CN106318904A

CN106318904A - 间充质干细胞条件培养基用于美容品领域的用途

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Publication number: CN106318904A
Application number: CN201510328786.4A
Authority: CN
Inventors: 姜宁
Original assignee: SHANGHAI LANACE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI LANACE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2035-06-15
Also published as: CN106318904B

Abstract

本发明涉及间充质干细胞条件培养基用于美容品的用途，优选用于皮肤的修复再生、美白、抗皱以及抗氧化的用途，其特征在于，所述间充质干细胞条件培养基通过以下方法制备：(1)获得间充质干细胞；(2)在完全培养基中培养步骤(1)中所得的间充质干细胞；(3)在基础培养基中培养步骤(2)中所得的间充质干细胞；(4)离心去除间充质干细胞，取上清液过滤，滤液即为间充质干细胞条件培养基。

Description

间充质干细胞条件培养基用于美容品领域的用途

技术领域

本发明涉及间充质干细胞条件培养基的用途。具体地，本发明涉及间充质干细胞条件培养基用于美容品领域的用途。

技术背景

众所周知，人体皮肤衰老是由内在因素和外在因素共同引起的。其中，内在因素是指人体生命周期中自然发生的功能退化现象，例如随着年龄增加细胞端粒逐渐缩短，而有氧细胞代谢所引起的氧化损伤却逐渐增多。具体表现为皮肤表皮层和真皮层变薄、网脊变平、血管网络减少、血管壁变薄、真皮层成纤维细胞数量减少和功能紊乱、胶原纤维合成速度逐渐减慢的同时胶原蛋白被基质金属蛋白酶(MMP-1)酶解的速度却在慢慢增加。引起皮肤衰老的外在因素包括生活方式、营养状况、环境因素等。其中，日光中紫外线所引起的光损伤(photodamage)是导致皮肤衰老的主要环境因素。随着生活水平的提高，人们对自身外表尤其是皮肤状况日益关注，要求也越来越高。而现代生物及医学的飞速发展，尤其是干细胞技术的出现，则使通过活化皮肤细胞、促进皮肤干细胞增殖、分化，修复或替代衰老的皮肤细胞，最终从根本上改变皮肤的生理机能变为可能。

干细胞(stem cell)是一种具有自我复制能力，并能在特定条件下分化成特殊细胞的未分化细胞。人体干细胞根据其发育阶段大体上可以分为两类：胚胎干细胞(embryonic stem cell)和成体干细胞(somatic stem cell)。胚胎干细胞来自胚囊的内层细胞团，成体干细胞则存在于成体的各个器官。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是一种多能成体干细胞，源于发育早期的中胚层和外胚层，于上世纪70年代由Friedenstein和他的同事首次在骨髓中发现。随后经过深入和广泛的研究，发现间充质干细胞存在于人体发生、发育过程的许多组织中，例如脐带、皮下脂肪组织、脑、肝、肺、牙髓等组织。间充质干细胞属于非终末分化细胞，能在体外特定的诱导条件下，分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。此外，间充质干细胞获得方便，不受伦理限制，且一般不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞的这种免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。

研究发现，间充质干细胞在各种疾病模型中具有有益效果(Gonzalez，M.A.et al.，Adipose-derived mesenchymal stem cellsalleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmuneresponse，Gastroenterology 136，978-989，2009；Semedo，P.et al.，Mesenchymal stem cells attenuate renal fibrosis through immunemodulation and remodeling properties in a rat remnant kidney model，Stem cells 27，3063-3073，2009；Kanazawa，H.et al.，Bonemarrow-derived mesenchymal stem cells ameliorate hepatic ischemiareperfusion injury in a rat model，PloS ONE 6：e19195，2011)。然而，Eggenhofer等表明，间充质干细胞经静脉注射后，其存活时间很短，24小时后，在血液、肝脏、骨髓、肺等组织或器官中已经检测不到活的间充质干细胞。此外，他们还发现，活性间充质干细胞在受伤器官和健康器官中的迁移并没有差异(Eggenhofer，E.et al.，Mesenchymalstem cells are short-lived and do not migrate beyond the lungs afterintravenous nfusion，Frontiers in Immunology Vol.3，Article 297，2012)。因此，间充质干细胞在疾病模型中的治疗缓和效果似乎并不依赖该细胞本身。

间充质干细胞在生长过程中能产生各种生物活性物质，如神经生长因子、基质红细胞源性生长因子、血管内皮细胞生长因子、表皮生因子、白细胞介素-6、白细胞介素-7、巨核细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子、干扰素等。目前的研究认为，这些生物活性物质使间充质干细胞具有免疫调节、抗炎效应及旁分泌活性等生物活性，从而对受体组织和器官进行调节控制，并达到对其进行生理性修复和再生等作用。

