CN107227295A - 脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法 - Google Patents

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周彦恒
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Abstract

本发明公开了脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法，该方法包括选牙、乳牙切割、乳牙干细胞分离，乳牙干细胞培养增殖等步骤，本发明的有益效果是：通过本方法获得纯化的人脱落乳牙干细胞，在一定条件下可向特定的细胞类型包括成骨细胞、成脂肪细胞、神经细胞等分化，为牙髓干细胞的研究提供更广阔的空间。

Description

脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法，通过人脱落乳牙干细胞进行分离，然后利用有限稀释法克隆纯化人脱落乳牙干细胞，并使人脱落乳牙干细胞得到增殖。
背景技术
干细胞是一种具有多分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞。根据细胞来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是最原始的干细胞，它位于个体发育的顶端，能够分化为组成机体的所有类型的细胞，进而形成机体的任何组织和器官，具有发育的全能性。但是胚胎干细胞的研究利用牵涉到一定的伦理问题。成体干细胞是成体组织中具有自我更新能力和定向分化潜能的细胞，其存在使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。大量研究表明成体干细胞已经可以从多种组织器官中分离培养出来，其多向分化潜能及可塑性也得到了公认。
随着干细胞研究的进一步发展，人们发现成体干细胞还存在于口腔组织的牙髓、牙周膜、牙胚、口腔上皮等组织。这些组织来源的成体干细胞同样具有多向分化潜能，可以向骨、软骨、脂肪等组织分化，但在细胞生物学特性以及分化潜能上又存在一定区别。其中，人脱落乳牙干细胞具有离成熟细胞近、可塑性强、免疫排斥小以及高度增殖能力和多向分化的潜能。
人脱落乳牙干细胞作为一种有很大潜能的干细胞，在牙髓干细胞的研究中有较大的应用前景。因此，人脱落乳牙组织的分离和体外增殖成为干细胞分化的基础，如何有效得获得人脱落乳牙干细胞成为研究的关键。
为了解决上述问题，选择并收集6-10岁健康儿童因滞留而拔除的，无牙体牙髓疾病的乳牙，使用酶消化分离法得到原代人脱落乳牙干细胞，再利用有限稀释克隆法分离纯化，最终获得纯化后的人脱落乳牙干细胞。有益效果是：通过此方法获得纯化的人脱落乳牙干细胞，在一定条件下可向特定的细胞类型包括成骨细胞、成脂肪细胞、神经细胞等分化，为牙髓干细胞的研究提供更广阔的空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法。
为实现上述方法，本发明提供如下技术方案：
脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤a，选择并收集6-10岁健康儿童因滞留而拔除的，无牙体牙髓疾病的乳牙。拔除后立即放入装有含PBS试剂的试管中保存备用，在4小时内进行取材；
步骤b，取出所述乳牙，无菌条件下沿牙齿长轴劈开牙冠，取出冠根部牙髓，在超净台内切除根尖部的牙髓组织，置于含有不完全培养液的EP管内，用无菌PBS反复洗涤后放入培养皿中。在培养皿中用眼科剪将牙髓组织剪成小块，并置于无菌离心管中；
步骤c，将所述牙髓组织消化，离心分离，再经培养获得原代人脱落乳牙干细胞；
步骤d，采用有限稀释法克隆纯化所述原代人脱落乳牙干细胞，使所述原代人脱落乳牙干细胞增殖。
所述步骤c中还包括以下分步骤：
分步骤1，在所述无菌离心管中加入3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml Dispase酶各1ml，将所述无菌离心管置入恒温(37℃)水浴箱中消化。多次摇晃，直至所述牙髓组织呈絮状；
分步骤2，所述牙髓组织经消化后，在所述无菌离心管中以1000r/min离心10分钟,使用所述PBS试剂洗涤2次且每次离心2分钟，弃上清液从而洗净消化酶得到沉淀；
分步骤3，用培养液将所述沉淀充分混匀，反复吹打以离散细胞团块，通过高压灭菌后的细胞筛网，获得单细胞悬液；
分步骤4，将所述单细胞悬液接种于塑料培养瓶中，在37℃,5％CO2等温箱标准条件下培养。培养48-72小时后，弃去培养液，用所述PBS试剂洗涤三次，以去除未贴壁的细胞；
分步骤5,对上述细胞继续培养，每隔3天换完全培养液一次。用倒置显微镜观察细胞，记录细胞形态及生长情况并拍照；
分步骤6，当细胞90％长满瓶底时，使用浓度为0.25％的胰蛋白酶室温消化3-5分钟,在所述离心管中以1000r/min离心5分钟，弃上清液得到原代人脱落乳牙干细胞。
所述步骤d中还包括以下分步骤：
分步骤01，取所述原代人脱落乳牙干细胞中处于对数生长期的细胞，用特定培养基倍比稀释，调整细胞浓度并充分吹打混匀，接种于96孔培养板；
分步骤02，经24小时后，在所述96孔培养板中标记单个细胞孔，每2-3天更换所述培养液。待80-90％长满所述96孔培养板的孔底后，使用所述浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，扩大培养。
