CN112569408B - 组织工程补片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组织工程补片及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将所述接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；(2)当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种。本发明方法制备的组织工程补片具有高细胞负载量，目的细胞在支架中均匀分布并具有良好的生物学活性。

Description

组织工程补片及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种组织工程补片及其制备方法。

背景技术

干细胞治疗在实验和临床上都取得了良好的治疗效果，显示出了光明的应用前景。现在干细胞治疗领域的干细胞使用方式或干细胞递送的方式主要分为三类：1.干细胞直接注射；2.干细胞细胞片技术；3.组织工程补片技术。在这三类治疗手段各有利弊，使用干细胞注射操作简单易重复对患者损伤小，但是干细胞的有效使用率低，尤其是使用静脉注射作为干细胞递送方式时，大部分干细胞不能在受损组织处发挥治疗的作用，并且由于受损组织处的炎症环境，使少量在受损组织处黏附、归巢的干细胞无法良好的生长、增殖，无法在患处起到良好的治疗效果。细胞片法可以使干细胞在特定部位发挥治疗的作用，同时构建的细胞片富含细胞外基质的组成成分，为干细胞的生长、增殖提供了良好的微环境；为干细胞生物学功能的发挥提供了有利条件，但是单纯的细胞片结构无法为受损部位提供有效的机械支撑，且无论是单层细胞片还是复层细胞片都无法提供足够数量的干细胞用于受损组织的再生。所以组织工程补片技术就孕育而生，干细胞结合支架材料，组织工程补片不仅可以实现让干细胞在特定区域发挥治疗作用，还可以通过支架材料在患处提供有效的机械支撑，并且可以通过对支架材料进行改性，为细胞提供更有利于其生长、增殖和发挥生物学功能的微环境。相较于干细胞注射和干细胞片的干细胞递送方式，组织工程补片在组织再生治疗显示出更广泛的运用范围。

现行常见的细胞与支架的构建技术包括：1.浸渍法；2.沉淀法；3.吸附法；4.凝胶法；5.动态培养系统法。浸渍法是将支架材料置于高密度细胞悬液中进行静置培养，使细胞黏附在支架上，这种静态培养方法的优点使操作简单，不易污染，缺点是细胞接种数量有限，接种率低，细胞只接种在表层。沉淀法又称接种法是最常用的构建方法，沉淀法主要包括一次沉淀法和二次沉淀法，主要构建方式是将细胞悬液缓缓的逐滴滴加于支架材料上，待细胞充分黏附于支架后再加入培养基进行培养，二次沉淀法是增加滴加细胞悬液的次数，以增加种子细胞的黏附数量。沉淀法的优势是操作简单，可以通过重复接种的方式提高细胞接种数量，缺点是接种细胞分布不均匀，并且接种率与支架的结构紧密相关。吸附法是近几年出现的细胞接种方式，一般采用负压吸附法，负压吸附法是将高密度细胞悬液滴加在支架材料上或将支架材料置于细胞悬液中后，对该细胞悬液支架体系置于负压容器中，施加一定的负压吸引力，使细胞被负压吸附在支架材料上。该构建方法的优点是有利于细胞黏附于支架材料内部，细胞接种较为均匀，且细胞接种量较多，局限是使用负压作为细胞迁移的动力负压太大易对细胞造成损伤且操作过程不易控制。凝胶法是将高密度细胞悬液与凝胶(例如胶原凝胶、纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶)进行混合后制备形成细胞凝胶混合物后，黏附在支架材料表面。该方法的优势是使用凝胶包裹种子细胞在为细胞提供保护的同时为细胞的生长增殖提供了三维的空隙结构，但是缺点也同样明显凝胶只能贴敷在支架材料表面，而不能均匀分布在整个支架材料，并且凝胶为细胞迁移到支架内部形成阻力。动态培养系统法是将支架材料浸没于高密度细胞悬液中，采用旋转、离心、震荡的培养操作使细胞接种在支架材料上，动态培养系统相较于浸渍法和沉淀法可以使细胞更加均匀和更多的吸附在支架材料上且更有利于细胞向支架材料内部迁移，但是动态培养系统施加的物理因素的同时，旋转、离心和震荡同样会使黏附不紧密的细胞从支架中脱落下来，或对细胞造成损伤，影响种子细胞的接种率和种子细胞活性。虽然以上细胞构建技术可以实现种子细胞与支架材料相互复合的目的，但是接种后支架材料的细胞负载量低，细胞在支架材料内分布不均匀，以及在接种过程中如何保证种子细胞的质量仍是需要解决的问题。

