CN110669729A - 一种制备间充质干细胞外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞技术领域，特别涉及一种制备间充质干细胞外泌体的方法。该方法包括：制备含明胶微载体的培养液；向所述培养液中接种间充质干细胞，搅拌培养；待贴附于所述明胶微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，加入重组干扰素γ和细胞松弛素D，继续培养12～48h，收集条件性培养基提取外泌体。本发明采用京尼平制备的明胶微球用于培养间充质干细胞，并在培养的特定时期加入重组干扰素γ和细胞松弛素D，与现有技术相比明显提高了外泌体的分泌，获得了更多具有生物学活性的外泌体，可实现规模化的外泌体获取与外泌体的规模化制备。
Description
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种制备间充质干细胞的方法。
背景技术
外泌体(Exosome)是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30-150nm，具有脂质双层膜结构，携带RNA和蛋白质，被大多数细胞类型释放，是细胞间通讯系统的一部分。几乎所有的细胞都分泌胞外囊泡，包括间充质干细胞，间充质干细胞来源的胞外囊泡含有与母细胞相似的成分，如细胞因子、生长因子、脂类、mRNAs及调控型miRNAs等。他们主要参与细胞与细胞间的交流通讯及改变组织的微环境等，在免疫调控，组织损伤修复等方面起着不可低估的作用。
干细胞分泌的外泌体指的是直径在30-150nm的同质性囊泡，由与细胞质膜相同的脂质双分子层包裹，内部含有蛋白质和RNA等生物活性物质。间充质干细胞(MSCs)以旁分泌方式发挥作用，其机制为干细胞通过产生大量细胞因子和生长因子，以及产生外泌体(exosomes)来起到组织修复的作用。目前干细胞广泛应用于组织修复及缺血性疾病治疗领域。研究发现，干细胞分泌的外泌体能模拟干细胞的生物学功能，也逐渐被证实能促进组织修复和治疗一些难治性疾病，具有广阔的应用前景。与干细胞相比，作为其旁分泌物的干细胞外泌体具有更稳定的生物特性，有研究表明外泌体在-80℃保存2年仍能保持其生物学功能。在体内实验中外泌体的脂质双分子层结构能防止其内容物降解，保持内部蛋白及遗传物质的活性，并且与干细胞分泌的可溶性细胞因子不同，外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。这种“载体式”信号转导方式使外泌体具备更高更稳定的信号转导效率，且在生物体内不会被细胞外介质稀释。
越来越多的研究表明，干细胞外泌体可减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学作用。外泌体的这些作用使得其在治疗心肌梗死，皮肤创伤等组织损伤中存在良好的应用前景，并且已经有较多深入的研究。与干细胞的移植治疗相比，干细胞外泌体可以降低细胞移植致瘤风险，因此通过干细胞来源的外泌体进行促进血管生成和增强损伤细胞修复，有望成为组织损伤修复的治疗新策略。外泌体的独特生物学优势也为未来药物载体的研发开启了一条全新的思路。科学家们认为与干细胞相比，使用干细胞分泌的外泌体治疗的安全性更高及可操作性更强。因为干细胞外泌体作为治疗产品具有干细胞制剂不具有的某些特性，例如外泌体相比活细胞而言，成分比较确定，易于质量控制；并且外泌体在体外环境下的稳定性更有利于运输和保存。因此这些特性使得外泌体具有很大的应用价值。
外泌体技术作为递送平台的临床前和临床开发需要大量的外泌体。外泌体的分离方法需要易于扩展以支持大规模生产。目前的方法产量低并且不可扩展，这阻碍了外泌体在临床前动物中功效评估。通常每只小鼠使用的剂量为109-1011，以实现生物学结果。分离这种外泌体量需要处理一升的条件培养基来处理一只动物。因此，目前顺利支持开展非临床与临床研究的外泌体生产可能需要数月时间。与永生肿瘤细胞系不同，间充质干细胞(MSC)的扩增能力是有限的。外泌体的低产量阻碍了间充质干细胞用于外泌体的大规模生产。
