CN108546674B - 预刺激干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种预刺激干细胞及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得获得焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物用于培养干细胞。本发明所述制备方法可获取受焦亡细胞分泌物预刺激的干细胞，该干细胞能够适应天然的炎症环境，提高干细胞对受损区域的修复能力，是组织工程领域种子材料预处理的新突破，同时所述预刺激干细胞也为解决临床疾病治疗提供可行方案。

Description

预刺激干细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于组织工程领域，特别涉及一种预刺激干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
干细胞作为一种具有自我复制能力及分化潜能的细胞，可以通过增殖分化及外分泌功能对损伤区域进行修复，一直被认为是组织工程种子细胞的良好选择。病损部位包含大量坏死细胞，缺血缺氧，并伴有大量炎症细胞浸润。将干细胞植入病灶后，由于其所处环境恶劣，大部分干细胞凋亡，使干细胞的治疗效果大打折扣。为增强移植干细胞对炎症环境的适应，研究者提出在移植前对干细胞进行预刺激的方法。与直接应用干细胞相比，经过预刺激的干细胞主要优势在于：①模拟干细胞在移植体内所处环境，在预刺激过程中主动淘汰一部分适应能力差的干细胞，提高干细胞的体内移植存活率；②预刺激后干细胞从静止期或低活性期进入高活性期，增殖、分化及外分泌功能加强，使移植的干细胞对体内恶劣的环境更具有适应性。
现有的干细胞预刺激方法包括①低氧刺激；②炎症因子刺激；③药物刺激；④物理刺激。不同的刺激方法对于干细胞的应激状态产生不同的影响。①低氧刺激是指体外在长期低氧的环境培养干细胞，使干细胞适应体内缺氧环境。然而，体外培养难以长期维持低氧的培养环境，频繁的低氧/复氧过程对细胞损失巨大。②炎症因子刺激是指在干细胞体外培养过程中加入炎症因子如TNF-α、白介素，使干细胞适宜体内坏损组织中的炎症浸润环境。其缺点主要在于添加的炎症因子种类、浓度的控制不当，干细胞存活率低。③药物刺激主要包括基质细胞来源因子(SDF)、干扰素(IFN)这类对细胞活性有关的药物的刺激。这类药物刺激可以使干细胞活化，增殖和分泌功能增强，但过度活化容易导致干细胞体外分化，并且药物刺激并非模拟体内真实环境，干细胞移植后存活率依然不高。④物理刺激是指通过物理刺激如电刺激、光线刺激、声波刺激、热刺激、力学刺激对细胞产生影响。这种刺激通过非接触性影响，较为容易地得到活化后的细胞，但此法给予的刺激无法模拟体内的损伤环境，细胞对此作出的响应未必对损伤环境有利。
以上预刺激的共同特点在于，给干细胞施加人为的作用因素，使干细胞在受到刺激后从静止期转入相对活跃期，增强细胞活动，增强其增殖、分泌、迁移能力，提高移植存活率，以达到更优的治疗效果。但受损组织周围的微环境相当复杂，目前这些处理方法均未能对其实现真实的还原。因此，寻找一种充分模拟体内干细胞刺激环境的条件对移植干细胞具有重要意义。
细胞焦亡(pyroptosis)是一种炎症性细胞坏死，主要发生原因例如是受到一系列微生物感染(如沙门氏菌，弗朗西斯氏菌)和非感染性刺激(包括心肌梗死期间产生的宿主因子)。细胞发生焦亡时，细胞核浓缩，染色质断裂，形成数量众多的焦亡小体；同时，细胞膜上形成1-2nm的小孔，破坏细胞膜的完整性，释放出包含炎性物质如IL-1β和IL-18的细胞内容物。这些细胞内容物的释放，激活及招募其他免疫细胞，诱导炎症因子、趋化因子、黏附因子等的合成，有利于机体迅速对损伤作出反应。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种新的预刺激干细胞的制备方法，该制备方法通过诱导细胞焦亡再将其用于预刺激干细胞，可实现对体内损伤环境的最优模拟，使预刺激后的干细胞提高对该微环境的适应能力，增强其治疗效果。