虽然组织工程补片技术具有广泛的运用场景和光明的前景，但是现有构建技术的不足，限制了组织工程补片的应用和治疗效果。在组织工程领域，良好的构建技术构建出的组织工程补片应具有以下技术要求：1.高细胞负载量，组织工程补片中应具有足够数量的种子细胞参与受损区域组织修复，足够数量的细胞是发挥种子细胞生物学作用和组织修复的基础。2.种子细胞在支架中均匀分布，均匀分布的细胞促进宿主对组织工程补片的整合是实现受损区组织连续、组织功能重现的基础。3.构建过程不会对种子细胞造成损伤，组织工程补片中的种子细胞具有良好生物学活性，在组织损伤部位可以存活、生长和增殖，且可以通过分化和旁分泌作用参组组织的再生和修复。因此，如何获得具有以上三种技术要求的构建手段成为组织工程亟待解决的重大课题。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种组织工程补片的制备方法，其不会对目的细胞(种子细胞)造成损失，制备具有一定厚度的补片且所得组织工程补片具有高细胞负载量，目的细胞在支架中均匀分布并具有良好的生物学活性。

具体技术方案如下：

一种组织工程补片的制备方法，包括以下步骤：

(1)在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；

(2)当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；

所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述目的细胞为间充质干细胞，其优选为羊膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

在其中一些实施例中，制备所述细胞焦亡产物的细胞为成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和淋巴细胞中的至少一种。作为举例可以为骨髓间充质干细胞、心肌球干细胞或成纤维细胞。

在其中一些实施例中，所述脱细胞支架的细胞去除率大于95％的脱细胞组织。

在其中一些实施例中，所述脱细胞支架无免疫原性或低免疫原性的脱细胞组织。

在其中一些实施例中，所述脱细胞支架为完整保留细胞外基质的脱细胞组织。

在其中一些实施例中，所述脱细胞支架为脱细胞肝组织支架、脱细胞脂肪支架、脱细胞皮肤支架、脱细胞软骨支架、脱细胞心肌组织支架、脱细胞心包膜支架或脱细胞血管支架。

在其中一些实施例中，所述细胞焦亡产物为细胞焦亡分泌物或细胞焦亡提取物时，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后再置于脱细胞支架的另一侧。

在其中一些实施例中，所述凝胶为天然多肽凝胶和天然生物凝胶中的至少一种；优选所述天然多肽水凝胶为纳米多肽水凝胶；优选所述天然生物凝胶优选为纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶和胶原凝胶中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后的混合物中的炎症因子蛋白浓度为1ng/ml～10mg/ml，优选为1ng/ml～1mg/ml。

在其中一些实施例中，所述目的细胞为目的细胞片。进一步地，所述目的细胞片为单层目的细胞片或多层目的细胞片。

在其中一些实施例中，所述脱细胞支架的厚度为0.1mm～50mm，优选为0.5～2cm。

在其中一些实施例中，诱导所述细胞焦亡的方法包括物理诱导法、化学诱导法或生物诱导法。

在其中一些实施例中，所述物理诱导法包括用紫外线、超声、辐射刺激、羟丙基纤维素辛酸酯涂覆皿培养诱导中的至少一种方法对细胞进行诱导。

在其中一些实施例中，所述化学诱导法包括用细胞穿孔素、尿酸盐结晶、鞭毛蛋白和脂多糖中的至少一种物质对细胞进行诱导。

在其中一些实施例中，所述生物诱导法包括用假单胞菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、军团杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、耶尔森林杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、黄金色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、肝炎病毒和免疫缺陷类病毒中的至少一种微生物对细胞进行感染。