针对上述间充质干细胞的规模化制备需求与技术问题，需要提供一种间充质干细胞外泌体的制备方法，以实现规模化的外泌体获取与外泌体的规模化制备。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备间充质干细胞外泌体的方法。使得该方法能够提高间充质干细胞外泌体的分泌，从而获得更多的外泌体。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种间充质干细胞外泌体的制备方法，包括：
制备含明胶微载体的培养液；
向所述培养液中接种间充质干细胞，搅拌培养；待贴附于所述明胶微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，加入重组干扰素γ和细胞松弛素D，继续培养12～84h，收集条件性培养基，提取外泌体。
本发明采用京尼平制备的明胶微球用于培养间充质干细胞，并在培养的特定时期加入重组干扰素γ和细胞松弛素D，与现有技术相比明显提高了间充质干细胞外泌体的分泌，获得了更多的外泌体。
京尼平(genipin)是一类氨基多糖/蛋白质的良好交联剂，具有独特的明胶交联机理。用京尼平制备明胶微载体时，京尼平上的烯碳原子受到明胶上氨基的亲核攻击，开环形成杂环胺化合物，其对细胞的毒害作用明显小于戊二醛，且明胶微载体尺寸均一，无明显破碎(见图1)。
本发明中，明胶微载体的制备方法为：
取明胶水溶液，用双乳法制得明胶微球粗品；
将明胶微球粗品以无水乙醇脱水后，于含京尼平的无水乙醇溶液中进行交联，制得所述明胶微载体。
一些实施方案中，所述含京尼平的无水乙醇溶液中京尼平的质量百分比为0.5％～1％。在一些具体实施例中，含京尼平的无水乙醇溶液中京尼平的质量体积百分比为1％。
本发明中，含明胶微载体的培养液以无血清完全培养基为基础培养基。在一些具体实施例中基础培养基为本公司自主研发的无血清培养基，生产批号为S-10-013。
本发明中，含明胶微载体的培养液中明胶微载体的浓度为2.5～20g/L，优选地，明胶微载体的浓度为2.5g/L。
本发明提供的制备方法中，间充质干细胞接种的密度为0.5×105～2×106cells/mL；优选地，接种的密度为1.2×106cells/mL。
本发明制备方法中，搅拌培养在5％CO2、37℃、95％湿度的条件下进行，搅拌培养的时间为3～5天。搅拌培养的搅拌方式为间歇搅拌，所述间歇搅拌为30～50rpm搅拌4～10min，停止搅拌10～20min，如此循环4h～10h，待细胞贴壁明胶微载体后以55rpm的转速恒速搅拌。
一些实施方案中，所述间歇搅拌为38rpm搅拌4min，停止搅拌16min，如此循环4h，待细胞贴壁明胶微载体后以55rpm的转速恒速搅拌。
本发明中，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞。
一些实施方案中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
本发明中，所述继续培养的培养液中，重组干扰素γ的浓度为10-50μg/L，所述细胞松弛素D的浓度为0.5-2.0μg/ml。
一些实施方案中，所述继续培养的培养液中，重组干扰素γ的浓度为20μg/L，所述细胞松弛素D的浓度为1.0μg/ml。
本发明提供的间充质干细胞外泌体的制备方法，采用京尼平制备的明胶微球用于培养间充质干细胞，并在培养的特定时期加入重组干扰素γ和细胞松弛素D，与现有技术相比明显提高了外泌体的分泌，整套工艺可实现规模化的外泌体获取与外泌体的规模化制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示明胶微载体形态；
图2示实施例1搅拌培养的pH、温度、溶氧监控图；
图3示实施例1步骤(6)的间充质干细胞的细胞形态，其中，图3-A为100×细胞形态图，图3-B为400×细胞形态图；
图4示实施例1间充质干细胞增殖结果；
图5示实施例1间充质干细胞在明胶微载体上贴壁生长及增殖情况；
图6示实施例1间充质干细胞表面标记流式鉴定图；
图7示实施例1间充质干细胞成骨和成脂的分化结果，其中，图7-A为成骨分化结果，图7-B为成脂分化结果；
图8示western blot检测CD9蛋白的表达结果，分别为实施例1、2与对照组1、2；
图9示western blot检测CD63蛋白的表达结果，分别为实施例1、2与对照组1、2；