上述目的通过下述技术方案实现：
一种预刺激干细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物；
(2)将焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物用于目的干细胞的培养；
(3)获取具有应激状态的预刺激干细胞。
在其中一个实施例中，所述辅助细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞、心肌细胞、全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞中的任何一种或一种以上。
在其中一个实施例中，所述将焦亡细胞的分泌物用于目的干细胞的培养包括：诱导辅助细胞焦亡后收集其培养上清液，与干细胞培养液混合后用于目的干细胞的培养，和/或诱导辅助细胞焦亡后从其分泌物中提取焦亡小体，将提取所得的焦亡小体用于目的干细胞培养中。
在其中一个实施例中，所述将焦亡细胞的提取物用于目的干细胞的培养包括：通过酶消化法、裂解法、物理破碎法中的一种或一种以上获得焦亡细胞提取物，并用于目的干细胞的培养。
在其中一个实施例中，所述将焦亡细胞用于目的干细胞的培养包括：诱导辅助细胞焦亡后将诱导焦亡因素撤去，在原有体系中加入目的干细胞共培养。
在其中一个实施例中，所述的诱导细胞焦亡的方法为物理方法、化学方法、生物方法。
在其中一个实施例中，所述的诱导细胞焦亡的物理方法包含以紫外线、超声、微波、辐照、力学刺激中的任何一种或一种以上进行诱导；
所述的诱导细胞焦亡的化学方法包含以细胞穿孔素、细胞外ATP、尿酸盐结晶、鞭毛蛋白、脂多糖中的任何一种或一种以上进行诱导；
所述的诱导细胞焦亡的生物方法包含以假单胞菌、沙门氏杆菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、军团杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、耶尔森林杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、耐药性金黄色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、肝炎病毒、免疫缺陷类病毒中的任何一种或一种以上上述微生物及/或其培养提取物进行感染。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的预刺激干细胞。
本发明的再一目的在于上述预刺激干细胞在组织工程产品中的应用。
本发明所述预刺激干细胞的制备方法，相对于现有技术具有以下的优点和效果：
(1)预刺激环境与天然炎症环境相似度高：焦亡细胞分泌物含有的炎性物质，其成分和数量都与天然炎症环境相类似，更好地模拟了损伤部位所处的炎症环境；
(2)所得干细胞体内移植适应性良好：通过焦亡细胞分泌物使干细胞提前适应体内恶劣环境，使干细胞及时作出相应的变化，提高干细胞的移植存活率和治疗效果；
(3)所得干细胞分泌功能加强：为了适应环境的改变，在焦亡细胞分泌物的刺激下培养的干细胞可增强其分泌功能，分泌更多有利于细胞生长的因子；
(4)可选择性保留生长状态良好的细胞：在焦亡细胞分泌物预刺激后，有一部分生长状态较差的细胞死亡，选择性地保留了生长状态良好的细胞，为进一步的细胞治疗提供更优质的细胞来源；
(5)处理过程无毒无害：本方法采用细胞分泌物或细胞作为刺激源，避免了化学物质，物理因素或病菌与目的干细胞的直接接触，处理条件温和，预刺激后的干细胞不会有残留的毒性物质，不会对干细胞的使用产生毒性作用；
(6)可避免细胞的过度刺激：焦亡细胞分泌物给干细胞带来的刺激程度适中，避免药物带来过度刺激使细胞迅速分化、老化，存活率下降。
