CN104673745A - 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，包括:抽取猪皮下脂肪组织，将脂肪组织使用含双抗的PBS缓冲液洗涤，在脂肪组织中加入Ⅰ型胶原酶消化液消化后获得猪脂肪干细胞，再使用含有EGF的无血清培养基培养；本发明在猪脂肪干细胞分离培养中，能够减少脂肪组织来源中血液等杂质对酶解脂肪的影响，缩短I型胶原酶酶解脂肪时间、使用无血清培养基培养原代细胞，培养基中添加合适的生长因子，能够更好地分离培养猪脂肪干细胞，保持较强的增殖生长能力，从而建立一套规范标准的猪脂肪干细胞原代分离培养的方法。

Description

一种猪脂肪干细胞的分离培养方法

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种猪脂肪干细胞的分离培养方法。

背景技术

脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs)是来源于脂肪组织中的具有不断的自我更新与多向分化潜能的间充质干细胞。脂肪干细胞为成纤维细胞样,脂肪干细胞低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明AMSCs具有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，在一定条件下，可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化，脂肪干细胞的基本形态、增殖周期、免疫源性及多向分化潜能与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相似。

ADSCs取自于脂肪组织，具有来源广泛、取材简单、培养成功率高、细胞老化率低等优点，引起研究者的广泛关注，逐渐成为组织工程学的理想种子细胞。

脂肪组织的获得方法：通常利用吸脂术获得脂肪抽提物，或者用外科手术切取的脂肪组织。动物腹股沟皮下脂肪或内脏脂肪(如：肠、肾、卵巢及睾丸等部位脂肪)一般被用于分离ADSCs。不管是人ADSCs还是动物ADSCs，通常采用胶原酶消化法分离AMSCs。不同研究小组采用不同的胶原酶类型、消化时间和消化不同部位的脂肪组织均能得到多能干细胞。现有技术获取的脂肪组织含有较多血管及血液，需要手动去除血管，只通过PBS清洗整块脂肪组织，没有清洗剪碎后的脂肪组织。脂肪组织中含有大量血液等其他杂质影响酶解效果，因此胶原酶消化脂肪组织时间过长。另外，目前分离培养脂肪干细胞的培养基通常为含胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，而血清可能存在对细胞的毒性作用和血清源性污染。

发明内容

本发明在猪脂肪干细胞分离培养中，能够减少脂肪组织来源中血液等杂质对酶解脂肪的影响，缩短I型胶原酶酶解脂肪时间、使用无血清培养基培养原代细胞，培养基中添加合适的生长因子，能够更好地分离培养猪脂肪干细胞，保持较强的增殖生长能力，从而建立一套规范标准的猪脂肪干细胞原代分离培养的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，包括以下步骤:

(1)抽取猪皮下脂肪组织后，将脂肪组织与含双抗的PBS缓冲液混匀，静置5～10分钟，脂肪组织与PBS缓冲液分层；吸去下层PBS缓冲液与血液的混合液体，再加入含双抗的PBS缓冲液重复清洗；

(2)将清洗后的脂肪组织剪碎，去除结缔组织，再加入含双抗的PBS缓冲液混匀后，500g～700g离心3～5分钟，去除上层油脂与下层的PBS及血液，留下中层的脂肪组织；

所述含双抗的PBS缓冲液为含青霉素和链霉素的PBS缓冲液；

(3)在脂肪组织中加入Ⅰ型胶原酶消化液，震荡条件下消化45～75min；

(4)消化后，立即以1000rpm～1500rpm离心5～10min，离心后，沉淀部分即为猪脂肪干细胞；

(5)将猪脂肪干细胞用完全培养基中培养；所述完全培养基为含有EGF的无血清培养基，EGF的浓度为10ng/ml。

所述PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选所述含双抗的PBS缓冲液为含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PBS缓冲液。

优选，步骤(1)和步骤(2)所述含双抗的PBS缓冲液的加入量是脂肪组织体积的1～2倍。

优选，步骤(2)所述去除上层油脂与下层的PBS及血液是用10ml量程的移液管吸除脂肪组织上层油脂与下层PBS及离心管底部的血液，留下中层的脂肪组织。

优选，步骤(4)所述沉淀部分是采用10ml量程的移液管吸除离心后悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，得到的沉淀。

