CN107267447A

CN107267447A - 一种表皮干细胞的富集方法

Info

Publication number: CN107267447A
Application number: CN201710460498.3A
Authority: CN
Inventors: 王丹丹; 卢永波; 李潇; 吴迪
Original assignee: Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-06-18
Filing date: 2017-06-18
Publication date: 2017-10-20

Abstract

本发明提供一种表皮干细胞的富集方法，涉及生物细胞技术领域，能够在短时间内获得纯度较高的表皮干细胞。表皮干细胞的富集方法包括如下几个步骤：步骤一、利用无血清培养基对表皮干细胞进行富集；步骤二、利用IV型胶原对表皮干细胞进行二次富集。

Description

一种表皮干细胞的富集方法

技术领域

本发明涉及生物细胞技术领域，尤其涉及一种表皮干细胞的富集方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，也是人体的第一道防线。表皮干细胞位于皮肤表皮的基底层，具有多种分化潜能以及高度增殖的能力。表皮干细胞最显著的特征是慢周期性和自我更新能力，它不仅可以保持细胞恒定，还是皮肤及其附属器官发生、改建和修复的关键性功能细胞。随着组织工程、基因工程等科技领域的发展，大面积烧伤、严重创伤后的皮肤缺损的修复等临床问题的出现，以及毒理学的皮肤刺激性评价的替代材料需求的日益提高，表皮干细胞的分离和培养，以及如何维持其干性，利用表皮干细胞构建动物替代皮肤模型，成为了研究人员的关注重点。

由于组织结构和遗传发育背景的一致性，表皮干细胞在皮肤组织工程的研究中具有天然优势；研究表明，如连续传代培养，表皮干细胞可进行140次分裂，即能产生1×10⁴⁰个子代细胞。近年来，国内外学者应用多种方法体外分离、培养表皮干细胞均获得了成功，但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法。

表皮干细胞纯化培养的技术方法主要包括细胞外基质快速黏附法、流式细胞仪分选法、低密度单克隆筛选法等。细胞外基质快速黏附法是利用不同细胞的贴壁时间及粘附性能不同，从而达到分离的效果。利用Ⅰ型、Ⅳ型胶原快速粘附法快速的分离和筛选富集表皮干细胞应用越来越广泛。但也有部分学者认为利用该法筛选的表皮干细胞中含有少量的非表皮干细胞存在，不够充分精确。利用流式细胞仪进行表皮干细胞的分选，受抗体和细胞数量的影响，不能达到快速且准确的分离和富集表皮干细胞的目的。低密度单克隆筛选，是将细胞以克隆密度接种于含有滋养细胞的培养皿，培养后计算克隆形成率，再将单个克隆挑取出来分散成单细胞接种培养，若一个克隆中95%以上细胞能再次形成细胞数大于50的克隆，即认为该克隆是干细胞的克隆。该方法对实验室的无菌条件和操作者的操作技术水平要求较高，非简便易行的方法。胰蛋白酶差速脱壁法主要是利用胰蛋白酶分离培养最先脱壁的细胞，再用胰蛋白酶消化未脱壁细胞，分别培养，多次后分离和纯化表皮干细胞。该法虽然简便易行，但得到纯化的表皮干细胞需要较长时间。

发明内容

本发明提供了一种表皮干细胞的富集方法，能够在短时间内获得纯度较高的表皮干细胞。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

步骤一、利用无血清培养基对表皮干细胞进行富集；

步骤二、利用型胶原对表皮干细胞进行二次富集。

进一步地，所述步骤一具体包括如下几个步骤：

（1）将三种商用无血清培养基MCDB153、K-SFM和KMG中的任意两种培养基按照1:1的比例配制的混合培养基；

（2）将G418加入混合培养基中，G418的浓度范围为500~800μg/mL，配制完成的培养基放入4℃冰箱保存待用；G418能抑制成纤维细胞生长，去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞和黑色素细胞；

（3）在无菌条件下切取皮肤，去除疏松结缔组织，用PBS进行浸洗；将组织切割成3mm×9mm大小，每15块组织放入1个25mL血清瓶中，加入质量分数为1%的Dispase酶和0.3mg/mL的透明质酸酶消化8h，后分离表皮和真皮层，表皮中加入胰酶消化液，37℃、5%CO₂培养箱中消化10min，消化完成后，每个25mL消化瓶中加入0.1的胎牛血清的DMEM培养终止消化，后过200目网筛，800rpm离心6 min，弃上清，用PBS轻柔吹打细胞，至细胞悬液完全混匀，用计数板计数；

