체는 레이카(Leica) CM1900 냉동박절기(Cryostat)에 의해 10-15마이크로미터 두께로 절편화되었다. 절편을 양하전 유리 슬라이드에 올리고, 실온에서 최소 1시간 동안 공기 건조하였다. 구체 절편을 PBS에서 새로 만든 차가운(4℃) 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 사용하여 10분 동안 다시 고정한 다음, PBS에서 3회 세척하였다. 조직학적 검사를 위해, 슬라이드를 헤마톡실린 용액으로 30초 동안 염색하고, 수돗물로 헹구고, 수성 마운트(Vector Fab)에 장착하였다. 구체의 형태를 명시야 현미경 하에서 컬러 이미징 시스템에 의해 기록하였다.
면역 형광 염색을 위해, 표본을 차단 용액(DAKO/Agilent)으로 RT에서 30분 동안 처리한 후, 비접합딘 1차 항체(차단 용액으로 1:50-100의 비율로 희석된 CD31, CD34, CD43)를 포함하거나 포함하지 않으면서 RT에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 차단 용액으로 1:200 또는 1:400의 비율로 희석한 일치하는 Alexa 488-접합 당나귀 항-마우스 항체(Thermo Fisher)와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 슬라이드를 다시 PBS로 3회 세척하고, DAPi를 포함하는 장착 배지(mounting medium)로 장착하였다. 세포 구체 절편에서 HEC 및/또는 조혈 마커의 발현은 형광 현미경 이미징 시스템(Nikon, Eclipse)에 의해 가시화되었다.
CD34 + 집단의 정제 및 특성화
다양한 분화 단계에서 세포 구체를 수집하고, CD34+ 집단 농축을 위해 단일 세포로 분리시켰다. 초기 구체(12일차까지의)의 분리는 37℃에서 15분 내지 1시간 동안만 TripLE와 함께 인큐베이팅하여 달성할 수 있다. 12일차 후의 구체의 경우에는, 후속적인 TripLE 분리에 추가하여 1 mg/ml 농도의 콜라게나아제 IV(Thermo-Fisher)와 함께 37℃에서 3-24시간 동안 사전 인큐베이팅이 필요할 것이다. 분리가 끝날 때, 세포 현탁액을 40 μm 메시가 있는 스트레이너를 통해 여과하여 임의의 큰 세포 덩어리를 제거하였다. 밀테니이 CD34 및 CD45 마이크로비드 키트(Miltenyi)를 사용하여 특정 세포 집단 농축을 수행하였다. CD133+ 및 CD133- HPC 집단은 제조업체의 지시에 따라 CD133 마이크로비드 키트(Miltenyi)에 의해 분리되었다. 상이한 분획의 세포를 CD34, CD45 및 CD133 발현에 대해 유세포 분석에 의해 분석하였다.
여러 분화 일차에 구체로부터 정제된 CD34+, CD34-CD45+ 및 CD34-CD45- 집단을 조혈 콜로니 형성 검정에 사용하였다. 간단히 설명하면, 3개 분획 각각으로부터 2,000개의 세포를 1 ml Methcult H4436(Stemcell Technologies)과 혼합하고, 24웰 초저 부착 플레이트에 시딩하였다. 콜로니의 성장은 최대 25일 동안 매일 현미경 관찰에 의해 모니터링하였다. 조혈 콜로니의 형태 및 양은 사진 및 수동 계수에 의해 기록하였다.
거핵구(MK) 계통 특이적 분화 및 HPC로부터 혈소판의 생성
분화 8일차로부터 10일차까지 방출된 HPC는 이전에 보고된 바와 같이 MK 계통에 유리한 조건을 사용하여 시험관 내에서 수집 및 배양되었다(Feng et al. 2014; Thon et al. 2014). StemSpan™-ACF(STEMCELL Technologies Inc.) 배지에는 초저 부착 플레이트(Corning)에서 TPO, SCF, IL-6 및 IL-9 및 헤파린(5 U/ml)이 보충되었다. 5 마이크로몰 Y-27632를 배양의 처음 3일 동안 첨가하고, 세포를 39℃에서 7% C02에서 인큐베이팅하였다. 세포 밀도는 매일 모니터링하고, 처음 4일 동안 106개 세포/ml로 유지하기 위해 신선한 배지를 첨가하였다. MK 전구 세포(MKP)로부터 MK의 성숙은 CD41a 및 CD42b 발현을 분석함으로써 모니터링되었다. 일단 프로혈소판 형태(도 12)가 관찰되면, 혈소판을 3-5일 동안 연속적으로 수집하고, CD41a/CD42b 발현에 대해 분석하였다.