图10示实施例1外泌体的电镜检测结果，黑色箭头所指为外泌体；
图11示实施例外泌体分泌量的检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种间充质干细胞外泌体的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的间充质干细胞外泌体的制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)按专利CN109234231A实施例1的方法制备明胶微载体，如图1所示，制得的凝胶微载体尺寸均一，且无明显破碎。
(2)MSCs常规培养以及收集：
MSCs使用完全培养基进行常规二维培养。3-4天后细胞用PBS清洗2次后，加入0.25％胰酶消化，用完全培养基终止消化收集。1500rpm离心弃上清，无血清完全培养基重悬备用。
(3)玻璃瓶与培养瓶预处理：
硅化：玻璃瓶与培养瓶洗净灭菌烘干后用硅化液浸润瓶壁，吸去硅化液后，将转瓶置于通风处风干12h，三蒸水冲洗备用。
(4)明胶微载体预处理与脐带间充质干细胞接种培养：
称量6.25g明胶微载体，倒入装瓶中，用PBS浸泡3h，吸弃加入新的PBS，121℃高压蒸汽灭菌20min，吸去PBS并加入无血清完全培养液，37℃孵育过夜，制得含明胶微载体的培养液。
(5)取间充质干细胞以1.2×106cells/mL的密度接种于含明胶微载体培养液的培养瓶中，置于5％CO2、37℃、95％湿度的条件下，先以38rpm搅拌4min，停止搅拌16min，如此循环4h，待细胞贴壁明胶微载体后以55rpm的转速恒速搅拌，培养4天。培养期间监测pH、温度、溶氧，结果见图2。
(6)待贴附于所述明胶微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，加入重组干扰素γ(20μg/l)和细胞松弛素Cytochalasin D(1.0μg/ml)，继续培养24h，其中，间充质干细胞的形态如图3所示。
(7)收集条件培养基与细胞，提取外泌体。
实施例2
步骤(6)中加入重组干扰素γ(20μg/L)和细胞松弛素Cytochalasin D(2.0μg/L)刺激细胞培养24h，其余条件同实施例1；
实施例3
步骤(6)中加入重组干扰素γ(40μg/L)和细胞松弛素Cytochalasin D(1.0μg/ml)刺激细胞培养24h，其余条件同实施例1。
实施例4微载体培养间充质干细胞的增殖及活力检测
本实验设置对照组1～2。其中：
对照组1：步骤(6)中只加入重组干扰素γ(20μg/l)，继续培养24h；其他条件与实施例1相同。
对照组2：步骤(6)中只加入细胞松弛素Cytochalasin D(1.0μg/ml)，继续培养24h，其他条件与实施例1相同。
按照本发明实施例1、对照组1～2的方法对脐带间充质干细胞进行培养，取步骤(7)对细胞增值情况进行检测。
结果显示，本发明方法能够实现细胞附着生长，细胞活力均能达到90％以上，并实现细胞增殖15倍以上，明显高于对照组1～2的扩增倍数，如图4～5所示。
实施例5间充质干细胞流式鉴定
利用流式细胞仪检测实施例1步骤(6)培养后的间充质干细胞的细胞表面标记物，结果见图6和表1。
结果显示，本发明提供的方法所得的间充质干细胞的表面标记物均表达正常。
表1间充质干细胞表面标记流式检测结果
实施例6间充质干细胞多向分化潜能研究鉴定
取实施例1步骤(6)培养后的间充质干细胞进行多向分化潜能研究鉴定，结果见图7。
结果显示，间充质干细胞具有较好的成骨和成脂的分化潜能。
实施例7外泌体的鉴定
1、外泌体的Western blot检测
本实验设置实验组和对照组。其中：
实验组：实施例1～2提取得到的外泌体；
对照组：按实施例4中对照组1～2提取外泌体。
向实验组和对照组1～2的外泌体沉淀中加入蛋白裂解液，冰上放置5～15min，期间震荡3-4次，每次30s。然后于4℃条件下，12000rpm的转速离心5min，取上清转移置新的离心管中，进行Western blot检测CD9和CD63蛋白的表达情况。结果见图8～9。
2、外泌体的电镜检测