（4）根据计数结果，按照5E6~8E6/瓶进行接种，每瓶加入15mL上述混合培养基，放入37℃ 5% CO₂培养箱中进行培养，24h后轻轻倒掉上清液，每瓶用10mL的混合培养基吹打细胞，直至所用的贴壁细胞全部脱落，吸出细胞混合悬液，800rpm离心6 min，弃上清；再次加入上述混合培养基5mL，重悬细胞，并移入T75一次性培养瓶，用5mL混合培养基清洗离心管，一同加入培养瓶，再给培养瓶中加入5mL上述培养基，放入37℃ 5% CO₂培养箱中进行培养；培养24h后，按照上述方法得到第2代细胞。

进一步地，所述步骤二具体包括如下几个步骤：

（1）型胶原以醋酸溶解并以0.01mol/LPBS稀释至0.1g/L，无菌过滤后，在六孔板的每孔中加入50~100μL，确保涂满6孔板，置4℃冰箱过夜，弃上清，40℃干燥箱烘干，紫外线照射2h消毒备用；用0.01mol/LPBS漂洗3次，洗去未贴壁的胶原；置37℃自然干燥后，再重复2~3次，得到预铺型胶原的6孔培养板；

（2）将利用无血清培养基富集得到的第2代表皮干细胞悬液1.0E5~5E5/mL接种于预铺型胶原的6孔培养板，37℃、5% CO₂培养箱内静置20min；吸出培养液和未贴壁的细胞，PBS清洗3次，去除残留细胞，保证型胶原表面附着性质均一的表皮干细胞；

（3）用原代消化液消化粘附于型胶原表面的表皮干细胞，离心获得表皮干细胞沉淀。使用表皮细胞培养液重悬细胞干细胞，得到纯度较高的第三代表皮干细胞。

进一步地，所述原代消化液为质量分数为0.25%的胰酶消化液。

本发明实施例提供一种表皮干细胞的富集方法，该方法包括如下几个步骤：步骤一、利用无血清培养基对表皮干细胞进行富集；步骤二、利用型胶原对表皮干细胞进行二次富集。基于上述实施例的描述，该方法能够在短时间内获得纯度较高的表皮干细胞。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。

实施例1

本实施例中，表皮干细胞的富集方法，包括G418浓度筛选、细胞富集和结果鉴定，具体步骤为：

1、G418浓度筛选

选取实验室培养的人皮肤成纤维细胞，按照每孔100个细胞进行铺板，体积100μL，G418浓度梯度为0，50，100，150，200，300，400，500，600，700，800，900，1000μg/mL，每个浓度设2个平行，培养时间为10天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，筛选出最适合用于筛选成纤维细胞的浓度，最终选取500μg/mL作为混合培养基中的浓度；

2、细胞富集

（a）将K-SFM和KMG两种培养基按照1:1的比例配制成500mL的混合培养基，混合后添加G418，G418的浓度为500μg/mL。人胎型胶原以醋酸溶解并以0.01mol/LPBS稀释至0.1g/L，无菌过滤后，在六孔板的每孔中加入60μL，确保涂满6孔板，置4℃冰箱过夜，弃上清，用0.01mol/LPBS漂洗3次，洗去未贴壁的胶原，40℃干燥箱烘干，得到预铺型胶原的6孔培养板，紫外线照射2h消毒备用。

（b）选取正常人包皮组织，在无菌条件下，用PBS溶液浸洗直至无血污，将组织切割成3mm×9mm大小，用质量分数为1%的Dispase酶和0.3mg/mL的透明质酸酶消化8h，分离表皮和真皮，表皮中加入0.25%的胰酶消化液，37℃、5%CO₂培养箱中消化10min，消化完成后，加入0.1的胎牛血清培养液终止消化，后过200目网筛，800rpm离心6 min，弃上清，用PBS轻柔吹打细胞，至细胞悬液完全混匀，用计数板计数。用表皮细胞培养液按照3E6/瓶接种一瓶，后续待用。

（c）根据计数结果，按照5E6/瓶进行接种，每瓶加入15mL上述混合培养基，放入37℃ 5%CO₂培养箱中进行培养，24h后轻轻倒掉上清液，每瓶用10mL的混合培养基吹打细胞，直至所用的贴壁细胞全部脱落，吸出细胞混合悬液，800rpm离心6 min，弃上清。再次加入上述混合培养基5mL，重悬细胞，并移入T75一次性培养瓶，用5mL混合培养基清洗离心管，一同加入培养瓶，再给培养瓶中加入5mL上述培养基，放入37℃ 5% CO₂培养箱中进行培养。培养24h后，按照上述方法得到第2代细胞。