시험관 내에서 HPC의 NK 계통 특이적 분화
분화 8일, 11일 및 18일차에 방출된 HPC를 수집하고, 보고된 바와 같은(Kaufman 2009; Knorr et al. 2013) NK 계통 개발에 유리한 조건을 일부 변경 사용하여 시험관 내에서 배양하였다. 10% FBS, SCF(10 ng/mL), Flt-3(5 ng/mL), IL-7(5 ng/mL), IL-15(10 ng/mL), sDLL-1(50 ng/mL), IL-6(10 ng/mL), OSM(10 ng/mL) 및 헤파린(3 U/mL)으로 보충된 2개의 상이한 기본 배지가 비교를 위해 사용되었다. 모든 세포는 2 x 106개 세포/ml의 밀도로 초저 부착 표면에서 배양되었다. 배지를 격일로 교체하고, NK 계통 마커 CD56의 발현을 최대 25일 동안 모니터링하였다. 세포 스캐폴드를 사용한 NK 계통 발달의 경우, 6일차 구체로부터 수집된 2-4 x 106개의 HEC를 제조업체의 지침에 따라 Cell-Mate 3D μGel 40 키트(BRTI Life Sciences)에 로딩하였다. 로딩된 스캐폴드는 IL-3(2-10 ng, 처음 5일 동안만), IL-7(5-20 ng/ml), IL-15(5-20 ng/ml), SCF(10-100 ng/ml), Flt3L(10-100 ng/ml), sDLL-1(20-100 ng/ml) 및 헤파린이 보충된 무혈청 버전의 NK 촉진 배지에서 현탁액으로 배양되었다. 배지는 격일로 교체되었다. 현탁액 내의 스캐폴드로부터 방출된 세포는 최대 50일 동안 NK 특이적 마커 CD56, NKp44, NKp46, NKG2D, KIR, TCR, CD3 및 CD19에 대해 모니터링되었다.
K562 적백혈병 세포에 대한 인간 iPS 유래 NK 세포의 세포 독성
NK 세포의 세포 독성 활성을 정량적으로 측정하기 위한 시약 키트는 글리코토프 바이오테크놀로니 게엠베하(Glycotope Biotechnology GmbH, 독일 하이델베르크 소재)로부터 구입하였다. 간단히 설명하면, 표적 세포(T) K562 GFP 세포를 해동하고, 세포 생존율을 측정하였다(>92%). 완전한 배지(제공됨)로 K562 농도를 1 x 105개의 세포/ml로 조정하였다. NK 배양물로부터 수집한 iPS-NK는 정제 없이 이펙터 세포(E)로서 직접 사용되었다. 완전한 배지로 이펙터 세포 농도를 5 x 106/ml로 조정하였다. 12 x 75 mm 배양 튜브에서, IL-2(200 U/ml)가 있거나 없는 이펙터 세포를 각각 1:50, 1:25 및 1:12.5의 T:E 비율로 표적 세포와 혼합하고, K562 세포만을 대조군으로 사용하였다. 120 g에서 2-3분 동안 모든 튜브, 원심분리 튜브를 볼텍싱하였다. CO2 인큐베이터에서 120분 동안 튜브를 인큐베이팅하였다. 각각의 튜브에 50 ml DNA 염색 용액을 첨가하고, 볼텍싱하고, 빙상에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. GFP 및 PE의 유동 채널로 DNA 염색 용액을 첨가한 후 30 분 이내에 세포 현탁액을 측정하였다.
