CN111454889A - 干细胞抗蓝光伤害功效组合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种干细胞抗蓝光伤害功效组合物的用途,其中所述干细胞抗蓝光伤害组合物含有10‑50%(v/v)的瓦顿式凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)条件培养基,且所述瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基是将瓦顿式凝胶间叶干细胞生长于含有人类碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)的培养基中2‑5日后,收集所述培养基,经离心并过滤后而获得。所述瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基可抑制蓝光造成的细胞伤害。
Description
技术领域
本发明是关于一种干细胞抗蓝光伤害功效组合物的用途,是利用瓦顿式凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)条件培养基降低蓝光对细胞的伤害。
背景技术
蓝光是指波长介于380-500nm的可见光,其为可见光中最接近紫外光的一段波段;蓝光的波长短、能量强,因此长期暴露于蓝光照射下会造成细胞伤害。目前因为3C电子产品使用率极高,且此类产品所发射的光线中又以蓝光的比例偏高,因此在常使用3C产品的状况下,使用者等同于暴露于大量的蓝光照射之中;由于蓝光能量强,因此在长期暴露下会对细胞产生伤害,例如对眼部的细胞造成伤害而导致黄斑部病变,此外目前亦有研究指出蓝光对于皮肤细胞亦会产生伤害。目前降低蓝光伤害的方法包含在3C产品荧幕上加装滤片以降低其散发出的蓝光,但并无任何可使用于细胞以降低蓝光对细胞伤害的组合物或保养品。
发明内容
本案发明人有鉴于现有抗蓝光组合物于实际实施时仍有不足,于是乃一本孜孜不倦的精神,并藉由其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐,而加以改善,并据此研创出本发明。
本发明是一种干细胞抗蓝光伤害功效组合物的用途,其中所述干细胞抗蓝光伤害功效组合物含有10-50%(v/v)的瓦顿式凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymalstem cell,简称WJMSC干细胞)条件培养基,且所述WJMSC干细胞条件培养基是将WJMSC干细胞生长于含有人类碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)的培养基中2-5日后,收集所述培养基,经离心并过滤后而获得。
于本发明的一实施例中,干细胞抗蓝光伤害功效组合物含有25-50%(v/v)的瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基。
于本发明的一实施例中,干细胞抗蓝光伤害功效组合物是抑制蓝光诱发的细胞死亡。
于本发明的一实施例中,干细胞抗蓝光伤害功效组合物是抑制蓝光与氧化压力共同诱发的细胞死亡。
于本发明的一实施例中,干细胞抗蓝光伤害功效组合物是抑制蓝光诱发的细胞内活性氧生成。
藉此,本案干细胞抗蓝光伤害功效组合物的用途,确实可有效抑制蓝光造成的细胞伤害。
附图说明
图1:WJMSC干细胞条件培养基抑制蓝光诱发细胞死亡分析图。
图2:WJMSC干细胞条件培养基抑制蓝光与氧化压力诱发细胞死亡的分析图(一)。
图3:WJMSC干细胞条件培养基抑制蓝光与氧化压力诱发细胞死亡的分析图(二)。
图4:WJMSC干细胞条件培养基抑制蓝光与氧化压力诱发细胞产生活性氧分子的分析图(一)。
图5:WJMSC干细胞条件培养基抑制蓝光与氧化压力诱发细胞产生活性氧分子的分析图(二)。
具体实施方式
本发明的目的及其结构功能上的优点,将依据以下图面所示的结构,配合具体实施例予以说明,俾使阅读者能对本发明有更深入且具体的了解。
本发明为一种干细胞抗蓝光伤害功效组合物的用途,其中所述干细胞抗蓝光伤害功效组合物含有10-50%(v/v)的WJMSC干细胞条件培养基,且所述WJMSC干细胞条件培养基是将WJMSC干细胞生长于含有人类碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,后简称bFGF)的培养基中2-5日后,收集所述培养基,经离心并过滤后而获得;本发明含有WJMSC干细胞条件培养基的抗蓝光伤害功效组合物具有抑制蓝光诱发的细胞死亡或是蓝光偕同氧化压力诱发的细胞死亡的功能,并可抑制细胞产生活性氧分子(reactiveoxygen species,ROS)。
此外,藉由下述具体实施例,可进一步证明本发明可实际应用的范围,但不意欲以任何形式限制本发明的范围。
一、瓦顿式凝胶干细胞条件培养基制备
(一)、瓦顿氏凝胶干细胞培养
瓦顿氏凝胶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell,后简称WJMSC干细胞)为BCRC编号BCRC H-WJ001的间叶干细胞,于进行一般继代培养时,是培养于含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum,简称FBS)与4ng/mL人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的α-MEM培养基中,当细胞的生长密度达到80%时便进行继代培养,且每2-3日,移除旧培养基并更换新鲜培养基。