通过本发明所述预刺激干细胞的制备方法，可获取受焦亡细胞分泌物等预刺激的干细胞，使得到的干细胞能够适应天然的炎症环境，提高干细胞对受损区域的修复能力。该预刺激干细胞的制备方法是组织工程领域种子材料预处理的新突破，同时所述预刺激干细胞也为解决临床疾病治疗提供可行方案。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明所述一种预刺激干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得焦亡细胞的提取物和/或焦亡细胞；
(2)将焦亡细胞的分泌物、提取物和/或焦亡细胞用于目的干细胞的培养；
(3)获取具有应激状态的预刺激干细胞。
下面对本发明的技术方案原理进行详细说明。
本发明包含的步骤如下：
a.辅助细胞培养及诱导其焦亡：
本发明选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，采用物理法、化学法或生物法诱导其焦亡。因为细胞焦亡是细胞受到外界刺激后自主发生的一系列变化，从而导致细胞发生炎症性坏死，并释放一些炎症因子。细胞焦亡与粥样动脉硬化、感染性疾病、神经系统退行性疾病、慢性组织损伤和急性肝损伤等各类疾病相关。在这些情况下，病变组织周围充满由焦亡细胞分泌出的各种炎症因子。因此，发明人发现：体外诱导细胞焦亡促使细胞自主分泌的炎症因子可最大程度模拟病理条件下炎症环境，干细胞在此炎症环境下可作出利于适应该环境的调整，提高干细胞的治疗效果。
b.收集焦亡细胞的分泌物和/或提取物和/或焦亡细胞用于目的干细胞的培养：
本发明利用焦亡细胞分泌的炎症环境刺激目的干细胞，促使目的干细胞移植前适应炎症环境，并提高增殖和迁移能力，增强细胞的分泌功能。在正常的体外培养条件下，干细胞处于正常状态，其分泌、增殖功能处于正常水平，不具有对损伤环境的针对性。发明人发现：而当干细胞处于刺激条件下时，干细胞能够感受并响应外界的刺激，及时地对外界的改变进行调整，以更好地适应所处的环境。这些外界的刺激可以是各种物理、化学、生物的方法，当细胞表面的蛋白受体接收到这些信号时，多种信号通路被激活，从而促进某些特定蛋白合成及表达、促进细胞的增殖、迁移的行为能力、促进细胞向有利方向分化几方面做出调整，以抵御外界的刺激。
c.获取具有应激状态的预刺激干细胞：
干细胞的应激状态是指具高增殖力，高迁移能力，高分泌功能和高抗炎能力的状态。发明人发现：步骤b使用焦亡细胞分泌的因子或焦亡细胞刺激目的干细胞，焦亡细胞分泌的因子或焦亡细胞对于目的干细胞来说均属于刺激因素，当目的干细胞处于外界刺激环境时，发生一系列信号通路的激活，增强干细胞的生物学功能。
本发明所述的辅助细胞是指非目的干细胞的细胞，在体外培养中人为诱导其焦亡，利用其分泌物对干细胞进行预刺激的细胞。进一步地，所述辅助细胞可以包括有单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞、心肌细胞、全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，等等，只要是非目的干细胞的细胞中的任何一种或一种以上。
所述细胞焦亡是指程序性的细胞炎性坏死，依赖于半胱天冬酶-1/4/5/11，并伴有大量炎症因子的释放。
只要能诱导细胞焦亡的方法都适合本发明。通常，所述的诱导细胞焦亡的方法包括常规的物理方法、化学方法及生物方法。
进一步地，所述的诱导细胞焦亡的物理方法包含以紫外线、超声、微波、辐照、力学刺激中的任何一种或一种以上进行诱导。
进一步，所述的诱导细胞焦亡的化学方法包含以细胞穿孔素、细胞外ATP、尿酸盐结晶、鞭毛蛋白、脂多糖中的任何一种或一种以上进行诱导。
进一步，所述的诱导细胞焦亡的生物方法包含以假单胞菌、沙门氏杆菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、军团杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、耶尔森林杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、耐药性金黄色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、肝炎病毒、免疫缺陷类病毒中的任何一种或一种以上上述微生物及/或其培养提取物进行感染。