在体外培养间充质干细胞的过程中，该细胞会将上述生物活性物质分泌到培养基中，形成条件培养基(conditioned medium，CM)。已有研究表明，间充质干细胞的条件培养基对肺、肝、肾等损伤器官具有一定的修复治疗作用。例如，Poll等发现间充质干细胞的条件培养基在患有急性肝损伤的小鼠模型中抑制肝细胞死亡，刺激再生，为治疗爆发性肝衰竭提供了可能性(van Poll D.et al.，Mesenchymal stemcell-derived molecules directly modulate hepatocellular death andrefeneration in vitro and in vivo，Hepatology，Vol.47，No.5，1634-1643，2008)；Koppen等发现胚胎间充质干细胞的条件培养基在小鼠模型中减缓慢性肾病的进展，降低高血压和肾小球损伤(van Koppen A.et al.，Human embryonic mesenchymal stem cell-derived conditioned mediumrescues kidney function in rats with established chronic kidney disease，PloS ONE，6：e38746，2012)；Waszak等则发现骨髓间充质干细胞条件培养基能在新生小鼠中预防O₂诱导的慢性肺泡损伤(Waszak P.et al.，Preconditioning enhances the paracrine effect of mesenchymal stem cellsin preventing oxygen-induced neonatal lung injury in rats，Stem Cells andDevelopment，Vol.21，No.15，2789-2797，2012)。

然而，就本发明人所知，目前还没有将间充质干细胞条件培养基应用于美容品的技术。

发明内容

因此，本发明提供间充质干细胞条件培养基在美容品的用途，尤其是在用于皮肤的修复再生、美白、抗皱以及抗氧化等方面的用途。

在本发明的一个实施方案中，间充质干细胞条件培养基用以下方法制备：

1.获得间充质干细胞：提供健康的含有间充质干细胞的组织，洗去血细胞后，经第一种酶处理，然后离心、将沉淀悬浮于PBS、过滤，即可获得间充质干细胞。

2.在完全培养基中培养间充质干细胞：将步骤1中获得的间充质干细胞悬浮于完全培养基中，培养4-7天后，更换新的完全培养基再培养2-3天。然后经第二种酶消化后，将分散的细胞再次接种培养。

3.在基础培养基中培养间充质干细胞：将步骤2中的间充质干细胞接种至基础培养基中培养24-72小时。

4.获得间充质干细胞条件培养基：收集步骤3中的培养液，离心去除间充质干细胞，取上清液过滤，所得滤液即是本发明的干细胞条件培养基。

在本发明的一个实施方案中，所述间充质干细胞来源于脐带、胎盘、脂肪、骨髓、牙髓等组织。由于取材更为简单，操作方便，优选来源于脂肪的间充质干细胞(ADSCs)。

在本发明的一个实施方案中，步骤1中所述第一种酶是胶原酶(I型)。

在本发明的一个实施方案中，步骤1中所述过滤采用100μm的滤膜。

在本发明的一个实施方案中，步骤2中所述的完全培养基是DMEM或α-MEM(低糖)培养基。

在本发明的一个实施方案中，步骤2中所述的完全培养基含有10-20％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素、和100IU/ml链霉素。

在本发明的一个实施方案中，步骤2中更换培养基后再培养2-3天，直到细胞生长融合度达到约80％-90％，然后经酶消化。

在本发明的一个实施方案中，步骤2中所述第二种酶是胰蛋白酶。

在本发明的一个实施方案中，步骤2中的间充质干细胞连续传代培养至少三代(P3)以上，以获得相对较活跃的活性物质的分泌。优选P4。

在本发明的一个实施方案中，步骤3中所述的基础培养基是DMEM/F12(无血清)培养基。该步骤中，无血清培养基的使用可以增加细胞传代次数，并减少血清成分对条件培养基中活性分子的干扰。

在本发明的一个实施方案中，步骤2和步骤3中所述的培养是在温度为37℃且含有5％CO₂的细胞培养箱中培养。

在本发明的一个实施方案中，步骤4中所述过滤包含两次过滤，优选先用22μm的滤膜过滤，滤液再用20nm的滤膜过滤。

在本发明的一个实施方案中，获得的干细胞条件培养基可用以下方法保存：在上述步骤4所得滤液中加入赋形剂，无菌条件下分装，任选地用真空冷冻干燥机中冻干制成冻干粉，然后密封贮藏于-20℃。