在其中一些实施例中，所述细胞焦亡产物距离所述脱细胞支架另一侧的距离为1mm～10cm。

在其中一些实施例中，所述营养液的组成为完全培养基。

在其中一些实施例中，所述完全培养基包括由以下的组分经稀释而成：低糖DMEM、(10±2)％(v/v)胎牛血清、(1±0.2)％(v/v)谷氨酰胺和(1±0.2)％(v/v)青霉素-链霉素溶液。

本发明的另一目的是提供一种上述的制备方法制备的组织工程补片。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明方法首次实现了一种不对目的细胞(如干细胞)造成损害，就可实现高目的细胞负载量、目的细胞在支架中均匀分布并具有良好的生物学活性的组织工程补片。本发明方法首创地通过在组织工程支架的一侧表面种植目的细胞，在支架的另一侧放置细胞焦亡产物构建炎症环境，以炎症环境为迁移驱动力促使目的细胞从脱细胞支架的一侧迁移到另一侧，最终以不损害目的细胞的方式，实现了目的细胞在支架中全层连续分布均匀，并且目的细胞在支架内迁移的同时也在增殖，所以支架内接种的细胞数量会远远大于覆盖在支架表面的细胞数量，具有很高的目的细胞负载量。

其次，本发明方法中的细胞焦亡产物不仅仅作为迁移驱动力，同时活化了目的细胞，经活化的目的细胞才会定向迁移到支架内部，从而确保支架内部的目的细胞均具有高活性。

另外，本发明方法的目的细胞在迁移的过程中目的细胞分泌的细胞外基质组成成分覆盖并包裹在支架材料表面，增加了支架材料的组织相容性，有利于宿主细胞的迁入，有利于宿主对支架材料的整合。

附图说明

图1为实施例1的组织工程补片的结构示意图。

图2为骨髓间充质干细胞(BMSC)在OPC培养皿上培养，形成的焦亡小体的光镜照片。图2中，黑色箭头所指的为焦亡细胞，红色方框所框选的圆球状对象为焦亡小体。

图3为心肌球干细胞(CDCs)在OPC培养皿上培养3天后，caspase-1再细胞内的表达。图3中，绿色的荧光显示的是细胞焦亡的特异性标记物caspase-1，蓝色荧光表示的是细胞核所在的位置。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本实施方式提供一种组织工程补片的制备方法，包括以下步骤：

(1)在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将所述接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；

(2)当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；

所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种。

本发明所述细胞焦亡是指程序性的细胞炎症性坏死，其特征为依赖于半胱天冬酶-1(caspase-1)的诱导作用，并伴有多种促炎因子的释放。细胞发生焦亡时，细胞核浓缩，染色质断裂，形成数量众多的焦亡小体。同时细胞膜上形成1～2nm直径的小孔，破坏细胞膜的完整性，并释放出包含白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)在内的多种炎症因子。相较于单一的炎症因子(如TNF-α、白细胞介素或INF-γ等)对间充质干细胞的刺激，使用细胞焦亡产物作为间充质干细胞的刺激条件，提供了更加全面的炎症因子种类，更接近体内组织受损后所形成的炎症环境，对间充质干细胞的活化效果更好。

本发明方法巧妙利用目的细胞，例如干细胞，对细胞焦亡产物形成的炎症环境的感知和反应特性，将细胞焦亡产物中的炎症因子作为目的细胞定向迁移的驱动力，促使干细胞向炎症环境处定向迁移并自身活化，从而使得干细胞定向迁移到支架材料内部，最终可以获得高细胞负载量、全层连续分布的组织工程补片。

其次，本发明方法中的细胞焦亡产物不仅仅作为迁移驱动力，同时活化了目的细胞，经活化的目的细胞才会定向迁移到支架内部，从而确保支架内部的目的细胞均具有高活性，即具有更强的增殖、迁移、旁分泌和炎症抑制能力。而且经过炎症环境预刺激的目的细胞，可以在炎症环境中生长、增殖和迁移，体现出良好的细胞活性。可以适应组织受损的炎症环境，并在炎症环境中发挥其生物学功能。

