KR20200034727A - 세포외 소포를 생산하는 유체 시스템 및 관련 방법 - Google Patents
세포외 소포를 생산하는 유체 시스템 및 관련 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 적어도 하나의 용기, 용기에 함유된 액체 배지 및 생산 세포를 포함하는 생산 세포로부터 세포외 소포를 생산하는 유체 시스템에 있어서, 그것은 액체 배지 중에 현탁된 미세담체를 또한 포함하고, 생산 세포의 대부분이 미세담체의 표면에 부착되며, 액체 배지 교반기를 또한 포함하고, 교반기 및 용기의 치수는 용기 내의 액체 배지의 와류를 제어할 수 있는 것을 특징으로 하는, 유체 시스템에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생산 세포로부터 세포외 소포를 생산하는 시스템, 이러한 소포를 생산하고 회수하는 방법, 및 예를 들어 세포 요법 및 재생 의학에 사용되는 이러한 시스템에 의해 생산된 소포에 관한 것이다.
세포는 세포외 소포를 그들의 환경 내로, 예를 들어, 생체내에서, 유기체의 생물학적 유체 내로 방출하는 것으로 알려져 있다. 세포외 소포는 개인화되거나 표적화된 방식으로 인체에 약물을 전달하는 효율적인 수단으로서 인정되어 왔다. 우선, 그들은 천연적인 생체적합성 및 면역 용인성을 나타낸다. 그들은 또한 신체의 소정 부분을 영상화하는 것 및 치료 기능을 가진 활성 성분을 전달하는 것 양자 모두를 가능하게 하는 치료진단 나노입자를 포함할 수 있다. 세포외 소포는 또한 세포간 소통 기능을 가진다: 예를 들어, 그들은 상이한 세포들 사이의 지질, 막 및 세포질 단백질, 및/또는 세포질의 뉴클레오티드, 예컨대 mRNA, 마이크로RNA, 또는 긴 비-코딩 RNA의 수송을 가능하게 한다.
특히, 세포외 소포의 사용은 세포의 치료적 사용 중의 알려진 문제, 예컨대 세포 복제, 분화, 혈관 폐색, 거부의 위험, 및 저장 및 냉동의 난점을 해결하는 것을 가능하게 할 수 있다. 결과적으로, 특히 세포 요법에 대한 대체물로서 또는 이에 부가하여, 치료적 사용에 충분한 양으로 세포 소포를 생산할 산업적 필요성이 존재한다.
이 목적을 위해, 문헌[Piffoux, M., Silva, A.K., Lugagne, J.B., Hersen, P., Wilhelm, C., & Gazeau, F., 2017, Extracellular Vesicle Production Loaded with Nanoparticles and Drugs in a Trade-off between Loading, Yield and Purity: Towards a Personalized Drug Delivery System, Advanced Biosystems]에는 세포외 소포를 생산하는 상이한 방법의 비교가 기재되어 있다.
첫번째 방법은 제대 정맥의 내피 세포(HUVEC)로부터 세포외 소포를 생산하는 데에 있는데, 이들 세포를 모세 혈관 내에서 생리학적 조건 하에, 또는 병리학적 조건 하에 혈관의 협착 중에 가해지는 스트레스를 모방하는 유체역학적 스트레스를 받게 하는 것에 의한 방법이다. 이들 스트레스는 4 시간 동안 미세유체 채널 내로 생산 세포를 통과시킴으로써 야기된다. 미세유체 칩은 200개의 채널을 포함하며, 여기서 세포가 층류로 수송되어 병렬 방식으로 소포를 생산한다.
그러나, 이 방법은 규모 문제를 가지고 있다: 미세유체 칩에 의해 생산되는 소포의 양은 전술한 용도에 필요한 양에 적합하지 않다. 게다가, 이러한 칩 내로 도입된 세포당 생성되는 세포외 소포의 수율(약 2 × 104 소포/세포)은, 세포에 의해 생성되는 소포의 최대 이론 수율, 예를 들어 MSC-유형 세포(중간엽 줄기 세포의 두문자어)의 경우의 대략 3.5 × 106 소포/세포 정도보다 훨씬 더 낮다. 최종적으로, 이 방법은 약물의 제조에 필요한 G.M.P.(의약품 제조 관리 기준(Good Manufacturing Practises)의 두문자어)라고 칭하는 표준에 부합할 것이 요구된다.
문헌에서 통상적으로 사용되고 문헌[Piffoux et al.]에 기재된 두번째 방법은 혈청이 없는 DMEM 유형(둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modied Eagle's Medium)의 두문자어)의 배양 배지 중에 HUVEC을 3 일 동안 배양하는 단계(기아, 또는 혈청 기아 기술이라고 칭함)로 구성된다. 혈청의 부재는 세포 스트레스를 이끌어 생산 세포에 의한 소포의 방출을 촉발한다. 이 방법은 미세유체 칩을 사용하는 방법보다 더 높은 수율을 나타내며 더 많은 양의 소포를 생산하는 것을 가능하게 한다(약 4 × 104 소포/생산 세포). 그러나, 계산된 수율은 이전 방법의 생산 시간보다 훨씬 더 긴 생산 시간에 상응한다. 이 방법은 전술한 용도에 충분한 양의 세포외 소포를 생산하는 것을 가능하게 하지 않는다. 최종적으로, 이 방법은 그것이 세포의 사멸을 유도하므로 소포를 연속적으로 생산하는 것을 허용하지 않는다.
문헌[Watson, D.C., Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G., ... & Jones, J.C., 2016, Efficient production and enhanced tumour delivery of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205]에는 생산되는 소포의 양을 증가시키는 것을 가능하게 하는 소포 생산 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 HEK293-유형 세포를 배양 플라스크에서, 이어서 중공섬유 막에서 배양하는 데에 있다. 중공섬유의 중앙 통로는 배양 배지가 생산 세포에 이송되는 것을 가능하게 한다. 생산 세포들이 이 통로 주위에 먼저 시딩되며, 여기서 그것들이 섬유간 공간에서 소포를 생산한다. 섬유간 공간에 포함된 액체 배지를 주 3회 수집하여, 예를 들어 대략 5 × 108 세포의 매우 많은 양의 시딩된 세포에 대해, 수주 내에 약 3 × 1012 소포를 생산하는 것을 가능하게 하여, 세포당 약 6000개의 세포외 소포의 수율 및 매우 낮은 순도 비율(예를 들어 단백질 마이크로그램당 1.09 × 109 입자)을 유발한다. 그러나, 이 생산은 전술한 용도에 관해서는 충분히 높지 않고 너무 느리다. 게다가, 이 방법은 무혈청 배지 중의 배양에 대해 특히 저항성인 세포주에 상응하는 생산 세포를 사용하여 기재되어 있다: 이 방법은 덜 저항성이고 표적화된 치료적 용도에 특히 적합한 줄기 세포, 예를 들어 인간 줄기 세포와 같은 생산 세포에 의한 소포의 생산으로 전환가능하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은, G.M.P 표준에 부합하는 조건 하에, 공지 방법에 의한 것보다 더 신속하게, 생산 세포로부터 다량의 세포외 소포를 생산하는 해결책을 제시하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 소포 생산 시스템의 수율, 즉, 생산된 소포의 개수와 생산 시스템 내로 도입된 생산 세포의 개수 사이의 비를 증가시키는 것을 가능하게 하는 해결책을 제시하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 생산 시스템 내로 도입되는 세포의 유형의 저항성 및 혈청 기아에 대한 저항성 여부에 무관하게, 매우 다양한 부착성 생산 세포로부터 세포외 소포를 생산하기에 적합한 시스템을 제시하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 세포외 소포를 연속적으로 생산하고 회수하는 해결책을 제시하는 것이다. 최종적으로, 본 발명의 다른 목적은 소포의 생산을 위한 유체 시스템의 구조를 단순화하고 그의 제조 비용을 감소시키는 것이다.
특히, 본 발명의 목적은, 적어도 하나의 용기, 용기에 함유된 액체 배지 및 생산 세포를 포함하는, 생산 세포로부터 세포외 소포를 생산하는 유체 시스템에 있어서, 그것은 액체 배지에 현탁된 미세담체를 또한 포함하고, 생산 세포의 대부분이 미세담체의 표면에 부착되며, 액체 배지 교반기를 또한 포함하고, 교반기 및 용기의 형상 및 치수는 용기 내의 액체 배지의 와류의 발생에 적합한 것을 특징으로 한다.
이러한 시스템을 이용하면, G.M.P 표준에 부합하는 시스템에서 다량으로 소포를 생산하는 것이 가능하다는 것이 이해된다. 이러한 시스템은 세포외 소포를 생산하는 공지 시스템보다 더 단순하고 제조 비용이 덜 든다는 것 또한 이해된다.