(二)、WJMSC干细胞条件培养基制备
将WJMSC干细胞以5x 104cells/cm2的密度培养于10厘米培养盘,使用的培养基为含有10%FBS、4ng/mL bFGF的α-MEM培养基,并将细胞培养于37℃、提供5%二氧化碳(CO2)的细胞培养箱中;次日,移除培养基,并以1x PBS缓冲液清洗细胞3次,再于每一10厘米培养盘中加入10mL的不含PBS的基本培养基(含有4ng/mL bFGF的α-MEM培养基),并将细胞培养于37℃、提供5%二氧化碳(CO2)的细胞培养箱;培养48小时之后,收取细胞培养基,并将细胞培养基以4℃、转速2000rpm的条件离心10分钟,再将离心后的上清液以0.22μm的网筛过滤,所获得的滤液即为WJMSC干细胞条件培养基(conditioned medium,后简称为WJMSC-CM);将WJMSC-CM分装并保存于-20℃,解冻后立即使用,并不会再回冻。
二、WJMSC干细胞条件培养基抗蓝光伤害
本试验是使用纤维母细胞HS68细胞株作为测试对象,此细胞株购自财团法人食品工业研究所,编号为BCRC 60038,所使用的细胞株为第27-31继代的细胞株;HS68细胞株培养于含有10%FBS的DMEM培养基中,并于细胞生长密度达到8成时,进行细胞继代培养。
本试验所使用的蓝光光源为VitaLux LED灯具,其所提供的光线波长介于440nm-453nm,且以提供453nm波长的光线为主;接着再使用激光功率计(LaserCheck,Coherent)调整所传递光线的功率,所传递的蓝光功率约为55mW/cm2。
此外,本试验中会使用手持式远红外线温度计(IR Thermoter,Extech 42509)测量细胞照光区域于照光前与照光后的温度,并记录其变化;其中,本试验中细胞照光前后的温度皆不会大于31℃。
(一)、WJMSC干细胞条件培养基抑制蓝光诱发的细胞凋亡
将HS68细胞以1x104cells/well的数量培养于12孔细胞培养盘(每孔培养盘的底面积为3.8cm2),并培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中(定义为培养第0天);于培养后第3天与第4天进行蓝光照射步骤,照光前先移除细胞培养基,并将细胞培养于1x PBS缓冲液中后进行照蓝光照射,本试验使用的蓝光照射强度分别为(1)以33J/cm2照射10分钟,以及(2)以66J/cm2照射20分钟二种条件;蓝光照射步骤结束之后,以1x PBS缓冲液清洗细胞,移除1xPBS缓冲液并将细胞培养于含有1%FBS的DMEM培养基中;完成第二次蓝光照射步骤后(培养第4天),将HS68细胞培养于无血清的DMEM培养基中(即添加0%(v/v)WJMSC-CM的组别),或是含有25%(v/v)-50%(v/v)WJMSC-CM的DMEM培养基,并继续培养48小时;进行MTT试验以量测细胞的相对存活率。
MTT试验的实验步骤简述如下:移除细胞培养基,并以1x PBS缓冲液清洗细胞两次,并将细胞培养于1x PBS缓冲液中;加入0.5mg/mL的MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)试剂,并使细胞于37℃培养2小时;移除85%体积的培养基,加入300μL的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,简称DMSO),再于37℃作用10分钟;测量细胞于波长450nm的吸光值,并计算各组细胞的相对存活率。
请参见图1,是以负对照组(negative control,N.C.)组的细胞存活率为100%,以计算其他组细胞的相对存活率;其中37℃对照组为170%,而添加1mM H2O2的组别为确认细胞死亡状况的对照组;其中负对照组(NC)与37℃对照组的细胞皆无经过蓝光照射,但负对照组(NC)为培养于室温,而37℃对照组则是于避光处理后培养于37℃培养箱。请参见图1,37℃对照组的细胞存活率与负对照组(NC)相比,上升了约70%;照射33J/cm2蓝光的各组中,仅照射蓝光的细胞的存活率与负对照组相比无明显差异;而照射33J/cm2蓝光、并培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基者,细胞存活率与仅照射蓝光的组别相比有上升的趋势,并与NC组以及仅照射蓝光的组别具有显著差异(P<0.05)。照射66J/cm2蓝光的组别,其存活率与负对照组(N.C.)或是37℃对照组相比皆有显著下降的情形(P<0.05),表示蓝光确实会造成细胞伤害;而培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基并照射66J/cm2蓝光的细胞,与仅照射66J/cm2蓝光者相比,相对存活率亦有上升的情形。
(二)、CCK8细胞毒性测试