此外，在迁移的过程中干细胞分泌的细胞外基质组成成分(例如纤粘连蛋白，层粘连蛋白和胶原)覆盖并包裹在支架材料表面，而细胞外基质不仅为细胞生长、增殖、黏附提供支撑，还促进细胞的迁移和分化，因此经过细胞外基质修饰的支架材料更有利于宿主细胞的迁入，大大增加了支架材料的组织相容性，更有利于宿主的整合。

在其中一些实施方式中，所述目的细胞接种在脱细胞支架的上侧表面，所述细胞焦亡产物置于脱细胞支架的下侧，使得凝胶或焦亡细胞释放的细胞焦亡产物在重力和扩散(布朗运动)的作用下，实现从上到下的浓度梯度。并且，其中所述细胞焦亡产物不与所述脱细胞支架的下侧表面接触，从而避免所述细胞焦亡产物污染所述脱细胞基质。

本发明所述目的细胞为再造组织或器官所用的各类细胞。包括但不限于脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

本发明制备所述细胞焦亡产物的细胞为可以经焦亡诱导生成细胞焦亡产物的各类细胞。包括但不限于纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和淋巴细胞中的至少一种。

本发明所述脱细胞支架为由经化学和物理的方法去除异体或异种组织中的细胞，形成的无免疫原性或低免疫原性的材料。本发明所述脱细胞支架包括但不限于脱细胞肝组织支架、脱细胞脂肪支架、脱细胞皮肤支架、脱细胞软骨支架、脱细胞心肌组织支架、脱细胞心包膜支架或脱细胞血管支架。在其中一些实施方式中，本发明所述脱细胞支架的细胞去除率大于95％。进一步地，所述脱细胞支架无免疫原性。更进一步地，所述脱细胞支架完整保留细胞外基质。进一步地，所述脱细胞基质的厚度为0.1～5mm。

在其中一些实施例中，所述细胞焦亡产物为细胞焦亡分泌物或细胞焦亡提取物时，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后再置于脱细胞支架的另一侧。进一步地，所述凝胶为天然多肽凝胶和天然生物凝胶中的至少一种；所述天然多肽水凝胶为纳米多肽水凝胶；所述天然生物凝胶优选为纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶和胶原凝胶中的至少一种。进一步地，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后的混合物中的炎症因子蛋白浓度为10ng/ml～10mg/ml。

在其中一些优选实施例中，所述目的细胞为目的细胞片。进一步地，所述目的细胞片为单层目的细胞片或多层目的细胞片。所述单层目的细胞片通过将目的细胞接种在温敏水凝胶表面制备而成。所述多层目的细胞片由单层细胞折叠而成，或由多个单层细胞片覆盖而成。此外，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞可以采用物理法，例如使用组织镊、止血钳、组织剪提供的机械力或使用手术刀切除脱细胞支架表面的未迁移的目的细胞。

本发明中诱导所述细胞焦亡的方法包括物理诱导法、化学诱导法或生物诱导法。其中，所述物理诱导法包括但不限于用紫外线、超声、辐射刺激、羟丙基纤维素辛酸酯涂覆皿培养诱导中的至少一种方法对细胞进行诱导；所述化学诱导法包括但不限于用细胞穿孔素、尿酸盐结晶、鞭毛蛋白和脂多糖中的至少一种物质对细胞进行诱导。所述生物诱导法包括但不限于用假单胞菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、军团杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、耶尔森林杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、黄金色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、肝炎病毒和免疫缺陷类病毒中的至少一种微生物对细胞进行感染。

在其中一些实施方式中，所述细胞焦亡产物距离所述脱细胞支架另一侧的距离为1mm～10cm。

在其中一些实施方式中，在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞是指，将目的细胞覆盖在脱细胞支架的一侧后，将细胞支架体系浸没于培养液中培养2～24h，直至目的细胞黏附在支架表面。

在其中一些实施方式中，所述营养液的组成为完全培养基，具体地，所述完全培养基包括由以下的组分经稀释而成：低糖DMEM、(10±2)％(v/v)胎牛血清、(1±0.2)％(v/v)谷氨酰胺和(1±0.2)％(v/v)青霉素-链霉素溶液。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1体外构建组织工程脂肪组织