步骤(5)所述将猪脂肪干细胞用完全培养基培养包括以下步骤：

(1)用PBS重悬猪脂肪干细胞，过滤获得细胞悬液，将细胞悬液以1000rpm～1500rpm离心5～10min，弃上清液加入无血清培养基，吹打均匀，按1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²的密度将细胞接种于培养皿中，加入完全培养基；

(2)在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后用预温的PBS洗涤，以除去未贴壁细胞以及杂质，加入完全培养基；

(3)每2～3d换一次培养基，待细胞融合度达到80％～90％时，用预温的PBS清洗，再用2.5mg/ml胰蛋白酶在37℃条件下消化细胞2～3min,之后用等体积的完全培养基中和，以1000rpm离心5min后，弃上清,按1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²接种至完全培养基中，每2～3d换一次完全培养基。

优选，所述过滤是过70μm的细胞筛。

优选，所述预温的PBS是温度在25℃～37℃的PBS。

优选，所述I型胶原酶的终浓度为1mg/ml(占脂肪组织和消化液总体积)。

本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果：

(1)本发明脂肪组织用I型胶原酶作用时间缩短，但细胞总量没有变少，节省操作时间。

(2)本发明分离得到的细胞总量高于现有技术。

(3)本发明分离的细胞活性高,细胞经细胞计数仪鉴定，细胞活力达到90％以上。

(4)本发明分离培养细胞形态良好，呈现梭形，簇团性生长趋势、增殖能力高于现有技术。

(5)本发明分离培养的细胞明显表达猪脂肪干细胞表面标记物。

为了实现1、2、3优点，本发明在猪脂肪干细胞分离中，在猪脂肪酶解前，进行有效的脂肪清洗，去除血液等杂质，使得脂肪组织更为干净，在I型胶原酶中得到充分酶解消化。

为了实现4、5优点，本发明使用用无血清培养基+表皮生长因子EGF共同培养原代分离的猪脂肪干细胞，很好促进细胞的生长。

附图说明

图1实施例1与对比例的原代培养细胞形态对比:A为对比例的猪脂肪干细胞P0代细胞培养6天放大100倍的照片；B为实施例1的猪脂肪干细胞P0代培养6天放大100倍的照片；

图2为实施例2得到的猪脂肪干细胞P1代细胞的流式鉴定；

图3为实施例3得到的P3代的猪脂肪干细胞成脂诱导后细胞形态变化图；

图4为实施例1得到的P3代的猪脂肪干细胞采用茜素红染色检测成骨分化结果。

具体实施方式

对比例1

现有技术:脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究[D]。西北农林科技大学.2006,公开了一种猪脂肪干细胞的分离和培养方法.

(1)选择出生3d，经临床检查健康的仔猪，术前按外科手术要求剃毛、消毒，心脏放血或用乙醚麻醉致死。在无菌操作下切开颈部和背部皮肤，取皮下脂肪组织，用含高浓度青霉素和链霉素的PBS缓冲液冲洗3次。剪去脂肪组织中可见的血管和结缔组织，将脂肪组织剪成1mm³左右的小块，加入Ⅰ型胶原酶消化液(I型0.1％胶原酶+1％BSA)消化90min(37℃，水浴锅中振荡)，消化结束后用等体积的完全培养液(DMEM/F12+10％FBS胎牛血清)中和消化液。

(2)100μm和25μm的双层尼龙筛过滤，1500r/m离心10min，以去除悬浮的脂肪细胞及脂滴；沉淀部分即为脂肪干细胞，弃上清液，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置10min，1000r/m离心5min，弃上清液，加入无血清培养液(DMEM/F12)，吹打均匀，1000r/m离心5min，弃上清液，

(3)加入完全培养基(DMEM/F12+10％FBS胎牛血清)，吹打均匀，台盼蓝染色，用计数板计数后，按5×104/mL的密度将细胞接种于6孔培养板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；24h后用预温的PBS洗两次，以除去未贴壁细胞。之后每3d换次液，待细胞达到80％汇合时，用预温的PBS清洗，再用0.25％胰蛋白酶在37℃条件下消化细胞5min,之后用等体积的完全培养液中和，离心弃上清，台盼蓝染色，用计数板计数，按1×105/mL接种，并计为P0代。每3d换一次生长培养液；待细胞生长至80％汇合时传代。

