CN114606183A - 一种动物源脂肪干细胞分离提取方法 - Google Patents
一种动物源脂肪干细胞分离提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114606183A CN114606183A CN202210263643.XA CN202210263643A CN114606183A CN 114606183 A CN114606183 A CN 114606183A CN 202210263643 A CN202210263643 A CN 202210263643A CN 114606183 A CN114606183 A CN 114606183A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- adipose
- cell
- stem cells
- derived stem
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 101
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 45
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 16
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 10
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims description 10
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 4
- RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N (E)-roxithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=N/OCOCCOC)/[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 RXZBMPWDPOLZGW-XMRMVWPWSA-N 0.000 claims description 3
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 claims description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 3
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004100 Oxytetracycline Substances 0.000 claims description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 3
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 claims description 3
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 claims description 3
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 claims description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 229960004841 cefadroxil Drugs 0.000 claims description 3
- NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N cefadroxil monohydrate Chemical compound O.C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=C(O)C=C1 NBFNMSULHIODTC-CYJZLJNKSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 claims description 3
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 claims description 3
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002588 cefradine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001668 cefuroxime Drugs 0.000 claims description 3
- JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N cefuroxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CC=CO1 JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N 0.000 claims description 3
- RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N cephradine Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CCC=CC1 RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002626 clarithromycin Drugs 0.000 claims description 3
- AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N clarithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@](C)([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)OC)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AGOYDEPGAOXOCK-KCBOHYOISA-N 0.000 claims description 3