(1)将非目的细胞进行预培养获取炎症环境

将骨髓间充质干细胞作为非目的细胞，以1*106cell/cm²的密度接种于直径为10cm的大皿上，于二氧化碳恒温培养箱中培养24h，培养基为完全培养基：低糖DMEM+10％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％青霉素-链霉素(100X)。24h后更换培养基为添加含有2mol/ml脂多糖的完全培养基，培养36h，待骨髓间充质干细胞形成明显的焦亡小体后(如图2所示，红色方框所框选的圆球状对象为焦亡小体，黑色箭头所指的是发生焦亡的细胞)，说明骨髓间充质干细胞诱导焦亡培养完成。去除培养基，用PBS清洗皿底两遍，去除细胞碎片，获得贴有焦亡骨髓间充质干细胞的大皿。

(2)获取多层目的细胞的细胞片，将获取的细胞片接种在脱细胞支架材料一侧。

将脐带间充质干细胞接种于涂覆了热响应性甲基纤维素水凝胶的平皿内，培养4天，到细胞融合率为95％。在20℃下，细胞与涂有凝胶的平皿分离，获得单层细胞片。将获得的单层细胞片进行折叠获得复层细胞片，将复层细胞片置于脱细胞脂肪支架一侧后，将复层细胞片-脱细胞脂肪支架复合体系置于完全培养基中静置培养1～2天，至复层细胞片黏附在脱细胞脂肪支架的一侧。对照组使用细胞密度为1*106cell/ml²的脐带间充质干细胞悬液滴加到脱细胞脂肪支架表面后进行静置培养。

(3)将接种过目的细胞的支架材料置于非目的细胞焦亡培养体系进行共培养。

将上述复层细胞片-脱细胞脂肪支架复合体系置于步骤(1)制备的含有焦亡骨髓间充质干细胞的培养皿中，培养液为完全培养基(培养液的液面高于该复层细胞片-脱细胞脂肪支架复合体系)，进行共培养。在共培养时复层脐带间充质干细胞位于脱细胞脂肪支架一侧，该侧远离培养皿底部的焦亡骨髓间充质干细胞，同时所述脱细胞脂肪支架靠近皿底的一侧表面与皿底的焦亡骨髓间充质干细胞之间的距离约为0.5cm，在37℃二氧化碳恒温培养箱中共培养5天(如图1所示)。

(4)在目的细胞迁移通过脱细胞脂肪支架且在脱细胞脂肪支架内均匀分布的时候，将脱细胞脂肪支架脱离共培养体系，去除未迁移的目的细胞，获取具有良好细胞活性的再细胞化的组织工程补片。

培养5天后，脐带间充质干细胞从远离皿底的一侧穿过脱细胞脂肪组织支架迁移到靠近皿底的一侧，将脐带间充质干细胞接种的脱细胞脂肪支架从培养皿中取出，置于新鲜的培养基中。使用组织镊将黏附于脱细胞脂肪组织外部未迁移的脐带间充质干细胞片从脱细胞脂肪支架上去除，获得组织工程补片。

细胞分布检测：

将获取的组织工程补片经过石蜡包埋，切片。进行细胞核的免疫荧光染色。在倒置荧光纤维镜下观察，发现具有大量的细胞核均匀的分布在脱细胞脂肪内，而对照组的细胞核大多分布在脱细胞脂肪组织外侧，组织中央形成无细胞的空腔。说明本发明的构建方法可以使细胞均匀的分布在脱细胞支架内部。

细胞外基质成分检测：

将获取的组织工程补片经过石蜡包埋，切片，抗原修复后，进行层粘连蛋白，纤粘连蛋白，一型胶原，二型胶原，三型胶原的免疫荧光染色。在倒置荧光纤维镜下观察，发现具有大量的层粘连蛋白，纤粘连蛋白，一型胶原，二型胶原，三型胶原分布在细胞周围和脱细胞脂肪上。

脐带间充质干细胞免疫表型分析：

将构建的组织工程补片置于平皿中静置培养获取迁出的脐带间充质干细胞，收集迁出的脐带间充质干细胞，使用流式细胞术检测，结果表明细胞高表达CD29、CD105、CD44、CD73，极低表达CD31、CD34、CD45、MHC-Ⅱ。

