CN110295141A - 一种脐带间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于干细胞制备领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法。本发明采用了一种脐带间充质干细胞的制备方法，即采用了组织块贴壁的方法制备脐带间充质干细胞，即将脐带清洗后，去除脐带动脉和静脉膜，用手术剪刀剪成小的组织块，再将组织块筛选清洗后，贴在培养皿底部，经37度烤干后，加入培养液，置于CO2培养箱中培养，12‑‑14天后消化、收集细胞。使用该方法成功收集了足量的脐带间充质干细胞。使用该方法成功收集了足量的脐带间充质干细胞，从而解决了现有的组织块法收获细胞效率低下的问题。

Description

一种脐带间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明属于干细胞制备领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的制备方法。
背景技术
目前从脐带组织中提取间充质干细胞有2种方法，一种是酶消化，另一种是组织块贴壁。组织块法较酶消化法而言，其成本较低，操作也方便，为目前使用较为普遍的一种提取脐带间充质干细胞的方法。不过目前使用的组织块贴壁法还是有一定的缺点，以前是采用将组织块一个个贴到平面底部，这样虽然可以保证皿底整洁干净无粘液，但此方法效率低，耗费时间长；现有的组织块贴壁法一般是将组织块剪碎后直接铺散在平皿底部，这样做虽然缩短了接种时间，但无法去除剪碎过程中产生的粘液和过小的组织碎屑，在后续的培养过程中会影响细胞的爬出和生长，因此，现有的组织块法收获细胞的效率仍然较为低下。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种新的脐带间充质干细胞的制备方法，使用该方法成功收集了足量的脐带间充质干细胞，从而解决了现有的组织块法收获细胞效率低下的问题。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)组织块贴壁：清洗脐带表面粘液和血渍，将脐带剪成1.5-2.5cm左右的小段，去除脐带2根动脉和静脉膜，用剪刀剪碎成小块，清洗过滤后接种至培养皿中，将培养皿置于37度培养箱中烤干；
(2)组织培养：烤干后，在培养皿中加入4-6ml培养液，于37度培养箱中静置培养；培养第三天补加4-6ml培养液，第7--8天换液；
(3)收获细胞：第12--14天，镜下观察细胞集落生长情况；轻轻剔除组织块，加入消化液消化，获得脐带间充质干细胞。
整个过程无需酶消化，而采用组织块贴壁来获取脐带间充质干细胞。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以作如下改进：
进一步的，用于清洗脐带表面粘液和血渍的清洗液为含1％双抗的PBS或者生理盐水。
进一步的，过滤用的滤网为8目和16目滤网，获得组织块大小为1-2mm之间。
进一步的，所述烤干的时间为2--3小时。
进一步的，所述培养液为含有20％胎牛血清的a-MEM或D-MEM培养液。
与现有技术相比本发明的有益效果为：本发明采用了一种新的脐带间充质干细胞的制备方法，使用该方法成功收集了足量的脐带间充质干细胞，从而解决了现有的组织块法收获细胞效率低下的问题。
(1)获得的组织块大小均匀，贴壁时间较一致，易于控制烤干时间；
(2)皿底没有粘液和组织碎屑的干扰，为细胞爬出和生长提供了充足的空间；
(3)与现用的方法相比，每皿可以长出更多的细胞集落，收获更多的原代细胞。
附图说明
图1：本发明所述的脐带间充质干细胞培养7天照片；
图2：本发明所述的脐带间充质干细胞培养13天照片；
图3：本发明所述的脐带间充质干细胞P5代照片(左图为40X，右图为100X)；
图4：本发明所述的羊脐带间充质干细胞P5代的流式数据图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。根据权利要求书和下面的说明，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比率，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
实施例
1.将脐带从保存液中取出，置于150mm平皿中，用手术剪刀将脐带剪成2cm的小段；用止血钳挑出脐带的2根动脉；手术剪刀剪开脐带静脉，用止血钳刮去静脉膜；去除动脉和静脉膜的脐带组织置于50ml离心管中，加30ml含1％双抗的生理盐水清洗，反复清洗10次；清洗后的脐带组织放入新的50ml离心管中，用新的手术剪刀剪10分钟；加入30ml含1％双抗的生理盐水，摇匀；将组织混合液依次过8目滤网和16目滤网，吸取中间层1-2mm大小的组织块，置于50ml离心管中，加20ml新鲜培养液重悬；400g离心3分钟，倒去上清；用一次性吸管吸取0.5ml的组织沉淀放入100mm培养皿中，用吸管分摊均匀，一共铺10个平皿；放入37度培养箱2个小时；
2.取出培养皿，每个皿加入5ml含20％胎牛血清的a-MEM培养液，置于37度CO2培养箱中培养；培养第三天，每皿补加5ml含20％胎牛血清的a-MEM培养液；培养第六天观察到有细胞从组织块周围游离出；培养第七天换液，每皿加10ml含20％胎牛血清的a-MEM培养液；培养第10天，组织块周围形成中等大小集落，轻轻敲击平皿，促使大部分组织块从皿底脱离；
3.培养第13天，镜下观察细胞已经形成较大集落，集落中心细胞开始老化，开始收获原代细胞；用一次性吸管轻轻剔除剩余贴壁的组织块；倒去皿中培养液，每皿加10ml生理盐水清洗，倒去清洗液；每皿加3ml Tryple消化液，于37度培养箱中消化3分钟；每皿加入3ml生理盐水终止消化；吹打后装入50ml离心管，取样计数；细胞连续培养传代至P5代，消化细胞，检测克隆率和表面标记。图1-图3分别为羊脐带间充质干细胞培养第7天，13天和P5代的照片。
如图4所示的羊脐带间充质干细胞P5代的流式数据图细胞检测数据：原代平均每皿收获细胞为4.5*10^5个；P5代细胞的克隆效率为4.6％，用流式细胞仪检测表面标记结果为：CD73:99.4％CD90:99.7％CD105:99.8％CD31:0.79％CD34:0.26％CD45:0.65％HLA-DR:6.74％。
显然，本领域的技术人员可以对发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包括这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)组织块贴壁：清洗脐带表面粘液和血渍，将脐带剪成1.5-2.5cm左右的小段，去除脐带2根动脉和静脉膜，用剪刀剪碎成小块，清洗过滤后接种至培养皿中，将培养皿置于37度培养箱中烤干；
(2)组织培养：烤干后，在培养皿中加入4-6ml培养液，于37度培养箱中静置培养；培养第三天补加4-6ml培养液，第7--8天换液；
(3)收获细胞：第12--14天，镜下观察细胞集落生长情况；轻轻剔除组织块，加入消化液消化，获得脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，用于清洗脐带表面粘液和血渍的清洗液为含1％双抗的PBS或者生理盐水。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，过滤用的滤网为8目和16目滤网，获得组织块大小为1-2mm之间。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述烤干的时间为2--3小时。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养液为含有20％胎牛血清的a-MEM或D-MEM培养液。
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CN113604428A (zh) * 2021-08-19 2021-11-05 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种人脐带来源间充质干细胞的原代分离方法

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