实施例1

(1)在无菌操作下利用抽脂术抽取猪皮下脂肪组织后，将脂肪组织用1倍体积的含高浓度青霉素和链霉素的PBS缓冲液充分混匀，静置5分钟，脂肪组织与PBS分层。用25ml量程的移液管吸去下层PBS与血液混合液体，再加入PBS重复1次清洗。

在步骤1中，PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液。

(2)将少量较大体积的脂肪组织剪碎，去除结缔组织后，将脂肪组织分装至转入50ml离心管中，加入脂肪1倍体积上述PBS混匀后，以700g离心3分钟。

用10ml量程的移液管(50ml离心管用10ml量程的移液管吸取液体较为方便，25ml量程的移液管管径过大，破坏分离后分层效果)去除脂肪组织上层油脂与下层PBS及离心管底部的血液，留下中层的脂肪组织。

(3)将脂肪组织转移至新的50ml离心管中，加入Ⅰ型胶原酶消化液(终体积使I型胶原酶为1mg/ml)，在37℃恒温空气震荡仪(可避免水浴震荡仪中水污染)震荡50min。

(4)消化后，立即放入离心机中，以1500rpm离心10min，离心后，用10ml量程的移液管吸取悬浮的脂肪细胞及脂滴；弃上清液，沉淀部分即为脂肪干细胞，

(5)用PBS重悬细胞沉淀，70μm一次性细胞筛过滤，将细胞悬液以1000rpm离心5min，弃上清液加入无血清培养基(Ultra CULTURE)，吹打均匀，台盼蓝染色，用细胞自动计数仪计数后，按1×10⁴/cm²的密度将细胞接种于直径为10cm的培养皿，加入无血清培养基及EGF(使EGF终浓度为10ng/ml)

EGF为表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)，调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。

Ultra CULTURE为无血清培养基商品名。

(6)在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。48h后用预温的PBS洗两次，以除去未贴壁细胞以及杂质。加入无血清培养基培养+10ng/ml EGF；

(7)之后每3d换次液，待细胞达到局部达到80％汇合时，用预温的PBS清洗，再用2.5mg/ml胰蛋白酶在37℃条件下消化细胞2min,之后用等体积的完全培养液中和，以1000rpm离心5min后，弃上清,台盼蓝染色，用计数板计数，按1×10⁴/cm²接种，并计为P1代。每3d换一次生长培养基；待细胞生长至80％汇合时传代。

实施例1与对比例1获得的分离猪脂肪干细胞原代培养的细胞形态对比。

实施例1分离得到的猪脂肪干细胞，将细胞在无血清培养基+10ng/ml EGF中培养，细胞汇合至80％-90％进行拍照，以对比例1作为对照如图1所示。

由图可知，实施例1(图1-B)与对比例1(图1-A)相比，细胞汇合80％所花费时间更短，细胞形态更为均一，呈现明显梭形，细胞折光性更为良好。

实施例2猪脂肪干细胞P1代细胞的流式鉴定

(1)在无菌操作下利用抽脂术抽取猪皮下脂肪组织后，将脂肪组织用2倍体积的含高浓度青霉素和链霉素的PBS缓冲液充分混匀，静置10分钟，脂肪组织与PBS分层。用25ml量程的移液管吸去下层PBS与血液混合液体，再加入PBS重复1次清洗。

在步骤1中，PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液。

(2)将少量较大体积的脂肪组织剪碎，去除结缔组织后，将脂肪组织分装至转入50ml离心管中，加入脂肪2倍体积上述PBS混匀后，以500g离心5分钟。

用10ml量程的移液管(50ml离心管用10ml量程的移液管吸取液体较为方便，25ml量程的移液管管径过大，破坏分离后分层效果)去除脂肪组织上层油脂与下层PBS及离心管底部的血液，留下中层的脂肪组织。

(3)将脂肪组织转移至新的50ml离心管中，加入Ⅰ型胶原酶消化液(终体积使I型胶原酶为1mg/ml)，在37℃恒温空气震荡仪(可避免水浴震荡仪中水污染)震荡50min。