脐带间充质干细胞分化潜能鉴定：

将构建的组织工程补片置于平皿中静置培养获取迁出的脐带间充质干细胞，收集迁出的脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞成脂诱导分化结果：定向诱导14天后，本实施例获取的细胞可见油红O染色呈强阳性，倒置显微镜下可见胞浆中含有脂肪空泡。成骨分化结果：定向诱导14天后，本实施例构建的组织工程补片在测试过程中可见细胞间充满黑色颗粒，大小不均一。以上结果说明本发明接种在脱细胞支架内的脐带间充质干细胞具有良好的成脂成骨分化能力。

实施例2：体外构建组织工程肝组织

(1)将非目的细胞进行焦亡预刺激获取炎症环境。

分离心肌球干细胞(CDCs)，将心肌球干细胞作为非目的细胞，以5*106cell/cm²的密度接种于OPC(羟丙基纤维素辛酸酯)涂覆的大皿上培养3天。三天后焦亡炎症因子分泌量提高，形成焦亡小体，进行细胞焦亡标记物caspase-1染色(如图3所示)，说明心肌球干细胞的焦亡诱导培养完成，获得含有焦亡心肌球干细胞的大皿。

(2)获取单层或多层目的细胞的细胞片，将获取的细胞片接种在脱细胞支架的一侧。

使用纳米多肽水凝胶混悬骨髓间充质干细胞后，接种于平皿内，培养4天，待细胞长至90％融合后将其取下，获取单层细胞片，将多个单层细胞片相互覆盖获取复层细胞片。将复层细胞片置于脱细胞肝组织支架的一侧后，将复层细胞片-脱细胞肝组织支架复合体系置于完全培养基中静置培养2天，至上述复层细胞片与脱细胞肝组织支架一层连接紧密。对照组将骨髓间充质干细胞与纳米多肽水凝胶混悬后直接接种在脱细胞肝组织支架上。

(3)将接种目的细胞的支架材料置于非目的细胞培养提供的焦亡炎症环境进行共培养。

将复层细胞片-脱细胞肝组织支架复合体系置于上述有焦亡心肌球干细胞的OPC培养皿中进行共培养，培养液为完全培养基(培养液的液面高于该复层细胞片-脱细胞肝组织支架复合体系)。共培养时，复层细胞片位于脱细胞肝组织支架的一侧，该侧是远离OPC培养皿底部的一侧，同时所述脱细胞肝组织靠近皿底的一侧表面与皿底的焦亡心肌球干细胞之间的距离约为1cm。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养3天。对照组中将包含骨髓间充质干细胞纳米多肽水凝胶于脱细胞肝组织支架上凝固后，将所得补片直接置于完全培养基中静置培养3天。

(4)在目的细胞迁移通过脱细胞肝组织支架的另一侧，且在脱细胞肝组织支架内均匀分布时，将脱细胞肝组织支架脱离共培养体系，去除未迁移的目的细胞，获取具有良好细胞活性的再细胞化的组织工程肝组织补片。

培养3天后，骨髓间充质干细胞从远离皿底的一侧穿过脱细胞肝组织支架，迁移到靠近皿底的一侧，将骨髓间充质干细胞复层细胞片-脱细胞肝组织支架复合体系从共培养体系中取出，置于新鲜培养基中，使用刮刀将上层未迁出的骨髓间充质干细胞复层细胞片刮除，获得组织工程肝组织补片。

对照组：直接从培养基中获得组织工程肝组织补片。

细胞分布：将焦亡预刺激组与对照组制备的组织工程肝组织补片进行石蜡包埋及切片。进行细胞核的hoechst染色，置于荧光显微镜下观察，发现焦亡预刺激制备的肝组织补片中可观察到大量的细胞核均匀分布在脱细胞肝组织中，而对照组中的核只局限分布在脱细胞肝组织的一侧，并未嵌入到支架材料中。说明本发明的构建方法可以使细胞均匀分布在支架内部。

细胞迁出能力：将本发明焦亡预刺激组与对照组制备的组织工程肝组织补片进行贴壁培养，获取迁出的骨髓间充质干细胞。结果发现焦亡预刺激组制备的肝组织补片可迁出大量的骨髓间充质干细胞，而对照组制备的肝组织补片仅有少量骨髓间充质干细胞迁出。说明本发明的构建方法可实现骨髓间充质干细胞的大量二次迁出。

