CN112063583B

CN112063583B - 一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN112063583B
Application number: CN202011275178.9A
Authority: CN
Inventors: 张玲洁; 吴基伟; 郑婕
Original assignee: Guangzhou Dude Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xiangxue Stem Cell Regenerative Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2020-11-16
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2040-11-16
Also published as: CN112063583A

Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法。本发明公开的分离提取方法采用低浓度0.01% I型胶原酶溶液来消化脂肪组织，降低分离成本的同时降低I型胶原酶对细胞的伤害，提高细胞活率；另外，脂肪组织中加入无血清培养基后再进行消化，可在消化过程中维持细胞的生长繁殖，提高间充质干细胞的提取率。由于在I型胶原酶消化过程中无血清培养基的加入，使得未完全消化掉的脂肪组织中的细胞还保持着较好的活性，因此，本申请对未完全消化掉的脂肪组织继续培养至细胞汇合度为80%~90%时，再使用胰蛋白酶进行消化，获取间充质干细胞。本发明脂肪组织经两次消化提取的间充质干细胞得率高，且活率高。

Description

一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）最初从骨髓中提取，是一类具有无限自我复制更新能力的细胞，可在特定的条件下分化出超过一种以上的人体细胞类型，并能够在生物体内重建原来组织的功能。

在2001年Zuk等人在人脂肪组织中成功分离获得间充质干细胞，并命名为人脂肪间充质干细胞（human adipose derived stem/stomal cells，hADSCs）。随后研究证明在脂肪组织中含有大量未分化的干细胞，且储量丰富。相对于骨髓MSCs，脂肪来源的MSCs，取材于抽脂术或外科手术中弃去的皮下脂肪，可使患者免受抽骨髓取材的痛苦。且人脂肪间充质干细胞在不同的条件下被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞，同时也可以向其他胚层分化，证明脂肪间充质干细胞是多分化潜能干细胞。

近年来研究显示，MSCs具有调节免疫应答的能力，可在适应性免疫应答中抑制Ｔ细胞功能，改变辅助性Ｔ细胞（Th细胞）的平衡，诱导调节性Ｔ细胞（Treg）产生。Najar等研究指出hADSCs相比骨髓MSCs具有更强的免疫调节作用，被视为治疗自身免疫疾病如多发性硬化、移植物抗宿主病等比较理想的种子细胞。同时，hDASCs可通过自分泌或旁分泌途径释放细胞因子，这些活性物质可定向聚集于特定部位起到抑制细胞凋亡、纤维化，促进血管生成或缓解炎性反应等作用。hADSCs 具有来源丰富、取材方便、免疫原性低、体外扩增容易等诸多优点，其在组织工程、创面修复及基因治疗方面具有良好的应用前景。因此，成功分离出hADSCs，实现其在体外扩增，是进一步探究其生物学作用和进行移植研究的基础。

分离脂肪组织的过程中必须去除大体可见的血管与结缔组织，这样可以减少分离得到的细胞中内皮细胞及成纤维细胞的污染。目前，常用的hADSCs的分离方法是使用浓度为0.1% Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，该方法胶原酶浓度高，用量大，不利于大量获取细胞，难以满足干细胞研究的需求。同时Ⅰ型胶原酶价格昂贵，分离成本高，且较高的浓度易对细胞产生不可逆的损伤，影响研究结果。

发明内容

本发明提供了一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法，解决了目前脂肪间充质干细胞的分离方法是使用浓度为0.1% Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，该方法胶原酶浓度高，用量大，不利于大量获取细胞，且Ⅰ型胶原酶价格昂贵，分离成本高的问题。

其具体技术方案如下：

本发明提供了一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1：向脂肪组织中加入基础培养基后，再加入I型胶原酶进行消化，重悬消化液后进行离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；

步骤2：收集步骤1离心后上层脂肪组织，加入基础培养基进行培养，当细胞汇合度为80%~90%时，加入胰蛋白酶进行消化，重悬消化液后，过滤、离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；