(4)消化后，立即放入离心机中，以1000rpm离心5min，离心后，用10ml量程的移液管吸取悬浮的脂肪细胞及脂滴；弃上清液，沉淀部分即为脂肪干细胞，

(5)用PBS重悬细胞沉淀，70μm一次性细胞筛过滤，将细胞悬液以1500rpm离心10min，弃上清液加入无血清培养基(Ultra CULTURE)，吹打均匀，台盼蓝染色，用细胞自动计数仪计数后，按2×10⁴/cm²的密度将细胞接种于直径为10cm的培养皿，加入无血清培养基及EGF(使EGF终浓度为10ng/ml)

EGF为表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)，调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。

(Ultra CULTURE)为无血清培养基商品名。

(6)在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。48h后用预温的PBS洗两次，以除去未贴壁细胞以及杂质。加入无血清培养基培养+10ng/ml EGF；

(7)之后每3d换次液，待细胞达到局部达到80％汇合时，用预温的PBS清洗，再用0.25％胰蛋白酶在37℃条件下消化细胞3min,之后用等体积的完全培养液中和，以1000rpm离心5min后，弃上清,台盼蓝染色，用计数板计数，按1×104/cm²～2×104/cm²接种，并计为P1代。每3d换一次生长培养基；待细胞生长至80％汇合时传代。

当猪脂肪干细胞P1代细胞生长至80％时，用2.5mg/ml胰酶消化后收集细胞，取两个1.5ml EP管,每管2×10⁵个细胞，用染色缓冲液(10％胎牛血清+90％PBS)洗两遍，每管加入200μl染色缓冲液，样品分别加入下列四个抗体CD90、CD59、HLA-DR、CD45各2μl，阴性对照不加抗体，4℃孵育20min,用染色缓冲液洗两遍，后用500μl DMEM培养基重悬，用流式细胞仪采集100000个细胞，检测CD90、CD59、HLA-DR、CD45等在猪脂肪干细胞中的表达情况。结果见图2,A为空白对照，B为实施例2样品。

从图2的结果可以看出，实施例2样品表达CD59、CD90；低表达HLA-DR、CD45，符合脂肪干细胞特性，证明本发明可获得纯度较高的猪脂肪干细胞。

实施例3

(1)在无菌操作下利用抽脂术抽取猪皮下脂肪组织后，将脂肪组织用1.5倍体积的含高浓度青霉素和链霉素的PBS缓冲液充分混匀，静置8分钟，脂肪组织与PBS分层。用25ml量程的移液管吸去下层PBS与血液混合液体，再加入PBS重复1次清洗。

在步骤1中，PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液。

(2)将少量较大体积的脂肪组织剪碎，去除结缔组织后，将脂肪组织分装至转入50ml离心管中，加入脂肪1.5倍体积上述PBS混匀后，以600g离心4分钟。

用10ml量程的移液管(50ml离心管用10ml量程的移液管吸取液体较为方便，25ml量程的移液管管径过大，破坏分离后分层效果)去除脂肪组织上层油脂与下层PBS及离心管底部的血液，留下中层的脂肪组织。

(3)将脂肪组织转移至新的50ml离心管中，加入Ⅰ型胶原酶消化液(终体积使I型胶原酶为1mg/ml)，在37℃恒温空气震荡仪(可避免水浴震荡仪中水污染)震荡50min。

(4)消化后，立即放入离心机中，以1200rpm离心8min，离心后，用10ml量程的移液管吸取悬浮的脂肪细胞及脂滴；弃上清液，沉淀部分即为脂肪干细胞，

(5)用PBS重悬细胞沉淀，70μm一次性细胞筛过滤，将细胞悬液以1000rpm离心5min，弃上清液加入无血清培养基(Ultra CULTURE)，吹打均匀，台盼蓝染色，用细胞自动计数仪计数后，按1.5×10⁴/cm²的密度将细胞接种于直径为10cm的培养皿，加入无血清培养基及EGF(使EGF终浓度为10ng/ml)

EGF为表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)，调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。

(Ultra CULTURE)为无血清培养基商品名。

(6)在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。48h后用预温的PBS洗两次，以除去未贴壁细胞以及杂质。加入无血清培养基培养+10ng/ml EGF；