骨髓间充质干细胞活性检测：将本发明焦亡预刺激组与对照组制备的组织工程肝组织补片用胰酶进行消化，获得单细胞悬液，使用流式细胞术检测，结果表明焦亡预刺激组中的骨髓间充质干细胞CD29、CD90、CD105等干细胞标志物均表达95％以上，CD31、CD45则表达5％以下，而对照组中的骨髓间充质干细胞CD29、CD90、CD105等干细胞标志物仅表达55％以上。说明本发明的构建方法可实现种子细胞的干性维持。

实施例3体外构建组织工程心肌组织

(1)将非目的细胞进行焦亡预刺激获取炎症环境。

选择成纤维细胞作为非目的细胞，以3*106cell/cm²的密度将其种植在培养皿中加入培养基进行培养，该培养基为完全培养基：高糖DMEM+10％(v/v)胎牛血清+1％(v/v)谷氨酰胺+1％(v/v)青霉素-链霉素(100X)。待细胞长至80％融合后，去除培养基，加入PBS清洗，随后加入含有100μg/ml细胞穿孔素及0.5μg/ml鞭毛蛋白的无血清培养液，培养36h。培养过后收集所得含有细胞焦亡因子的培养基，使用BCA试剂盒检测焦亡因子蛋白浓度，用无菌PBS调整其浓度为80ng/ml后，-20℃保存备用。

(2)获取单层目的细胞片，将获取的细胞片接种在脱细胞支架的一侧。

将温敏水凝胶进行培养皿的铺板，随后将人羊膜间充质干细胞种植在含有温敏水凝胶的培养皿中。培养至细胞达到95％融合后，在25℃环境下将细胞片与培养皿分离，获得单层细胞片。将单层细胞片种植在脱细胞心肌组织支架一侧，随后将单层细胞片-脱细胞心肌组织支架复合体系置于培养皿中培养4天至单层细胞片粘附在脱细胞心肌组织支架上。对照组使用浸渍法，将脱细胞心肌组织支架浸没于细胞浓度为6*105cell/ml的人羊膜间充质干细胞悬液中，接种2h后将脱细胞心肌组织支架从细胞悬液中取出，置于培养基中静置培养4天。

(3)将接种目的细胞的支架材料置于非目的细胞培养提供的焦亡炎症环境进行共培养。

将步骤(2)稀释所得含有细胞焦亡因子的培养基与基质胶(属于细胞外基质胶，购自

CATALOG NUMBER:356234)按照10:1混合后铺板于培养皿底部后，单层细胞片-脱细胞心肌组织支架复合体系置于上述铺板有焦亡因子的培养基中共培养，培养液为完全培养基(培养液的液面高于该单层细胞片-脱细胞心肌组织支架复合体系)。共培养时，单层细胞片位于脱细胞心肌组织支架一侧，远离含有细胞焦亡因子的基质胶的皿底一侧。置于37℃，5％CO₂培养箱中培4天。

(4)在目的细胞迁移通过脱细胞心肌组织支架另一侧，且在脱细胞心肌组织支架内均匀分布的时，将脱细胞心肌组织支架脱离共培养体系，去除未迁移的目的细胞，获取具有良好细胞活性的再细胞化的脱细胞补片。

培养4天后，羊膜间充质干细胞从远离皿底的一侧穿过脱细胞心肌组织支架迁移到靠近皿底的一侧，将单层细胞片-脱细胞心肌组织支架复合体系从共培养体系中取出，置于新鲜培养基中培养。使用镊子将支架上层未迁移的的单层细胞片去除，获得组织工程心肌组织补片。

脱细胞心肌组织支架内细胞活性检测：将焦亡预刺激组与对照组制备的组织工程心肌组织补片使用胰酶进行消化，获得单细胞悬液，进行细胞的死活染色。染色结果显示焦亡预刺激组支架内间充质干细胞的存活率为95％，对照组间充质干细胞的存活率为70％，两者之间有显著差异。说明本发明构建的组织工程心肌组织补片具有良好的细胞活性。