在本发明的一个实施方案中，所述赋形剂是蔗糖。

在本发明的一个实施方案中，所述赋形剂的含量是4-25％(V/W)。

在本发明的一个实施方案中，所得条件培养基用缓冲溶液稀释后，直接涂抹于皮肤，优选再配合按摩或用超声波导入。

在本发明的一个实施方案中，所述缓冲液是浓度为0.05mol/L，pH为6.8-7.5，且包含0.9％NaCl和0.0015mol/LCaCl₂的磷酸缓冲液。

在本发明的一个实施方案中，所得条件培养基作为活性成分加入至美容品，如护肤品、化妆品中。

本发明还涉及包含上述间充质干细胞条件培养基的美容品，如护肤品、化妆品。所述美容品还可以包括本领域技术人员熟知的其他添加剂，如赋形剂、缓冲剂等。所述赋形剂是蔗糖，所述缓冲剂是浓度为0.05mol/L，pH为6.8-7.5，且包含0.9％NaCl和0.0015mol/LCaCl₂的磷酸缓冲液。其中，蔗糖作为赋形剂，还可以稳定本发明的条件培养基中活性物质，例如各种蛋白质的活性。

具体实施方式

实施例1：间充质干细胞条件培养基的制备

通过抽脂从年轻健康女性获得皮下脂肪组织，用磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)冲洗3-5次，洗去血细胞及组织碎片。于37℃用0.075％的胶原酶(I型)处理30-45分钟，然后在250-500g条件下离心约10分钟。将离心获得的细胞沉淀悬浮于PBS中，并用孔径为100μm的滤膜过滤。所得沉淀再次用PBS冲洗2-3次，即可获得脂肪间充质干细胞。

将获得的脂肪间充质干细胞悬浮于含有10-20％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素及100IU/ml链霉素的DMEM或α-MEM(低糖)的完全培养基中，然后以2-20x10⁵/cm²的细胞密度接种至培养瓶，并置于37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中培养4-7天。更换培养基以去除未贴壁的细胞，将贴壁的细胞再培养2-3天直到细胞生长融合度达到80％左右。用0.25％的胰蛋白酶-EDTA-PBS消化后，将培养细胞分散成单个细胞后，以4-5x10³/cm²的细胞密度接种到新的培养瓶。连续传代培养至少三代(P3)以上。

将连续培养至少三代以上的间充质干细胞以2-5x10⁵/cm²的细胞密度接种至含有DMEM/F12(无血清)的基础培养基，并置于37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中培养24-72小时。

然后收集培养液，在2000-4000rpm条件下离心10-30分钟，弃沉淀。离心上清液用22μm的滤膜过滤，滤液再用20nm的滤膜过滤，所得滤液即本发明所述的间充质干细胞条件培养基。

在无菌条件下取2000ml上述条件培养基，加入684g蔗糖(GR)，搅拌。待蔗糖完全溶解后，将条件培养基分装在西林瓶中(1ml/瓶)。直接密封贮藏于-20℃，此即为CM1。

另在无菌条件下取3000ml上述条件培养基，加入1026g蔗糖(GR)，搅拌。待蔗糖完全溶解后，将条件培养基分装在西林瓶中(1ml/瓶)。然后放入真空冷冻干燥机中冻干，并密封贮藏于-20℃，此即为CM2。

实施例2：去皱实验

实验组：取实施例1中制备的条件培养基CM1和CM2各一瓶，在常温溶化后，加入2mL 0.05mol/L且包含0.9％NaCl和0.0015mol/LCaCl₂的磷酸缓冲液(pH7.2)稀释。

对照组：用2mL 0.05mol/L且包含0.9％NaCl和0.0015mol/LCaCl₂的磷酸缓冲液(pH7.2)作为安慰剂。

实验方法：将45名35-45岁的女性随机分成3组，每组15人。分别用上述实验组的条件培养基(CM1和CM2)和对照组的安慰剂涂抹实验对象的眼眶周围，然后按摩涂液部位10分钟。每日两次，连续使用3个月。最后评价实验组和对照组的去皱效果，结果如下表1所示。

表1：去皱实验结果

	实验组CM1	实验组CM2	对照组
				效果显著	11人	10人	0人
效果一般	3人	5人	0人
				效果不明显	1人	0人	15人

其中，效果显著是指去皱效果达到75％以上，效果一般是指去皱效果在40％-60％之间，效果不明显是指去皱效果在30％以下。由表1的结果可知，条件培养基CM1和CM2均有显著的去皱效果。