（d）将利用无血清培养基富集得到的第2代表皮干细胞悬液按照5E5/mL接种于预铺型胶原的6孔培养板，37℃、5% CO₂培养箱内静置20min。吸出培养液和未贴壁的细胞，PBS清洗3次，去除残留细胞，保证型胶原表面附着性质均一的表皮干细胞。

（e）用原代消化液（质量分数为0.25%的胰酶消化液）消化粘附于IV型胶原表面的表皮干细胞，离心获得表皮干细胞沉淀。使用表皮细胞培养液重悬表皮干细胞，得到纯度较高的第3代表皮干细胞。

3、结果鉴定

分别取表皮细胞第1代、第3代，吸掉培养液，用胰酶消化液消化得到表皮细胞，后用1%BSA洗涤后制成细胞悬液，按照每孔1E6个细胞接种于6孔板。对照孔中只加入PE标记的小鼠IgG1抗体及FITC标记的小鼠IgG1抗体，其他孔中分别加入FITC标记的小鼠抗人细胞表面分子CD29、CD49f抗体。室温孵育30min，用含1%BSA的PBS洗涤后，流式细胞仪检测。结果显示，第1代表皮细胞CD29阳性率为93.24%，CD49f阳性率为88.45%，而经过本发明方法富集后，第3代表皮细胞CD29阳性率为96.89%，CD49f阳性率为96.72%。由此说明，使用本发明方法进行表皮干细胞的富集，不仅时间短，而且富集效果明显，能够应用于体外3D皮肤的重建。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种表皮干细胞的富集方法，其特征在于，所述表皮干细胞的富集方法包括如下几个步骤：

步骤一、利用无血清培养基对表皮干细胞进行富集；

步骤二、利用IV型胶原对表皮干细胞进行二次富集。

2.根据权利要求1所述的表皮干细胞的富集方法，其特征在于，所述步骤一具体包括如下几个步骤：

（3）在无菌条件下切取皮肤，去除疏松结缔组织，用PBS进行浸洗；将组织切割成3mm×9mm大小，每15块组织放入1个25mL血清瓶中，加入质量分数为1%的Dispase酶和0.3mg/mL的透明质酸酶消化8h，后分离表皮和真皮层，表皮中加入胰酶消化液，37℃、5%CO2培养箱中消化10min，消化完成后，每个25mL消化瓶中加入0.1的胎牛血清的DMEM培养终止消化，后过200目网筛，800rpm离心6 min，弃上清，用PBS轻柔吹打细胞，至细胞悬液完全混匀，用计数板计数；

（4）根据计数结果，按照5E6~8E6/瓶进行接种，每瓶加入15mL上述混合培养基，放入37℃ 5% CO2培养箱中进行培养，24h后轻轻倒掉上清液，每瓶用10mL的混合培养基吹打细胞，直至所用的贴壁细胞全部脱落，吸出细胞混合悬液，800rpm离心6 min，弃上清；再次加入上述混合培养基5mL，重悬细胞，并移入T75一次性培养瓶，用5mL混合培养基清洗离心管，一同加入培养瓶，再给培养瓶中加入5mL上述培养基，放入37℃ 5% CO2培养箱中进行培养；培养24h后，按照上述方法得到第2代细胞。

3.根据权利要求1或2所述的表皮干细胞的富集方法，其特征在于，所述步骤二具体包括如下几个步骤：

（1）IV型胶原以醋酸溶解并以0.01mol/LPBS稀释至0.1g/L，无菌过滤后，在六孔板的每孔中加入50~100μL，确保涂满6孔板，置4℃冰箱过夜，弃上清，40℃干燥箱烘干，紫外线照射2h消毒备用；用0.01mol/LPBS漂洗3次，洗去未贴壁的胶原；置37℃自然干燥后，再重复2~3次，得到预铺IV型胶原的6孔培养板；

（2）将利用无血清培养基富集得到的第2代表皮干细胞悬液1E5~5E5/mL接种于预铺IV型胶原的6孔培养板，37℃、5% CO2培养箱内静置20min；吸出培养液和未贴壁的细胞，PBS清洗3次，去除残留细胞，保证IV型胶原表面附着性质均一的表皮干细胞；

（3）用原代消化液消化粘附于IV型胶原表面的表皮干细胞，离心获得表皮干细胞沉淀,

使用表皮细胞培养液重悬细胞干细胞，得到纯度较高的第三代表皮干细胞。

4.根据权利要求3所述的表皮干细胞的富集方法，其特征在于，所述原代消化液为质量分数为0.25%的胰酶消化液。