脱细胞心肌组织支架内部细胞分布：将焦亡预刺激组与对照组制备的组织工程心肌组织补片进行石蜡包埋及切片。进行细胞核的hoechst染色，置于荧光显微镜下观察，发现焦亡预刺激制备的心肌组织补片中可观察到大量的细胞核均匀分布在脱细胞心肌组织内部，而对照组中的核只局限分布在脱细胞心肌组织的周围，并未迁移到支架材料内部，形成大量的无细胞区域。说明本发明的构建方法可以使细胞均匀分布在支架内部。

心肌组织生物相容性：将焦亡预刺激组与对照组制备的组织工程心肌组织补片同时移植到裸鼠皮下，分别在1、3、6、10天将裸鼠处死，获取移植后的样品，进行免疫荧光染色，染色结果显示焦亡预刺激组在第三天，在移植的脱细胞心肌组织补片具有α-SMA的阳性表达，而对照组在10天才有α-SMA的阳性表达。且通过HE染色显示焦亡预刺激组相较于对照组具有更多的微血管和小血管形成。以上结果显示本发明构建的组织工程心肌组织具有良好的生物相容性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种组织工程补片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在脱细胞支架的一侧表面接种目的细胞，在脱细胞支架的另一侧放置细胞焦亡产物，所述细胞焦亡产物与所述脱细胞支架另一侧表面分离；再将接种目的细胞的脱细胞支架和细胞焦亡产物共同在培养液中进行培养；

（2）当所述目的细胞从所述脱细胞支架的一侧迁移到另一侧时，去除所述脱细胞支架一侧表面未迁移的目的细胞，得到组织工程补片；

所述细胞焦亡产物为细胞焦亡后所产生的细胞焦亡分泌物、细胞焦亡提取物和焦亡细胞中的至少一种；

制备所述细胞焦亡产物的细胞为成纤维细胞、胶质细胞、间质细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和淋巴细胞中的至少一种；所述目的细胞为间充质干细胞；

所述细胞焦亡产物距离所述脱细胞支架另一侧的距离为1mm~10cm。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述目的细胞为羊膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞支架为细胞去除率高于95%、低免疫原性的脱细胞组织。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞组织为脱细胞肝组织、脱细胞脂肪、脱细胞皮肤、脱细胞软骨、脱细胞心肌组织、脱细胞心包膜或脱细胞血管。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞焦亡产物为细胞焦亡分泌物或细胞焦亡提取物时，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后再置于脱细胞支架的另一侧。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶为天然多肽凝胶和天然生物凝胶中的至少一种，所述天然多肽凝胶为纳米多肽水凝胶，天然生物凝胶为纤维蛋白凝胶、细胞外基质胶和胶原凝胶中的至少一种；和/或，所述细胞焦亡产物与凝胶混合后的混合物中的炎症因子蛋白浓度为1ng/mL~10mg/mL。

7.根据权利要求1~6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述目的细胞为目的细胞片；所述目的细胞片为单层目的细胞片或多层目的细胞片；和/或，所述脱细胞支架的厚度为0.1 mm~50 mm；和/或，诱导所述细胞焦亡的方法包括物理诱导法、化学诱导法或生物诱导法。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述物理诱导法包括用紫外线、超声、辐射刺激、羟丙基纤维素辛酸酯涂覆皿培养诱导中的至少一种方法对细胞进行诱导；和/或，所述化学诱导法包括用细胞穿孔素、尿酸盐结晶、鞭毛蛋白和脂多糖中的至少一种物质对细胞进行诱导；和/或，所述生物诱导法包括用假单胞菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、军团杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、耶尔森林杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、黄金色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、肝炎病毒和免疫缺陷类病毒中的至少一种微生物对细胞进行感染。

9.根据权利要求1~6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述培养液的组成为完全培养基，所述完全培养基包括由以下的组分经稀释而成：低糖DMEM、（10±2）%（v/v）胎牛血清、（1±0.2）%（v/v）谷氨酰胺和（1±0.2）%（v/v）青霉素-链霉素溶液。

10.权利要求1~9任一项所述的制备方法制备的组织工程补片。

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