본 발명은 개별적으로 또는 기술적으로 가능한 그들의 조합 중 어느 하나로 채택되는 하기 특징에 의해 유리하게 보충된다:
- 액체 배지의 교반기 및 용기의 치수는 액체 배지의 유동을 제어하기에 적합하며, 유동의 콜모고로프(Kolmogorov) 길이는 75 ㎛ 이하, 바람직하게는 50 ㎛이하임;
- 유체 시스템은 출구 및 출구에 연결된 연결기를 포함하며, 연결기는 액체 배지 및 세포외 소포를 포함할 수 있음;
- 교반기는 회전식 교반기이며, 그것의 회전 속도(들), 형상, 크기는 용기의 형상 및 치수와 함께 용기 내의 액체 배지의 와류의 발생에 적합함;
- 미세담체는 마이크로비드이며, 마이크로비드의 직경은 100 ㎛ 내지 300 ㎛에 포함됨;
- 유체 시스템은 세포외 소포의 분리기를 포함하며, 이것은 소포가 고갈된 액체 배지를 용기 내로 재도입할 수 있도록 용기에 유동적으로 연결됨.
본 발명의 다른 목적은,
- 용기 내의 액체 배지의 와류를 야기하는 교반기를 제어하는 단계로서, 용기는 출구를 포함하고, 액체 배지는 미세담체의 표면 상에 부착되는 생산 세포를 포함하며, 미세담체는 액체 배지 중에 현탁되는 단계, 및
- 용기의 출구에서 세포외 소포를 포함하는 액체 배지를 수집하는 단계를 포함하는, 생산 세포로부터 세포외 소포를 생체외 생산하는 방법이다.
본 방법은 개별적으로 또는 기술적으로 가능한 그들의 조합 중 어느 하나로 채택되는 하기 특징에 의해 유리하게 보충된다:
- 액체 배지는 30 분 초과 동안 교반됨;
- 교반기는 액체 배지의 유동을 야기하도록 제어되며, 유동의 콜모고로프 길이는 75 ㎛ 이하, 바람직하게는 50 ㎛ 이하임;
- 분리기는 세포외 소포의 용기의 출구에서 수집된 액체 배지의 일부를 고갈시키며, 액체 배지의 일부는 용기 내로 재도입됨.
본 발명의 목적은 또한, 본 발명의 세포외 소포 생산 방법 목적에 의해 얻어질 수 있는 세포외 소포이다.
본 발명의 목적은 또한, 본 발명의 세포외 소포 생산 방법 목적에 의해 얻어질 수 있는 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물이다.
유리하게는, 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물은 재생 의학에 사용될 수 있다.
정의
용어 "세포외 소포"는 일반적으로 생산 세포에 의해 내인성으로 방출되는 소포를 지칭하며, 그의 직경은 30 nm 내지 5000 nm에 포함된다. 세포외 소포는 특히 엑소좀 및/또는 마이크로소포 및/또는 세포 자멸체(cellular apoptotic body)에 상응한다.
용어 "미세담체" 및 "미세지지체"는 그것의 표면 또는 내부에 부착되는 생산 세포의 성장을 가능하게 하는 구형 매트릭스를 지칭하며, 그것의 최대 크기는 50 ㎛ 내지 500 ㎛, 바람직하게 100 ㎛ 내지 300 ㎛에 포함된다. 미세담체는 일반적으로 비드이며, 그것의 밀도는 생산 세포의 액체 배양 배지의 것에 실질적으로 근접하도록 선택된다. 따라서, 온화한 혼합은 비드가 액체 배양 배지 중에 현탁되어 유지되는 것을 가능하게 한다.
이어지는 상세한 설명으로부터 다른 특징 및 이점 또한 나타날 것이며, 이는 순전히 예시적이고 비제한적이며, 첨부된 도면을 참조하여 판독되어야 한다.
- 도 1은 세포외 소포를 생산하는 유체 시스템을 개략적으로 예시한다.
- 도 2는 상이한 교반에 대해 유체 시스템 내의 HUVEC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수를 예시한다.
- 도 3은 상이한 교반에 대해 유체 시스템 내의 HUVEC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수를 예시한다.
- 도 4는 상이한 교반에 대해 유체 시스템 내의 MSC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수를 예시한다.
- 도 5는 HUVEC 및 MSC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수에 대한 콜모고로프 길이의 영향을 예시한다.
- 도 6은 미세담체의 표면 상에 부착되는 생산 세포를 예시한다.
- 도 7은 미세담체의 표면 상에 부착되는 생산 세포를 예시한다.
- 도 8은 상이한 교반 지속기간, 상이한 생산 세포, 및 상이한 교반 조건에 대해 세포외 소포의 생산 수율을 예시한다.
- 도 9는 72 h 동안의 혈청 결핍 방법과 비교하여 상이한 생산 세포 및 상이한 교반 조건에 대해 240 분의 교반 후의 세포외 소포의 생산 수율을 예시한다.
- 도 10은 상이한 교반 조건에 대해 교반 전 및 후의 미세 담체 상에 부착되는 생산 세포의 농도를 예시한다.
- 도 11은 세포외 소포의 생산을 위한 교반 조건 하의 HUVEC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 12는 세포외 소포의 생산을 위한 교반 조건 하의 HUVEC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 13은 세포외 소포 EV의 생산을 위한 교반 조건 하의 쥐과 동물 MSC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 14는 세포외 소포의 생산을 위한 교반 조건 하의 쥐과 동물 MSC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 15는 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 저온 전자 현미경법 현미경사진이다.
- 도 16은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 직경의 분포를 예시한다.
- 도 17은 72 h 동안의 혈청 결핍 방법과 비교하여, 입자의 개수와 단백질의 질량 사이의 비에 의해 제공되는, 액체 배지에서 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 순도를 예시한다.
- 도 18은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 액체 배지의 혈관신생 촉진 특성을 예시한다.
- 도 19는 유체 시스템, 혈청 결핍 방법, 또는 자발적 소포 방출 방법에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 액체 배지의 혈관신생 촉진 특성을 예시한다.
- 도 20은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 배양 배지에서 1 일 인큐베이션한 후의 심근세포(세포주 H9C2)의 대사 활성을 예시한다.
- 도 21은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 상이한 배양 배지에서 2 일 인큐베이션한 후의 심근세포(세포주 H9C2)의 대사 활성을 예시한다.
- 도 22는 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 다양한 농도를 포함하는 액체 배양 배지의 인큐베이션의, 심근세포의 증식에 대한 용량 효과를 예시한다.
- 도 23은 세포외 소포를 포함하는 액체 배양 배지의 존재 하에 2 일 인큐베이션한 후의 심근세포(세포주 H9C2)의 증식을 예시한다.
- 도 24는 랫트에서 캔(can)과 맹장 사이의 누공을 치료하기 위한 폴록사머 겔에서의 약제학적 조성물로서의, 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 조성물의 용도를 예시한다.
- 도 25는 랫트에서 캔과 맹장 사이의 누공을 치료하기 위한 폴록사머 겔에서의 약제학적 조성물로서의, 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 조성물의 용도를 예시한다.
- 도 26은 선행 기술에 따른 관용적인 생산 방법에 의해 생산되는 세포외 소포의 프로파일과 비교하여 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 세포외 소포의 단백질 프로파일(proteomic profile)을 예시한다.
- 도 1은 세포외 소포를 생산하는 유체 시스템을 개략적으로 예시한다.
- 도 2는 상이한 교반에 대해 유체 시스템 내의 HUVEC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수를 예시한다.
- 도 3은 상이한 교반에 대해 유체 시스템 내의 HUVEC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수를 예시한다.
- 도 4는 상이한 교반에 대해 유체 시스템 내의 MSC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수를 예시한다.
- 도 5는 HUVEC 및 MSC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포의 개수에 대한 콜모고로프 길이의 영향을 예시한다.
- 도 6은 미세담체의 표면 상에 부착되는 생산 세포를 예시한다.
- 도 7은 미세담체의 표면 상에 부착되는 생산 세포를 예시한다.
- 도 8은 상이한 교반 지속기간, 상이한 생산 세포, 및 상이한 교반 조건에 대해 세포외 소포의 생산 수율을 예시한다.
- 도 9는 72 h 동안의 혈청 결핍 방법과 비교하여 상이한 생산 세포 및 상이한 교반 조건에 대해 240 분의 교반 후의 세포외 소포의 생산 수율을 예시한다.
- 도 10은 상이한 교반 조건에 대해 교반 전 및 후의 미세 담체 상에 부착되는 생산 세포의 농도를 예시한다.
- 도 11은 세포외 소포의 생산을 위한 교반 조건 하의 HUVEC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 12는 세포외 소포의 생산을 위한 교반 조건 하의 HUVEC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 13은 세포외 소포 EV의 생산을 위한 교반 조건 하의 쥐과 동물 MSC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 14는 세포외 소포의 생산을 위한 교반 조건 하의 쥐과 동물 MSC-유형 생산 세포의 대사작용을 예시한다.
