TWI775992B - 幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途，其中該抗藍光傷害組成物含有10-50%(v/v)之瓦頓式凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)條件培養基，且該瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基係將瓦頓式凝膠間葉幹細胞生長於含有人類鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)之一培養基中2-5日後，收集該培養基，經離心並過濾後而獲得；該瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基可抑制藍光造成之細胞傷害。
Description
本發明係關於一種幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途，係利用瓦頓式凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)條件培養基降低藍光對細胞之傷害。
藍光係指波長介於380-500nm之可見光，其為可見光中最接近紫外光的一段波段；藍光的波長短、能量強，因此長期暴露於藍光照射下會造成細胞傷害。目前因為3C電子產品使用率極高，且此類產品所發射的光線中又以藍光的比例偏高，因此在常使用3C產品的狀況下，使用者等同於暴露於大量的藍光照射之中；由於藍光能量強，因此在長期暴露下會對細胞產生傷害，例如對眼部的細胞造成傷害而導致黃斑部病變，此外目前亦有研究指出藍光對於皮膚細胞亦會產生傷害。目前降低藍光傷害的方法包含在3C產品螢幕上加裝濾片以降低其散發出的藍光，但並無任何可使用於細胞以降低藍光對細胞傷害的組成物或保養品。
今，發明人有鑑於現有抗藍光組成物於實際實施時仍有不足，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明係一種幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途，其中該抗藍光傷害組成物含有10-50%(v/v)之瓦頓式凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell，簡稱WJMSC幹細胞)條件培養基，且該WJMSC幹細胞條件培養基係將WJMSC幹細胞生長於含有人類鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)之一培養基中2-5日後，收集該培養基，經離心並過濾後而獲得。
於本發明之一實施例中，抗藍光傷害組成物含有25-50%(v/v)之瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基
於本發明之一實施例中，抗藍光傷害組成物係抑制藍光誘發之細胞死亡。
於本發明之一實施例中，抗藍光傷害組成物係抑制藍光與氧化壓力共同誘發之細胞死亡。
於本發明之一實施例中，抗藍光傷害組成物係抑制藍光誘發之細胞內活性氧生成。
藉此，本案幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途，確實可有效抑制藍光造成之細胞傷害。
第一圖：WJMSC幹細胞條件培養基抑制藍光誘發細胞死亡分析圖。
第二圖：WJMSC幹細胞條件培養基抑制藍光與氧化壓力誘發細胞死亡分析圖(一)。
第三圖：WJMSC幹細胞條件培養基抑制藍光與氧化壓力誘發細胞死亡分析圖(二)。
第四圖：WJMSC幹細胞條件培養基抑制藍光與氧化壓力誘發細胞產生活性氧分子分析圖(一)。
第五圖：WJMSC幹細胞條件培養基抑制藍光與氧化壓力誘發細胞產生活性氧分子分析圖(二)。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明為一種幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途，其中該抗藍光傷害組成物含有10-50%(v/v)之WJMSC幹細胞條件培養基，且該WJMSC幹細胞條件培養基係將WJMSC幹細胞生長於含有人類鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，後簡稱bFGF)之一培養基中2-5日後，收集該培養基，經離心並過濾後而獲得；本發明含有WJMSC幹細胞條件培養基之抗藍光傷害組成物具有抑制抑制藍光誘發之細胞死亡，或是藍光偕同氧化壓力誘發
之細胞死亡，並可抑制細胞產生活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
一、瓦頓式凝膠幹細胞條件培養基制備
(一)、瓦頓氏凝膠幹細胞培養
瓦頓氏凝膠幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell，後簡稱WJMSC幹細胞)為BCRC編號BCRC H-WJ001之間葉幹細胞，於進行一般繼代培養時，係培養於含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，簡稱FBS)與4ng/mL人類鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)之α-MEM培養基中，當細胞的生長密度達到80%時便進行繼代培養，且每2-3日，移除舊培養基並更換新鮮培養基。
(二)、WJMSC幹細胞條件培養基製備
將WJMSC幹細胞以5 x 104cells/cm2之密度培養於10公分培養盤，使用之培養基為含有10% FBS、4ng/mL bFGF之α-MEM培養基，並將細胞培養於37℃、提供5%二氧化碳(CO2)之細胞培養箱中；次日，移除培養基，並以1 x PBS緩衝液清洗細胞3次，再於每一10公分培養盤中加入10mL之不含FBS的基本培養基(含有4ng/mL bFGF之α-MEM培養基)，並將細胞培養於37℃、提供5%二氧化碳(CO2)之細胞培養箱；培養48小時之後，收取細胞培養基，並將細胞培養基以4℃、轉速2000rpm之條件離心10分鐘，再將離心後之上清液以0.22μm之網篩過濾，所獲得之濾液即為
WJMSC幹細胞條件培養基(conditioned medium，後簡稱為WJMSC-CM)；將WJMSC-CM分裝並保存於-20℃，解凍後立即使用，並不會再回凍。
二、WJMSC幹細胞條件培養基抗藍光傷害
本試驗係使用纖維母細胞HS68細胞株作為測試對象，此細胞株係購自財團法人食品工業研究所，編號為BCRC 60038，所使用之細胞株為第27-31繼代之細胞株；HS68細胞株係培養於含有10% FBS之DMEM培養基中，並於細胞生長密度達到8成時，進行細胞繼代培養。
本試驗所使用之藍光光源為VitaLux LED燈具，其所提供之光線波長介於440nm-453nm，且以提供453nm波長之光線為主；接著再使用雷射功率計(LaserCheck，Coherent)調整所傳遞光線的功率，所傳遞的藍光功率約為55mW/cm2。
此外，本試驗中會使用手持式遠紅外線溫度計(IR Thermoter，Extech 42509)測量細胞照光區域於照光前與照光後的溫度，並記錄其變化；其中，本試驗中細胞照光前後之溫度皆不會大於31℃。
(一)、WJMSC幹細胞條件培養基抑制藍光誘發之細胞凋亡
將HS68細胞以1x104cells/well之數量培養於12孔細胞培養盤(每孔培養盤之底面積為3.8cm2)，並培養於37℃、5%CO2之細胞培養箱中(定義為培養第0天)；於培養後第3天與第4天進行藍光照射步驟，照光前先移除細胞培養基，並將細胞培養於1 x PBS緩衝液中後進行照藍光照射，本試驗使用的藍光照射強度分別為(1)以33J/cm2照射10分鐘，以及(2)以66J/cm2照射20分鐘二種條件；藍光
照射步驟結束之後，以1 x PBS緩衝液清洗細胞，移除1 x PBS緩衝液並將細胞培養於含有1% FBS之DMEM培養基中；完成第二次藍光照射步驟後(培養第4天)，將HS68細胞培養於無血清之DMEM培養基中(即添加0%(v/v)WJMSC-CM之組別)，或是含有25%(v/v)-50%(v/v)WJMSC-CM的DMEM培養基，並繼續培養48小時；進行MTT試驗以量測細胞的相對存活率。
MTT試驗的實驗步驟簡述如下：移除細胞培養基，並以1 x PBS緩衝液清洗細胞兩次，並將細胞培養於1 x PBS緩衝液中；加入0.5mg/mL之MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)試劑，並使細胞於37℃培養2小時；移除85%體積的培養基，加入300μL之二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)，再於37℃作用10分鐘；測量細胞於波長450nm之吸光值，並計算各組細胞的相對存活率。
請參見第一圖，係以負對照組(negative control，N.C.)組的細胞存活率為100%，以計算其他組細胞的相對存活率；其中37℃對照組為170%，而添加1mM H2O2之組別為確認細胞死亡狀況的對照組；其中負對照組(NC)與37℃對照組之細胞皆無經過藍光照射，但負對照組(NC)為培養於室溫，而37℃對照組則是於避光處理後培養於37℃培養箱。請參見第一圖，37℃對照組的細胞存活率與負對照組(NC)相比，上升了約70%；照射33J/cm2藍光之各組中，僅照射藍光之細胞的存活率與負對照組相比無明顯差異；而照射33J/cm2藍光、並培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基者，細胞存活率與僅照射藍光之組別相比有上升之趨勢，並與NC組以及僅照射藍光之組別具有顯著差異(P<0.05)。照射66
J/cm2藍光之組別，其存活率與負對照組(N.C.)或是37℃對照組相比皆有顯著下降的情形(P<0.05)，表示藍光確實會造成細胞傷害；而培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基並照射66J/cm2藍光之細胞，與僅照射66J/cm2藍光者相比，相對存活率亦有上升之情形。
(二)、CCK8細胞毒性測試
將HS68細胞HS68以2 x 104cells/well之數量培養於96孔細胞培養盤，並培養於37℃、5%CO2之細胞培養箱中(定義為培養第0天)；於培養後第1天與第2天進行藍光照射步驟，照光前先移除細胞培養基，並將細胞培養於1 x PBS緩衝液中後進行照藍光照射，本試驗使用的藍光照射強度分別為(1)以33J/cm2照射10分鐘，以及(2)以66J/cm2照射20分鐘；藍光照射步驟結束之後，以1 x PBS緩衝液清洗細胞，移除1 x PBS緩衝液並將細胞培養於含有1% FBS之DMEM培養基中；完成第二次藍光照射步驟後，將HS68細胞培養於無血清之DMEM培養基中，或是含有25%(v/v)-50%(v/v)WJMSC-CM的DMEM培養基中，並加入1% DMSO或是不同劑量之H2O2，再繼續培養24小時，處理H2O2之目的係為模擬細胞處於氧化壓力之狀態下；進行CCK-8試驗(Cell counting kit-8)以量測細胞的相對存活率。
CCK-8試驗係使用Sigma之CCK-8測試套組(產品編號：96992)進行，簡述如下：將10μL之CCK-8試劑加入細胞中，將細胞培養於37℃，培養2小時之後測量細胞於波長450nm之吸光值。
請參見第二圖，係為照光強度33J/cm2所獲得之試驗結果，其中對照組之細胞係於照光後培養於10% FBS DMEM培養基，0%