所述的焦亡细胞分泌物用于目的干细胞的培养方法包含以焦亡细胞条件培养液培养干细胞、提取焦亡小体(pyroptosome)并与干细胞共培养、焦亡细胞与干细胞共培养、焦亡细胞提取物与干细胞共培养中的任何一种或一种以上。
所述的目的干细胞包含全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞的任何一种或一种以上。
进一步地，所述的以焦亡细胞条件培养液培养目的干细胞的培养方法指诱导辅助细胞焦亡后收集其培养上清液，与干细胞培养液混合后用于目的干细胞的培养。
进一步地，所述的提取焦亡小体并与目的干细胞共培养的培养方法指通过收集焦亡细胞培养上清液，经离心法、色谱法、过滤法和物理吸附法中的一种或一种以上方法进行焦亡小体的提取，将提取所得的焦亡小体用于目的干细胞培养中。
进一步地，所述的焦亡细胞与目的干细胞共培养的培养方法是指诱导辅助细胞焦亡后将诱导焦亡因素撤去，在原有体系中加入目的干细胞共培养。
所述的焦亡细胞提取物与目的干细胞共培养的培养方法指通过酶消化法、裂解法中的一种或一种以上获得焦亡细胞提取物，并用于目的干细胞的培养。
所述的离心法包含超速离心、差速离心、超滤离心、密度梯度离心和旋转超滤中的一种或一种以上的方法。
所述的色谱法包含凝胶层析色谱法、吸附层析色谱法、离子交换法中的一种或一种以上的方法。
所述的物理吸附方法可以为静电吸附和磁力吸附的一种或一种以上的方法；
所述的过滤法可以指利用纳滤膜和超滤膜中的一种或一种以上的膜将不同分子量或粒径的分子分离获取焦亡小体的方法。
所述的具有应激状态的预刺激干细胞指外界条件改变使得干细胞从静止期或低活性期转化为高活性期，增殖、分化及外分泌功能增强，以应对外界变化的状态。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：用于大鼠组织工程板层角膜构建的预刺激角膜缘干细胞的制备
1.大鼠角膜基质细胞的诱导焦亡
选取大鼠角膜基质细胞作为辅助细胞，以1*106cells/cm2的密度将细胞接种于10cm直径塑料培养皿中，于培养箱中培养24h，培养液为高糖DMEM+10％胎牛血清+1％L-谷氨酰胺+1％NEAA+1％青霉素-链霉素溶液(100X)+0.02％EGF+0.1％转铁蛋白+0.1％胰岛素，培养条件为37℃，5％二氧化碳。24h后更换含有1mol/ml的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/尼日利亚菌素混合物的培养液培养48小时。
2.收集焦亡细胞分泌物
加入上述LPS/尼日利亚菌素混合物培养48h后收集其培养液，再以PBS冲洗2遍，轻轻吹打，使细胞表面物质吹落并收集PBS。将收集的培养液和PBS进行离心，3000rpm离心5min，取上清液，0.22μm滤器过滤除去细胞碎片。
3，将焦亡细胞分泌物用于角膜缘干细胞的培养
使用BCA试剂盒检测焦亡细胞分泌物的蛋白浓度，用无菌PBS调整其密度为0.3mg/ml。培养大鼠角膜缘干细胞，其培养液为高糖DMEM+10％胎牛血清+1％L-谷氨酰胺+1％NEAA+1％青霉素-链霉素溶液(100X)+0.02％EGF+0.1％转铁蛋白+0.1％胰岛素+0.1％醋酸泼尼松龙，培养条件为37℃，5％二氧化碳。当角膜缘干细胞密度达80％及其以上时，更换新鲜的角膜缘干细胞培养液，加入已配置好的焦亡细胞分泌物，正常条件下培养48h。
4.获取预刺激的大鼠角膜缘干细胞
48h后除去原有培养液，PBS清洗后以0.25％胰蛋白酶于室温消化3min，用角膜缘干细胞培养液终止消化后，轻轻吹打至细胞脱落，收集细胞悬液，3000rpm离心5min，获得预刺激后的大鼠角膜缘干细胞。
经试验，分别使用经过上述预刺激大鼠角膜缘干细胞和未经过预刺激大鼠角膜缘干细胞进行DiR标记，并制备成组织工程板层角膜。一周后检测DiR荧光强度，结果显示经过上述预刺激干细胞组荧光强度显著高于未刺激干细胞组，使用流式细胞仪检测发现表征干细胞低分化标记的p63蛋白表达率从20.3％上升至63.7％，使用焦亡细胞分泌物预刺激大鼠角膜缘干细胞，能显著提高大鼠角膜缘干细胞对环境变化的适应能力，提高移植干细胞的存活率。本法得到的预刺激干细胞，对组织工程板层角膜的构建效果有提高作用。