- 도 15는 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 저온 전자 현미경법 현미경사진이다.
- 도 16은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 직경의 분포를 예시한다.
- 도 17은 72 h 동안의 혈청 결핍 방법과 비교하여, 입자의 개수와 단백질의 질량 사이의 비에 의해 제공되는, 액체 배지에서 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 순도를 예시한다.
- 도 18은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 액체 배지의 혈관신생 촉진 특성을 예시한다.
- 도 19는 유체 시스템, 혈청 결핍 방법, 또는 자발적 소포 방출 방법에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 액체 배지의 혈관신생 촉진 특성을 예시한다.
- 도 20은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 배양 배지에서 1 일 인큐베이션한 후의 심근세포(세포주 H9C2)의 대사 활성을 예시한다.
- 도 21은 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포를 포함하는 상이한 배양 배지에서 2 일 인큐베이션한 후의 심근세포(세포주 H9C2)의 대사 활성을 예시한다.
- 도 22는 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 다양한 농도를 포함하는 액체 배양 배지의 인큐베이션의, 심근세포의 증식에 대한 용량 효과를 예시한다.
- 도 23은 세포외 소포를 포함하는 액체 배양 배지의 존재 하에 2 일 인큐베이션한 후의 심근세포(세포주 H9C2)의 증식을 예시한다.
- 도 24는 랫트에서 캔(can)과 맹장 사이의 누공을 치료하기 위한 폴록사머 겔에서의 약제학적 조성물로서의, 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 조성물의 용도를 예시한다.
- 도 25는 랫트에서 캔과 맹장 사이의 누공을 치료하기 위한 폴록사머 겔에서의 약제학적 조성물로서의, 유체 시스템에 의해 생산되는 세포외 소포의 조성물의 용도를 예시한다.
- 도 26은 선행 기술에 따른 관용적인 생산 방법에 의해 생산되는 세포외 소포의 프로파일과 비교하여 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 세포외 소포의 단백질 프로파일(proteomic profile)을 예시한다.
이론적 요소
콜모고로프 길이(또는 콜모고로프 치수 또는 에디(eddy)) 길이는 그로부터 유체의 점도가 이 유체의 유동의 운동 에너지를 소멸시키는 것을 허용하는 길이이다. 사실상, 콜모고로프 길이는 와류로 최소 소용돌이의 크기에 상응한다. 이 길이 LK는 콜모고로프의 간행물(문헌[Kolmogorov, A.N., 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301-305])에서 계산되며, 하기 수학식 (1)에 의해 기재된다:
상기 식에서, 
는 유동 액체 배지의 동점도이고 ε은 질량 단위당 유체 내에 소멸된 에너지(또는 유체로의 에너지 주입률(rate of energy injection))이다.
문헌[Zhou, G., Kresta, S.M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AIChE journal, 42(9), 2476-2490]에는 블레이드 임펠러-유형 교반기에 의해 액체 배지가 교반되는 용기의 기하형태와 ε 사이의 관계가 기재되어 있다. 이 관계는 하기 수학식 (2)에 의해 제공된다:
상기 식에서, Np는 액체 배지 내의 교반기의 무차원 동력수(dimensionless power number)(또는 뉴턴 수(Newton number))이고, D는 교반기의 직경(미터 단위)이며, N은 회전 속도(초당 회전수 단위)이고, V는 액체 배지의 부피(입방 미터 단위)이다. 이 관계는 본 발명의 실시에 사용되는 용기 및 교반기의 기하형태에 상응하는 ε을 계산하기 위해 사용된다. 동력수 Np는 수학식 (3)에 의해 알려진 방식으로 제공된다:
상기 식에서, P는 교반기에 의해 제공되는 동력이고, ρ는 액체 배지의 밀도이다. 수학식 (3)은 액체 배지의 유동의 레이놀즈 수(Reynolds number)에 따라 문헌[Nienow, A. W., & Miles, D., 1971, Impeller power numbers in closed vessels, Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1), 41-43] 또는 문헌[Zhou, G., Kresta, S.M., 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AIChE journal, 42(9), 2476-2490]에 기재된 바와 같이 조정될 수 있다. 하기 수학식 (4)에 의해 시스템의 레이놀즈 수를 계산하는 것 또한 가능하다:
유체 시스템의 일반 구조
도 1은 세포외 소포(EV)를 생산하는 유체 시스템(1)을 개략적으로 예시한다. 세포외 소포(EV)를 생산하는 유체 시스템(1)은 용기(4) 내에 세포외 소포(EV)를 다량으로 생산하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 본 발명은 이 실시 형태로 제한되지 않으며 병렬 또는 직렬로 유동적으로 연결된 일련의 용기(4)를 포함할 수 있다.
용기(4)는 액체 배지(5)를 함유한다. 용기(4)는, 예를 들어 유리 또는 플라스틱 재료로 제조된 통(vessel), 플라스크, 또는 액체 배지(5)를 함유하기에 적합한 임의의 다른 용기일 수 있다. 용기(4)의 부피는 세포외 소포(EV)를 다량으로 생산하는 것을 허용하는 인자 중의 하나이며: 이 부피는 50 mL 내지 500 L, 바람직하게 100 mL 내지 100 L, 바람직하게 500 mL 내지 10 L에 포함될 수 있다. 도 1에 개략적으로 예시된 용기(4)의 부피는 1 L이다. 용기(4)는 전형적으로 기체 입구(input) 및 기체 출구(output)를 포함하며, 이를 통해 세포 배양을 위해 적합하게 된 O2 및 CO2 농도를 포함하는, 예를 들어 5%의 CO2를 포함하는 분위기를 유동시킬 수 있다. 이 분위기는 적합한 기체 주입기/혼합기로부터, 또는 CO2 제어된 분위기의 오븐으로부터 유래할 수 있다. 제2 펌프(17)는 용기(4) 내의 이러한 기체 유동을 제어하는 것을 허용한다. 용기(4)는 또한 액체 배지(5) 및 세포외 소포(EV)를 포함할 수 있는 출구(9)를 포함한다. 이 출구는 미세담체(3)가 용기(4)로부터 회수되는 것을 허용하지 않는 미세담체(3)의 분리 및/또는 여과를 위한 수단에 의해 완성된다. 이 출구(9)는 생산되는 세포외 소포(EV)를 용기(4)로부터 추출하는 것을 허용한다. 용기(4)는 또한 액체 배지(5)를 용기(4) 내로 도입하도록 조정된 적어도 하나의 입구(8)를 포함할 수 있다.
액체 배지(5)는 일반적으로 식염수, 예를 들어 등장성 용액일 수 있다. 바람직하게, 액체 배지(5)는 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)가 혈청으로부터의 단백질 또는 다른 소포에 의해 오염되는 것을 허용하지 않는, 관심 세포의 배양을 허용하는 화합물이 있거나 이들이 첨가된 액체 배양 배지, 또는 세포외 소포로부터 사전에 정제된 혈청으로 보충된 배지 또는 혈청이 없는 배지이다. 혈청이 없는 DMEM-유형 액체 배지(5)가 사용될 수 있다. 액체 배지(5)의 최대 부피는 용기(4)에 의해 부분적으로 결정된다. 이 최대 부피는 또한 50 mL 내지 500 L, 바람직하게 100 mL 내지 100 L, 더욱 바람직하게 500 mL 내지 10 L에 포함될 수 있다. 용기(4) 내에 함유되는 액체 배지(5)의 최대 부피는 액체 배지(5)를 교반하는 것을 허용하는 교반기(7)의 선택에 의해 부분적으로 결정된다.
유체 시스템(1)은 또한 액체 배지(5) 중에 현탁된 미세담체(3)를 포함한다. 미세담체(3)는, 예를 들어 덱스트란으로 제조된 마이크로비드(14)일 수 있으며, 각각의 마이크로비드(14)는 콜라겐 또는 세포의 배양에 필요한 다른 재료의 층으로 덮일 수 있다. 유리, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 콜라겐, 및/또는 알기네이트와 같은 다른 재료가 미세담체(3)의 제조에 사용될 수 있다. 일반적 방식으로, 세포 배양에 적합한 미세담체의 세트는 세포외 소포(EV)의 생산에 적합하다. 예를 들어, 미세담체(3)의 밀도는 액체 배지(5)의 것보다 약간 더 클 수 있다. 덱스트란으로 제조된 마이크로비드(14)의 밀도는, 예를 들어 1.04이다. 이 밀도는 액체 배지(5)를 약간 교반함으로써 마이크로비드(14)를 액체 배지(5) 중에 현탁시키는 것을 가능하게 하며, 액체 배지(5) 중의 각각의 미세담체(3)의 드래그(drag)는 미세담체(3)의 밀도에 의존한다. 미세담체(3)의 최대 크기는 50 ㎛ 내지 500 ㎛, 바람직하게 100 ㎛ 내지 300 ㎛, 및 바람직하게는 130 ㎛ 내지 210 ㎛에 포함될 수 있다.