实施例3：美白实验

在15名20-45岁肤色较深的女性的两个手臂外侧分别标记一个直径为3cm的圆圈。其中一个圆圈涂抹实施例2中的条件培养基CM1稀释液(实验组)，另一个圆圈涂抹实施例2中的安慰剂(对照组)。然后用超声波导入。每日1次，连续使用2个月。最后评价实验组和对照组的美白效果，结果如下表2所示。

表2：美白实验结果

	实验组	对照组
			效果显著	13人	0人
效果一般	2人	0人
			效果不明显	0人	15人

其中，效果显著是指美白效果达到75％以上，效果一般是指美白效果在40％-60％之间，效果不明显是指美白效果在30％以下。由表2的结果可知，条件培养基CM1具有显著的美白效果。

实施例4：修复实验

将30名用CO₂激光治疗皮肤的人员随机分成实验组和对照组，每组15人。实验组人员在CO₂激光处理后，对处理部位涂抹实施例2中的条件培养基CM1稀释液，每日两次，直至处理部位完全修复；对照组在CO₂激光处理后，处理部位不作任何涂抹处理。统计实验组和对照组中皮肤的修复情况，结果如下表3所示：

表3：修复实验结果

	实验组	对照组
			平均修复时间(天)	8	29

实施例5：抗氧化实验

用Benzie和Strain的FRAP法测定本发明的间充质干细胞条件培养基的抗氧化活性。该方法原理为：在酸性环境下，Fe³⁺-TPTZ(tripyridyltriazine)可被样品中的抗氧化物质还原成Fe²⁺-TPTZ，其呈现明显的蓝色，在593nm处有最大光吸收。然后根据吸光度的大小计算样品抗氧化活性的强弱。

具体实施步骤如下：取200μl实施例2中的条件培养基CM1稀释液，加入6ml FRAP工作液和600μl蒸馏水，震荡混匀，在37℃下反应10min后，于593nm处测定吸光值。重复测试5次。同样按照上述方法测定实例2中安慰剂的抗氧化活性。最后，以0.1-1.5mmol/LFeSO₄的标准溶液代替样品绘制标准曲线。样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO₄的毫摩尔数表示。试验结果测得CM1的平均抗氧化活性为0.92mmol/L FeSO₄，而安慰剂的平均抗氧化活性小于0.05mmol/L FeSO₄。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.间充质干细胞条件培养基用于美容品的用途，优选用于皮肤的修复再生、美白、抗皱以及抗氧化的用途，其特征在于，所述间充质干细胞条件培养基通过以下方法制备：

(1)获得间充质干细胞；

(2)在完全培养基中培养步骤(1)中所得的间充质干细胞；

(3)在基础培养基中培养步骤(2)中所得的间充质干细胞；

(4)离心去除间充质干细胞，取上清液过滤，滤液即为间充质干细胞条件培养基。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带、胎盘、脂肪、骨髓、牙髓等组织，优选来源于脂肪的间充质干细胞(ADSCs)。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述步骤(1)包括：提供健康的含有间充质干细胞的组织，洗去血细胞，经第一种酶处理，离心，将沉淀悬浮于PBS，过滤，即可获得间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述第一种酶是胶原酶(I型)。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述步骤(2)包括：将步骤(1)中获得的间充质干细胞悬浮于完全培养基中，培养4-7天直到细胞生长融合达到约80％-90％后，更换新的完全培养基再培养2-3天，经第二种酶消化后，将分散的细胞再次接种培养。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述完全培养基是DMEM或α-MEM(低糖)培养基。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述完全培养基包含10-20％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素。

8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述第二种酶是胰蛋白酶。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，间充质干细胞在完全培养基中连续传代培养至少三代以上。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基础培养基是无血清的DMEM/F12培养基。

11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述过滤包含两次过滤，优选先用22μm的滤膜过滤，滤液再用20nm的滤膜过滤。

12.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述间充质条件培养基加入赋形剂后，直接用缓冲液稀释1-10倍后涂抹于皮肤，或用真空冷冻干燥机冻干制成冻干粉后再用缓冲液稀释1-10倍后涂抹于皮肤。

13.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述赋形剂是蔗糖。

14.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述赋形剂的含量是4-25％(V/W)。

15.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述缓冲液是浓度为0.05mol/L，pH为6.8-7.5，且包含0.9％NaCl和0.0015mol/LCaCl₂的磷酸缓冲液。

16.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述条件培养基作为活性成分加入至美容品，如护肤品、化妆品中。

17.一种美容品，包含根据权利要求1所述的间充质干细胞条件培养基，所述美容品优选为护肤品、化妆品。

18.根据权利要求17所述的美容品，还包括一种选自赋形剂和缓冲剂的添加剂。