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 claims description 3
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 claims description 3
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000625 oxytetracycline Drugs 0.000 claims description 3
- IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N oxytetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3[C@H](O)[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-PXOLEDIWSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019366 oxytetracycline Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 229960005224 roxithromycin Drugs 0.000 claims description 3
- ZPCCSZFPOXBNDL-RSMXASMKSA-N spiramycin II Chemical compound O([C@H]1/C=C/C=C/C[C@@H](C)OC(=O)C[C@H]([C@@H]([C@H]([C@@H](CC=O)C[C@H]1C)O[C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@](C)(O)C2)[C@@H](C)O1)N(C)C)O)OC)OC(C)=O)[C@H]1CC[C@H](N(C)C)[C@H](C)O1 ZPCCSZFPOXBNDL-RSMXASMKSA-N 0.000 claims description 3
- 229950006796 spiramycin ii Drugs 0.000 claims description 3
- IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N terramycin dehydrate Natural products C1=CC=C2C(O)(C)C3C(O)C4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O IWVCMVBTMGNXQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 3
- 229960000707 tobramycin Drugs 0.000 claims description 3
- NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N tobramycin Chemical compound N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N NLVFBUXFDBBNBW-PBSUHMDJSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 claims 1
- 229960000741 erythromycin ethylsuccinate Drugs 0.000 claims 1
- NSYZCCDSJNWWJL-YXOIYICCSA-N erythromycin ethylsuccinate Chemical compound O1[C@H](C)C[C@H](N(C)C)[C@@H](OC(=O)CCC(=O)OCC)[C@@H]1O[C@H]1[C@@](O)(C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)[C@@H](CC)OC(=O)[C@H](C)[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@](C)(OC)C2)[C@@H]1C NSYZCCDSJNWWJL-YXOIYICCSA-N 0.000 claims 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 15
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 13
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 235000019737 Animal fat Nutrition 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种动物源脂肪干细胞分离提取方法，包括以下步骤：S1：清洗、剪碎和离心：将采集到的动物源脂肪组织，采用抗生素的清洗液清洗5‑8次，剪碎、离心；S2：酶解：向离心后的脂肪组织加入同体积的0.15％的I型胶原酶，放置于37℃恒温摇床，转速120‑150r/min，消化1h；然后再加入等体积的含0.25％EDTA的胰酶继续消化15min后终止酶解、离心；S3：向离心后的底部沉淀物加入培养液过滤，将过滤后的细胞悬液离心，将收集到的细胞上清液和细胞沉淀分别单独接种培养。本发明属于一种新型的动物源脂肪干细胞提取技术，制备方式方法简单易获取，成本较低，能从动物脂肪组织获取大量的原代的动物源脂肪干细胞。
Description
技术领域
本发明属于脂肪干细胞分离提取技术领域，尤其涉及一种动物源脂肪干细胞分离提取方法。
背景技术
脂肪干细胞作为脂肪组织中的一类间充质干细胞，具有易获取、获取率高、损伤小等特点。目前在组织工程方向和再生医学领域中，人成体脂肪干细胞应用相较广泛，其优点在于脂肪干细胞免疫原性低，具备多项分化的潜能，在一定条件下，能定向分化成脂、成骨、软骨等细胞。动物脂肪干细胞目前在市场及医学领域应用相较比较空缺，从动物脂肪提取的脂肪相较应用比较广泛，主要应用于护肤、美容领域。动物脂肪干细胞所具备的脂肪干细胞特性，是未来作为动物组织工程研究的理想的种子细胞之一，也会随着护肤、医美市场领域需求的提升，最有可能成为脂肪组织工程的种子细胞之一。但是根据目前国内外市场及技术资料调研汇总，动物源脂肪细胞(尤其变温动物脂肪干细胞)是相对比较空缺，基于未来市场的可能需求及目前现技术空缺的现状，本发明提供了一种高效的动物源脂肪干细胞的分离提取方法。