예를 들어, 미세담체(3)는 사이토덱스(Cytodex) 1(등록 상표) 유형의 마이크로비드(14)일 수 있다. 이들 마이크로비드(14)에 의해 형성되는 분말을 사용 전에 재수화시키고 멸균할 수 있다. 5 g의 PBS가 이어서, 사용 전에 4 ℃에서, 혈청이 없는 배양 배지(예를 들어 DMEM)에서 사용될 수 있다.
유체 시스템(1)은 또한 생산 세포(6)를 포함한다. 세포외 소포(EV)는 유체 시스템(1)에 의해 이들 생산 세포(6)로부터 생산된다. 적합한 세포 배양 배지에서 미세담체(3)의 표면 상에서, 유체 시스템(1)에 의한 세포외 소포(EV)의 생산 전에, 생산 세포(6)기 배양될 수 있다. 따라서, 생산 세포(6)의 배양과 세포외 소포(EV)의 생산 사이에 세포의 이전이 필요하지 않으며, 이는 임의의 오염을 피하고 전체 방법을 단순화하는 것을 허용한다. 예를 들어 액체 배지(5)의 교반에 의해 작은 비율의 생산 세포(6)가 탈착될 수 있다 하더라도, 대부분의 생산 세포(6)는 미세담체(3)의 표면에 부착된다. 이어서 다른 생산 세포가 액체 배지(5) 중에 현탁되거나 용기(4)의 저부에 침강된다. 일반적 방식으로, 비부착성 생산 세포를 포함하는 임의의 유형의 생산 세포(6), 바람직하게 부착성 생산 세포(6)를 사용할 수 있다. 예를 들어, 생산 세포(6)는 다능 세포 또는 유도 만능 줄기 세포(IPS 또는 IPSC)일 수 있다. 그들은 또한 유전자 변형 세포 및/또는 종양 세포주일 수 있다.
용기(4)는 또한 액체 배지(5)를 교반하는 것을 허용하는 교반기(7)를 포함한다. 교반기(7)는 블레이드 임펠러일 수 있으며, 그것의 블레이드는 적어도 부분적으로 액체 배지(5) 내로 침지되고, 자기력의 전달에 의해 움직인다. 교반기(7)는 또한 용기에 함유되는 액체 배지(5)를 교반하기에 충분한 유속의 액체 배지(5) 관류 시스템, 또는 회전 벽(예를 들어 롤러 상에 배열됨)이 있는 시스템일 수 있다. 교반기(7) 및 용기(4)의 치수는 용기(4) 내의 액체 배지(5)의 와류를 제어하기에 적합하다. 와류는 레이놀즈 수가 2000 초과인 유동을 의미한다. 예를 들어, 레이놀즈 수는 화학식 (4)에 의해 계산될 수 있다. 바람직하게는, 액체 배지(5) 유동의 레이놀즈 수 Re는 7 000 초과, 바람직하게 10 000 초과, 바람직하게 12 000 초과이다.
본 발명의 예시적인 실시 형태에 사용되는 교반기(7)는 용기(4) 내에 배열되고 자기력 전달 시스템에 의해 움직이는 블레이드 임펠러를 포함한다. 액체 배지(5) 내의 블레이드 임펠러의 속도는 액체 배지(5)의 유동을 야기한다. 교반기는 용기(4)의 치수를 감안하여 와류인 유동을 제어하도록 적합하게 한다. 도 1에 예시된 교반기(7)의 경우에, 몇몇 파라미터는 액체 배지(5)의 와류를 나타내는 값, 특히 액체 배지(5)의 동점도 v, 용기(4)의 치수 및 특히 용기(4) 내에 함유된 액체 배지(5)의 부피 V, 블레이드 임펠러의 잠긴 부분에 상응하는 동력수 Np, 교반기 및 특히 임펠러의 직경 D, 임펠러의 회전 속도 N을 계산하는 것을 허용한다. 따라서, 이들 파라미터에 따라, 방정식 (1), (2), 및 (3)에 의해 제공되는 바와 같이, 사용자는 유동의 와류를 나타내는 값, 및 특히 콜모고로프 길이 LK를 계산할 수 있다. 특히, 교반기(7)는 길이 LK가 75 ㎛ 이하, 바람직하게는 50 ㎛ 이하인 유동을 제어하기에 적합하다.
유체 시스템(1)의 예시적인 실시 형태에서, 교반기(7)의 회전 속도는 100 rpm(분당 회전수)으로 제어될 수 있고, 블레이드 임펠러의 직경은 10.8 cm이며, 용기(4) 내에 함유된 액체 배지의 부피는 400 mL이다. 수학식 (3)에 의해 측정되는 액체 배지(5) 내의 블레이드 임펠러의 동력수 NP는 실질적으로 3.2와 동일하다. 수학식 (2)에 의해 계산되는 질량 단위당 소멸되는 에너지 ε은 5.44 × 10-1 J.kg-1과 동일하다. 따라서 수학식 (1)에 의해 계산되는 콜모고로프 길이 LK는 41.8 ㎛와 동일하다.
미세담체 및 생산 세포의 제조
용기(4)는 1회용 용기이거나 액체 배지(5), 미세담체(3), 및 생산 세포(6)의 임의의 도입 전에 멸균될 수 있다. 미세담체(3), 이 경우에 마이크로비드(14)도 또한 멸균된다. 용기(4) 내에서 혈청을 포함하는 생산 세포(6)의 배양 배지 중에 마이크로비드(14)를 인큐베이션한다. 이 인큐베이션은 배양 배지에 산소를 공급하고 마이크로비드(14)의 표면을 단백질의 적어도 부분적인 층으로 덮어 마이크로비드(14)의 표면에 대한 생산 세포(6)의 부착을 촉진하는 것을 허용한다.
유체 시스템(1) 내로 도입하기 전에, 트립신을 포함하는 배지에 의해 생산 세포(6)를 현탁시킨다. 이어서, 튜브의 저부에 농축되도록 그들을 300 G에서 5 분 동안 원심분리함으로써, 트립신을 포함하는 배지를 DMEM 배지로 대체할 수 있다. 이어서, 마이크로비드(14)당 5 내지 20개의 생산 세포(6)에 실질적으로 상응하는 양으로, 배양 배지 및 마이크로비드(14)를 포함하는 용기(5) 내로 생산 세포(6)를 도입한다. 그 후에, 생산 세포(6) 및 마이크로비드(14)를 교반한 후에 침강시킴으로써, 마이크로비드(14)를 생산 세포(6)와 접촉시키고, 마이크로비드(14)의 표면 상의 생산 세포(6)의 부착을 촉진한다. 마이크로비드(14)의 표면에 대한 생산 세포(6)의 부착의 균질성을 촉진하도록, 예를 들어 5 내지 24 시간 동안 매 45 분마다 주기적으로 교반을 재개할 수 있다. 그 후에, 배양 배지의 약한 교반(예를 들어 20 rpm의 속도로 블레이드 임펠러를 회전시킴)과 더불어, 배양 배지의 규칙적인 대체(예를 들어 매일 배양 배지의 5% 내지 40%를 대체함)를 동반하여 생산 세포의 배양을 실행한다.
세포외 소포(EV)의 생산의 예
세포외 소포(EV)는, 예를 들어 혈청이 없는 액체 배지(5), 미세담체(3), 및 미세담체(3)의 표면에 부착되는 생산 세포(6)를 함유하는 용기(4) 내에서 생산된다. 미세담체(3) 상의 생산 세포(6)의 배양을 위한 생산 전에 사용되는 배지는 혈청을 포함하며, 혈청이 없는 DMEM 액체 배지(5)로 용기(4)를 3 내지 4회 세척한다(각각의 세척은, 예를 들어 약 400 mL의 부피에 상응함). 이어서, 용기(4) 내에 와류를 야기하도록 교반기(7)에 의해 액체 배지(5)의 교반을 제어한다. 교반은 콜모고로프 길이 LK가 75 ㎛ 이하, 바람직하게는 50 ㎛ 이하인 액체 배지(5)의 유동을 제어하도록 바람직하게 적합하게 한다. 액체 배지(5)의 교반은 적어도 30 분 동안, 바람직하게 1 시간 초과 동안, 바람직하게 2 시간 초과 동안 제어된다. 생산 중에 세포외 소포(EV)의 생산을 측정할 수 있다. 이 목적을 위해 교반을 일시적으로 중단할 수 있다. 마이크로비드(14)를 용기(4)의 저부에 침강시킨 후, 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)의 샘플을 채취한다. 샘플을 2000 G에서 10 분 동안 원심분리함으로써 세포 잔해를 제거한다. 개별 입자 추적 방법(individual particle tracking method)(또는 NTA, 나노입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis)의 두문자어)에 의해 상청액을 분석함으로써 세포외 소포(EV)의 개수를 계수하고 샘플의 세포외 소포(EV)의 농도를 추론한다. 교반의 시작점에서 세포외 소포(EV)의 농도가 0에 근접하거나 무시할 수 있음을 확인할 수 있다.