步骤3：收集步骤1和步骤2获得的脂肪间充质干细胞；

所述I型胶原酶的质量浓度为0.01%。

在I型胶原酶溶液同等用量下，本发明采用低浓度0.01wt%I型胶原酶溶液来消化脂肪组织，降低分离成本的同时可以降低I型胶原酶对细胞的伤害，提高细胞活率；另外，脂肪组织中加入无血清培养基后再进行消化，可以在消化过程中维持细胞的生长繁殖，提高间充质干细胞的提取率。由于在I型胶原酶消化过程中无血清培养基的加入，使得未完全消化掉的脂肪组织中的细胞还保持着较好的活性，因此，本申请对未完全消化掉的脂肪组织继续培养至细胞汇合度为80%~90%时，再使用胰蛋白酶进行消化，获取间充质干细胞。本发明脂肪组织经两次消化提取的间充质干细胞得率高，且细胞活率高。

本发明步骤1中，每10 mL所述脂肪组织加入2 mL所述I型胶原酶进行消化，每10mL所述脂肪组织加入18 mL所述基础培养基；

所述基础培养基为脂肪间充质干细胞无血清培养基；

所述消化的时间为60 min~90 min,优选为60 min；

消化结束后，优选采用生理盐水进行重悬消化液，再进行离心，取沉淀；所述离心的速率为1500 r/min，时间为5 min；

取沉淀后，优选再采用生理盐水重悬沉淀，筛网过滤，离心后弃上清，得到的沉淀即为脂肪间充质干细胞；所述筛网为200目；所述离心的速率为1500 r/min，时间为5 min。

本发明步骤2中，上层脂肪组织与基础培养基的体积比为1:4；

所述基础培养基为脂肪间充质干细胞无血清培养基；

当细胞汇合度为80%~90%，优选为80%时，加入胰蛋白酶进行消化，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，再优选采用生理盐水对消化液进行重悬，优选采用100 nm细胞过滤器进行过滤，离心，沉淀即为间充质干细胞；所述离心的速率优选为1500 r/min，时间优选为5min。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法，该分离提取方法采用低浓度0.01% I型胶原酶溶液来消化脂肪组织，降低分离成本的同时可以降低I型胶原酶对细胞的伤害，提高细胞活率；另外，脂肪组织中加入无血清培养基后再进行消化，可以在消化过程中维持细胞的生长繁殖，提高间充质干细胞的提取率。由于在I型胶原酶消化过程中无血清培养基的加入，使得未完全消化掉的脂肪组织中的细胞还保持着较好的活性，因此，本申请对未完全消化掉的脂肪组织继续培养至细胞汇合度为80%~90%时，再使用胰蛋白酶进行消化，获取间充质干细胞。本发明脂肪组织经两次消化提取的间充质干细胞得率高，且细胞活率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例二中分离提取得到的原代脂肪间充质干细胞的显微镜图（40×）；

图2为本发明对比例一中分离提取得到的原代脂肪间充质干细胞的显微镜图（40×）；

图3为本发明对比例二中分离提取得到的原代脂肪间充质干细胞的显微镜图（40×）；

图4为本发明实施例二中第一代脂肪间充质干细胞的流式结果图；

图5为本发明对比例一中第一代脂肪间充质干细胞的流式结果图；

图6为本发明对比例二中第一代脂肪间充质干细胞的流式结果图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中的试剂均为市购，其中，脂肪间充质干细胞无血清培养基购自广州东锐科技有限公司。

实施例一

本实施例研究不同浓度的I型胶原酶处理脂肪组织对脂肪间充质干细胞活率的影响

1、人脂肪组织的采集：在无菌条件下，取三甲医院吸脂手术的健康，无传染病的女性脂肪组织30 mL，保存于无菌器皿中，于1h内送至实验室，同时避免X射线。

2、人脂肪组织的清洗：用含1%双抗（青霉素-链霉素溶液(100X)）的生理盐水清洗2次，除去结缔组织和血管。

3、取0.1.g、0.05 g、0.01 g I型胶原酶溶于100 mL PBS中获得终浓度为0.1%、0.5%、0.01% I型胶原酶溶液，并用0.22μm过滤网过滤除菌。