将HS68细胞HS68以2x 104cells/well的数量培养于96孔细胞培养盘,并培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中(定义为培养第0天);于培养后第1天与第2天进行蓝光照射步骤,照光前先移除细胞培养基,并将细胞培养于1x PBS缓冲液中后进行照蓝光照射,本试验使用的蓝光照射强度分别为(1)以33J/cm2照射10分钟,以及(2)以66J/cm2照射20分钟;蓝光照射步骤结束之后,以1x PBS缓冲液清洗细胞,移除1x PBS缓冲液并将细胞培养于含有1%FBS的DMEM培养基中;完成第二次蓝光照射步骤后,将HS68细胞培养于无血清的DMEM培养基中,或是含有25%(v/v)-50%(v/v)WJMSC-CM的DMEM培养基中,并加入1%DMSO或是不同剂量的H2O2,再继续培养24小时,处理H2O2的目的是模拟细胞处于氧化压力的状态下;进行CCK-8试验(Cell counting kit-8)以量测细胞的相对存活率。
CCK-8试验使用Sigma的CCK-8测试套组(产品编号:96992)进行,简述如下:将10μL的CCK-8试剂加入细胞中,将细胞培养于37℃,培养2小时之后测量细胞于波长450nm的吸光值。
请参见图2,为照光强度33J/cm2所获得的试验结果,其中对照组的细胞于照光后培养于10%FBS DMEM培养基,0%WJMSC-CM的细胞于照光后培养于0%FBS DMEM培养基;根据图2,仅照射蓝光的组别,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基组别的细胞存活率,与培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞相比并无显著差异;而于照射蓝光并处理1%DMSO的各组别中,培养于含有50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,相对存活率显著高于培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞(P<0.05);于照射蓝光与处理1mM H2O2的各组别中,各种处理的细胞的相对存活率并无显著差异,且都明显低于仅照射蓝光的各组细胞;于照射蓝光与处理100μM H2O2的各组别中,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,存活率与培养于0%WJMSC-CM的细胞相比有显著上升的趋势(P<0.05);于照射蓝光与处理10μMH2O2的各组别中,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,存活率与培养于0%WJMSC-CM的细胞相比亦有显著上升的情形(P<0.05)。
请参见图3,为照光强度66J/cm2所获得的试验结果,其中对照组的细胞于照光后培养于10%FBS DMEM培养基,0%WJMSC-CM的细胞系于照光后培养于0%FBS DMEM培养基;根据图3,仅照射蓝光的组别,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,存活率与培养于0%WJMSC-CM的细胞相比有显著上升的情形(P<0.05);而照射蓝光并处理1%DMSO的组别,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,相对存活率亦显著高于0%WJMSC-CM的细胞(P<0.05);照射蓝光与处理1mM H2O2的各组别中,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞的相对存活率略高于培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞,且都明显低于仅照射蓝光的细胞;于照射蓝光与处理100μM H2O2的各组别中,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞的相对存活率,与培养于0%WJMSC-CM的细胞相比有显著上升的情形(P<0.05);于照射蓝光与处理10μM H2O2的各组别中,培养于含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,相对存活率与培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞相比亦有显著上升的情形(P<0.05)。
根据图2与图3,可知本案的WJMSC-CM对于蓝光与氧化压力所造成的细胞伤害或死亡具有一定的细胞保护能力。
(三)、细胞内活性氧(ROS)生成试验
将HS68细胞以2x 104cells/well的数量培养于96孔细胞培养盘,并培养于37℃、5%CO2的细胞培养箱中(定义为培养第0天);于培养后第1天与第2天进行蓝光照射步骤,照光前先移除细胞培养液,并将细胞培养于1x PBS缓冲液中后进行照蓝光照射,本试验使用的蓝光照射强度分别为(1)以33J/cm2照射10分钟,以及(2)以66J/cm2照射20分钟;在第二次蓝光照射步骤之前,以1x PBS缓冲液清洗细胞数次,再将细胞培养于DMEM培养基中,加入H2DCFDA(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate)试剂,并于37℃中作用30分钟;再使用1x PBS缓冲液清洗细胞,并将细胞培养于1x PBS缓冲液中后,检测细胞于波长525nm的吸光值,再进行第二次蓝光照射步骤;完成第二次蓝光照射步骤后,将HS68细胞培养于无血清的DMEM培养基中,或是含有25%(v/v)-50%(v/v)WJMSC干细胞条件培养基的DMEM培养基,并加入1%DMSO或是不同剂量的H2O2,处理H2O2的目的在于模拟细胞的氧化压力;培养后30分钟,再测量一次细胞于波长525nm的荧光值。