생산되는 세포외 소포(EV)는 또한 투과 전자 저온 현미경법에 의해 관찰되고/되거나 계수될 수 있다. 이 목적을 위해, 세포외 소포(EV)를 포함하는 2.7 ㎕의 용액 방울을 저온 현미경법에 적합한 그리드 상에 배치한 후, 액체 에탄에 침지시켜, 얼음 결정의 형성을 피하면서 상기 방울이 거의 순간적으로 동결되게 한다. 세포외 소포(EV)를 담지하는 그리드를 현미경 내로 도입하고 대략 -170 ℃의 온도에서 세포외 소포(EV)를 관찰한다.
세포외 소포의 분리
용기(4) 에서 생산된 세포외 소포(EV)를 용기(4) 출구(9)를 통해 용기(4)로부터 추출하고, 액체 배지(5)에 현탁시킬 수 있다. 필터(18)를 출구(9)에 배열함으로써, 용기(4)로부터 세포외 소포(EV)를 추출하는 중에 미세담체(3) 및 미세담체(3)에 부착되는 생산 세포(6)를 여과할 수 있다. 연결기(13)가 출구(9)에 유동적으로 연결되어, 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)의 수송을 허용한다.
유체 시스템(1)은 세포외 소포(EV)의 분리기(15)를 포함할 수 있다. 분리기(15)는 분리기 입구(10)를 포함하며, 여기서 용기(4)로부터의 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)가 직접적으로 또는 간접적으로 이송될 수 있다. 분리기(15)는 또한 제1 분리기 출구(11)를 포함할 수 있으며, 이를 통해 분리기(15) 입구(10)에서보다 더 낮거나 심지어 실질적으로 0인 세포외 소포(EV)의 농도로 액체 배지(5)가 분리기(15)를 떠날 수 있다. 분리기(15)는 또한 제2 분리기(15) 출구(12)를 포함할 수 있으며, 이로부터 분리기(15) 입구(10)에서보다 더 큰 세포외 소포(EV)의 농도로 액체 배지(5)가 분리기(15)를 떠날 수 있다.
일반적 방식으로, 소포(EV)가 고갈된 액체 배지(5)를, 예를 들어 용기(4)의 입구(8)를 통해 용기(4) 내로 재도입할 수 있도록, 세포외 소포(EV)의 분리기(15)를 용기(4)에 유동적으로 연결할 수 있다. 따라서, 용기(4) 내의 액체 배지(5)의 실질적으로 일정한 부피에서 세포외 소포(EV)의 생산 및/또는 추출이 연속적으로 실행될 수 있다.
도 1에 예시된 유체 시스템(1)의 예시적인 실시 형태에서, 수집기(19) 내에 액체 배지(5)가 수송되도록, 연결기(13)를 통해, 제1 펌프(16)에 의해 용기(4)로부터 액체 배지(5)를 추출할 수 있다. 다른 제1 펌프(16)는, 다른 연결기를 통해, 수집기(19) 내에 함유된 액체 배지(5)를 분리기(15) 입구(10)로 이송하는 것을 허용한다. 세포외 소포(EV)가 고갈된 액체 배지(5)가 용기(4) 내로 재도입되도록, 제1 분리기(15) 출구(11)가 연결기를 통해 용기(4)에 연결된다. 수집기(19) 내에 함유된 액체 배지(5)에 세포외 소포(EV)가 풍부해지도록, 제2 분리기(15) 출구(12)가 연결기를 통해 수집기(19)에 연결된다. 대안적으로, 분리기(15) 입구(10)가 용기(4) 출구(9)에 직접(또는 제1 펌프(16)를 통해) 연결될 수 있다. 제1 분리기(15) 출구(11)는 용기(4)에 연결되고, 제2 분리기(15) 출구(12)는 수집기(19)에 연결된다. 몇몇 분리기는 또한, 액체 배지(5) 내의 세포외 소포(EV) 분리의 정도를 변동시키기 위해 직렬로 배치되고/되거나, 각각의 분리기(15) 내의 액체 배지(5) 유속을 제1 펌프(16)의 유속에 대해 적합하게 하기 위해 병렬로 배치될 수 있다.
세포외 소포(EV)의 생산에 대한 교반의 영향
도 2는 교반기(7)에 의해 제어되는 상이한 교반에 대해 유체 시스템(1)에서 생산되는 세포외 소포(EV)의 개수를 예시한다. 좌측 종좌표는 용기(4) 내에 생산되는 세포외 소포(EV)의 개수에 상응한다. 각각의 컬럼은 용기(4) 내의 교반기(7)의 상이한 회전 속도에 대한 세포외 소포(EV)의 생산에 상응한다. 우측 종좌표는, 수학식 (1), (2), 및 (3)에 의해 계산된, 세포외 소포(EV)의 생산 중에 교반기(7)에 의해 야기되는 길이 LK에 상응한다. 세포외 소포(EV)는 100 ml 스피너 플라스크 내에서 50 mL의 액체 배지(5) 중의 3 g.L-1 농도의 미세담체(3)를 사용하여 용기(4) 내의 HUVEC-유형 생산 세포(6)로부터 생산된다. 길이 LK가 75 ㎛, 바람직하게 50 ㎛와 동일한 더 약한 교반의 조건 하의 세포외 소포(EV)의 생산(컬럼 150 RPM에 상응하는 생산)과 비교하여, 길이 LK가 35 ㎛와 동일한 액체 배지(5)의 유동을 제어함으로써 세포외 소포(EV)의 유의적으로 높은 생산을 관찰할 수 있다(컬럼 300 RPM에 상응하는 생산).
도 3은 교반기(7)에 의해 제어되는 상이한 교반에 대해 유체 시스템(1)에서 생산되는 세포외 소포(EV)의 개수를 예시한다. 1000 mL 스피너 플라스크 내에서 350 mL의 액체 배지(5) 중의 3 g.L-1 농도의 미세담체(3)를 사용하여, 2천만개의 HUVEC-유형 생산 세포(6)를 사용한다. 좌측 종좌표는 용기(4) 내에 생산되는 세포외 소포(EV)의 개수에 상응한다. 각각의 컬럼은 용기(4) 내의 교반기(7)의 상이한 회전 속도에 대한 세포외 소포(EV)의 생산에 상응한다. 우측 종좌표는, 수학식 (1), (2), 및 (3)에 의해 계산된, 세포외 소포(EV)의 생산 중에 야기되는 길이 LK에 상응한다. 더 약한 교반의 조건 하의 세포외 소포(EV)의 생산과 비교하여, 길이 LK가 40 ㎛ 미만인 액체 배지(5)의 유동을 제어함으로써 세포외 소포(EV)의 유의적으로 높은 생산을 관찰할 수 있다(컬럼 125 RPM, 150 RPM, 및 175 RPM에 상응하는 생산).
도 4는 교반기(7)에 의해 제어되는 상이한 교반에 대해 유체 시스템(1) 내에 생산되는 세포외 소포(EV)의 개수를 예시한다. MSC 유형(중간엽 줄기 세포의 두문자어)의 생산 세포(6)를 사용하며, 미세담체(3)는 500 mL 스피너 플라스크 내에 200 mL의 액체 배지(5) 중의 3 g.L-1 농도로 도입된다. 좌측 종좌표는 용기(4) 내에 생산되는 세포외 소포(EV)의 개수에 상응한다. 각각의 컬럼은 용기(4) 내의 교반기(7)의 상이한 회전 속도에 대한 세포외 소포(EV)의 생산에 상응한다. 우측 종좌표는, 수학식 (1), (2), 및 (3)에 의해 계산된, 세포외 소포(EV)의 생산 중에 야기되는 길이 LK에 상응한다. 길이 LK가 50 ㎛와 동일한 더 약한 교반의 조건 하의 세포외 소포(EV)의 생산과 비교하여, 길이 LK가 35 ㎛와 동일한 액체 배지(5)의 유동을 제어함으로써 세포외 소포(EV)의 유의적으로 높은 생산을 관찰할 수 있다(컬럼 175 RPM에 상응하는 생산).
도 5는 생산되는 세포외 소포(EV)의 개수에 대한 콜모고로프 길이 LK의 영향을 예시한다. 길이 LK는 세포외 소포(EV)의 생산에 관련된 척도 파라미터이다. 정사각형 (a)는 상이한 길이 LK에 대해 도 2에 예시된 세포외 소포(EV)의 생산에 상응하고, 다이아몬드 (b)는 상이한 길이 LK에 대해 도 3에 예시된 세포외 소포(EV)의 생산에 상응하며, 삼각형 (c)는 상이한 길이 LK에 대해 도 4에 예시된 세포외 소포(EV)의 생산에 상응한다. LK의 함수로서 세포외 소포(EV)의 생산의 기울기의 변화를 특성화하는 LK의 특징적인 값은 도 5의 다이어그램으로부터 추출될 수 있으며, LK = 50 ㎛와 실질적으로 동일하다. 따라서, 50 ㎛ 이하의 LK 값에 대해, 세포외 소포(EV)의 생산은 유의적으로 증가한다.