(7)之后每3d换次液，待细胞达到局部达到80％汇合时，用预温的PBS清洗，再用2.5mg/ml胰蛋白酶在37℃条件下消化细胞2.5min,之后用等体积的完全培养液中和，以1000rpm离心5min后，弃上清,台盼蓝染色，用计数板计数，按1.5×104/cm²接种，并计为P1代。每3d换一次生长培养基；待细胞生长至80％汇合时传代。

猪脂肪干细胞的成脂分化鉴定

收集实施例3的P3代的猪脂肪干细胞，以1×10³/cm²的细胞密度接种于24孔板中，细胞汇合度达到100％时，实验组换用成脂诱导培养液培养，对照组用生长培养基培养(无血清培养基+10ng/ml EGF)，每2-3天更换新鲜的诱导培养基，2周之后采用油红O染色检测成脂分化结果。图3-B为猪脂肪干细胞成脂诱导后细胞形态变化(×200)，诱导15d后可见大多数细胞充满红色的油滴空泡，图3-A为对照，未诱导的细胞形态不变，没有见到油滴。

实施例四

脂肪干细胞的成骨分化鉴定

收集实施例1获得的P3代的猪脂肪干细胞，分别以1×10³/cm²的细胞密度接种于24孔板中，培养至60～70％融合时，实验组换用成骨诱导培养液，对照组用生长培养基培养(无血清培养基+10ng/ml EGF)，每3天更换新鲜的成骨诱导培养基，3周之后采用茜素红染色检测成骨分化结果。

由图4可以看出，A为成骨诱导组，B为对照组，猪脂肪干细胞在体外成骨诱导分化过程中，21天时可见明显的矿化结节，用茜素红染色可将其形成的钙结节染成红色。而对照组细胞形态不变仍为长梭形。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (9)

1.一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)抽取猪皮下脂肪组织后，将脂肪组织与含双抗的PBS缓冲液混匀，静置5～10分钟，脂肪组织与PBS缓冲液分层；吸去下层PBS缓冲液与血液的混合液体，再加入含双抗的PBS缓冲液重复清洗；

(2)将清洗后的脂肪组织剪碎，去除结缔组织，再加入含双抗的PBS缓冲液混匀后，500g～700g离心3～5分钟，去除上层油脂与下层的PBS及血液，留下中层的脂肪组织；

所述含双抗的PBS缓冲液为含青霉素和链霉素的PBS缓冲液；

(3)在脂肪组织中加入Ⅰ型胶原酶消化液，震荡条件下消化45～75min；

(4)消化后，立即以1000rpm～1500rpm离心5～10min，离心后，沉淀部分即为猪脂肪干细胞；

(5)将猪脂肪干细胞用完全培养基中培养；所述完全培养基为含有EGF的无血清培养基，EGF的浓度为10ng/ml。

2.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述含双抗的PBS缓冲液为含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述含双抗的PBS缓冲液的加入量是脂肪组织体积的1～2倍。

4.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)所述去除上层油脂与下层的PBS及血液是用10ml量程的移液管吸除脂肪组织上层油脂与下层PBS及离心管底部的血液，留下中层的脂肪组织。

5.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)所述沉淀部分是采用10ml量程的移液管吸除离心后悬浮的脂肪细胞及脂滴，弃上清液，得到的沉淀。

6.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)所述将猪脂肪干细胞用完全培养基培养包括以下步骤：

(1)用PBS重悬猪脂肪干细胞，过滤获得细胞悬液，将细胞悬液以1000rpm～1500rpm离心5～10min，弃上清液加入无血清培养基，吹打均匀，按1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²的密度将细胞接种于培养皿中，加入完全培养基；

(2)在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养48h后用预温的PBS洗涤，以除去未贴壁细胞以及杂质，加入完全培养基；

(3)每2～3d换一次培养基，待细胞融合度达到80％～90％时，用预温的PBS清洗，再用2.5mg/ml胰蛋白酶在37℃条件下消化细胞2～3min,之后用等体积的完全培养基中和，以1000rpm离心5min后，弃上清,按1×10⁴/cm²～2×10⁴/cm²接种至完全培养基中，每2～3d换一次完全培养基。

7.根据权利要求6所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述过滤是过70μm的细胞筛。

8.根据权利要求6所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述预温的PBS是温度在25℃～37℃的PBS。

9.根据权利要求1所述的一种猪脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶的终浓度为1mg/ml。