CN106701670A - 一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种用于动物间充质干细胞生物活性因子能力增强和间充质干细胞培养液中生物活性因子提取的方法，对间充质干细胞采用低氧培养技术进行培养，并且培养液选用不含动物源性成分的无血清培养液，促进动物间充质干细胞生物活性因子分泌的能力，并且使用无血清培养液，提取到的生物活性因子具有安全稳定无污染的优点，可使间充质干细胞生物活性因子提取物安全高效的应用于美容、保健、医疗、临床研究等各个领域。

Description

一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法

技术领域

本发明涉及一种用于增强动物间充质干细胞分泌生物活性因子能力的方法，以及涉及一种提取间充质干细胞培养液中生物活性因子的技术方法。

背景技术

间充质干细胞源于动物胚胎发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经从骨髓、脂肪、外周血、胎盘、脐带等多种组织中成功将其分离培养出来，这些组织成为间充质干细胞实验研究和临床应用的重要来源。

间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。

间充质干细胞具有多分化潜能，可产生多种生长因子、细胞因子、调节肽以及干细胞特异性归巢和营养因子等生物活性因子的细胞体系，所分泌的上述物质在局部形成复杂的生物活性因子网络，并受缺血、缺氧、生长因子、性别和激素调节。

现已证实，干细胞能表达、合成并分泌生长因子、细胞因子、调节肽及信号分子等多种生物活性因子，而且胚胎干细胞和成体干细胞以及不同来源的成体干细胞所产生的生物活性因子谱相似，这些生物活性因子调节代谢、免疫、细胞分化、增殖、迁移、营养、存活、凋亡和组织器官功能。这些研究结果提示干细胞是机体潜在的旁分泌/自分泌系统，植入后干细胞的分泌功能不仅直接影响植入干细胞自身的存活和分化，而且是干细胞移植发挥治疗效应的重要机制之一。

干细胞所分泌的生物活性物质在局部形成复杂的生物活性因子网络，并受缺血、缺氧、生长因子、性别和激素调节。其分泌功能影响移植干细胞自身及所在组织器官的结构、功能及其病理状态下的修复，是干细胞改善靶器官功能、抗凋亡、抗炎等疗效的重要机制之一。

体内各组织中的氧浓度存在较大差别，且生理、病理状态下均处于低氧环境，间充质干细胞移植后也将处于低氧微环境。然而，目前间充质干细胞在体外细胞培养时大多在常氧环境下进行，与体内正常组织低氧环境及病理状态下低氧状态相差较大.低氧环境对间充质干细胞生物学特性的影响也有一些研究进展。适度的低氧能够促进细胞增殖、迁移，抑制凋亡，影响细胞分化。

公开号为CN101461772A的发明专利提供了一种用于美容护肤的人干细胞分泌因子的制备方法。但是该专利方法所用的培养液含有胎牛血清成分。利用其技术提取的干细胞分泌生物活性因子量较少，且存在血清的安全隐患，因此应用上局限性较大，仅适用于美容护肤方面的应用，对于更深一步的医学治疗不适用。

发明内容

鉴于以上方法的缺点，本发明采取了较安全的无血清培养液对拟提取生物活性因子的干细胞进行培养，并且增强了间充质干细胞在体外培养过程中分泌生物活性因子的能力。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：制备原代动物间充质干细胞——无血清低氧培养、扩增——收集废弃间充质干细胞培养液——生物活性因子提取、浓缩、灭菌——高纯度干细胞生物活性因子提取液。

本发明选用无血清培养液培养间充质干细胞。

优选地，选用Invitrogen公司STEMPRO MSC SFM培养液培养间充质干细胞。

本发明采用低氧培养技术增加间充质干细胞分泌生物活性因子的能力。

优选地，低氧培养间充质干细胞所选用的氧气浓度为1％～2％。

本发明定期对培养的间充质干细胞的无血清培养液进行更换。

优选地，间充质干细胞每培养3-4天对培养液进行半量更换，并收集废弃培养液。

本发明对收集到的间充质干细胞废弃培养液进行生物活性因子的超滤和浓缩。

优选地，选用50KD中空纤维超滤柱进行超滤浓缩。

本发明对浓缩后的间充质干细胞生物活性因子提取液进行过滤除菌。

优选地，选用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌。

本发明的有益效果是：

1.对间充质干细胞的培养使用无血清培养液，避免了血清源性污染。

2.使用不含动物源性成分的无血清培养液培养间充质干细胞，所提取到的生物活性因子在应用上不受血清等动物源性成分的应用限制。

3.采用低氧培养技术，特异性地增加间充质干细胞分泌生物活性因子的能力，降低传统方法生产间充质干细胞生物活性因子的成本。

4.通过超滤除菌等步骤，保证了间充质干细胞生物活性因子提取物的安全性。

5.用本方法技术所得到的间充质干细胞生物活性因子提取液可应用于医学治疗、美容保健等各个领域。

附图说明

图1为显示利用本发明方法培养的脐带间充质干细胞培养液中SCF(干细胞因子)含量与常氧组的差异。

图2为显示利用本发明方法培养的脐带间充质干细胞培养液中SDF-1(基质细胞衍生因子)含量与常氧组的差异。

图3为显示利用本发明方法培养的脐带间充质干细胞VEGF(血管表皮生长因子)含量与常氧组的差异。

图4为显示利用本发明方法培养的脐带间充质干细胞bFGF(碱性纤维细胞生长因子)含量与常氧组的差异。

图5为显示利用本发明方法培养的脐带间充质干细胞G-CSF(粒细胞集落刺激因子)含量与常氧组的差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。