도 6은 세포외 소포(EV)의 생산에 상응하는 교반 전에, 액체 배지(5) 중에 현탁된 미세담체(3), 이 경우에 마이크로비드(14)의 표면 상에 부착되는 생산 세포(6)를 예시한다. 미세담체(3)의 표면에 부착되는 생산 세포(6)는 가시적이고 정량가능하다.
도 7은 세포외 소포(EV)의 생산에 상응하는 교반 후에, 액체 배지(5) 중에 현탁된 미세담체(3), 이 경우에 마이크로비드(14)의 표면 상에 부착되는 생산 세포(6)를 예시한다. 미세담체(3)의 표면에 부착되는 생산 세포(6)는 가시적이고 정량가능하다. 세포외 소포(EV)의 생산을 위한 교반 전 및 후의 미세담체(3)의 표면에 부착되는 생산 세포의 개수 사이의 비교는, 이전에 기재된 교반 조건, 예를 들어 길이 LK가 75 ㎛ 미만, 바람직하게 50 ㎛ 미만인 유동을 야기하는 교반이 생산 세포(6)의 미세담체(3)로부터의 탈착을 야기하지 않음을 확인하는 것을 허용한다.
도 8은 교반의 상이한 지속기간, 상이한 생산 세포, 및 교반기(7)에 의해 제어되는 유동의 상이한 길이 LK에 상응하는 상이한 교반 조건에 대해 세포외 소포(EV)의 생산 수율을 예시한다. 곡선 (a)는 교반 동안 생산되는 입자의 개수(세포외 소포(EV)를 포함함)와 용기(4) 내로 도입되는 생산 세포(6)의 개수 사이의 비의 진전을 예시하며, 생산 세포(6)는 쥐과 동물 MSC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 35 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 곡선 (b)는 동일한 진전을 예시하며, 생산 세포(6)는 인간 MSC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 33 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 곡선 (c)는 동일한 진전을 예시하며, 생산 세포(6)는 HUVEC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 35 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 곡선 (d)는 동일한 진전을 예시하며, 생산 세포(6)는 인간 MSC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 35 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 곡선 (e)는 동일한 진전을 예시하며, 생산 세포는 HUVEC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 50 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 곡선 (f)는 동일한 진전을 예시하며, 생산 세포는 쥐과 동물 MSC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 50 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 곡선 (g)는 동일한 진전을 예시하며, 생산 세포(6)는 인간 MSC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 50 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 곡선 (h)는 동일한 진전을 예시하며, 생산 세포는 쥐과 동물 MSC 유형의 것이고, 액체 배지(5)의 유동은 53 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK를 특징으로 한다. 따라서, 30 분 초과의 교반의 지속기간 동안, 세포외 소포(EV)는 공지된 것들보다 더 높은 수율로 생산된다.
도 9는 240 분의 교반 후에, 상이한 생산 세포(6) 및 상이한 교반 조건에 대해 세포외 소포(EV)의 생산 수율을 예시한다. 4개의 좌측 컬럼은 쥐과 동물 MSC-유형 생산 세포(6)를 사용하는 세포외 소포(EV)의 생산 수율을 예시한다. 50 ㎛(제1 컬럼), 47 ㎛(제2 컬럼), 및 35 ㎛(제3 컬럼)의 길이 LK를 유발하는 교반에 상응하는 3개의 교반 조건에 대한 생산 수율을 혈청 기아 방법(또는 혈청 결핍 방법)에 따른 생산 수율과 비교한다. 조건 LK = 47 ㎛ 및 LK = 35 ㎛ 하의 세포외 소포(EV)의 생산 수율은 LK = 50 ㎛ 및 혈청 기아 조건 하에서보다 유의적으로 더 높다. 3개의 컬럼은 HUVEC-유형 생산 세포(6)를 사용하는 세포외 소포(EV)의 생산 수율을 예시한다. 50 ㎛(제4 컬럼) 및 47 ㎛(제5 컬럼)의 길이 LK를 유발하는 교반에 상응하는 2개의 교반 조건에 대한 생산 수율을 혈청 기아 방법에 따른 생산 수율과 비교한다. 조건 LK = 35 ㎛ 하의 세포외 소포(EV)의 생산 수율은 LK = 50 ㎛ 및 혈청 기아 조건 하에서보다 더 높다. 도면의 4개의 최우측 컬럼은 인간 MSC-유형 생산 세포(6)를 사용하는 세포외 소포(EV)의 생산 수율을 예시한다. 50 ㎛(제8 컬럼), 35 ㎛(제9 컬럼), 및 33 ㎛(제10 컬럼)의 길이 LK를 유발하는 교반에 상응하는 3개의 교반 조건에 대한 생산 수율을 혈청 기아 방법에 따른 생산 수율과 비교한다. 조건 LK = 35 ㎛ 및 LK = 33 ㎛ 하의 세포외 소포(EV)의 생산 수율은 LK = 50 ㎛ 및 혈청 기아 조건 하에서보다 유의적으로 더 높다.
도 10은, 상이한 교반 조건에 대해, 교반 전 및 후에 미세담체(3) 상에 부착되는 생산 세포(6)의 농도를 예시한다. 컬럼 (a)는 세포외 소포(EV)의 생산을 위한 교반 전(J0) 및, "강한" 교반 조건이라고 칭하는, 즉, 길이 LK = 35 ㎛에 의해 특성화되는 유동을 야기하도록 교반기(7)가 제어되는 교반 조건 하의 교반 후 1 일(J1)의 생산 세포(6)의 농도에 상응한다. 컬럼 (b)는 세포외 소포(EV)의 생산을 위한 교반 전(J0) 및, "약한" 교반 조건이라고 칭하는, 즉, 길이 LK = 50 ㎛에 의해 특성화되는 유동을 야기하도록 교반기(7)가 제어되는 교반 조건 하의 교반 후 1 일(J1)의 생산 세포(6)의 농도에 상응한다. 세포외 소포(EV)의 생산을 위한 액체 배지(5)의 교반 후에 생산 세포(6)의 농도의 유의적인 감소를 관찰할 수 없다.
도 11은 세포외 소포(EV)를 생산하기 위한 교반 조건 하의 HUVEC-유형 생산 세포(6)의 대사 활성을 예시한다. 액체 배지(5)의 교반은 1 L 스피너 플라스크 내에서 75 RPM으로 회전하는 교반기(7)에 의해 제어되어, 240 분 동안 실질적으로 50 ㎛와 동일한 길이 LK에 의해 특성화되는 유동을 야기한다. 액체 배지(5) 중의 알마 블루(Alamar blue) 시약에 의해 방출되는 파장의 변동을 관찰함으로써 대사작용을 측정한다. 이들 교반 조건 하에서 생산 세포(6)의 대사작용의 유의적인 하락을 관찰할 수 없다.
도 12는 세포외 소포(EV)를 생산하기 위한 교반 조건 하의 HUVEC-유형 생산 세포(6)의 대사작용을 예시한다. 액체 배지(5)의 교반은 1 L 스피너 플라스크 내에서 125 RPM으로 회전하는 교반기(7)에 의해 제어되어, 240 분 동안 35 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK에 의해 특성화되는 유동을 야기한다. 액체 배지(5) 중의 알마 블루 시약에 의해 방출되는 파장의 변동을 관찰함으로써 대사작용을 측정한다. 250 분의 교반 후에 생산 세포(6)의 대사작용의 하락 또는 심지어 소멸을 관찰할 수 있다. 그러나, 세포 대사작용의 이러한 감소는 교반 중에 세포외 소포(EV)의 생산을 방지하지 않는다.
도 13은 세포외 소포(EV)를 생산하기 위한 교반 조건 하의 MSC-유형 생산 세포(6)의 대사작용을 예시한다. 액체 배지(5)의 교반은 1 L 스피너 플라스크 내에서 75 RPM으로 회전하는 교반기(7)에 의해 제어되어, 240 분 동안 실질적으로 50 ㎛와 동일한 길이 LK에 의해 특성화되는 유동을 야기한다. 액체 배지(5) 중의 알마 블루 시약에 의해 방출되는 파장의 변동을 관찰함으로써 대사작용을 측정한다. 이들 교반 조건 하에서 생산 세포(6)의 대사작용의 유의적인 하락을 관찰할 수 없다.
도 14는 세포외 소포(EV)를 생산하기 위한 교반 조건 하의 MSC-유형 생산 세포(6)의 대사작용을 예시한다. 액체 배지(5)의 교반은 1 L 스피너 플라스크 내에서 125 RPM으로 회전하는 교반기(7)에 의해 제어되어, 240 분 동안 35 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK에 의해 특성화되는 유동을 야기한다. 액체 배지(5) 중의 알마 블루 시약에 의해 방출되는 파장의 변동을 관찰함으로써 대사작용을 측정한다. 이들 교반 조건 하에서 생산 세포(6)의 대사작용의 유의적인 하락을 관찰할 수 없다.
