KR101773956B1 - 귤피추출물을 포함하는 지방줄기세포 배양용 배지 조성물 및 배양방법 - Google Patents

Abstract

귤피추출물을 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포 증식용 배지 조성물을 제공한다. 본 발명의 귤피추출물을 유효성분으로 함유한 배지 조성물은 세포 증식 촉진에 있어서 시너지 효과를 가져오며, 동물성 성장촉진인자의 대체제로서의 활용이 가능하다.

Description

귤피추출물을 포함하는 지방줄기세포 배양용 배지 조성물 및 배양방법{ADIPOSE DERIVED STEM CELL CULTURE MEDIUM COMPOSITIONS CONTAINING THE CITRUS PELL EXTRACT AND ADIPOSE DERIVED STEM CELL CULTURE METHOD}

본 발명은 귤피추출물을 포함하는 지방 줄기세포 증식 배양용 배지 조성물 및 배양방법에 관한 것이다.

줄기세포는 자기 재생능력 및 적합한 신호에 의해 자극되면 특정 세포 또는 기관으로 분화될 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 이유에서 줄기세포는 재생의학 분야에서 큰 관심을 받고 있다. 그러나 배아줄기세포의 의학적 이용은 윤리적 문제, 면역 부적합성 및 제어되지 않는 종양 또는 기형종의 생성을 유발할 수 있고, 성제줄기세포는 윤리적 문제 및 면역 거부반응을 피할 수 있지만, 분화능이 제한적이라는 단점이 있다(Florian et al.,2007). 성체줄기세포는 조직 보수 및 줄기세포와 비대칭 세포 분할에 의해 분화된 세포간의 평형을 유지하는데 관여한다.

성체줄기세포는 미분화 상태로 자가증식하고 다른 조직의 세포로 다중 분화될 수 있는 세포로 우리 몸에 많은 조직에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 그 중 가장 먼저 알려진 것은 골수에서 유래하였다. 이후 탯줄혈액 뿐만 아니라 말초혈액 에서 분리되며 또한 태반, 피부, 신경조직 등 우리 몸 어느 곳에서나 성체줄기세포가 존재한다. 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC)는 많은 연구를 통해 간엽줄기세포로 확인되어 왔으나 채취 시 동통, 많은 양의 줄기세포 획득이 불가한 단점이 있으며(Zuk PA et al., 2001), 탯줄혈액 등은 적기에 얻기 힘들며 자가조직으로 사용하기에는 장기간의 보관 등의 문제점을 갖고 있다(Kern S et al.,2006). 최근 지방조직에서도 줄기세포가 존재한다는 사실의 기원은 1992년 인체 지방 조직에서 분리한 SVF 층에서 von Willebrand factor (vWF), a-smooth muscle cell actin과 cytokeratin에 염색된 세포인 미세혈관내피세포를 발견한 이후(Young C et al.,1992) 최근 연구에서 줄기세포와 유사한 형태의 세포가 이들 조직 내에 존재하며 이들 세포가 다중분화 능력을 가지는 줄기세포임을 확인하였다(Zuk PA et al., 2001, Gronthos S et al.,2001).

지방조직은 배아의 중배엽에서 기원하며, 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, 지방줄기세포는 배양시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 골수줄기세포와 같이 다양한 세포로의 분화가 가능하다는 것이 증명되었다 중배엽조직의 줄기세포는 뼈, 연골, 근육, 지방 조직을 생성할 수 있다.(Strem BM et al., 2005).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있는 물질로서 귤피추출물로부터 줄기세포의 증식을 촉진할 수 있는 효과가 있음을 밝혀냄으로써, 이를 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 배지 조성물을 완성하였다.

본 발명의 목적은 귤피추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 귤피추출물을 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포 증식용 배지 조성물을 제공한다.

상기 지방 줄기세포의 증식용 배양 배지는 10% FBS가 포함된 DMEM 일반배지에 귤피추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 귤피추출물의 농도는 0.1~50 ㎍/㎖ 인 것을 특징으로 한다.