发明内容
本发明提供了一种动物源脂肪干细胞分离提取方法，其领域及应用不同于人脂肪细胞，提取方式方法简单获取，成本较低，能从动物脂肪组织获取大量的原代的动物源脂肪干细胞，收获的大量原代细胞通过扩增培养后可用于细胞建库。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种动物源脂肪干细胞分离提取方法，包括以下步骤：
S1：清洗、剪碎和离心：将采集到的动物源脂肪组织，采用抗生素的清洗液清洗5-8次，剪碎、离心；
S2：酶解：向离心后的脂肪组织加入同体积的0.15％的I型胶原酶，放置于37℃恒温摇床，转速120-150r/min，消化1h；然后再加入等体积的含0.25％EDTA的胰酶继续消化15min后终止酶解、离心；其中，所述含0.25％EDTA的胰酶的体积和I型胶原酶的体积比为1：2-3；
S3：向离心后的底部沉淀物加入培养液过滤，将过滤后的细胞悬液离心，将收集到的细胞上清液和细胞沉淀分别单独接种培养。
所述动物源脂肪来自于变温动物，尤其是冷血动物：如蛇。
所述步骤S1中，无菌采集变温动物源脂肪组织，用75％酒精浸没组织3-5分钟，然后用含抗生素的0.6％-0.9％的Nacl溶液清洗5-8次，含抗生素的清洗液清洗包裹在动物脂肪组织的外油脂，同时采用无菌器械(例如无菌镊、医科剪等)进一步剔除脂肪表面的油膜等物质，整个清洗过程去除脂肪组织表面的油膜、油脂、血渍等废弃物，排除其对后续工艺消化和细胞收获的影响，保障和保证整个细胞的收获量。
所述抗生素选用青链霉素、庆大毒素或两性霉素B、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素和林可霉素中的一种或几种。
所述步骤S1中，剪碎、离心：将清洗后的脂肪组织用无菌手术剪剪碎至1-3mm3大小的组织碎块，放入离心管中，加入0.6％-0.9％的Nacl溶液，转速1500r/min，离心5-10min，去除离心管上层的油脂混合液及底部的Nacl溶液，收集脂肪组织；此步骤是为了进一步深度清洗及去除脂肪表面的油脂，避免对后续细胞消化及细胞培养产生干扰、影响，造成细胞的减少和损失。
所述步骤S2中，采用含15％FBS的α-MEM培养液终止酶消化，随后离心，转速1500r/min，离心10-15min。
所述步骤S3中，收集步骤S2中离心后的沉淀物，加入含15％FBS的α-MEM培养液混匀，随后用70μm细胞筛网或200目滤网过滤；收集过滤后的细胞悬液，转速1500r/min，离心10-15min，随后将离心后的细胞上清液和细胞沉淀单独进行接种，放置于30℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中进行培养。
还包括S4：传代培养，待细胞密度长至85％-95％，进行冻存。
所述步骤S4传代培养具体为：步骤S3中细胞沉淀接种48h后进行第一次换液，随后每隔3天进行一次换液，待细胞融合度长到70％-80％，用0.25％EDTA的胰蛋白酶进行消化，并继续传代；传代后的细胞每隔2天进行一次换液，待细胞密度长至85％-95％，进行冻存；
其中，培养基换液为：用0.6％-0.9％的氯化钠溶液冲洗培养皿表面，去除细胞表面的杂质，更换新鲜的15％FBS的α-MEM培养液。
本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：
本发明提供了动物源脂肪干细胞提取分离装置，不同于人源脂肪干细胞，人源性脂肪组织呈现“颗粒状”，工艺清洗相较容易，而动物源组织整个脂肪组织偏大，在脂肪组织剥离(采集)的过程中相较人源性脂肪组织也比较困难，尤其会附着较多的油脂、油膜等，这些会对整个工艺提取效率产生极大的影响。本发明清洗结合含抗生素的清洗液清洗动物脂肪组织，同时采用酶联合消化的方式进行，并同时控制消化时间，采用0.15％的I型胶原酶可以根据酶的特性充分的解离脂肪组织并消化得到细胞，随即混合0.25％EDTA胰酶联合消化15min，是为了进一步解离细胞团，获得更多的的单细胞悬液，含EDTA的胰酶能够更加有效促进细胞消化效率，使其产量、得率更高。但因胰酶消化作用较强，过高浓度或过长时间使用胰酶消化会使细胞减少甚至死亡，所以需要特别控制消化时间和胰酶的含量。
附图说明
图1为本发明实施例的脂肪组织清洗后的照片；
图2为本发明实施例的脂肪细胞提取接种48h换液后的显微镜照片；
图3为本发明实施例培养第10天的脂肪细胞的显微镜照片；
图4为本发明实施例培养第12天的脂肪细胞的显微镜照片；
图5为本发明实施例培养第14天的脂肪细胞的显微镜照片；
图6为本发明实施例培养第16天的脂肪细胞的显微镜照片；
图7为本发明对比例的脂肪组织清洗后的照片。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种动物源脂肪干细胞分离提取方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。
本实施例是一种适用于动物源脂肪细胞提取的高效工艺提取的方式方法，其领域及应用不同于人脂肪细胞，人源性脂肪组织呈现“颗粒状”，工艺清洗相较容易，而动物源组织整个脂肪组织偏大，在脂肪组织剥离(采集)的过程中相较人源性脂肪组织需要更复杂和更高要求的操作，尤其附着更多的油脂、油膜等，需要通过深度清洗和进一步剥离的方式去除，从而提高脂肪目的细胞的获得率。
本实施例以蛇脂肪干细胞分离提取方法为例，说明本发明的观点
1、无菌采集动物源脂肪组织，相较于人脂肪采集的方式(如抽脂)，其获得的难度程度及过程相对更为困难及复杂，目前市面上没有设备仪器针对动物源组织进行对其脂肪的采集、收集，由此说明如何获取大量的动物源脂肪组织显得越发重要。本实施例以蛇脂肪为例，在整个脂肪采集获取的过程中，在保证组织鲜活性的前提下采集其脂肪组织，是相较复杂且比较困难；蛇脂肪表面附着有大量的蛇油，在采集过程中剔除蛇油及避免非脂肪组织(如内脏等)带来的实验影响也是尤为困难且重要的。采集到的动物源脂肪组织用75％酒精浸没浸泡组织3-5分钟。