따라서, 50 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK에 의해 특성화되는 유동을 야기하는 교반에 상응하는 약한 교반 조건은, 후속 세포외 소포(EV)의 생산을 위해 생산 세포(6)를 재사용하는 것을 허용한다.
도 15는 유체 시스템(1)에 의해 쥐과 동물 MSC 세포에 의해 생산된 세포외 소포(EV)의 현미경사진이다. 축척 막대는 200 nm의 길이에 상응한다. 현미경사진은 투과 전자 저온 현미경법(저온-TEM)의 기술을 사용하여 수행한다.
도 16은 저온-TEM에 의해 측정되는 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)의 직경의 분포를 예시한다. 분포 (a)는 35 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK에 의해 특성화되는 유동을 야기하는 교반(강한 교반 조건)으로 쥐과 동물 MSC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)에 상응한다. 분포 (b)는 50 ㎛와 실질적으로 동일한 길이 LK에 의해 특성화되는 유동을 야기하는 교반(약한 교반 조건)으로 생산되는 세포외 소포(EV)에 상응한다. 약한 교반 조건 하에 생산되는 세포외 소포(EV)의 메디안 직경은 강한 교반 조건 하에 생산되는 세포외 소포(EV)의 메디안 직경보다 더 크다. 세포외 소포(EV)의 크기는 실질적으로 30 내지 500 nm에 포함될 수 있다.
도 17은 입자의 개수와 마이크로그램 단위의 단백질 질량 사이의 비에 의해 표시되는, 액체 배지(5) 중에 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)의 순도를 예시한다. 세포외 소포(EV)의 생산 동안, 상이한 실체가 생산 세포(6)에 의해 생산될 수 있으며, 이 경우에는 세포외 소포(EV) 뿐 아니라 단백질 응집체 또한 생산될 수 있다. 개별 입자 추적 분석(또는 NTA: 나노입자 추적 분석)에 의한 입자의 정량화는 이들 상이한 실체를 구별하는 것을 허용하지 않는다: 또한 NTA에 의해 측정된 입자의 개수와 생산된 단백질의 질량 사이의 비를 정량하여 세포외 소포(EV)의 순도를 정의하는 것이 유리하다. 도 17에 예시된 컬럼 (a)는 쥐과 동물 MSC-유형 생산 세포(6)로부터의 세포외 소포(EV)의 생산에 상응하고, 컬럼 (b)는 인간 MSC-유형 생산 세포(6)로부터의 세포외 소포(EV)의 생산에 상응한다. 2개의 좌측 컬럼은 강한 교반 조건 하의 세포외 소포(EV)의 생산에 상응하고, 2개의 우측 컬럼은 혈청 기아 방법에 따른 세포외 소포(EV)의 생산에 상응한다. 생산 후에 얻어진 배지의 세포외 소포(EV)의 순도는 양자 모두의 방법에서 유사하다.
도 18은 유체 시스템(1)에 의해 쥐과 동물 MSC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 혈청이 없는 액체 배지(5)의 혈관신생 촉진 특성을 예시한다. 도 18의 패널 A는 HUVEC-유형 세포가 위에 부착되어 있는 표면의 사진이다. 표면의 일부로부터 세포가 제거되었다(사진 중앙의 세포가 없는 영역). 이 사진은 실험의 시작점에서, 시간 t = 0 h에서 촬영되며, 그 동안에 세포는 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)로 덮인다. 도 18의 패널 B는 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중에 4 시간 인큐베이션한 후의 동일한 표면의 사진이다. 도 18의 패널 C는 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중에 9 시간 인큐베이션한 후의 동일한 표면의 사진이다. 실험 동안, 실험의 시작점에서는 세포가 존재하지 않았던 표면의 부분을 HUVEC-유형 세포가 덮는다. 따라서, 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)는 혈관신생 촉진 및/또는 증식 촉진 특성을 나타낸다.
도 19는 상이한 조건 하에서 유체 시스템(1)에 의해 쥐과 동물 MSC 세포에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)의 혈관신생 촉진 특성을 예시한다. 각각의 컬럼은 각각의 인큐베이션 조건에 대해 0 h(도 18의 패널 A에 상응함)와 9 h(도 18의 패널 C에 상응함) 사이의 여백의 폐쇄의 정규화된 백분율을 예시한다. 제1 컬럼("완전 배지")은 HUVEC 세포 배양 배지 중의 인큐베이션에 상응한다(양성 대조군에 상응함). 제2 컬럼("음성 대조군")은, 혈청이 없고 주어진 부피의 PBS가 첨가된, 세포외 소포(EV)가 없는 액체 배지(5)(배양 배지) 중의 인큐베이션에 상응한다. 제3 컬럼("강한 교반 10/1")은 강한 교반 조건 하에 유체 시스템(1)에 의해 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 동일한 주어진 부피의 PBS가 첨가된 액체 배양 배지(5) 중의 인큐베이션에 상응하며, 여기서 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 HUVEC 세포에 대해 10개의 쥐과 동물 MSC 생산 세포(6)에 상응한다. 제4 컬럼("약한 교반 10/1")은 약한 교반 조건 하에 유체 시스템(1)에 의해 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 동일한 주어진 부피의 PBS가 첨가된 배양 배지(5) 중의 인큐베이션에 상응하며, 여기서 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 HUVEC 세포에 대해 10개의 쥐과 동물 MSC 생산 세포(6)에 상응한다. 제5 컬럼("lib 10/1")은 엑소좀이 고갈된 HUVEC 세포 배양 배지 중의 인큐베이션에 상응하며, 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 HUVEC 세포에 대해 10개의 생산 세포(6)에 상응한다. 제6 컬럼("스트레스 10/1")은 혈청 기아에 의해 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 동일한 주어진 부피의 PBS가 첨가된 액체 배양 배지(5) 중의 인큐베이션에 상응하며, 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 HUVEC 세포에 대해 10개의 쥐과 동물 MSC 생산 세포(6)에 상응한다. 강한 교반 조건 하에 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중의 인큐베이션("강한 교반 10/1")은 초기에 세포가 없었던 부분을 유의적으로 덮는 것을 허용한다.
도 20은 인큐베이션 배지 중에 포함된 알마 블루에 의해 측정된, 상이한 액체 배지 중에 1 일 인큐베이션한 후의 심근세포의 증식을 예시한다. 제1 컬럼은 H9C2 심근세포의 배양에 적합한 배지 중의 인큐베이션에 상응한다("완전 배지", 양성 대조군). 제2 컬럼은 PBS 중의 인큐베이션에 상응한다. 제3 컬럼은 강한 교반 조건 하에 유체 시스템(1)에 의해 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중의 인큐베이션에 상응하며("강한 교반 10/1"), 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 세포에 대해 10개의 생산 세포(6)에 상응한다. 제4 컬럼은 약한 교반 조건 하에 유체 시스템(1)에 의해 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중의 인큐베이션에 상응하며("약한 교반 10/1"), 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 세포에 대해 10개의 생산 세포(6)에 상응한다. 제5 컬럼은 엑소좀이 고갈된 심근세포 배양 배지 중의 인큐베이션에 상응하며("lib 10/1"), 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 세포에 대해 10개의 생산 세포(6)에 상응한다. 제6 컬럼은 혈청이 없는 배지 중의 생산 방법에 의해 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중의 인큐베이션에 상응하며("스트레스"), 도입된 생산 세포(6)의 양은 하나의 수용자 세포에 대해 10개의 생산 세포(6)에 상응한다. 강한 교반 및/또는 약한 교반 조건 하에 유체 시스템(1) 내에 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중의 인큐베이션 조건은, PBS 중의 인큐베이션 조건, 및 "엑소" 조건 및 "스트레스" 조건하에서와 비교하여 심근세포의 유의적으로 더 높은 증식을 유발한다.
도 21은 2 일 인큐베이션한 후의 H9C2 심근세포의 증식을 예시한다. 약한 교반 조건 하에, 강한 교반 조건 하에, 또한 엑소좀이 고갈된 완전 배지 중의 자발적 방출에 의해, 유체 시스템(1)에 의해 쥐과 동물 MSC-유형 생산 세포(6)로부터 생산된 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중에 인큐베이션한 심근세포는, 혈청 기아를 가진 배지 중에 인큐베이션한 심근세포보다 더 유의적으로 증식한다. 약한 교반 조건 및 강한 교반 조건 하에 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중에 인큐베이션한 심근세포는, 혈청 기아를 가진 배지 중에 인큐베이션한 심근세포보다 더 유의적으로 증식한다.