4、人脂肪组织的消化：在50 mL离心管中将脂肪组织剪成1 mm³大小的碎块，分成三份，每份10 mL，分为组1、组2和组3。

组一~组三分别采用2 mL 质量百分浓度为0.1%、0.05%、0.01%的 I型胶原酶37℃恒温摇床消化脂肪碎块60 min，消化完毕后200目筛网过滤，1500 r/min，离心5 min，得到细胞沉淀，1mL生理盐水重悬。吸取50µL细胞悬液，显微镜下计算活率，结果如表1所示。

由表1可知，在相同消化时间和温度下，I型胶原酶的浓度越低，对处理后脂肪组织中的脂肪间充质干细胞活率的影响也越低。由此可以证明，低浓度下的I型胶原酶处理脂肪组织，有助于在保证消化程度的情况下，对脂肪间充质干细胞的损伤更小，进而提高分离脂肪间充质干细胞时的活率。

实施例二

本实施例采用0.01%胶原酶从脂肪组织分离提取脂肪间充质干细胞

1、采集和清洗人脂肪组织，同实施例一步骤1~2。

2、人脂肪组织的消化：将清洗后的脂肪组织剪成1 mm³大小的碎块，取10 mL脂肪碎块加入18 mL脂肪间充质干细胞无血清培养基后，再加入2 mL 0.01%Ⅰ型胶原酶，37℃，5%二氧化碳浓度的培养消化60 min。

3、人脂肪间充质干细胞的获取：消化后，使用同体积的生理盐水重悬消化液，1500r/min，离心5 min，收集上层脂肪组织及油脂，沉淀采用生理盐水重悬后，200目筛网过滤，再次离心，废弃上清，沉淀为脂肪间充质干细胞。

4、人脂肪组织二次贴壁：取步骤3离心后收集的上层脂肪组织，以5 mL/瓶的密度加入T175瓶中，加入20 mL脂肪间充质干细胞无血清培养基，转移至5% CO₂，37℃，饱和湿度为95%的二氧化碳培养箱进行贴壁培养。

5、人脂肪间充质干细胞再获取：培养48 h后，显微镜下观察是否有细胞贴壁生长，吸弃上清液和脂肪组织块，加入适量新鲜培养液，置于5% CO₂，37℃，饱和湿度为95%的培养箱继续培养。

当观察细胞生长状态达80%融合时，吸弃培养瓶中培养基，加入适量生理盐水清洗。加入0.25%胰酶，在显微镜下观察细胞，轻轻拍打培养瓶，确保细胞完全消化下来。

6、迅速加入加适量脂肪间充质干细胞无血清培养基终止消化，反复吹打，将细胞悬液进行100 nm细胞过滤器过滤，移入50 ml离心管中，1500 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀即为间充质干细胞。

7、收集步骤3和步骤6获得的脂肪间充质干细胞，使用1 mL生理盐水重悬细胞。

8、重复实验两次。

对比例一

本对比例采用组织块培养法培养脂肪组织块：

1、将10mL已经剪碎的脂肪组织平均加入5个T75培养瓶中，并加入10mL脂肪间充质干细胞无血清培养基混匀后，置于5% CO₂，37℃，饱和湿度为95%的培养箱中培养7d。

2、培养7d后，显微镜下观察是否有细胞贴壁生长，吸弃上清液和脂肪组织块，加入适量脂肪间充质干细胞无血清培养基，置于5% CO₂，37℃，饱和湿度为95%的培养箱继续培养7d。

3、当观察细胞生长状态达80%融合时，进行消化。吸弃培养瓶中培养基，加入适量生理盐水清洗。加入0.25%胰酶5mL，在显微镜下观察细胞，轻轻拍打培养瓶，确保细胞完全消化下来。

4、迅速加入加适量脂肪间充质干细胞无血清培养基终止消化，反复吹打，将细胞悬液进行100 nm细胞过滤器过滤，移入50 ml离心管中。1500 r/min离心5 min，弃上清液。使用1mL生理盐水重悬细胞沉淀。