2、将步骤1得到的脂肪组织，用含抗生素(青链霉素、庆大毒素或两性霉素B、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素或林可霉素中的一种或几种，此处不做限制)的0.6％-0.9％的Nacl溶液清洗5-8次，去除脂肪组织表面的油膜、油脂、血渍等废弃物，同时采用无菌器械(例如无菌镊、医科剪等)进一步剔除脂肪表面的油膜等物质，随后将脂肪组织用无菌手术剪剪碎至1-3mm3大小的组织碎块，放入50ml离心管中，加入等体积的0.6％-0.9％Nacl溶液，混匀，1500r/min，离心5-10分钟。如图1为蛇脂肪组织清洗中的照片，清洗后的蛇脂肪组织，其脂肪在剪碎的情况，脂肪大小仍相较大多数常规脂肪族组织会偏大。
3、步骤2结束后，去除离心管上层的油脂混合液及底部的Nacl溶液(此步骤是为了进一步深度清洗及去除脂肪表面的油脂，避免对后续细胞消化及细胞培养产生干扰、影响，造成细胞的减少和损失)。
4、将步骤3得到的脂肪组织分装至50ml无菌离心管中，每管的脂肪组织体积量为15-20ml，随后每管加入等体积量的0.15％的I型胶原酶，充分混匀后放置于37℃恒温摇床，转速120-150r/min，消化1h。
5、消化结束后，将4得到的产物，每管加入等量的含0.25％EDTA的胰酶继续消化15min，加入胰酶的体积和I型胶原酶的体积比为1:2-3。(先用I型胶原酶消化是因I型胶原酶对脂肪组织有非常有效的消化和细胞分离作用，而混合使用0.25％EDTA胰酶进一步消化，是因含EDTA的胰酶能够更加有效促进细胞消化效率，使其产量、得率更高。但因胰酶消化作用较强，过高浓度或过长时间使用胰酶消化会使细胞减少甚至死亡，所以需控制消化时间和胰酶体积)。
6、将5得到的产物，用含15％FBS的α-MEM培养液混匀，终止消化。随后离心10-15min，转速1500r/min。
7、离心后，去除上层油脂、油膜层和中层溶液，留取底部的沉淀。加入含15％FBS的α-MEM培养液混匀，随后用70μm细胞筛网(或200目滤网)过滤。将过滤后得到的细胞悬液收集至50ml离心管中，转速1500rpm，离心10min。随后将离心后得到的细胞上清液和细胞沉淀分别单独进行接种(单独接种细胞上清液的目的是因为细胞上清液中会因脂肪油的缘故粘连微量的细胞，单独对上清液进行接种可以进一步保障所收获的细胞不受损失或浪费，因而使初始获得原代细胞量是最大量的，在后续的培养过程中，可通过不断全换液的方式逐渐降低甚至消除脂肪油膜对细胞的干扰和影响。)，放置于30℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中进行培养(蛇作为变温动物之一，其体温会随环境的变化而变化，资料显示眼镜蛇的最适活动温度在30℃左右，超过35℃就会出现厌食、生病等情况，40℃-45℃以上会迅速死亡。本实施案例中同样也将部分蛇接种后的细胞放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中进行培养，实验结果表明其细胞在该环境下，细胞数量会逐渐凋亡且无法增殖，因此在30℃的环境的培养箱中培养)。
8、细胞在接种48h后进行第一次换液，用0.9％的氯化钠溶液轻柔冲洗培养皿表面，去除细胞表面的杂质，更换新鲜的15％FBS的α-MEM培养液。更换过培养液的细胞在显微镜下的照片如图2所示，蛇脂肪组织在接种后，间隔48h换液后细胞在显微镜下呈现的照片形态，从图片可看出细胞数量相较较多，细胞整体呈现梭形、多角的形态，细胞状态也相较良好。
9、随后每隔3天进行一次上述步骤8中描述的换液，第10天在光学显微镜下观察脂肪细胞的生长情况，如图3所示，整个细胞集落状态十分良好，细胞大小良好、细胞集落数量、大小也十分显著，充分表明该细胞具备良好的分化、增殖能力，而且细胞集落数达到4-8个(以100mm细胞培养皿为例)，用0.25％EDTA的胰酶进行消化，进行传代培养。
10、传代后的细胞隔2天进行一次全换液，传代培养在第12天进行第一次换液后，在光学显微镜下观察脂肪细胞的生长情况，如图4所示，从图中显示细胞的整体形态还是比较饱满，细胞贴壁良好，细胞延展性保持较高。
11、第14天进行第二次换液后，在在光学显微镜下观察脂肪细胞的生长情况，如图5所示，图中显示细胞在换液后细胞增殖的情况，从图中可以得到细胞整体增殖水平较高。
12、第16天进行第三次换液后，在光学显微镜下观察脂肪细胞的生长情况，如图6所示，此时细胞可以进行冷冻保存。
采用本实施例的方法从分离到细胞冻存，细胞整体工艺耗时短，细胞增殖快，细胞最终收获量高。
对比例
除了在酶解步骤中采用0.25％EDTA胰酶联合消化30min，其他操作步骤与实施例相同，细胞在接种培养48h进行第一次换液后，在光学显微镜下观察细胞培养情况，如图7所示，与图2对比，发现细胞数量减少，细胞形态变差，说明胰酶消化时长更长会对脂肪目的细胞产生影响，较为直接的影响则是细胞获得的量变少、细胞状态变差。
综上，在本实施例中公开了一种高效的动物源脂肪干细胞分离提取方法及培养方法，属于一种崭新的动物细胞工程技术领域。其操作过程包括采集动物的脂肪组织，去除脂肪的油脂颗粒，使用酶消化方式使脂肪组织变成脂肪细胞，使用70μm细胞筛网过滤组织碎片、残渣等及去除大颗粒脂肪、油脂等，最终获取大量的原代脂肪干细胞。本技术属于一种新型的动物源脂肪干细胞提取技术，制备方式方法简单易获取，成本较低，能从动物脂肪组织获取大量的原代的动物源脂肪干细胞，收获的大量原代细胞通过扩增培养后可用于细胞建库。可作为重要的、充足的细胞工程、组织工程资源。
变温动物脂肪组织相较于人源性脂肪组织，在整个采集过程需要相较更复杂和更高要求的操作，对于整个清洗工艺，动物源脂肪组织需要通过深度清洗和进一步剥离的方式去除或降低大量油膜、油脂等杂质，从而提高脂肪目的细胞的获得率。在整个培养阶段，本发明是以通过间隔换液的方式(2d全换液一次)，加以结合细胞自身竞争增殖的能力，降低红细胞、去除细胞液表面的油性物质，从而保障细胞质量和增殖速率。
而在常规的提取工艺中，是以通过红细胞裂解液的方式破碎红细胞，从而降低红细胞的污染率，但此方式方法会同样对目的细胞产生破坏和影响，以及破碎后的细胞碎片会残留在目的细胞中，同样会影响其细胞的贴壁效率。本发明的方式方法是以在源头充足充分的保障细胞源量，在不对目的细胞产生破坏的情况下，通过有效的物理方式及结合细胞自身的特性(细胞在适应的环境中良性增殖，而不适应环境/培养液的细胞会随着时间及目的细胞越来越多而消亡)保障细胞有效的增殖、扩大培养。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明做出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：清洗、剪碎和离心：将采集到的动物源脂肪组织，采用抗生素的清洗液清洗5-8次，剪碎、离心；