상기 귤피추출물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 지방 줄기세포의 배양 방법은, 증류수에 귤피가루를 넣고 열수추출하고 1㎎/㎖의 농도가 되도록 귤피추출물 스톡(stock)을 제조하는 단계;

조직배양액 기본배지에 상기 귤피추출물 스톡을 혼합하여 귤피추출물을 포함하는 지방줄기세포 배양배지를 제조하는 단계;

공여자 유래 지방조직을 collagenase 처리하여 기저-혈액세포분획(Stromal Vascular Fraction : SVF) 을 분리하는 단계;

플라스크에서 10% FBS가 포함된 DMEM 일반배지에 상기 세포를 플레이팅하는 단계;

상기 플라스크에서 세포가 80% 이상 자랐을 때 트립신 EDTA 를 처리하여 플라스크 바닥으로부터 세포를 떼어내고 계대배양하는 단계; 및

상기 계대배양 후 제 2계대, 제 3계대 세포를 상기 귤피추출물을 포함하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함한다.

상기 지방 줄기세포 배양 배지에서 귤피추출물의 농도는 0.1 ~ 50 ㎍/㎖ 가 바람직하다.

본 발명의 귤피추출물을 유효성분으로 함유한 배지 조성물은 세포 증식 촉진에 있어서 시너지 효과를 가져오며, 동물성 성장촉진인자의 대체제로서의 활용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 귤피추출물의 농도에 따른 생존세포 증식률 비교 그래프.
도 2는 본 발명의 귤피추출물의 농도에 따른 세포증식 확인 실험 그래프,
도 3은 계대배양 후 각 세포의 morphology 관찰 사진,
도 4는 본 발명의 귤피추출물의 농도에 따른 세포 생존율 비교 그래프,
도 5는 유세포 분석 시험 결과 그래프이다.

이하, 실시예 및 도면을 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 귤피추출물 제조

증류수에 귤피가루 100g 넣고 열수추출하여 귤피추출물 만들고 1㎎/㎖의 농도가 되도록 귤피추출물 stock 제조하였다.

2. 줄기세포배양 방법

건강한 공여자 유래 지방조직을 collagenase 처리하여 기저-혈액세포분획 (Stromal Vascular Fraction : SVF) 을 분리하고, 세포수에 적당한 플라스크를 선택하여 10% FBS가 포함된 DMEM 일반배지에 세포를 플레이팅 하였다.(0계대)

세포가 플라스크에 80%이상 자라면 트립신 EDTA를 처리하여 플라스크 바닥으로부터 세포를 떼어낸 후 계대배양하였다.

위와 같은 계대배양의 과정을 거쳐 2계대, 3계대 세포를 얻은 후 각각의 세포에 귤피추출물 0, 0.1, 1, 10, 30, 50, 100 ㎍/㎖를 처리하여 일반배지와 귤피추출물이 들어간 배지에서의 세포변화를 관찰하였다.

<실험예>

실험예 1: 귤피추출물 농도에 따른 지방줄기세포 증식률 비교

- 대조군은 기존의 지방줄기세포 배양 배지: 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 사용하였다.

- 실험군은 기존의 지방줄기세포 배양 배지에 귤피추출물 0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 10㎍/㎖, 30㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 의 농도로 첨가하였다.

- 대조군 및 실험군은 2계대, 3계대를 거친 지방줄기세포를 각각 사용하여 생존 세포수 비교하였다.(5일배양)

귤피추출물이 농도별로 처리된 각 그룹별로 T-225 (cm²) 플라스크에 지방줄기세포를 seeding 하고 5일간 배양하여 2계대와 3계대의 세포를 수집하고 세포수를 확인하였다. 그 결과, 2계대와 3계대의 세포 사이에서는 큰 차이점이 없으나 농도 의존적으로 세포수가 증가하다가 50 ㎍/㎖ ~ 100 ㎍/㎖ 사이에서 세포수가 급격히 감소되는 것을 알 수 있었고, 귤피추출물 50 ㎍/㎖ 이상 처리되었을 때 지방줄기세포에 독성이 있을 것으로 예상되었다.(도 1)

실험예 2: 귤피추출물에 대한 세포증식 및 독성 확인 시험

귤피추출물이 각각의 농도로 처리되었을 때 세포의 증식 및 독성을 CCK-8을 이용하여 확인하였다.