도 22는, 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 다양한 농도의 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 인큐베이션의, H9C2 심근세포의 증식에 대한 용량 효과를 예시한다. 액체 배지 중에 2 일 인큐베이션한 후에 알마 블루에 의해 심근세포의 대사 활성을 측정한다. 3개의 인큐베이션 조건에 대해 심근세포 대사작용을 측정한다: (a)에서는 약한 교반 조건 하에 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5) 중에, (b)에서는 약한 교반 조건 하에, 그리고 (c)에서는 혈청 기아를 가진 액체 배지 중에. 곡선 (a) 및 (b)에서, 횡좌표 상에 나타낸 세포외 소포(EV)의 농도와 심근세포의 농도 사이의 상이한 비에 대해, 심근세포 대사작용의 측정이 수행된다. 곡선 (a)는 세포외 소포(EV)의 존재 하의 증식의 용량 효과를 예시한다: 세포외 소포(EV)와 심근세포 사이의 농도의 비가 증가할 때 심근세포의 대사작용이 증가한다.
도 23은 심근세포당 100 000개의 세포외 소포(EV)의 농도로 쥐과 동물 MSC 세포의 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)의 존재 하에 2 일 인큐베이션한 후의 심근세포의 증식을 예시한다. 혈청 기아에 의해 얻어진 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지 및/또는 엑소좀이 고갈된 완전 배지 중의 자발적 방출에 의해 얻어진 세포외 소포(EV)를 함유하는 심근세포 배양 배지와 비교하여, 액체 인큐베이션 배지(5)가 강한 교반 또는 약한 교반 조건 하에 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 경우에, 2 일 후의 심근세포의 증식이 유의적으로 더 높다.
도 24는 약제학적 조성물로서의, 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)의 조성물의 사용을 예시한다. 랫트 그룹의 각각의 랫트에 대해 맹장조루술(caecostomy)을 수행한다. 3개의 조건 하에, 맹장조루술에 의해 형성된 누공의 개구에서 배설물의 존재를 관찰한다: 대조군 조건, 각각의 마우스의 누공의 개구 상에 폴록사머 407을 포함하는 겔을 적용함에 의한 치료에 상응하는 조건("겔"), 및 본 발명의 방법 목적에 따른 유체 시스템(1)에 의해, 예를 들어 강한 교반 조건 하에 생산되는 세포외 소포(EV)를 포함하는 이러한 겔의 적용에 상응하는 조건("겔 + 소포"). 밝은 회색 컬럼은 배설물이 있는 누공 개구에 상응하고, 어두운 회색 컬럼은 배설물이 없는 누공 개구에 상응한다. 대조군 및 소포가 없는 겔의 그룹과 비교하여, 세포외 소포(EV)를 포함하는 겔의 적용은 이들 조건 하에 누공의 개구에서 배설물의 존재를 유의적으로 감소시키는 것을 가능하게 하고 생산성 누공(productive fistula)(장 분비물(intestinal secretion)을 방출함)의 경우의 감소를 유발한다. 따라서, 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)의 조성물은 재생 의학에 사용될 수 있다.
도 25는 약제학적 조성물로서의, 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)의 조성물의 용도를 예시한다. 도 24에 나타낸 관찰사항으로부터 점수를 계산한다. 누공의 개구가 배설물을 가진 경우에는 1과 동일한 점수가 배정되고, 누공의 개구가 배설물을 가지지 않는 경우에는 0과 동일한 점수가 배정된다. 도 25는 모든 맹장조루술 및 각각의 조건에 대해 평균 점수를 예시한다: 대조군, "겔", 및 "겔 + 소포". 세포외 소포(EV)를 포함하는 겔의 적용은 대조군 및 소포가 없는 겔의 그룹과 비교하여 누공의 평균 생산성 점수의 감소를 유발하며, 이들 조건에서 누공의 개구에서 배설물의 존재를 유의적으로 감소시키는 것을 허용한다. 따라서, 유체 시스템(1)에 의해 생산되는 세포외 소포(EV)의 조성물은 재생 의학에 사용될 수 있다.
도 26은 선행 기술에 따른 관용적인 생산 방법, 더 구체적으로는 세포외 소포를 특성화하기 위해 관용적으로 사용되는 마커의 단백질 프로파일에 의해 생산되는 세포외 소포와 비교하여, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 세포외 소포의 단백질 프로파일을 예시한다. 4개의 상이한 생산 방법에 의해 얻어진 세포외 소포의 단백질 프로파일을 비교하였다. 72 시간의 지속기간 동안의 혈청 결핍에 의한 플라스크 생산 방법(2D), 72 시간의 지속기간 동안의 혈청 결핍에 의한 생물반응기 생산 방법(3D), 4 시간의 지속기간 동안의 50 ㎛와 동일한 콜모고로프 길이에 의해 특성화되는 중간 속도 생물반응기 생산 방법(MS), 및 4 시간의 지속기간 동안의 35 ㎛와 동일한 콜모고로프 길이에 의해 특성화되는 높은 속도 생물반응기 생산 방법(HS).
따라서 세포외 소포의 특성화를 위해 관용적으로 사용되는 생물학적 마커의 존재가 관찰된다. 본 발명의 방법 또는 관용적인 생산 방법에 따라 생산되는 세포외 소포들 간의 공통 마커(common marker)(CD63, CD9, CD81, lamp2, 및 TSG101)의 존재 및 양은 유사하다. 결론적으로, 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 세포외 소포는 선행 기술의 방법에 의해 생산되는 세포외 소포과 유사한 단백질 프로파일을 갖는다. 세포외 소포를 특성화하기 위해 관용적으로 사용되는 마커의 존재 및 양에 의해 특성화되는 단백질 프로파일은 유사한 단백질 프로파일로서 이해된다.
Claims (13)
- 적어도 하나의 용기(4), 용기(4)에 함유된 액체 배지(5) 및 생산 세포(6)를 포함하는, 생산 세포(6)로부터 세포외 소포(EV)를 생산하는 유체 시스템(1)에 있어서,
그것은 액체 배지(5) 중에 현탁된 미세담체(3)를 또한 포함하고, 생산 세포(6)의 대부분이 미세담체(3)의 표면에 부착되며, 액체 배지(5) 교반기(7)를 또한 포함하고, 교반기(7) 및 용기(4)의 형상 및 치수는 용기(4) 내의 액체 배지(5)의 와류의 발생에 적합한 것을 특징으로 하는, 유체 시스템(1). - 제1항에 있어서,
액체 배지(5)의 교반기(7) 및 용기(4)의 치수는 액체 배지(4)의 유동을 제어하기에 적합하며, 유동의 콜모고로프(Kolmogorov) 길이가 75 ㎛ 이하인 유체 시스템(1). - 제1항 또는 제2항에 있어서,
출구(9) 및 출구(9)에 연결된 연결기(13)를 포함하며, 연결기(13)는 액체 배지(5) 및 세포외 소포(EV)를 포함할 수 있는 유체 시스템(1). - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
액체 배지 교반기(7)가 회전식 교반기이며, 그것의 회전 속도(들), 형상, 및 크기는 용기(4)의 형상 및 치수와 함께 용기 내의 액체 배지(5)의 와류의 발생에 적합한 유체 시스템(1). - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
미세담체(3)가 마이크로비드(14)이고, 마이크로비드(14)의 직경은 100 ㎛ 내지 300 ㎛에 포함되는 유체 시스템(1). - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
세포외 소포(EV)가 고갈된 액체 배지(5)를 용기(4) 내로 재도입할 수 있도록 용기(4)에 유동적으로 연결된 세포외 소포(EV)의 분리기(15)를 포함하는 유체 시스템(1). - 용기(4) 내의 액체 배지(5)의 와류를 야기하는 교반기(7)를 제어하는 단계로서, 용기는 출구(9)를 포함하고, 액체 배지(5)는 미세담체(3)의 표면 상에 부착되는 생산 세포(6)를 포함하며, 미세담체(3)는 액체 배지(5) 중에 현탁되는 단계, 및
- 용기(4)의 출구(9)에서 세포외 소포(EV)를 포함하는 액체 배지(5)를 수집하는 단계를 포함하는, 생산 세포(6)로부터 세포외 소포(EV)를 생체외 생산하는 방법. - 제7항에 있어서,
액체 배지(5)가 30분 초과 동안 교반되는 방법. - 제7항 또는 제8항에 있어서,
교반기(7)가 액체 배지(5)의 유동을 야기하도록 제어되며, 유동의 콜모고로프 길이는 75 ㎛ 이하, 바람직하게 75 ㎛ 이하인 방법. - 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
분리기가 세포외 소포(EV)의 용기(4)의 출구에서 수집된 액체 배지(5)의 일부를 고갈시키며, 액체 배지(5)의 일부는 용기(4) 내로 재도입되는 방법. - 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어질 수 있는 세포외 소포(EV).
- 제11항에 따른 세포외 소포(EV)를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서,
재생 의학에서의 사용을 위한 약제학적 조성물.
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