S2：酶解：向离心后的脂肪组织加入同体积的0.15％的I型胶原酶，放置于37℃恒温摇床，转速120-150r/min，消化1h；然后再加入含0.25％EDTA的胰酶继续消化15min后终止酶解、离心；其中，所述含0.25％EDTA的胰酶的体积和I型胶原酶的体积比为1：2-3；
S3：向离心后的底部沉淀物加入培养液过滤，将过滤后的细胞悬液离心，将收集到的细胞上清液和细胞沉淀分别单独接种培养。
2.根据权利要求1所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，所述动物源脂肪来自于变温动物。
3.根据权利要求2所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，所述步骤S1中，无菌采集变温动物源脂肪组织，用75％酒精浸没组织3-5分钟，然后用含抗生素的0.6％-0.9％的Nacl溶液清洗5-8次，同时采用无菌器械剔除脂肪表面的油膜。
4.根据权利要求3所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，所述抗生素选用青链霉素、庆大毒素、两性霉素B、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素或林可霉素中的一种或几种。
5.根据权利要求2或3所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，所述步骤S1中，剪碎、离心：将清洗后的脂肪组织用无菌手术剪剪碎，放入离心管中，加入0.6％-0.9％的Nacl溶液，转速1500r/min，离心5-10min，去除离心管上层的油脂混合液及底部的Nacl溶液，收集脂肪组织。
6.根据权利要求1或2所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，所述步骤S2中，采用含15％FBS的α-MEM培养液终止酶消化，随后离心，转速1500r/min，离心10-15min。
7.根据权利要求1或2所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，所述步骤S3中，收集步骤S2中离心后的沉淀物，加入含15％FBS的α-MEM培养液混匀，随后用70μm细胞筛网或200目滤网过滤；收集过滤后的细胞悬液，转速1500r/min，离心10-15min，随后将离心后的细胞上清液和细胞沉淀单独进行接种，放置于30℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中进行培养。
8.根据权利要求1或2所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，还包括S4：传代培养，待细胞密度长至85％-95％，进行冻存。
9.根据权利要求8所述的动物源脂肪干细胞分离提取方法，其特征在于，所述步骤S4传代培养具体为：步骤S3中细胞沉淀接种48h后进行第一次换液，随后每隔3天进行一次换液，待细胞融合度长到70％-80％，用0.25％EDTA的胰蛋白酶进行消化，并进行传代培养；传代后的细胞每隔2天进行一次换液，待细胞密度长至85％-95％，进行冻存；
其中，培养基换液为：用0.6％-0.9％的氯化钠溶液冲洗培养皿表面，去除细胞表面的杂质，更换新鲜的15％FBS的α-MEM培养液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210263643.XA CN114606183A (zh) | 2022-03-17 | 2022-03-17 | 一种动物源脂肪干细胞分离提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210263643.XA CN114606183A (zh) | 2022-03-17 | 2022-03-17 | 一种动物源脂肪干细胞分离提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114606183A true CN114606183A (zh) | 2022-06-10 |
Family
ID=81865445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210263643.XA Pending CN114606183A (zh) | 2022-03-17 | 2022-03-17 | 一种动物源脂肪干细胞分离提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114606183A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117904036A (zh) * | 2024-03-19 | 2024-04-19 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种通过培养蛇的脂肪细胞生产蛇油的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005287479A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Kazuhisa Maeda | 組織幹細胞採取方法及びそれを利用した装置 |
| CN104673745A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-06-03 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 |
| CN106190967A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-12-07 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法 |
| CN109022358A (zh) * | 2018-10-05 | 2018-12-18 | 淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司 | 促进人脂肪干细胞增殖的方法 |