균등물
본 개시내용은 무엇보다도 시험관내 세포 배양 시스템 및 이의 용도를 제공한다. 본 개시내용의 특정 실시양태가 논의되었지만, 상기 명세서는 단지 예시적이며, 발명을 제한하는 것이 아니다. 본 명세서를 검토하면, 본 개시내용의 많은 변형이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 본 개시내용의 전체 범위는 그의 균등물의 전체 범위와 함께 청구범위, 및 상기 변형과 함께 명세서를 참고로 하여 결정되어야 한다.
참조에 의한 통합
본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
참고 문헌
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006

Claims (19)

  1. 조혈 계통 세포를 시험관 내에서 생산하는 방법으로서,
    (a) 제1 배양 배지에서 만능성 줄기 세포(PSC)를 포함하는 복수의 제1 구체를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 구체는 직경이 약 60-150 마이크로미터, 약 70-120 마이크로미터 또는 약 80-100 마이크로미터인 평균 크기를 갖고; 바람직하게는 제1 구체는 구체 크기를 모니터링하면서 3차원(3D) 구체 배양으로부터 생성되는 것인 단계;
    (b) PSC의 분화를 유도하기 위해 제2 배양 배지에서 복수의 제1 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 내피 세포(HEC)를 포함하는 복수의 제2 구체를 생성하는 단계;
    (c) HEC의 분화를 유도하기 위해 제3 배양 배지에서 복수의 제2 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 전구 세포(HPC)를 포함하는 복수의 제3 구체를 생성하는 단계;
    (d) HPC가 복수의 제3 구체로부터 방출되도록 하여 HPC의 실질적으로 단일 세포의 현탁액을 얻는 단계; 및
    (e) 선택적으로, HPC의 실질적으로 단일 세포의 현탁액을 공통 적혈구/거핵구 전구 세포, 적혈구, 거핵구, 혈소판, 공통 림프성 전구 세포, 림프 계통 세포, 림프구(예컨대, T 림프구), 자연 살해(NK) 세포, 공통 골수성 전구 세포, 공통 과립단핵구성 전구 세포, 단핵구, 대식세포 및/또는 수지상 세포로 추가로 분화시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 림프 계통 세포를 시험관 내에서 생산하는 방법으로서,
    (a) 제1 배양 배지에서 만능성 줄기 세포(PSC)를 포함하는 복수의 제1 구체를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 구체는 직경이 약 60-150 마이크로미터, 약 70-120 마이크로미터 또는 약 80-100 마이크로미터인 평균 크기를 갖고; 바람직하게는 제1 구체는 구체 크기를 모니터링하면서 3차원(3D) 구체 배양으로부터 생성되는 것인 단계;
    (b) PSC의 분화를 유도하기 위해 제2 배양 배지에서 복수의 제1 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 내피 세포(HEC)를 포함하는 복수의 제2 구체를 생성하는 단계;
    (c) 복수의 제2 구체를 효소적으로 분리하여 HEC의 실질적으로 단일 세포의 현탁액을 얻는 단계;
    (d) HEC의 실질적으로 단일 세포를 생체내 조혈 니치를 모방하는 스캐폴드에 시딩하는 단계; 및
    (e) 스캐폴드에서 HEC를 배양하고 림프 계통 세포로 분화시키는 단계.
    를 포함하는 방법.
  3. 림프 계통 세포를 시험관 내에서 생산하는 방법으로서,
    (a) 제1 배양 배지에서 만능성 줄기 세포(PSC)를 포함하는 복수의 제1 구체를 제공하는 단계로서, 여기서 제1 구체는 직경이 약 60-150 마이크로미터, 약 70-120 마이크로미터 또는 약 80-100 마이크로미터인 평균 크기를 갖고; 바람직하게는 제1 구체는 구체 크기를 모니터링하면서 3차원(3D) 구체 배양으로부터 생성되는 것인 단계;
    (b) PSC의 분화를 유도하기 위해 제2 배양 배지에서 복수의 제1 구체를 3D 구체 배양하여 조혈 내피 세포(HEC)를 포함하는 복수의 제2 구체를 생성하는 단계; 및
    (c) 림프 계통 세포가 제2 구체로부터 방출되도록 허용하면서, 스캐폴드가 없는 제3 배양 배지에서 제2 구체 내의 HEC를 배양하고 림프 계통 세포로 분화시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PCS가, 바람직하게는 인간으로부터의, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능성 줄기 세포인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PCS가 Oct-4 발현에 대해 적어도 95% 양성인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 3D 구체 배양 단계가, 바람직하게는 연속 교반 하에서, 스피너 플라스크 또는 교반 탱크 생물 반응기에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 배지가 약 1-10 ng/mL의 TGF-β, 약 10-500 ng/mL의 bFGF 및 약 1-5 μM의 Y27632로 보충된 PSC 배양 배지인 방법.