5、重复实验两次。

对比例二

本对比例采用0.1% I型胶原酶消化脂肪组织块；

1、将10 mL已经剪碎的脂肪组织置于50 mL离心管中，加入20 mL 0.1% I型胶原酶溶液，置于37℃恒温摇床消化60 min。

2、取出离心管，1500 r/min离心10 min，去除上层未消化的脂肪组织及油滴，沉淀使用脂肪间充质干细胞无血清培养基重悬，将细胞悬液进行100 nm细胞过滤器过滤，移入50ml离心管中。1500 r/min离心5 min，弃上清液。使用1 mL生理盐水重悬细胞沉淀。

3、重复实验两次。

实施例三

分别吸取实施例二、对比例一和对比例二50 µL细胞悬液，显微镜下计数并计算活率，观察间充质干细胞细胞形态由表1可知，相比于对比例一和对比例二，实施例二使用0.01% I型胶原酶和无血清培养基混合使用的消化法脂肪间充质干细胞收获率明显更高（提高20%-30%），细胞活率也明显更高。

如图1所示，实施例二分离提取获得的脂肪间充质干细胞沿着贴壁方向呈放射状生长，细胞形态均一，呈长梭形，细胞核为圆形或椭圆形，位于胞体中央，细胞质清澈透亮，生长状态好，符合脂肪间充质干细胞形态学要求。

如图2所示，细胞呈现梭形贴壁生长，符合间充质干细胞的形态，但细胞形态不均一，这是因为贴壁法会产生杂细胞。

如图3所示，细胞形态不均一，呈现多形状，有大量不贴壁的细胞且细胞生长状态较差，细胞生长较慢，高浓度胶原酶会导致细胞活力低下，有衰老的趋势。

实施例四

脂肪间充质干细胞的流式细胞仪表型检测

分别将实施例二、对比例一和对比例二脂肪间充质干细胞以6000个/cm²接种至培养瓶中。以第1次接种的细胞为0代，记作P0，细胞90%融合后0.25%胰酶消化，1∶3传代接种P1，再等细胞90%融合后，0.25%胰酶消化收获细胞，进行流式细胞仪表型检测，结果如表3所示。

由图4~6和表3可知，通过实施例二、对比例一和对比例二的方法均能获得脂肪间充质干细胞，但其细胞表型表达有一定差异，其中，采用对比例二获得的脂肪间充质干细胞CD90⁺表达略微较低，表明该细胞的干性较其他两组较差；通过实施例二获得的细胞，CD73⁺，CD90⁺，CD105⁺表达均在99.9%，说明该细胞高度符合脂肪间充质干细胞表型表达的要求。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种从脂肪组织中分离提取脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：向脂肪组织中加入脂肪间充质干细胞无血清培养基后，再加入I型胶原酶进行消化，重悬消化液后进行离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；

步骤2：收集步骤1离心后上层脂肪组织，加入脂肪间充质干细胞无血清培养基进行培养，脂肪间充质干细胞贴壁后，吸弃上清液和脂肪组织，加入脂肪间充质干细胞无血清培养基继续进行培养，当细胞汇合度为80%~90%时，加入胰蛋白酶进行消化，重悬消化液后，过滤、离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；

步骤3：收集步骤1和步骤2获得的脂肪间充质干细胞；

所述I型胶原酶的质量浓度为0.01%，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25%；

步骤1中每10 mL所述脂肪组织加入2 mL所述I型胶原酶进行消化；

步骤1每10 mL所述脂肪组织加入18 mL所述脂肪间充质干细胞无血清培养基；

步骤1所述I型胶原酶消化的时间为60 min；

步骤1所述取沉淀后，还包括：采用生理盐水重悬，200目筛网过滤，离心后弃上清，得到的沉淀即为脂肪间充质干细胞；

步骤2所述上层脂肪组织与所述脂肪间充质干细胞无血清培养基的质量比为1：4；

步骤2所述过滤采用100nm细胞过滤器进行过滤。