实施例1：

对人脐带间充质干细胞进行低氧培养。按如下步骤操作：(1)无菌条件下，将人脐带切成0.7mm³左右大小的组织块；(2)用Hank’s液冲洗后去除组织块上残留的血液并分离血管；(3)将处理后的组织块用胰蛋白酶消化，观察到细胞大部分分散时终止消化；(4)对消化后的物质过滤；(5)将所得滤液低速离心；(6)用Hank’s液对间充质干细胞混悬液离心清洗5次；(7)在离心后的滤液中加入细胞培养液，制成细胞混悬液。(8)在2％氧气浓度条件下，对脐带间充质干细胞进行培养。细胞传至第3代，用流式细胞仪检测培养所得细胞表面标志物，结果CD31、HLA-DR、CD34、CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性，证实为脐带间充质干细胞。

实施例2：

取人脐带间充质干细胞为实验材料。分为低氧浓度组(2％O₂、5％CO₂、93％N₂)和正常氧浓度组(20％O₂、5％CO₂、75％N₂)，具体操作如下：将人脐带间充质干细胞以1X10⁴/cm²接种到6孔培养板上，每孔中加入培养液2ml(STEMPRO MSC SFM)。将常氧组各培养板放入20％O₂浓度的培养箱中，低氧组各培养板放入2％O₂浓度的三气培养箱中培养，分别于培养后第24h、48h、72h，吸出相应培养孔的上清液，离心后分装于EP管中，标记后置于零下20度冰箱中待测。取冻存的人脐带间充质细胞的培养基上清液，并于常温下解冻融化。酶联免疫分析人脐带间充质干细胞细胞因子SCF、SDF-1、VEGF、bFGF、G-CSF的表达情况。结果如下：

低氧组培养基上清液中SCF含量在24h低于常氧组，且差异存在统计学意义，但随时间延长，两者差距逐渐缩小，48小时两组SCF含量差异无统计学意义，72h低氧组SCF含量较常氧组显著增高(图1)。

与常氧组比较，培养后24h低氧组SDF-1浓度较常氧组低而后低氧组SDF-1浓度随时间逐渐升高，并于72h明显高于常氧组(图2)。

与常氧组比较，低氧组VEGF浓度于培养后24h、48h两组VEGF浓度差异不明显，后随培养时间的延长逐渐升高，56h开始明显高于常氧组(图3)。

与常氧组比较，培养后24h两组bFGF浓度差异不显著，后随低氧组bFGF浓度不断升高，48h开始明显高于常氧组(图4)。

与常氧组比较，低氧组G-CSF浓度于72h明显高于常氧组(图5)。

实施例3：

将用本发明方法提取的脐带间充质干细胞生物活性因子或干细胞内生物活性物质加入到培养基中，并以此种浓度的培养基培养正常传代至第8代的脐带间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，以不加生物活性提取因子的培养基培养传至第8代的脐带间充质干细胞作为对照组。显微镜下观察细胞的生长状态，并于第3天收集细胞，与对照组相比，添加脐带间充质干细胞生物活性因子的组别，间充质干细胞增殖能力显著增强。

Claims (7)

1.一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法，其特征是间充质干细胞分泌生物活性因子能力增强的方法为采用低氧培养技术，提取间充质干细胞生物活性因子的方法为制备原代动物间充质干细胞——无血清低氧培养、扩增——收集废弃间充质干细胞培养液——生物活性因子提取、浓缩、灭菌——高纯度干细胞生物活性因子提取液。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于为人和/或动物来源间充质干细胞，来源组织可以为骨髓、脂肪、滑膜、脐带、胎盘等。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞，用于培养干细胞的培养液为无血清培养液(不含动物源成分)。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞低氧培养技术，其特征在于培养间充质干细胞时培养箱内的氧气浓度为1％～2％，小于常规细胞培养氧气浓度。

5.根据权利要求1所述的收集间充质干细胞废弃培养液，其特征在于每培养3～4天对培养液进行半量更换，并收集废弃培养液。

6.根据权利要求1所述的生物活性因子，其特征在于为间充质干细胞培养、扩增过程中分泌的生物活性因子。

7.根据权利要求1所述生物活性因子提取，其特征在于将废弃培养液经低温分离、50KD中空纤维超滤柱超滤和浓缩，进而得到间充质干细胞生物活性因子提取液。