本发明的有益效果是：通过本方法获得纯化的人脱落乳牙干细胞，在一定条件下可向特定的细胞类型包括成骨细胞、成脂肪细胞、神经细胞等分化，为牙髓干细胞的研究提供更广阔的空间。
附图说明
图1是本发明实施例1的整体流程示意图；
图2是本发明实施例1的消化，离心分离，培养的过程示意图；
图3是本发明实施例1中原代人脱落乳牙干细胞在显微镜下的示意图；
图4是本发明实施例1中使用有限稀释法克隆纯化原代人脱落乳牙干细胞的过程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参照图1所示脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法，该方法包括以下步骤：选择并收集6-10岁健康儿童因滞留而拔除的，无牙体牙髓疾病的乳牙1。拔除后立即放入装有含PBS试剂2的试管3中保存备用，在4小时内进行取材。之后取出所述乳牙1，无菌条件下沿牙齿长轴劈开牙冠，取出冠根部牙髓4，在超净台5内切除根尖部的牙髓组织6，置于含有不完全培养液的EP管7内，用无菌PBS试剂2反复洗涤后放入培养皿8中。在培养皿8中用眼科剪9将牙髓组织剪成小块，并置于无菌离心管10中。然后将所述牙髓组织消化，离心分离，再经培养获得原代人脱落乳牙干细胞11。采用有限稀释法克隆纯化所述原代人脱落乳牙干细胞11，使所述原代人脱落乳牙干细胞11增殖。
参照图2所示所述牙髓组织消化，离心分离，再经培养获得原代人脱落乳牙干细胞的过程还包括以下步骤：
在所述无菌离心管10中加入3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml Dispase酶各1ml，将所述无菌离心管10置入恒温(37℃)水浴箱12中消化。多次摇晃，直至所述牙髓组织呈絮状；
所述牙髓组织6经消化后，在所述无菌离心管10中以1000r/min离心10分钟,使用所述PBS试剂2洗涤2次且每次离心2分钟，弃上清液从而洗净消化酶得到沉淀13；
用培养液将所述沉淀充分混匀，反复吹打以离散细胞团块，通过高压灭菌后的细胞筛网14，获得单细胞悬液15；
将所述单细胞悬液15接种于塑料培养瓶16中，在37℃,5％CO2等温箱标准条件下培养。培养48-72小时后，弃去培养液，用所述PBS试剂洗涤三次，以去除未贴壁的细胞；
对上述细胞继续培养，每隔3天换完全培养液一次。参照图3所示用倒置显微镜观察细胞，记录细胞形态及生长情况并拍照；
当细胞90％长满瓶底时，使用浓度为0.25％的胰蛋白酶室温消化3-5分钟,在所述离心管10中以1000r/min离心5分钟，弃上清液得到原代人脱落乳牙干细胞11。
参照图4所示有限稀释法克隆所述原代人脱落乳牙干细胞的过程包括以下步骤：
取所述原代人脱落乳牙干细胞11中处于对数生长期的细胞，用特定培养基17倍比稀释，调整细胞浓度并充分吹打混匀，接种于96孔培养板18；
经24小时后，在所述96孔培养板18中标记单个细胞孔，每2-3天更换所述培养液。待80-90％长满所述96孔培养板的孔底后，使用所述浓度为0.25％的胰蛋白酶19消化，扩大培养。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤a，选择并收集6-10岁健康儿童因滞留而拔除的，无牙体牙髓疾病的乳牙，拔除后立即放入装有含PBS试剂的试管中保存备用，在4小时内进行取材；
步骤b，取出所述乳牙，无菌条件下沿牙齿长轴劈开牙冠，取出冠根部牙髓，在超净台内切除根尖部的牙髓组织，置于含有不完全培养液的EP管内，用无菌PBS反复洗涤后放入培养皿中，在培养皿中用眼科剪将牙髓组织剪成小块，并置于无菌离心管中；
步骤c，将所述牙髓组织消化，离心分离，再经培养获得原代人脱落乳牙干细胞；
步骤d，采用有限稀释法克隆纯化所述原代人脱落乳牙干细胞，使所述原代人脱落乳牙干细胞增殖。
2.根据权利要求1所述的脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于：所述步骤c中还包括以下分步骤：
分步骤1，在所述无菌离心管中加入3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml Dispase酶各1ml，将所述无菌离心管置入恒温(37℃)水浴箱中消化，多次摇晃，直至所述牙髓组织呈絮状；
分步骤2，所述牙髓组织经消化后，在所述无菌离心管中以1000r/min离心10分钟,使用所述PBS试剂洗涤2次且每次离心2分钟，弃上清液从而洗净消化酶得到沉淀；
分步骤3，用培养液将所述沉淀充分混匀，反复吹打以离散细胞团块，通过高压灭菌后的细胞筛网，获得单细胞悬液；
分步骤4，将所述单细胞悬液接种于塑料培养瓶中，在37℃,5％CO2等温箱标准条件下培养，培养48-72小时后，弃去培养液，用所述PBS试剂洗涤三次，以去除未贴壁的细胞；
分步骤5,对上述细胞继续培养，每隔3天换完全培养液一次，用倒置显微镜观察细胞，记录细胞形态及生长情况并拍照；
分步骤6，当细胞90％长满瓶底时，使用浓度为0.25％的胰蛋白酶室温消化3-5分钟,在所述离心管中以1000r/min离心5分钟，弃上清液得到原代人脱落乳牙干细胞。
3.根据权利要求1所述的脱落乳牙干细胞的分离与体外增殖方法，其特征在于：所述步骤d中还包括以下分步骤：
分步骤01，取所述原代人脱落乳牙干细胞中处于对数生长期的细胞，用特定培养基倍比稀释，调整细胞浓度并充分吹打混匀，接种于96孔培养板；
分步骤02，经24小时后，在所述96孔培养板中标记单个细胞孔，每2-3天更换所述培养液，待80-90％长满所述96孔培养板的孔底后，使用所述浓度为0.25％的胰蛋白酶消化，扩大培养。
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