实施例2：用于关节炎引起的骨缺损治疗的预刺激人骨髓间充质干细胞的制备
1.人外周血单核细胞的诱导焦亡
选择人外周血单核细胞作为辅助细胞，以2*106cells/cm2的密度将细胞接种于10cm直径塑料培养皿中，于培养箱中培养24h，培养液为基础培养基RPMI1640+10％胎牛血清，培养条件为37℃，5％二氧化碳。24h后更换新鲜培养液，并以50mJ/cm2的紫外照射24h。
2.提取焦亡小体
24h后继续培养24h，收集其培养液，再以PBS冲洗2遍，轻轻吹打，使细胞表面物质吹落并收集PBS。将收集的培养液和PBS进行超速离心，80000转/min，去除上清液收集焦亡小体。
3.将焦亡小体用于人骨髓间充质干细胞的培养
使用BCA试剂盒检测焦亡小体的蛋白浓度，用无菌PBS调整其密度为0.6mg/ml。培养人骨髓间充质干细胞，其培养液为基础培养基DMEM+10％胎牛血清，培养条件为37℃，5％二氧化碳。当人骨髓间充质干细胞密度达80％及其以上时，更换新鲜的人骨髓间充质干细胞培养液，加入已配置好的焦亡小体溶液1ml，正常条件下培养48h。
4.获取预刺激的人骨髓间充质干细胞
48h后除去原有培养液，PBS清洗后以0.25％胰蛋白酶于室温消化3min，人骨髓间充质干细胞培养液终止消化后，轻轻吹打至细胞脱落，收集细胞悬液，3000rpm离心5min，获得预刺激后的人骨髓间充质干细胞。
经试验，分别使用经过上述预刺激人骨髓间充质干细胞和未经过上述预刺激人骨髓间充质干细胞治疗羊膝关节缺损。首先对待移植人骨髓间充质干细胞进行GFP标记，然后将细胞与2％透明质酸混合后移植入羊膝关节缺损部位，2周后获取膝关节标本检测GFP表达情况，结果显示经过上述预刺激干细胞组GFP阳性细胞数量为78％，显著高于未经过上述预刺激干细胞组的49％，骨缺损部位的骨质密度提高10％～13％，说明使用焦亡小体预刺激人骨髓间充质干细胞显著提高了其对炎症环境的适应能力。
实施例3：用于兔糖尿病足溃疡修复补片的预刺激真皮间充质干细胞的制备
1.兔真皮成纤维细胞的诱导焦亡
选取兔真皮成纤维细胞作为辅助细胞，以初始种植量2.5*104cells种植于Transwell板(6孔，孔径3.0um)上室，加入成纤维细胞培养液(高糖DMEM+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素溶液(100X)+1％谷氨酰胺)，正常培养至80％细胞融合时，无菌PBS清洗，加入含有100μg/ml细胞穿孔素及0.5μg/ml鞭毛蛋白的无血清培养液，培养36h。
2.焦亡细胞与兔真皮间充质干细胞的共培养
36h后显微镜下可见细胞发生焦亡，表面产生囊泡状结构。此时在Transwell板下室加入5*104cells兔真皮间充质干细胞，以培养液(DMEM/F12+1.5％甲基纤维素+20ng/mlEGF+10ng/ml bFGF及TGF-β)培养48h。
3.获取预刺激后兔真皮间充质干细胞
移去Transwell板上室，PBS清洗后加入0.5ml 0.05％胰蛋白酶室温消化1.5min，真皮间充质干细胞培养液终止消化后，轻轻吹打至细胞脱落，收集细胞悬液，4000rpm离心5min，获取预刺激兔真皮间充质干细胞。
经检测，获取的经过上述预刺激的兔真皮间充质干细胞高表达CD29和CD90，其干性保持良好，细胞增殖速率明显。流式细胞仪检测细胞周期，与未预刺激的真皮干细胞相比，其处于增殖期(G0/G1期)的细胞从45％上升为65％。用于制备皮肤创伤修复补片6天后与补片载体通过胶原蛋白及弹性蛋白形成连接，构成稳定的体系。制备兔二型糖尿病足模型，使用预刺激的干细胞和未刺激的干细胞分别制备皮肤创伤修复补片，且细胞来源兔选用雄性，动物模型兔选用雌性。使用修复补片治疗1周后，取兔治疗部位皮肤组织，利用Y染色体的原位杂交技术检测移植干细胞的数量。结果显示单位面积内预刺激干细胞组明显高于未刺激干细胞组，且预刺激干细胞组移植干细胞分布范围较广。用此预刺激干细胞制备的皮肤损伤修复补片具有更好地抗炎效果，弹性模量与自然皮肤相接近，适用于皮肤损伤修复。