| CN110438072A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-12 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 脂肪间充质干细胞的制备方法 |
| CN112920993A (zh) * | 2021-04-23 | 2021-06-08 | 扬州大学 | 一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法 |
-
2022
- 2022-03-17 CN CN202210263643.XA patent/CN114606183A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005287479A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Kazuhisa Maeda | 組織幹細胞採取方法及びそれを利用した装置 |
| CN104673745A (zh) * | 2015-02-05 | 2015-06-03 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法 |
| CN106190967A (zh) * | 2016-07-19 | 2016-12-07 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种自体脂肪源干细胞用于美容抗衰的制备方法 |
| CN109022358A (zh) * | 2018-10-05 | 2018-12-18 | 淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司 | 促进人脂肪干细胞增殖的方法 |
| CN110438072A (zh) * | 2019-08-26 | 2019-11-12 | 广东唯泰生物科技有限公司 | 脂肪间充质干细胞的制备方法 |
| CN112920993A (zh) * | 2021-04-23 | 2021-06-08 | 扬州大学 | 一种高纯度的鸭肌内前体脂肪细胞分离方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SHYH-JER HUANG 等: ""Adipose-derived stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential"", 《CELL TRANSPLANT》, vol. 22, no. 4, pages 701 - 709 * |
| 邢昕等: ""体外分离培养人源性脂肪间充质干细胞及其鉴定"", 《中国输血杂志》, vol. 26, no. 08, pages 709 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117904036A (zh) * | 2024-03-19 | 2024-04-19 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种通过培养蛇的脂肪细胞生产蛇油的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104450611A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN113249317A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞的分离培养扩增方法及系统 | |
| CN105586309A (zh) | 一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN107043746A (zh) | 一种人脐带组织消化方法 | |
| CN111139221B (zh) | 一种羊膜间充质干细胞的培养及冻存方法 | |
| CN111088226A (zh) | 一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法 | |
| CN108315297A (zh) | 一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法 | |
| CN115322964B (zh) | 一种3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法 | |
| CN114606183A (zh) | 一种动物源脂肪干细胞分离提取方法 | |
| CN114045255B (zh) | 一种肾小管上皮细胞分离与培养方法 | |
| CN115851587A (zh) | 一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法 | |
| CN110791474A (zh) | 一种髓核细胞的分离及体外培养方法 | |
| CN106399236A (zh) | 一种促进脂肪干细胞生长的培养方法 | |
| WO2022056991A1 (zh) | 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110295141A (zh) | 一种脐带间充质干细胞的制备方法 | |
| CN114533957A (zh) | 胎盘平滑绒毛膜脱细胞外基质材料的制备方法 | |
| CN109771697B (zh) | 一种真皮成纤维细胞皮片及其构建方法和应用 | |
| CN108728411B (zh) | 一种脂肪干细胞的分离培养方法 | |
| CN115725498A (zh) | 一种人胎盘组织源蜕膜间充质干细胞的简易制备方法 | |
| CN113481153A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN110951683A (zh) | 一种牙髓干细胞的制备方法 | |
| CN111979188A (zh) | 一种胎盘间充质干细胞分离培养扩增方法 | |
| CN110592005A (zh) | 间充质干细胞的分离方法 | |
| CN109810942A (zh) | 一种脐带间充质干细胞的制备方法 | |
| CN114369569B (zh) | 脐带沃顿胶间充质干细胞的分离方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |