TW202346574A - 自然殺手細胞之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供一種可於短時間由多潛能幹細胞大量地製造簡便、廉價且安全的高品質自然殺手(NK)細胞的新穎NK細胞製造法。具體而言，係提供一種NK細胞之製造方法，其特徵為，包含：
(1)於第一培養基中，形成平均粒徑200μm以上的多潛能幹細胞球體之步驟；
(2)將步驟(1)中形成之多潛能幹細胞球體，藉由使用第二培養基之三維培養誘導至包含造血前驅細胞的胞群體之步驟；及
(3)將步驟(2)中所得之包含造血前驅細胞的胞群體，藉由使用第三培養基之三維培養誘導至包含NK細胞的胞群體之步驟，
且以滲流式培養法進行步驟(1)至(3)。
Description
本發明係有關於一種可由多潛能幹細胞有效率且大量地製造醫療領域中有用的自然殺手細胞(以下有簡稱為「NK細胞」)之方法。
關於由多潛能幹細胞誘導NK細胞的方法，已有諸多報導。就迄此之報導例，分化誘導至NK細胞之步驟以及其後之放大培養步驟極耗費時間，且以使用培養皿等的平面培養(二維培養)為主流(例如參照非專利文獻1及2)。專利文獻1中記載一種由多潛能幹細胞球體，經由造血前驅細胞而誘導NK細胞之方法。然而，專利文獻1所記載之多潛能幹細胞球體的平均粒形較小，且未記載任何藉由滲流式培養的培養基更換。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1] WO2020/086889
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 515, Issue 1, 12 July 2019, Pages 1-8
[非專利文獻2] Methods Mol Biol. 2019; 2048: 107-119.
[發明所欲解決之課題]
依循迄此之報導例誘導NK細胞時，分化誘導步驟或放大培養步驟極耗費時間，而且不易使培養培養基的更換作業機械化，而因有人工作業對最終製品的品質造成影響的風險。而且，亦推測會因更換培養基而導致工時增加而造成製造成本增加。尤其是二維培養時，放大培養規模理論上有其極限。基於此種背景，便要求比習知技術更有效且可放大規模的NK細胞之誘導技術。
[解決課題之手段]
本案發明人等多方面研究的結果發現，藉由使三維培養中形成之多潛能幹細胞之球體的平均粒徑成為200μm以上，並於此狀態下組合滲流式培養法，能有效且迅速地誘導NK細胞。而且以本方法所製造的NK細胞具有高活性，經冷凍、解凍後仍可維持其活性，由此可知亦可有用於作為細胞醫藥品之有效成分。
本案發明人等基於此等見解進一步重複多次研究的結果，終至完成本發明。
亦即，本發明如下：
[項1] 一種自然殺手(NK)細胞之製造方法，其特徵為，包含：
(1)於第一培養基中，形成平均粒徑200μm以上的多潛能幹細胞球體之步驟；
(2)將步驟(1)中形成之多潛能幹細胞球體，藉由使用第二培養基之三維培養誘導至包含造血前驅細胞的胞群體之步驟；及
(3)將步驟(2)中所得之包含造血前驅細胞的胞群體，藉由使用第三培養基之三維培養誘導至包含NK細胞的胞群體之步驟，
且以滲流式培養法進行步驟(1)至(3)。
[項2] 如項1之方法，其中未使用三維培養用載體及細胞外基質來實施步驟(1)至(3)。
[項3] 如項2之方法，其中步驟(1)中的滲流式培養係使用細孔徑15～75μm的分離膜來進行。
[項4] 如項2之方法，其中步驟(2)中的滲流式培養係使用細孔徑45～225μm的分離膜來進行。
[項5] 如項2之方法，其中步驟(3)中的滲流式培養係使用細孔徑0.2～10μm的分離膜來進行。
[項6] 如項1～5中任一項之方法，其中以連續滲流式培養法來進行步驟(1)至(3)。
[項7] 如項1～6中任一項之方法，其中第一培養基係包含ROCK抑制劑。
[項8] 如項1～7中任一項之方法，其中第二培養基係包含VEGF、BMP4及GSK3β抑制劑。
[項9] 如項8之方法，其中第二培養基進一步包含ROCK抑制劑或bFGF。
[項10] 如項1～7中任一項之方法，其中第二培養基係包含SCF、TGFβ/Smad抑制劑及VEGF。
[項11] 如項10之方法，其中第二培養基進一步包含ROCK抑制劑或bFGF。
[項12] 如項1～7中任一項之方法，其中第二培養基係包含SCF及Flt3L。
[項13] 如項12之方法，其中第二培養基進一步包含選自ROCK抑制劑、IL-3及IL-7的至少一種。
[項14] 如項1～7中任一項之方法，其中，
步驟(2)中的三維培養係包含：
(2-1)作為第二培養基使用包含VEGF、BMP4及GSK3β抑制劑的培養基之培養步驟；
(2-2)作為第二培養基使用包含SCF、TGFβ/Smad抑制劑及VEGF的培養基之培養步驟；及
(2-3)作為第二培養基使用包含SCF及Flt3L的培養基之培養步驟。
[項15] 如項1～14中任一項之方法，其中第三培養基係包含IL-15及SCF。
[項16] 如項15之方法，其中第三培養基進一步包含IL-7及Flt3L。
[項17] 如項1～16中任一項之方法，其中不需要NK細胞之區別步驟。
[發明之效果]
本發明細以藉由採三維滲流式培養之製造方法，而一次有效製造大量的NK細胞為特徵。藉由本發明之方法所製造之NK細胞對各種癌細胞顯示高細胞毒殺活性，由於其活性經冷凍也不會變差而維持，故適用於大規模臨床。
[實施發明之形態]
本發明為一種NK細胞之製造方法，其特徵為，包含：
(1)於第一培養基中，形成平均粒徑200μm以上的多潛能幹細胞球體之步驟；
(2)將步驟(1)中形成之多潛能幹細胞球體，藉由使用第二培養基之三維培養誘導至包含造血前驅細胞的胞群體之步驟；及
(3)將步驟(2)中所得之包含造血前驅細胞的胞群體，藉由使用第三培養基之三維培養誘導至包含NK細胞的胞群體之步驟，
且以連續滲流式培養法進行步驟(1)至(3)(以下有稱為「本發明之方法」)。
(三維培養法)
本發明中的三維培養法係首先使細胞之球體(球狀體)形成，並使其浮游於培養基中而進行培養之方法(本說明書中有記載為「三維浮游培養法」)。
三維浮游培養法為細胞培養法的一種，係以邊使用攪拌葉或振盪器使浮游細胞、球體(球狀體)，或者細胞經黏附之三維培養用之載體朝三維展開邊進行培養為特徵。因此，三維浮游培養與僅於培養容器底面培養細胞之二維培養相比，可使每單位空間的細胞數最大化；而且，透過使用攪拌葉或振盪器以三維混合，可使培養液的環境更均勻。又，於三維培養中，可藉由組合pH感測器或溶氧感測器等的各種檢測器，而在有效且均勻的環境下進行培養。
如此，可最大限度地利用培養空間、或可在均勻環境下進行培養，對假想商用生產之培養的放大規模亦屬有用。且在培養浮游細胞或球狀體時，由於為不需要經實施細胞培養用之特殊加工的塑膠載體、或多數培養細胞中所需之細胞外基質的培養法，可為在成本方面亦屬有利的培養方法。再者，其特徵之一在於，比起使細胞黏附於平面來培養的二維培養更能在接近生物體內的環境下進行培養，而為有用於製造需要各種細胞之分化誘導的多潛能幹細胞(例如胚性幹(ES)細胞、人工多潛能幹(iPS)細胞等)衍生之各種細胞製品的手段。
(滲流式培養法)
本發明之三維培養法，透過與滲流式培養法組合，可更有效地誘導NK細胞。
滲流式培養法為連續培養法的一種，係一邊對培養容器內的培養液供給一定量之新的培養基一邊同時抽取一定量的培養基，由此可達成連續地以更換培養基為目的之新的營養成分的供給與代謝物的去除之方法。
透過採用滲流式培養法，由於不需要培養基更換作業，可望大幅減低作業負擔。而且，由於此方法一般係以機械式進行，因此不會發生手動更換培養基時會發生之溫度變化、pH變化、溶氧濃度變化及溶解二氧化碳濃度變化等的環境變化。因此，可於同一容器內更長期地培養，其結果，亦可維持可於同一容器內維持的高細胞密度。又，滲流式培養法，亦能以一定濃度維持一般培養基更換時會被去除之細胞所生成的各種成長因子等，亦為可於接近仿血液循環系統之生物體內的環境進行培養的培養法。
滲流式培養時所使用之分離膜宜具有防止目標胞群體脫逃至培養系統外之一定的細孔徑及特性(例如疏水性程度等)。分離膜的細孔徑可根據目標胞群體而適宜選擇適切的大小；而在誘導至NK細胞之步驟中，由於在球體內外會誘導各種分化細胞，因此，其細孔徑的選擇一般需要各種的研討，極不易予以最佳化。
本案發明人等根據多重驗證，透過設定上述各培養步驟中的適切的細孔徑而完成本發明之有效的NK細胞誘導法。各步驟中的具體細孔徑係於後述；就本發明之滲流式培養中的合宜細孔徑，就步驟(1)，細孔徑為15～75μm；就步驟(2)，細孔徑為45～225μm；就步驟(3)，細孔徑為0.2～10μm。
分離膜之素材不特別限定，宜使用不會對細胞或培養基中之成分造成影響的素材，此種素材可舉出例如SUS304、SUS316等金屬素材、纖維素纖維等天然纖維，或者聚碸纖維、聚醚碸纖維等化學纖維。
本發明之三維培養法係以對在後述各步驟中存在於培養系統內的細胞球體或細胞等胞群體進行滲流式培養為特徵。各滲流式培養中的條件，關於各步驟係如後述之說明。又，本發明中的滲流式培養可「連續地進行滲流式培養」。
此處所稱「連續地進行滲流式培養」，係指在各步驟間僅進行膜更換，且於更換培養基時未插入通常所進行的洗淨步驟，而一邊抽去前步驟之培養基一邊供給下一步驟之培養基。
例如於步驟(1)中，係一邊供給後述之第一培養基一邊同樣地抽去培養基而連續地實施培養基更換，在步驟(1)至替換為步驟(2)之時間點，係一邊供給後述之第二培養基一邊同時抽去第一培養基而連續地實施由第一培養基至第二培養基的培養基更換。又，於步驟(2)中，係一邊供給第二培養基一邊同時抽去培養基而連續地實施培養基更換，在步驟(2)至替換為步驟(3)之時間點，係一邊供給後述之第三培養基一邊同時抽去第二培養基而連續地實施由第二培養基至第三培養基的培養基更換。進而，於步驟(3)中，係一邊供給第三培養基一邊同時抽去培養基而連續地實施培養基更換。
(關於形成多潛能幹細胞之球體之步驟：步驟(1))
本發明之方法中的步驟(1)係於第一培養基中形成平均粒徑200μm以上的多潛能幹細胞球體之步驟。
本發明中的多潛能幹細胞之球體化所使用之多潛能幹細胞可舉出ES細胞或iPS細胞，但不特別限制。例如使用iPS細胞時，iPS細胞之製造方法或來源細胞等不特別限定。又，iPS細胞之培養方法亦不特別限定，可為二維培養或三維培養。再者，即使為經冷凍保存之iPS細胞亦可使用。
球體化係於浮游培養條件下進行。作為浮游培養條件，只要可透過使用攪拌葉或振盪器進行三維混合而使培養液的環境呈均勻則不特別限定。又，浮游培養所用容器不特別限定，可使用具攪拌葉旋轉式、攪拌葉上下振盪式等的攪拌機構之容器。本發明之多潛能幹細胞之球體化中的多潛能幹細胞的播種密度為1.0×10
4cells/mL至1.0×10
6cells/mL的範圍。密度若高於此範圍，則球體的形狀會過大而影響後續的誘導效率。其中，更佳以5.0×10
4cells/mL至2.0×10
5cells/mL的範圍來播種。
本步驟(1)中的多潛能幹細胞之球體化所用培養液，只要是用於多潛能幹細胞的維持培養之培養液則不特別限定。此種培養液之實例可使用例如StemFit(註冊商標)AK03N(AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY股份有限公司)、mTeSR™1(STEMCELL Technologies Inc.)等可進行無供料培養之培養基。其中，本發明之方法中所使用之培養液較佳為可進行無供料培養之培養基中含有ROCK抑制劑的培養基。尤其是多潛能幹細胞使用iPS細胞時，宜使用StemFit(註冊商標)AK03N(AJINOMOTO HEALTHY
SUPPLY股份有限公司)等培養基。
本發明中的ROCK抑制劑可舉出例如Y27632或
Thiazovivin等。於iPS細胞培養中，一般作為ROCK抑制劑係使用Y27632；而於本發明中，其濃度較佳為1～20 μM，細胞播種後2日較佳以添加之狀態維持。
球體化所需之培養期間，只要可形成球體則不予限定，本發明中之球體並非為對凹部等插入多潛能幹細胞並結合而強制地使球體形成之類型，而是隨著細胞的生長而形成者，故需要一定的期間。例如較佳為細胞播種起2日至10日，更佳為4日至7日。
上述球體化可根據攪拌條件、播種密度條件、培養期間來調節。本發明之方法中的步驟(1)之球體平均粒徑係以通常200μm以上，具體而言為200～600μm的範圍適宜調整；為了進一步提升NK細胞的製造效率，較佳調整為200～500μm，甚而更佳調成為200～400μm。
平均粒徑若未達200μm，培養天數不足，無法充分取得細胞數，亦會影響步驟(2)而不佳。又，平均粒徑過大時，則充分的營養源的供給及氧氣的供給會阻滯於球體中心部，而誘發壞死等細胞死亡而不佳(例如參照Cells Tissues Organs 196.1 (2012): 34-47.)。
該球體化步驟(1)係以滲流式培養法來實施。步驟(1)中，滲流式培養可自多潛能幹細胞的播種時實施，惟較佳自最初之多潛能幹細胞的播種起經過約1日後實施，更佳為經過2日後實施。這是因為，在培養1～2日後會形成球狀體，於此條件下平均粒徑成為200μm以上之故；且因為若於形成球狀體前實施滲流式培養，則有無法充分形成球狀體之虞。
又，本步驟(1)中，滲流式培養中的分離膜的細孔徑較佳為15～75μm，更加為細孔徑25～45μm。這是因為，透過使用不超過合宜球狀體大小之細孔徑的分離膜，可使一定的球狀體停留於培養容器內地進行滲流式培養之故。從而，較佳為步驟(1)係包含：
(1-1)於第一培養基中，形成平均粒徑200μm以上的多潛能幹細胞球體之步驟及
(1-2)將步驟(1-1)中所得之平均粒徑200μm以上的多潛能幹細胞球體，以滲流式培養法進行維持培養之步驟。
亦即，步驟(1)(或步驟(1-2))之滲流式培養中的分離膜的細孔徑較佳為15～75μm，更佳為細孔徑25～45μm。
滲流式培養中的培養基更換係以一定的稀釋率實施。多潛能幹細胞之球體形成步驟較佳以0.01至0.2 hr
-1的稀釋率實施，能以細胞的播種密度、培養上清液的葡萄糖濃度、乳酸濃度、麩醯胺酸濃度、麩胺酸濃度等為參考為調整。稀釋率的調整可將培養容器、供給瓶、排出瓶載置於天秤或荷重元上，或者以蠕動泵的旋轉數來管理。
本步驟(1)中，可使用溫度感測器、pH感測器、溶氧感測器等將溫度、pH、溶氧濃度控制成適於形成多潛能幹細胞之球體的任意數值。
培養溫度較佳控制於35～39℃之間，更佳控制於36～38℃。pH係以經無菌處理之壓縮空氣，或經無菌處理之碳酸氣體的流入，或pH調整劑，或者滲流式培養培養基的稀釋率來控制，其控制值較佳控制於6.8～8.0之間，更佳控制於7.0～7.4之間。溶氧濃度係以經無菌處理之壓縮空氣，或經無菌處理之氮氣，或經無菌處理之氧氣來控制，其值係控制於0～6.86 mg/L之間，較佳維持於2.00 mg/L以上的濃度。此外，用於維持pH、溶氧所使用之氣體可吹入培養液上表面的氣體層、吹入培養液中及隔著透氣膜更換而不予限制。
對如此所得之多潛能幹細胞球體施行下列步驟(2)而誘導造血前驅細胞。
(關於將多潛能幹細胞之球體誘導至含造血幹細胞之胞群體之步驟：步驟(2))
本發明之方法中的步驟(2)係將步驟(1)中形成之球體，藉由使用第二培養基的三維培養誘導至含造血前驅細胞之胞群體之步驟。
此處所稱藉由本步驟所誘導之「含造血前驅細胞之胞群體」，係指藉由步驟(2)所得之胞群體，即包含在球體內外所誘導之造血前驅胞群體的概念。
此胞群體包含球體內所形成之造血前驅細胞、誘導後自球體脫逃之造血前驅細胞，以及處於誘導至造血前驅細胞之過程的球體內外的細胞。
步驟(2)亦與步驟(1)同樣地以滲流式培養法實施。本步驟中使用之分離膜的細孔徑較佳為45～225μm，細孔徑更佳為45～100μm。本步驟之滲流式培養係從步驟(2)剛開始後至步驟(2)結束時實施。於此期間，「多潛能幹細胞球體」係朝向「含造血前驅細胞之胞群體」誘導。
於步驟(2)之期間，透過使用具有上述細孔徑的分離膜，可使含有一定的造血前驅細胞之胞群體停留於培養容器內而進行滲流式培養。
伴隨本步驟(2)中的滲流式培養所進行之培養基更換亦與步驟(1)中所記載者同樣地以一定的稀釋率實施。具體而言，較佳與步驟(1)同樣地以0.01至0.2 hr
-1的稀釋率實施，能以細胞的播種密度、培養上清液的葡萄糖濃度、乳酸濃度、麩醯胺酸濃度、麩胺酸濃度等為參考來調整。此稀釋率在將步驟(1)中使用之培養基更換為步驟(2)中使用之培養基時亦適用。
本步驟(2)中的第二培養基，只要是可將多潛能幹細胞誘導至造血前驅細胞的培養基則不特別限定。
此種培養基可舉出例如包含血管內皮生長因子(VEGF)、骨形成蛋白質4(BMP4)及糖原合成酵素3β(GSK3β)抑制劑之培養基(以下記載為培養基(2-1))、包含幹細胞因子(SCF)及乙型轉化生長因子(TGFβ)/Smad抑制劑之培養基(以下記載為培養基(2-2))、或包含SCF及Flt3配位子(Flt3L)之培養基(以下記載為培養基(2-3))。此等各培養基成分亦可視需求適宜改變組合或量來設計適切的誘導培養基。以下，作為此種培養基的一例，茲說明(2-1)～(2-3)之各培養基。
培養基(2-1)係包含VEGF、BMP4及GSK3β抑制劑的培養基。
於此，GSK3β抑制劑可舉出CHIR99021或SB216763等，較佳為CHIR99021。
VEGF的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為50～100 ng/mL。BMP4的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為50～100 ng/mL。GSK3β抑制劑的濃度，使用CHIR99021時，較佳為1～10 μM，更佳為1～5 μM。
甚而，培養基(2-1)亦可包含ROCK抑制劑或bFGF。添加ROCK抑制劑時，ROCK抑制劑可舉出步驟(1)所記載者，較佳為Y27632。ROCK抑制劑的濃度，使用Y27632時，較佳為1～20 μM，更佳為1～10 μM。又添加bFGF時的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為10～50 ng/mL。
培養基(2-1)之基礎培養基不特別限定，較佳使用例如DMEM/F-12、HEPES(Thermo Fisher Scientific)、Essential 6 medium(Thermo Fisher Scientific)等培養基。
培養基(2-2)係包含SCF、TGFβ/Smad抑制劑及VEGF的培養基。
於此，TGFβ/Smad抑制劑可舉出SB431542、
LY2157299，以及LY2109761等，較佳為SB431542。SCF的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為20～50 ng/mL。TGFβ/Smad抑制劑的濃度，使用SB431542時，較佳為1～10 μM，更佳為1～5 μM。VEGF的濃度係與培養基(2-1)相同，較佳為1～100 ng/mL，更佳為50～100 ng/mL。
再者，培養基(2-2)亦可包含ROCK抑制劑或bFGF。各者的具體例或使用時的濃度係與培養基(2-1)所記載者相同。
培養基(2-2)之基礎培養基不特別限定，可使用與培養基(2-1)所記載之基礎培養基相同者。
培養基(2-3)係包含SCF及Flt3L的培養基。SCF的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為20～50 ng/mL。Flt3L的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為20～50 ng/mL。
再者，培養基(2-2)亦可包含選自ROCK抑制劑、介白素(IL)-3及IL-7的至少一種。ROCK抑制劑可舉出前述者，較佳為Y27632。添加ROCK抑制劑時的濃度，使用Y27632時，較佳為1～20 μM。添加IL-3時的濃度較佳為1～100 ng/mL。添加IL-7時的濃度較佳為1～100 ng/mL。
培養基(2-2)之基礎培養基不特別限定，可使用適於造血前驅細胞誘導的培養基，宜使用例如對Stem Pro-34 SFM(Thermo Fisher Scientific)以最終濃度成為1～10 mM的方式添加L-麩醯胺酸或L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸的培養基。
此外，上述培養基(2-1)、(2-2)及(2-3)可分別單獨使用，而於步驟(2)中，可於適切的時間點將培養基(2-1)或(2-2)與(2-3)進行培養基更換，而更有效地誘導造血前驅細胞。例如可藉由將步驟(2)的前半部分以培養基(2-1)或(2-2)進行培養，並將後半部分以培養基(2-3)進行培養而有效地誘導造血前驅細胞。
此時，步驟(2)中之前半部分、後半部分的時間可適宜設定，例如藉由將前半部分設定為2～6日、後半部分設定為3～14日，可有效誘導造血前驅細胞。此培養基(2-1)或(2-2)與培養基(2-3)的更換可藉由連續進行灌流操作來實施，亦可將全部量替換為新的培養基來進行培養基更換，更佳以連續地進行灌流操作來實施培養基更換為宜。
再者，可於步驟(2)之前半部分使用的培養基(2-1)與(2-2)，藉由依序進行培養基更換，可有效誘導造血前驅細胞。具體而言，係首先以培養基(2-1)進行培養，接著以培養基(2-2)進行培養。
此時，使用各培養基的培養時間可適宜設定，例如藉由將培養基(2-1)的培養時間設定為1～3日、培養基(2-2)的培養時間設定為1～3日，可有效誘導造血前驅細胞。此培養基(2-1)與(2-2)的更換可藉由連續進行灌流操作來實施，亦可將全部量替換為新的培養基來進行培養基更換，更佳以連續地進行灌流操作來實施培養基更換為宜。
從而，步驟(2)中的三維培養較佳為包含例如
(2-1)第二培養基使用培養基(2-1)之培養步驟；
(2-2)第二培養基使用培養基(2-2)之培養步驟；及
(2-3)第二培養基使用培養基(2-3)之培養步驟
的三維培養。各步驟(2-1)～(2-3)係以依序實施為佳。
本步驟(2)中，亦可與步驟(1)中記載者同樣地使用溫度感測器、pH感測器、溶氧感測器等將溫度、pH、溶氧濃度控制成適於形成多潛能幹細胞之球體的任意數值。
本發明之方法中，係自步驟(1)至步驟(3)，一連串未經由特殊的純化步驟而得到NK胞群體。因此，藉由本步驟(2)所得知此等胞群體，可按每個胞群體直接進入次一步驟(3)中，亦可僅篩選出造血前驅細胞後再進入步驟(3)。
本案發明人等確認，以任何方法皆可得到步驟(3)中的目標NK細胞。從而，於本發明之方法中，可加入由步驟(2)中所得之「含造血前驅細胞之胞群體」中去除造血前驅細胞以外之細胞之步驟，惟步驟(2)中所得之「含造血前驅細胞之胞群體」係以直接進入步驟(3)為宜。
藉由使如此所得之「含造血前驅細胞之胞群體」進入步驟(3)，來誘導NK細胞。
(關於將造血前驅細胞誘導至NK細胞之步驟：步驟(3))
本發明之方法中的步驟(3)係將步驟(2)中所得之「含造血前驅細胞之胞群體」，藉由使用第三培養基的三維培養誘導至「含NK細胞之胞群體」之步驟。
此處所稱藉由本步驟所誘導之「含NK細胞之胞群體」，係指包含藉由步驟(3)所得之NK細胞、或處於誘導至NK細胞之過程的細胞之胞群體。
NK細胞通常非形成球體而是以單一細胞存在。從而，根據步驟(3)，單一NK胞群體生長而形成多數個單一NK細胞之胞群體。此胞群體包含占大多數之NK細胞與處於誘導至部分NK細胞之過程的細胞。
步驟(3)亦可與步驟(1)及步驟(2)同樣地以滲流式培養法實施。所用分離膜的細孔徑較佳為0.1～10μm，細孔徑更佳為0.2～5μm。本步驟之滲流式培養係從步驟(3)剛開始後至步驟(3)結束時連續實施。於此期間，會生成誘導自造血前驅細胞球體之NK細胞，惟NK細胞不會停留於球體內而個別過濾出來。因此，步驟(3)之期間，透過使用不超過NK細胞的細胞徑的分離膜，可使一定的NK細胞停留於培養容器內而進行滲流式培養。
又，本步驟(3)中的培養基更換亦如步驟(1)所記載，以一定的稀釋率來實施。具體而言，較佳與步驟(1)同樣地以0.01至0.2 hr
-1的稀釋率實施，能以細胞的播種密度、培養上清液的葡萄糖濃度、乳酸濃度、麩醯胺酸濃度、麩胺酸濃度等為參考來調整。此稀釋率在將步驟(2)中使用之培養基更換為步驟(3)中使用之培養基時亦適用。
作為本步驟(3)中的第三培養基，只要是可將造血前驅細胞誘導至NK細胞的培養基則不特別限定。此種培養基可舉出例如包含IL-15及SCF之培養基。IL-15的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為20～50 ng/mL。SCF的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為20～50 ng/mL。此培養基中亦可進一步添加選自IL-7、Flt3L、ROCK抑制劑、GSK3β抑制劑及TGFβ受體(TGFβR)抑制劑的1種以上之成分。於此，ROCK抑制劑可舉出Y27632或Thiazovivin，較佳為Y27632。又，GSK3β抑制劑可舉出CHIR99021或SB216763等，較佳為CHIR99021。TGFβR抑制劑可舉出LY2157299、SB431542以及LY2109761等，較佳為LY2157299。於較佳一實施樣態中，第三培養基除IL-15及SCF外，進一步包含IL-7及Flt3L。
添加IL-7時的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為20～50 ng/mL。添加Flt3L時的濃度較佳為1～100 ng/mL，更佳為20～50 ng/mL。添加ROCK抑制劑時的濃度較佳為1～20 μM，更佳為1～10 μM。添加GSK3β抑制劑時的濃度較佳為1～10 nM，更佳為1～5 μM。添加TGFβR抑制劑時的濃度較佳為0.1～100 μM，更佳為0.1～5 μM。
步驟(3)中的培養時間通常為20～60日，較佳為約25～40日。
又，於步驟(3)中，添加IL-7、Flt3L、ROCK抑制劑、GSK3β抑制劑，或者TGFβR抑制劑時，藉由調節添加此等因子的時間點，可提升誘導效率。例如就IL-7及Flt3L，較佳在步驟(3)中的培養第10日以後去除，更佳為在第20日以後去除。又，就ROCK抑制劑、GSK3β抑制劑及TGFβR抑制劑，較佳於培養結束前4～7日添加。
步驟(3)中所使用之培養基的基礎培養基不特別限定，可使用例如AIM-V Medium(Thermo Fisher Scientific)、Stemline(註冊商標)II(Sigma-Aldrich)、ALyS505N-0(細胞科學研究所股份有限公司)及Stem Pro-34 SFM(Thermo Fisher Scientific)等培養基，較佳使用AIM-V Medium。再者，亦可含有人類血清、胎牛血清(FBS)、血清替代品。此等的濃度較佳為1～20%，更佳為1～10%。
本步驟(3)中，較佳進一步實施球體之去除步驟。去除的時間點可舉出例如本步驟開始前、本步驟實施中、本步驟結束時，不特別限定，可於任意時間點實施。
球體的去除較佳使用20～100μm的細胞過濾器來去除，更佳使用20～40μm的細胞過濾器來去除。
又，本步驟(3)中，亦可與步驟(1)中記載者同樣地使用溫度感測器、pH感測器、溶氧感測器等將溫度、pH、溶氧濃度控制成適於形成多潛能幹細胞之球體的任意數值。
又，於本發明之方法中，於步驟(3)之後，亦可進一步實施步驟(4)，其係所得之NK細胞的擴增培養步驟，或者NK細胞的成熟步驟。擴增培養步驟或者成熟步驟可適宜應用週知方法。
本發明之方法係以未使用三維培養用載體及細胞外基質來實施上述所有步驟(1)～(3)或步驟(1)～(4)為特徵。
於本發明之方法中，亦可進一步實施將進一步所得之NK細胞冷凍保存之步驟。本發明中的NK細胞可於NK製造步驟結束後，藉由自身熟知之方法冷凍、保存。
以下示出實施例及試驗例更具體地說明本發明，惟此等單僅為例示，本發明非限定於該等。
[實施例]
實施例1：由採滲流式培養之多潛能幹細胞向NK細胞的分化誘導
於本實施例中，多潛能幹細胞係使用人類iPS細胞株06E(TC-1133HKK_06E_MCB)，自iPS細胞球體形成至NK細胞的分化藉由三維滲流式培養法來實施。培養液的混合係使用攪拌葉，作為感測器係採用pH感測器、溫度感測器、溶氧感測器，對各種管理項目一邊連續地將培養液混合一邊實施監測及控制。又，滲流式培養係如圖1所示，使用專用的泵浦及天秤控制每單位時間的流入出速度來進行管理。
步驟(1)：形成多潛能幹細胞球體之步驟
多潛能幹細胞之球體形成係使用經二維放大培養之iPS細胞，於三維培養容器中以成為1.0×10
5cells/mL之細胞密度的方式實施細胞播種。其他細節係依以下方法實施。
步驟(1)中的培養基係對StemFit(註冊商標)AK03N (AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY股份有限公司)以成為10 μM的方式添加ROCK抑制劑Y27632而使用。
培養容器係使用總容量500 mL的一次性容器來實施，培養液係使用容器內的攪拌葉連續地混合。以pH感測器連續監控pH，供給無菌培養基，或者供給無菌空氣或無菌碳酸氣體時係控制成7.07。
溶氧濃度係使用溶氧感測器連續進行監控，供給無菌空氣或者無菌氧氣時係控制成維持1.50 mg/L以上。培養溫度係以溫度感測器連續進行監控，自容器外部以加熱器將容器加熱而將培養溫度控制成37.0℃。培養液量係調整成250 mL，使用泵浦與天秤供給新的培養基，並以同一速度實施培養液的排出，培養第2日至第4日係以0.02 hr
-1、培養第4日至第7日則以0.03 hr
-1的稀釋率控制。分離膜係使用細孔徑45μm的SUS316製分離膜來實施。
此外，作為比較對象係準備2種實施過手動更換培養基的檢體。比較對象係準備培養液量250 mL、培養液量30 mL此2檢體，培養基更換係以手動實施。
此時之培養基更換係停止培養容器的攪拌，靜置10分鐘後將上清液於第2日更換50%，於第4、5、6日更換80%來實施。對於培養液量30 mL之檢體係以旋轉式攪拌容器來培養，於CO
2恆溫箱內、CO
2濃度5%、37℃環境下實施浮游培養。以55 rpm的旋轉速度混合培養液來進行培養。對於培養液量250 mL之檢體，除手動實施培養基更換以外係以與滲流式培養檢體同樣的控制條件來培養。
於培養第7日自培養液中採取含球體之細胞懸浮液，使用顯微鏡測定球體的平均粒徑。將球體的顯微鏡照片(物鏡4倍)與球體的平均粒徑示於圖2。250 mL培養者，可將球徑控制於200-400μm之間而作成。又，以滲流式培養實施時，係連續地以自動控制實施行程中發生的培養基更換，無需實施培養槽向生物安全櫃等無菌環境下的移動，即可無問題地形成均勻球體。
步驟(2)：將多潛能幹細胞之球體誘導至含造血前驅細胞之胞群體之步驟
造血前驅細胞的作成係使用步驟(1)中作成之iPS細胞球體，於三維培養容器中以成為1.8×10
5cells/mL之細胞密度的方式實施iPS細胞球體播種。其他細節係依以下方法實施。
作為使用之培養基，於第2日前，係使用對DMEM/F-12, HEPES(Thermo Fisher Scientific)添加2μM之CHIR99021
、80 ng/mL之BMP4、80 ng/mL之VEGF165、50 ng/mL之bFGF者；於第2日至第4日，係使用對Essential 6(Thermo Fisher Scientific)添加50 ng/mL之SCF、80 ng/mL之VEGF165、2μM之SB431542、50 ng/mL之bFGF者。再者，於第4日至第14日，係使用對一般的造血前驅細胞分化誘導基礎培養基添加50 ng/mL之SCF、50 ng/mL之Flt3L者。
培養容器係使用總容量500 mL的一次性容器來實施，培養液係使用容器內的攪拌葉連續地混合。pH係以pH感測器連續監控，供給無菌培養基，或者供給無菌空氣或無菌碳酸氣體時係控制成7.07。溶氧濃度係使用溶氧感測器連續進行監控，供給無菌空氣或者無菌氧氣時係控制成維持1.50 mg/L以上。培養溫度係以溫度感測器連續進行監控，自容器外部以加熱器將容器加熱而將培養溫度控制成37.0℃。培養液量係調整成250 mL，使用泵浦與天秤供給新的培養基，並以同一速度實施培養液的排出，培養第1日至第2日係以0.07 hr
-1、培養第2日至第4日係以0.06 hr
-1、培養第5日至第7日係以0.13 hr
-1、培養第7日至第12日係以0.07 hr
-1、培養第12日至第14日則以0.02 hr
-1的稀釋率來實施控制。分離膜係使用細孔徑75μm的SUS316製分離膜。
此外，作為比較對象係準備2種實施過手動更換培養基的檢體。比較對象係準備培養液量250 mL、培養液量30 mL此2檢體，培養基更換係以手動實施。培養基更換之方法係停止培養容器的攪拌，靜置數分鐘後將上清液於第1、2、3、4、7、9日更換全部量來實施。此外，培養液量30 mL之檢體係以旋轉式攪拌容器來培養，於CO
2恆溫箱內實施培養，於5%、37℃環境下實施浮游培養，以55 rpm的旋轉速度混合培養液來進行培養。250 mL培養之比較對象，除手動實施培養基更換以外係以與滲流式培養檢體同樣的控制來培養。
於培養第14日自培養液中採取去除球體的浮游細胞懸浮液，以流式細胞儀確認已知表現為造血前驅細胞之細胞表面標記(CD34,CD43,CD45,CD117)(圖3)。
結果，以滲流式培養製造時與進行手動更換培養基時，比較造血前驅細胞的製造效率的結果，係於本步驟中，可連續地以自動控制實施行程中發生之培養基更換，無需實施培養槽向生物安全櫃等無菌環境下的移動即可實施培養，而且確認之標記的表現無大幅差之結果。從而，於步驟(2)中可藉由滲流式培養誘導造血前驅細胞。
步驟(3)：將造血幹細胞誘導至自然殺手細胞之步驟
NK細胞的製作係將步驟(2)中作成之造血前驅細胞於三維培養容器中以1.0×10
5cells/mL之細胞密度的方式播種含球體之浮游細胞來實施。又，培養的結果，在細胞密度成為1.0×10
7cells/mL以上的階段實施繼代。繼代後亦以同一培養基、培養條件持續培養，持續培養至細胞密度成為2.0×10
7cells/mL以上。其他細節係依以下方法實施。
培養基係使用對AIM V Serum Free Medium (Thermo Fisher scientific)以5%濃度添加FBS而製成培養基，並對其以最終濃度成為50 ng/mL的方式添加IL-15,IL-7,SCF,及Flt3L而作成者。
培養容器係使用總容量500 mL的一次性容器來實施，培養液係使用容器內的攪拌葉連續地混合。pH係以pH感測器連續監控，藉由供給無菌培養基，供給無菌空氣或無菌碳酸氣體而控制成7.07。
溶氧濃度係使用溶氧感測器連續進行監控，供給無菌空氣或者無菌氧氣時係控制成維持1.50 mg/L以上。培養溫度係以溫度感測器連續進行監控，自容器外部以加熱器將容器加熱而將培養溫度控制成37.0℃。培養液量係調整成250 mL，使用泵浦與天秤供給新的培養基，並以同一速度實施培養液的排出，配合細胞密度而以0.01 hr
-1至0.09 hr
-1的稀釋率來實施控制。
分離膜係使用細孔徑7μm的聚碸纖維製產品。作為比較對象係對培養液量250 mL、培養液量30 mL此2檢體實施手動更換培養基。根據手動之培養基更換，於1～2日實施1次培養基更換。具體而言，係停止培養容器的攪拌後，將培養液配合細胞密度回收50～90%，並以20℃、300 g、5分鐘的條件實施離心分離，去除上清液，對殘餘之顆粒添加與新的培養基除外之培養基量相等的量，充分混合後倒回至培養容器中。
此外，對於培養液量30 mL之檢體，係使用旋轉式攪拌容器，於5% CO
2恆溫箱內、37℃環境下，以55 rpm的旋轉速度實施浮游培養。對於培養液量250 mL之檢體，除手動實施培養基更換以外係以與滲流式培養檢體同樣的控制來培養。
採取100μL之培養中的培養液，其浮游細胞的密度係使用NC-200(ChemoMetec)來測定(圖4)。透過採用本發明之方法，就繼代後的細胞密度，結果能以高於比較對象的細胞密度來培養。其顯示由於此培養步驟之期間中的培養基更換可連續地自動實施，不僅可降低作業負擔，還能以更高的密度進行細胞培養。
回收以本發明之方法所製造之NK細胞培養液後，以20℃、300 g、5分鐘的條件進行離心分離，去除上清液後使細胞以STEM-CELLBANKER(註冊商標)GMP grade再懸浮，移至-80℃的冰箱予以冷凍。將經冷凍之細胞自冰箱中取出，以37℃的水浴熔解後，再懸浮於對AIM V Serum Free Medium(Thermo Fisher scientific)以5%濃度添加FBS之培養基，以最終濃度成為50 ng/mL的方式添加IL-15,IL-7,SCF,及Flt3L的培養基中，以20℃、300 g、5分鐘的條件進行離心分離，去除上清液後，再度以同樣的培養基使其再懸浮，播種於T75燒瓶，以5%、37℃控制的CO
2恆溫箱實施靜置培養。回收3日後的細胞，以流式細胞儀確認已知表現於NK細胞之作為細胞表面標記的CD56及已知與NK細胞的細胞毒殺活性有關之顆粒酶B及穿孔素的表現(圖5)。結果，與比較對象相同，可確認CD56、顆粒酶B、穿孔素的表現，顯示以本發明之方法亦可製造具有與既有方法相同之性質的自然殺手細胞。