WJMSC-CM之細胞係於照光後培養於0% FBS DMEM培養基；根據第二圖，僅照射藍光之組別，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基組別之細胞存活率，與培養於0%(v/v)WJMSC-CM之細胞相比並無顯著差異；而於照射藍光並處理1% DMSO之各組別中，培養於含有50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，相對存活率顯著高於培養於0%(v/v)WJMSC-CM之細胞(P<0.05)；於照射藍光與處理1mM H2O2之各組別中，各種處理之細胞的相對存活率並無顯著差異，且都明顯低於僅照射藍光之各組細胞；於照射藍光與處理100μM H2O2之各組別中，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，存活率與培養於0% WJMSC-CM之細胞相比有顯著上升的趨勢(P<0.05)；於照射藍光與處理10μM H2O2之各組別中，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，存活率與培養於0% WJMSC-CM之細胞相比亦有顯著上升的情形(P<0.05)。
請參見第三圖，係為照光強度66J/cm2所獲得之試驗結果，其中對照組之細胞係於照光後培養於10% FBS DMEM培養基，0% WJMSC-CM之細胞係於照光後培養於0% FBS DMEM培養基；根據第三圖，僅照射藍光之組別，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，存活率與培養於0% WJMSC-CM之細胞相比有顯著上升的情形(P<0.05)；而照射藍光並處理1% DMSO之組別，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，相對存活率亦顯著高於0% WJMSC-CM之細胞(P<0.05)；照射藍光與處理1mM H2O2之各組別中，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞的相對存活率略高於培養於
0%(v/v)WJMSC-CM之細胞，且都明顯低於僅照射藍光之細胞；於照射藍光與處理100μM H2O2之各組別中，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞的相對存活率，與培養於0% WJMSC-CM之細胞相比有顯著上升的情形(P<0.05)；於照射藍光與處理10μM H2O2之各組別中，培養於含有25%(v/v)或50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，相對存活率與培養於0%(v/v)WJMSC-CM之細胞相比亦有顯著上升的情形(P<0.05)。
根據第二圖與第三圖，可知本案之WJMSC-CM對於藍光與氧化壓力所造成的細胞傷害或死亡具有一定的細胞保護能力。
(三)、細胞內活性氧(ROS)生成試驗
將HS68細胞以2 x 104cells/well之數量培養於96孔細胞培養盤，並培養於37℃、5%CO2之細胞培養箱中(定義為培養第0天)；於培養後第1天與第2天進行藍光照射步驟，照光前先移除細胞培養液，並將細胞培養於1 x PBS緩衝液中後進行照藍光照射，本試驗使用的藍光照射強度分別為(1)以33J/cm2照射10分鐘，以及(2)以66J/cm2照射20分鐘；在第二次藍光照射步驟之前，以1 x PBS緩衝液清洗細胞數次，再將細胞培養於DMEM培養基中，加入H2DCFDA(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate)試劑，並於37℃中作用30分鐘；再使用1 x PBS緩衝液清洗細胞，並將細胞培養於1 x PBS緩衝液中後，檢測細胞於波長525nm之吸光值，再進行第二次藍光照射步驟；完成第二次藍光照射步驟後，將HS68細胞培養於無血清之DMEM培養基中，或是含有25%(v/v)-50%(v/v)WJMSC幹細胞條件培養基的DMEM培養基，並加入1% DMSO或是不同劑
量之H2O2，處理H2O2之目的係在於模擬細胞之氧化壓力；培養後30分鐘，再測量一次細胞於波長525nm之螢光值。
H2DCFDA試劑為一種活性氧族的細胞滲透性指示劑，進入細胞之後，會被細胞內的酯酶水解並生成不具螢光的DCFH分子，且DCFH分子並無法通過細胞膜，因此可停留於細胞內；細胞內的活性氧分子(reactive oxygen species，簡稱ROS)會使DCFH氧化，轉化成具有螢光的DCF分子，因此可藉由偵測細胞於波長525nm之螢光值以測量細胞內活性氧分子的含量，當測得之螢光值越高，表示細胞內的活性氧分子含量越高。
本試驗中係以負對照組作為基準，以計算各組別中的相對螢光強度；其中負對照組(NC)與37℃對照組之細胞皆無經過藍光照射，但負對照組(NC)為培養於室溫，而37℃對照組則是於避光處理後培養於37℃培養箱。請參見第四圖、表一至表三，為藍光照射強度為33J/cm2之試驗組；於無藍光照射的組別中，處理1mM H2O2確實會使細胞內的ROS含量上升；在僅照射藍光與藍光合併處理1%DMSO的組別中，培養於含有25%(v/v)或是50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，其細胞內的ROS含量會顯著低於培養於0%(v/v)WJMSC-CM之細胞(P<0.05)；又，於藍光照射合併處理不同濃度H2O2之各組別中，培養於含有25%(v/v)或是50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，其細胞內的ROS含量亦顯著低於培養於0%(v/v)WJMSC-CM之細胞(P<0.05)。