H2DCFDA试剂为一种活性氧族的细胞渗透性指示剂,进入细胞之后,会被细胞内的酯酶水解并生成不具荧光的DCFH分子,且DCFH分子并无法通过细胞膜,因此可停留于细胞内;细胞内的活性氧分子(reactive oxygen species,简称ROS)会使DCFH氧化,转化成具有荧光的DCF分子,因此可藉由侦测细胞于波长525nm的荧光值以测量细胞内活性氧分子的含量,当测得的荧光值越高,表示细胞内的活性氧分子含量越高。
本试验中以负对照组作为基准,以计算各组别中的相对荧光强度;其中负对照组(NC)与37℃对照组的细胞皆无经过蓝光照射,但负对照组(NC)为培养于室温,而37℃对照组则是于避光处理后培养于37℃培养箱。请参见图4、表一至表三,为蓝光照射强度为33J/cm2的试验组;于无蓝光照射的组别中,处理1mM H2O2确实会使细胞内的ROS含量上升;在仅照射蓝光与蓝光合并处理1%DMSO的组别中,培养于含有25%(v/v)或是50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,其细胞内的ROS含量会显著低于培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞(P<0.05);又,于蓝光照射合并处理不同浓度H2O2的各组别中,培养于含有25%(v/v)或是50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,其细胞内的ROS含量亦显著低于培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞(P<0.05)。
表一
表二
表三
请再参见图5、表一以及表四至表五,为蓝光照射强度为66J/cm2的试验组;于无蓝光照射的组别中,处理1mM H2O2的组别中,细胞内的ROS含量确实有上升的情形;在仅照射蓝光与蓝光合并处理1%DMSO的组别中,培养于含有25%(v/v)或是50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,其细胞内的ROS含量会显著低于培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞(P<0.05);又,于蓝光照射合并处理不同浓度H2O2的各组别中,培养于含有25%(v/v)或是50%(v/v)WJMSC-CM培养基的细胞,其细胞内的ROS含量亦显著低于培养于0%(v/v)WJMSC-CM的细胞(P<0.05)。
表四
表五
根据以上实验,波长介于440nm-453nm的蓝光确实会对细胞造成伤害,包含抑制细胞生长或导致细胞死亡,或是提高细胞内活性氧分子(ROS)的含量;又在合并蓝光照射与氧化压力下,细胞亦会受到伤害而有死亡等状况,且细胞内活性氧分子亦会明显上升;但是,若将细胞培养于含有10v/v%以上WJMSC-CM的培养基中,则可以显著抑制细胞死亡的情形以及降低细胞内ROS的含量,表示本案的WJMSC-CM确实具有保护细胞免于蓝光伤害的功效。
综上所述,本发明的瓦顿式凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymalstem cell)条件培养基于制备抗蓝光伤害组合物的用途,的确能藉由上述所揭露的实施例,达到所预期的使用功效。
Claims (5)
1.一种瓦顿式凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)条件培养基于制备抗蓝光伤害功效组合物的用途,其中所述抗蓝光伤害功效组合物含有10-50%(v/v)的瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基,且所述瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基是将瓦顿式凝胶间叶干细胞生长于含有人类碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor)的培养基中2-5日后,收集所述培养基,经离心并过滤后而获得。
2.如权利要求1所述的用途,其中所述抗蓝光伤害功效组合物含有25-50%(v/v)的瓦顿式凝胶间叶干细胞条件培养基。
3.如权利要求1所述的用途,其中所述抗蓝光伤害功效组合物是抑制蓝光诱发的细胞死亡。
4.如权利要求1所述的用途,其中所述抗蓝光伤害功效组合物是抑制蓝光与氧化压力共同诱发的细胞死亡。
5.如权利要求1所述的用途,其中所述抗蓝光伤害功效组合物是抑制蓝光诱发的细胞活性氧生成。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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