試驗例1：所得NK細胞的活性評定
將藉由實施例1而得到且經冷凍、熔解、靜置培養後所得之細胞與人類肺胞基底上皮腺癌細胞之A549細胞共同進行培養(ET比 3:1)。測定共同培養4小時後之培養液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性，並量測對作成之NK細胞所具有之A549細胞的細胞毒殺活性。作為比較對象，選自人類末梢血單核細胞且經培養之NK細胞(primary NK)亦同樣地進行處理(圖6)。
結果，由iPS細胞作成之NK細胞與primary NK相比顯示較高的細胞毒殺活性，且使用本發明之方法的滲流式培養所作成之NK細胞顯示與既有培養方法相同的細胞毒殺活性。
[產業上可利用性]
本發明之源自多潛能幹細胞之NK細胞之製造方法可連續地以自動控制實施各步驟中發生之培養基更換，無需實施培養槽向生物安全櫃等無菌環境下的移動即可大量製造，與既有方法相比各步驟之球狀體形成、細胞分化均可無問題地實施，且於NK細胞的高密度培養，顯示能以更高的密度進行培養，可謂有用於可使用於癌症免疫療法之NK細胞的大量製造之方法。
本申請案係以於日本所申請之日本特願2022-013646(申請日：2022年1月31日)為基礎，其內容係全包含於本說明書中。
[圖1]為表示本發明中的滲流式培養裝置之典型例的示意圖。
[圖2]為表示以各種條件浮游培養人類iPS細胞時之第7日之球體的顯微鏡照片(由左至右：手動更換培養基･250 mL培養；滲流式培養･250 mL培養；手動更換培養基･30 mL培養)及各條件下所得之球體的平均粒徑的圖。
[圖3]為表示以各種條件浮游培養步驟(1)中所得之iPS細胞球體而分化誘導至造血前驅細胞時之培養第14日之各種造血前驅細胞標記表面分子的表現頻率的圖(由左至右：手動更換培養基･250 mL培養；滲流式培養･250 mL培養；手動更換培養基･30 mL培養)。
[圖4]為表示以各種條件浮游培養步驟(2)中所得之造血前驅細胞而分化誘導至NK細胞時之NK生細胞密度之每日變化的圖。此外，在圖的中途細胞密度下降係因播種於新容器之故。
[圖5]為表示將以各種條件浮游培養步驟(2)中所得之造血前驅細胞所得之NK胞群體冷凍熔解後，測定與NK細胞標記表面分子(CD56)及細胞毒殺活性有關之顆粒酶B(GZB)･穿孔素的表現的結果的圖(由左至右：手動更換培養基･250 mL培養；滲流式培養･250 mL培養；手動更換培養基･30 mL培養)。
[圖6]為表示將步驟(3)中所得之NK細胞冷凍熔解，進一步靜置培養後，藉由LDH試劑測定對A549細胞之細胞毒殺活性的結果的圖(由左至右：分離自人類末梢血單核細胞之初代NK細胞(正控制)；手動更換培養基･250 mL培養；滲流式培養・250 mL培養；手動更換培養基･30 mL培養)。
Claims (17)
- 一種自然殺手(NK)細胞之製造方法，其特徵為，包含： (1)於第一培養基中，形成平均粒徑200μm以上的多潛能幹細胞球體之步驟； (2)將步驟(1)中形成之多潛能幹細胞球體，藉由使用第二培養基之三維培養誘導至包含造血前驅細胞的胞群體之步驟；及 (3)將步驟(2)中所得之包含造血前驅細胞的胞群體，藉由使用第三培養基之三維培養誘導至包含NK細胞的胞群體之步驟， 且以滲流式培養法進行步驟(1)至(3)。
- 如請求項1之方法，其中未使用三維培養用載體及細胞外基質來實施步驟(1)至(3)。
- 如請求項2之方法，其中步驟(1)中的滲流式培養係使用細孔徑15～75μm的分離膜來進行。
- 如請求項2之方法，其中步驟(2)中的滲流式培養係使用細孔徑45～225μm的分離膜來進行。
- 如請求項2之方法，其中步驟(3)中的滲流式培養係使用細孔徑0.2～10μm的分離膜來進行。
- 如請求項1～5中任一項之方法，其中以連續滲流式培養法來進行步驟(1)至(3)。
- 如請求項1之方法，其中第一培養基係包含ROCK抑制劑。
- 如請求項1之方法，其中第二培養基係包含VEGF、BMP4及GSK3β抑制劑。
- 如請求項8之方法，其中第二培養基進一步包含ROCK抑制劑或bFGF。
- 如請求項1之方法，其中第二培養基係包含SCF、TGFβ/Smad抑制劑及VEGF。
- 如請求項10之方法，其中第二培養基進一步包含ROCK抑制劑或bFGF。
- 如請求項1之方法，其中第二培養基係包含SCF及Flt3L。
- 如請求項12之方法，其中第二培養基進一步包含選自ROCK抑制劑、IL-3及IL-7的至少一種。
- 如請求項1之方法，其中， 步驟(2)中的三維培養係包含： (2-1)作為第二培養基使用包含VEGF、BMP4及GSK3β抑制劑的培養基之培養步驟； (2-2)作為第二培養基使用包含SCF、TGFβ/Smad抑制劑及VEGF的培養基之培養步驟；及 (2-3)作為第二培養基使用包含SCF及Flt3L的培養基之培養步驟。
- 如請求項1之方法，其中第三培養基係包含IL-15及SCF。
- 如請求項15之方法，其中第三培養基進一步包含IL-7及Flt3L。
- 如請求項1之方法，其中不需要NK細胞之區別步驟。
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