实施例4：用于小鼠阿尔茨海默病治疗的预刺激胚胎干细胞的制备
1.小鼠神经细胞的诱导焦亡
选取小鼠神经细胞作为辅助细胞，以5×104cells/cm2的密度将细胞接种于10mg/L多聚赖氨酸包被的25cm2塑料培养瓶中，于培养箱中培养24h，培养液为基础培养基DMEM+10％胎牛血清，培养条件为37℃，5％二氧化碳。24h后更换含有1mol/ml的脂多糖的培养液培养48h。
2.获取焦亡细胞
加入脂多糖培养48h后弃去培养液，再以PBS冲洗2遍，轻轻吹打以去除细胞碎片和死细胞，获得贴有焦亡细胞的培养瓶。
3.焦亡细胞与小鼠胚胎干细胞共培养
小鼠胚胎干细胞的培养，其培养液为Knockout DMEM+10％胎牛血清+0.1％β巯基乙醇+1％NEAA+0.01％LIF+0.05％CHIR+0.02％PD，培养条件为37℃，5％二氧化碳。当胚胎干细胞密度达80％及其以上时，弃去上清液，PBS润洗后0.25％胰蛋白酶室温消化1min，收集细胞悬液经离心后，加入新鲜培养液调整细胞密度，按照1×104cells/cm2密度将胚胎干细胞接种于步骤2中准备好的培养瓶中，加入4ml胚胎干细胞培养液继续培养。
4.获取预刺激的小鼠胚胎干细胞
待小鼠胚胎干细胞生长形成200-300μm大的小球后，弃去上清液，PBS清洗后以0.25％胰蛋白酶于室温消化1min，胚胎干细胞培养用培养液终止消化后，轻轻吹打至细胞脱落，收集细胞悬液，3000rpm离心5min，获得预刺激后的小鼠胚胎干细胞。
经试验，分别使用预刺激小鼠胚胎干细胞和未刺激小鼠胚胎干细胞治疗小鼠阿尔茨海默病。制备小鼠阿尔茨海默病模型，将预刺激的干细胞和未刺激的干细胞分别与多肽纳米凝胶混合后移植入小鼠脑部。2周后，使用Morris水迷宫定位航行实验检测小鼠空间记忆能力，结果显示预刺激干细胞组小鼠的平均空间记忆能力得到改善。提取小鼠血液，检测过氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)的含量进一步验证治疗效果，结果显示预刺激干细胞组SOD活力(290.54±15.21U/ml vs 256.32±10.65U/ml)和GSH含量(8.75±1.82mg/L vs 6.03±0.89mg/L)升高，MDA(7.01±0.57mol/ml vs 4.52±0.66mol/ml)降低。说明预刺激干细胞组治疗效果更佳。
实施例5：用于组织工程血管构建的血管内皮祖细胞的制备
1.大鼠内皮细胞的诱导焦亡
选取大鼠血管内皮细胞作为辅助细胞。以5*104个/cm2的密度将细胞接种于6cm直径塑料培养皿中，于培养箱中培养24h，培养液为基础培养基DMEM+20％胎牛血清+10％内皮细胞生长因子ECGS，培养条件为37℃，5％二氧化碳。待细胞密度达80％后，以感染复数10:1感染野生型单核细胞增生李斯特菌45分钟，然后用含5％庆大霉素的培养基洗涤3次以除去细胞外细菌。
2.收集焦亡细胞分泌物
诱导焦亡后以无血清培养基常规培养细胞。36-48小时后观察其细胞形态。待细胞出现明显囊泡状结构时，无菌PBS清洗，以0.25％胰蛋白酶消化收集内皮细胞，用RIPA裂解液将细胞充分破碎后，12000rpm离心30min，收集其细胞的蛋白提取液。用考马斯亮蓝法测定分泌物蛋白浓度。立即使用或-80℃下保存。
3.将焦亡细胞分泌物用于血管内皮祖细胞的培养
根据步骤2中测得蛋白浓度，配制含200μg/ml焦亡血管内皮细胞分泌物的血管内皮祖细胞培养用培养液。培养大鼠血管内皮干细胞，其培养液为基础培养基DMEM+20％胎牛血清+10％内皮细胞生长因子ECGS，培养条件为37℃，5％二氧化碳。当血管内皮祖细胞密度达80％及其以上时，使用含焦亡血管内皮细胞分泌物的培养液培养48h。
4.获取预刺激后的血管内皮祖细胞