  8. 제7항에 있어서, PSC 배양 배지가 NutriStem®, mTeSR™1, mTeSR™2, TeSR™-E8™ 또는 3D 현탁 배양에 적합한 다른 배양 배지인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 배양 배지가, 각각 바람직하게는 약 25 내지 약 50 ng/mL의 농도로, BMP4, VEGF 및 bFGF로 보충된, 선택적으로 각각 바람직하게는 약 1-10, 약 2-5, 또는 약 3 μM의 농도로, CHIR99012 및/또는 SB431542로 보충된 PSC 배양 배지인 방법.
  10. 제9항에 있어서, PSC 배양 배지가 NutriStem®, mTeSR™1, mTeSR™2, TeSR™-E8™ 또는 3D 현탁 배양에 적합한 다른 배양 배지인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 제2 배양 배지가 (i) 제1 기간(예를 들어, 1일차 및 2일차) 동안 BMP4, VEGF 및 bFGF, (ii) 제2 기간(예를 들어, 3일차) 동안 BMP4, VEGF, bFGF 및 CHIR99012, (iii) 제3 기간(예를 들어, 4일차) 동안 BMP4, VEGF, bFGF, CHIR99012 및 SB431542, (iv) 제4 기간(예를 들어, 5일차) 동안 BMP4, VEGF, bFGF 및 SB431542, 및 (v) 제5 기간(예를 들어, 6일차) 동안 BMP4, VEGF 및 bFGF로 보충되는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 제2 배양 배지에서의 상기 배양이 제1 기간 내지 제3 기간(예를 들어, 1일차 내지 4일차) 동안 저산소 상태(약 5% 산소), 이어서 제4 기간 및 제5 기간(예를 들어, 5일차 및 6일차) 동안 약 20%의 정상 산소 농도 하에서 수행되는 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제3항에 있어서, 제3 배양 배지가 TPO, SCF, Flt3L, IL-3, IL-6, IL-7, IL-15, SR1, sDLL-1, OSM 및/또는 EPO 중 하나 이상으로 보충된 조혈 기초 배지인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 조혈 기초 배지가 StemSpan™-ACF, PRIME-XV®, PromoCell® 조혈 전구세포 확장 배지 DXF 및 조혈 줄기 세포 확장에 적합한 다른 배양 시스템인 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (e)가 TPO, SCF, Flt3L, IL-3, IL-6, IL-7, IL-15, SR1, sDLL-1, OSM 및/또는 EPO 중 하나 이상으로 보충된 조혈 기초 배지에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 조혈 기초 배지가 StemSpan™-ACF, PRIME-XV®, PromoCell® 조혈 전구세포 확장 배지 DXF 및 계통 특이적 확장 및 성숙에 적합한 다른 배양 배지인 방법.
  17. 제2항 또는 제3항에 있어서, 림프 계통 세포가 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포인 방법.
  18. 입양 세포 요법용 조성물로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 복수의 세포를 포함하고, 바람직하게는 세포가 암 또는 다른 면역 질환의 치료를 위해 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체 또는 질환 항원에 대한 다른 수용체를 발현하도록 조작된 세포이고, 보다 바람직하게는 세포가 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포인 조성물.
  19. 암 또는 다른 면역 질환의 치료를 위해 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 세포로서, 바람직하게는 세포가 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체 또는 질환 항원에 대한 다른 수용체를 발현하도록 조작된 세포이고, 보다 바람직하게는 세포가 T 세포, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포인 세포.
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