귤피추출물이 농도별로 처리된 각 그룹별로 CCK-8 시약을 이용하여 세포독성 및 증식을 확인하는 시험을 시행하였다. 그 결과, 계대별 차이는 없으나 앞선 세포수 실험에서와 동일하게 귤피추출물이 50 ㎍/㎖까지 처리되었을 때는 세포의 증식이 농도 의존적으로 증가하다가 100 ㎍/㎖이 처리되었을 때는 비교군에 비해 더 낮은 증식율을 보이는 것으로 보아 귤피추출물 100 ㎍/㎖은 지방줄기세포에 독성을 보이는 것으로 확인되었다.(도 2)

실험예 3: 귤피추출물 농도에 따른 지방줄기세포 생존율 비교

위 실험예 2와 동일한 조건의 세포를 수집하여 트리판블루로 염색하여 세포생존율 확인하였다.

귤피추출물이 농도별로 처리된 각 그룹별로 세포에 트립판블루를 염색하여 그 생존율을 확인하는 시험을 시행하였다. 그 결과, 각 계대별 차이는 없었으며 비교군, 0.1, 1, 10, 30, 50 ㎍/㎖ 의 귤피추출물이 처리된 세포군에서는 94% 이상의 생존율이 확인되었으나 100 ㎍/㎖ 의 귤피추출물이 처리된 세포군에서는 75% 이상의 생존율로 높은 농도의 추출에서는 독성에 의해 세포의 생존율이 감소된 것이 확인되었다.

실험예 4: 유세포 분석기로 지방줄기세포의 세포 표면 특성 분석

- 위 실험예 3)과 동일한 조건으로 수집한 세포를 이용하여 세포 표면 특성 분석

- CD90에 양성반응을 보이며 CD45에 음성반응을 보이는지 확인하였다. 도 3은 세포의 morphology 관찰 사진이다.

앞선 실험예들을 통해 50 ㎍/㎖의 귤피추출물이 지방줄기세포의 증식에 효과적인 것을 확인하였고 일반배지와 귤피추출물을 처리하고 배양했을 때 지방줄기세포의 성격에 변화가 있는지 유세포 분석을 통해 확인해 보았다. 그 결과, 일반배지에서 배양한 세포는 지방줄기세포의 양성마커인 CD90에서 양성반응을 보이며 음성 마커인 CD45에서는 음성반응을 보였다. 귤피추출물이 들어간 배양배지에서도 역시 일반배지와 같은 양상을 보이는 것으로 확인되어 귤피추출물이 첨가되어도 지방줄기세포의 성격에는 변화가 없음을 확인하였다.

따라서, 귤피추출물을 유효성분으로 함유함으로써 세포증식 증진에 있어서 시너지 효과를 확인할 수 있었으며, 동물성 성장촉진인자의 대체제로서의 활용이 가능함을 알 수 있다.

Claims (4)

10% FBS가 포함된 DMEM 일반배지에 0.1~50 ㎍/㎖ 농도의 귤피추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 지방 줄기세포 증식용 배지 조성물.

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증류수에 귤피가루를 넣고 열수추출하고 1㎎/㎖의 농도가 되도록 귤피추출물 스톡(stock)을 제조하는 단계;
조직배양액 기본배지에 상기 귤피추출물 스톡을 혼합하여 0.1~50 ㎍/㎖ 농도의 귤피추출물을 포함하는 지방줄기세포 배양배지를 제조하는 단계;
공여자 유래 지방조직을 collagenase 처리하여 기저-혈액세포분획(Stromal Vascular Fraction : SVF) 을 분리하는 단계;
플라스크에서 10% FBS가 포함된 DMEM 일반배지에 상기 세포를 플레이팅하는 단계;
상기 플라스크에서 세포가 80% 이상 자랐을 때 트립신 EDTA 를 처리하여 플라스크 바닥으로부터 세포를 떼어내고 계대배양하는 단계; 및
상기 계대배양 후 제 2계대, 제 3계대 세포를 상기 귤피추출물을 포함하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 지방 줄기세포의 배양 방법.

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