将实施例1制备的外泌体重悬于20～30uL PBS中，取10μl滴加于透射电镜铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，吸取醋酸双氧铀10μl滴加于透射电镜铜网上沉淀1min，用滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟，即可上机，结果见图10。
结果显示，外泌体大小在30～100nm范围，外泌体结构成圆饼状，中间折光低，周围折光高。
3、外泌体浓度粒径NTA检测：
使用马尔文纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight NS300分析外泌体粒径大小与浓度，将分离获得的外泌体沉淀使用1mL经过滤的PBS重悬外泌体，密封置于冰上；选择一次性干净的样品池，对光使用无尘纸擦拭，确保光路上无颗粒附着外管壁，缓慢注入外泌体溶液避免气泡，可适度倾斜样品池，使用盖子将样品池封住；将样品池放入仪器，按照标准操作规程操作仪器检测，并保存数据，分析获得外泌体的粒径范围与浓度。
4、外泌体蛋白质BCA检测
对照组1：步骤(6)中只加入重组干扰素γ(20μg/l)，继续培养24h；其他条件与实施例1相同。
对照组2：步骤(6)中只加入细胞松弛素Cytochalasin D(1.0μg/ml)，继续培养24h，其他条件与实施例1相同。
收集本发明实施例1～3以及对照组1～2步骤(7)获得的条件培养基，使用BCA方法测定单位体积(1L)获得的外泌体蛋白量，结果见图11。
实验操作过程：针对裂解制备的外泌体蛋白，使用碧云天BCA蛋白定量试剂盒，按照操作说明书进行蛋白质定量，绘制标准曲线，计算出不同方法来源的间充质干细胞外泌体蛋白质量。
由图11可知，本发明制备方法获得的外泌体含量明显高于对照组1～2(P<0.01)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备间充质干细胞外泌体的方法，其特征在于，包括：
制备含明胶微载体的培养液；
向所述培养液中接种间充质干细胞，搅拌培养；待贴附于所述明胶微载体上的细胞生长汇合度至80％～90％时，加入重组干扰素γ和细胞松弛素D，继续培养12～48h，收集条件性培养基，提取外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述明胶微载体的制备方法为：
取明胶水溶液，用双乳法制得明胶微球粗品；
将明胶微球粗品以无水乙醇脱水后，于含京尼平的无水乙醇溶液中进行交联，制得所述明胶微载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含京尼平的无水乙醇溶液中京尼平的质量百分比为0.5％～1％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含明胶微载体的培养液以无血清完全培养基为基础培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含明胶微载体的培养液中明胶微载体的浓度为2.5～20g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种的密度为0.5×105～2×106cells/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述搅拌培养在5％CO2、37℃、95％湿度的条件下进行，搅拌培养的时间为3～5天。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌培养的搅拌方式为间歇搅拌，所述间歇搅拌为30～50rpm搅拌4～10min，停止搅拌10～20min，如此循环4h～10h，待细胞贴壁明胶微载体后以55rpm的转速恒速搅拌。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述继续培养的培养液中，重组干扰素γ的浓度为10-50μg/L，所述细胞松弛素D的浓度为0.5-2.0μg/ml。
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| GR01 | Patent grant | ||
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