48h后除去原有培养液，PBS清洗后以0.25％胰蛋白酶于室温消化2min，血管内皮祖细胞培养用培养液终止消化后，轻轻吹打至细胞脱落，收集细胞悬液，3000rpm离心5min，获得预刺激后的血管内皮祖细胞。
经试验，收集预刺激后的血管内皮祖细胞的培养上清液，通过液相色谱-质谱联用检测上清液中蛋白种类和浓度，结果发现用焦亡细胞分泌物预刺激后的血管内皮祖细胞旁分泌作用旺盛。分别使用预刺激大鼠血管内皮祖细胞和未刺激大鼠血管内皮祖细胞治疗大鼠粥样动脉硬化。将种子细胞种植于聚乳酸血管支架继续培养，细胞增殖活性良好，培养10天可见细胞逐渐形成致密结构。制备大鼠粥样动脉硬化模型，DiR标记血管支架表面细胞，并将其植入大鼠动脉内。体内移植后2周检测DiR的荧光强度，结果显示预刺激祖细胞组荧光强度显著高于未刺激祖细胞组，其存活率达89％，而未受预刺激的血管内皮祖细胞只有51％。本方法制备的预刺激血管内皮祖细胞，适用于组织工程血管的构建。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）选用非目的干细胞的细胞作为辅助细胞，诱导辅助细胞焦亡，获得焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物；
（2）将焦亡细胞、焦亡细胞的分泌物、和/或焦亡细胞的提取物用于移植目的干细胞的培养；
（3）获取具有应激状态的预刺激干细胞；
其中，所述辅助细胞为角膜基质细胞、所述目的干细胞为角膜缘干细胞；
或所述辅助细胞为外周血单核细胞、所述目的干细胞为骨髓间充质干细胞；
或所述辅助细胞为真皮成纤维细胞、所述目的干细胞为真皮间充质干细胞；
或所述辅助细胞为神经细胞、所述目的干细胞为胚胎干细胞；
或所述辅助细胞为内皮细胞、所述目的干细胞为血管内皮祖细胞。
2.根据权利要求1所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，所述将焦亡细胞的分泌物用于移植目的干细胞的培养包括：诱导辅助细胞焦亡后收集其培养上清液，与移植目的干细胞培养液混合后用于移植目的干细胞的培养,和/或诱导辅助细胞焦亡后从其分泌物中提取焦亡小体，将提取所得的焦亡小体用于移植目的干细胞培养中。
3.根据权利要求1所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，所述将焦亡细胞的提取物用于移植目的干细胞的培养包括：通过酶消化法、裂解法、物理破碎法中的一种或一种以上获得焦亡细胞提取物，并用于移植目的干细胞的培养。
4.根据权利要求1所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，将焦亡细胞用于目的干细胞的培养包括：诱导辅助细胞焦亡后将诱导焦亡因素撤去，在原有体系中加入移植目的干细胞共培养。
5.根据权利要求1-4任一项所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，所述的诱导细胞焦亡的方法为物理方法、化学方法、生物方法。
6.根据权利要求5所述的预刺激干细胞的制备方法，其特征在于，所述的诱导细胞焦亡的物理方法为以紫外线、超声、微波、辐照、力学刺激中的任何一种或一种以上进行诱导；
所述的诱导细胞焦亡的化学方法为以细胞穿孔素、细胞外ATP、尿酸盐结晶、鞭毛蛋白、脂多糖中的任何一种或一种以上进行诱导；
所述的诱导细胞焦亡的生物方法包含以假单胞菌、沙门氏杆菌、李斯特杆菌、志贺氏杆菌、军团杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、耶尔森林杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、耐药性金黄色葡萄球菌、伤寒沙门杆菌、肝炎病毒、免疫缺陷类病毒中的任何一种或一种以上上述微生物及/或其培养提取物进行感染。
7.根据权利要求1-6任一项所述的预刺激干细胞的制备方法得到的预刺激干细胞。
8.权利要求7所述的预刺激干细胞在制备组织工程产品中的应用。
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