請再參見第五圖、表一以及表四至表五，為藍光照射強度為66J/cm2之試驗組；於無藍光照射的組別中，處理1mM H2O2之組別中，細胞內的ROS含量確實有上升之情形；在僅照射藍光與藍光合併處理1%DMSO的組別中，培養於含有25%(v/v)或是50%(v/v)WJMSC-CM培養基之細胞，其細胞內的ROS含量會顯著低於培養於0%(v/v)WJMSC-CM之細胞(P<0.05)；又，於藍光照射合併處理不同濃度H2O2之各組別中，培養於含有25%(v/v)或是50%(v/v)
WJMSC-CM培養基之細胞，其細胞內的ROS含量亦顯著低於培養於0%(v/v)WJMSC-CM之細胞(P<0.05)。
根據以上實驗，波長介於440nm-453nm之藍光確實會對細胞造成傷害，包含抑制細胞生長或導致細胞死亡，或是提高細胞內活性氧分子(ROS)的含量；又在合併藍光照射與氧化壓力下，細胞亦會受到傷害而有死亡等狀況，且細胞內活性氧分子亦會明顯上升；但是，若將細胞培養於含有10v/v%以上WJMSC-CM的培養基中，則可以顯著抑制細胞死亡的情形以及降低細胞內ROS的含量，表示本案之WJMSC-CM確實具有保護細胞免於藍光傷害的功效。
綜上所述，本發明之幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇
Claims (4)
- 一種瓦頓式凝膠間葉幹細胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cell)條件培養基之用途，其用於製備抗藍光傷害組成物，以降低藍光誘發之纖維母細胞死亡，其中該抗藍光傷害組成物含有25-50%(v/v)之瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基，且該瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基係將瓦頓式凝膠間葉幹細胞生長於含有4ng/mL人類鹼性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor)之一培養基中2-5日後，收集該培養基，經離心並過濾後而獲得。
- 如請求項1所述之用途，其中該瓦頓式凝膠間葉幹細胞條件培養基，係將5 x 104cells/cm2的瓦頓式凝膠間葉幹細胞生長於含有4ng/mL人類鹼性成纖維細胞生長因子之培養基2-5日，收集該培養基，經離心並過濾後而獲得。
- 如請求項1所述之用途，其中該抗藍光傷害組成物係抑制藍光與氧化壓力共同誘發之細胞死亡。
- 如請求項1所述之用途，其中該抗藍光傷害組成物係抑制藍光誘發之細胞活性氧生成。
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| TW107142518A TWI775992B (zh) | 2018-11-28 | 2018-11-28 | 幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途 |
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| TW107142518A TWI775992B (zh) | 2018-11-28 | 2018-11-28 | 幹細胞於製備抗藍光傷害組成物之用途 |
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| TW202020143A TW202020143A (zh) | 2020-06-01 |
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Citations (1)
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| TW201427713A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-07-16 | Growgene Biotech Inc | 幹細胞條件培養基抑制氧化作用達到皮膚抗老化之用途 |
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2018
- 2018-11-28 TW TW107142518A patent/TWI775992B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201427713A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-07-16 | Growgene Biotech Inc | 幹細胞條件培養基抑制氧化作用達到皮膚抗老化之用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Song, Jiayin, et al. "The photocytotoxicity of different lights on mammalian cells in interior lighting system." Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 117 (2012): 13-18. * |
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| TW202020143A (zh) | 2020-06-01 |
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