CN105274055A - 神经元原代培养的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种神经元原代培养的纯化方法，包括步骤:提供神经组织后的酶解消化步骤，密度梯度离心法分离细胞步骤，接种细胞步骤和应用差速黏附特性分离细胞步骤，最后用阿糖胞苷(Ara-C)纯化，以获取神经元。显著缩短背根神经节(DRG)神经元的原代培养纯化周期，并明显提高神经元纯度，且保证细胞的良好活力，有利于细胞的培养和生长，为进一步开展实验奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及细胞培养，特别涉及神经元培养的纯化方法。
背景技术
神经细胞(包括神经元和神经胶质细胞)是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元是具有长突起的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。神经元是具有长突触(轴突)的细胞，它由细胞体和细胞突起构成。神经元的胞体(soma)在于脑和脊髓的灰质及神经节内，其形态各异，常见的形态为星形、锥体形、梨形和圆球形状等。胞体大小不一，直径在5～150μm之间。胞体是神经元的代谢和营养中心。
背根神经节神经元(dorsalrootganglion,DRG)是将初级感觉信息传入中枢的第一中继站，在感觉信息传递途径中有重要作用。周围神经损伤与变性疾病在临床上是较为常见的疾病，常常会累及感觉神经元-背根神经节神经元，为探究其损伤与修复机制，体外培养DRG神经元是重要的实验技术。目前，在DRG神经元的原代培养过程上，常使用阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)抑制神经胶质细胞的生长以纯化DRG神经元，这种方法仍然存在一些问题：由于需要多轮纯化，获得纯度较高的DRG神经元需要的周期较长，同时Ara-C对神经元的细胞活力也有一定影响；此外，Ara-C试剂生产厂家不同、批号不一，会造成纯化次数不定、纯度不能保证、不同批次培养的细胞差异性较大等问题。因此，为了解决上述现有技术中存在的缺陷，本发明对DRG神经元原代培养中的纯化方法进行了改良，以克服传统方法的不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种神经元原代培养的纯化方法。
为解决上述问题，本发明第一方面提供的技术方案是:神经元原代培养的纯化方法，
其特点在于，包括如下步骤
(1)提供神经组织；
(2)酶解消化神经组织：将Ⅰ型胶原蛋白酶加入神经组织，36-38℃进行消化，消化完毕吸去Ⅰ型胶原蛋白酶，再加入胰酶36-38℃消化，最后用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM完全培养基终止消化，800-1500r/min离心后弃上清；
(3)密度梯度离心法分离细胞：将步骤(2)消化后获得的细胞沉淀重悬于15％牛血清白蛋白(BSA)溶液中，800-1500r/min离心后弃上清；
(4)接种细胞：用DMEM完全培养基重悬前述步骤获得的细胞沉淀，过400目筛网，细胞计数后接种到培养板；
(5)应用差速黏附特性分离细胞：细胞接种6～8h后，观察到所有细胞已完全贴壁，用移液器轻轻均匀吹打细胞，当显微镜下观察到大部分神经细胞已被吹起而重新悬浮后，立即将含悬浮细胞的培养液转移至离心管中，800-1500r/min离心，弃上清后重悬；
(6)Ara-C纯化：细胞重新计数后用含10％FBS的神经元培养液接种到培养板，培养12～16h，用神经元纯化培养液纯化1d-2d后更换为神经元培养液，培养温度37℃，培养24h后收获神经元。
本发明的一优选技术方案中，前述步骤(2)、(3)、(5)中的离心转速优选为1000r/min，离心时间5min。前述Ⅰ型胶原蛋白酶、胰酶优选的消化温度为37℃。
本发明的一优选技术方案中，所述步骤(2)中，Ⅰ型胶原蛋白酶的浓度为3mg/mL，消化时间为30min。
本发明的一优选技术方案中，所述步骤(2)中，胰酶的浓度为0.25％，消化时间为20min。
本发明的一优选技术方案中，所述步骤(4)中，细胞接种密度为(1～1.5)×105/孔，优选为6孔培养板。
本发明的一优选技术方案中，所述步骤(6)中的细胞接种密度为(2～3)×104/孔，优选为24孔培养板。
本发明的一优选技术方案中，所述步骤(6)中神经元培养液为Neurobasal培养基添加2％B27、2mmol/LL-谷氨酰胺；神经元纯化培养液为神经元培养液添加10μmol/LAra-C。
本发明的一优选技术方案中，本方法的1个周期为4d-5d时间。
本发明的一优选技术方案中，所述的神经元为DRG神经元，感觉神经元。
本发明的一优选技术方案中，所述的神经元来自哺乳动物。
本发明的一优选技术方案中，所有培养板均预先用PLL包被待用。
神经元，是不同于神经胶质细胞的一种神经细胞，根据分类方法的不同，神经元有很多种类：根据神经元突起的数目分类，可以分为假单极神经元，双极神经元，多极神经元；根据神经元的功能，分为感觉神经元，运动神经元，中间神经元；按照释放的递质的不同，分为胆碱能神经元，胺能神经元，氨基酸能神经元，肽能神经元。
本发明中“神经元”来自哺乳动物，包括但不限为大鼠、小鼠、兔子、猫、狗。
现有技术中通常神经元原代培养的纯化周期长达10d，而本发明方法的1个周期至多仅需要5d。本发明特别优选用于DRG神经元的原代培养。
本发明根据神经元和神经胶质细胞的体积与密度的差异，使用15％BSA溶液密度梯度离心法，明显去除了许多细胞碎片和体积较小的神经胶质细胞；接种培养6～8h后，由于神经元贴壁能力弱，轻轻地吹打即可重新悬浮起来，利用差速黏附特性进一步去除了更多贴壁能力较强的神经胶质细胞；最后，应用Ara-C抑制神经胶质细胞在神经元培养液中的生长，使神经元得到进一步纯化。以上三种细胞纯化方法的联合应用，显著缩短DRG神经元原代培养的纯化周期，并明显提高神经元纯度，且保证细胞的良好活力，有利于细胞的培养和生长，为进一步开展实验、研究奠定了基础。
本发明方法主要是在接种细胞这一步骤的前后分别增加不同的纯化步骤，并减少Ara-C纯化神经元的次数。本发明的神经元原代培养的纯化方法可以成功建立基础研究、药物筛选的细胞试验模型、试验平台的系统化技术，可以使这类试验模型和试验平台的建设实现高效化、规范化、标准化。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1是DRG神经元的相差形态图比较，其中图1A,1C为现有技术培养纯化得到的DRG神经元显微镜观察图；图1B,1D为本发明方法培养纯化得到的DRG神经元显微镜观察图。
图2是DRG神经元的β-TubulinⅢ免疫荧光染色图比较，其中图1A,1C为现有技术培养纯化得到的DRG神经元免疫荧光染色图；图1B,1D为本发明方法培养纯化得到的DRG神经元免疫荧光染色图。
图3是DRG神经元纯度比较。
图4是DRG神经元活力的比较。
具体实施方式
以下结合附图描述本发明具体实施方式。
为了进一步详细描述在本发明的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关的细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括神经元：细胞和分子生物学，美，L.B.莱维坦；L.K.卡茨玛克。
细胞培养方法通常在“动物细胞培养：基本技术手册”最新版本(R.I.Freshney编辑，Wiley&Sons)；“细胞培养一般技术”(M.A.Harrison和I.F.Rae,剑桥大学出版社)中有描述。组织培养基供应和试剂可从商业供应商那里得到。
本文中所指的“哺乳动物”是脊椎动物中的最高等的一个类群，由爬行动物进化而来，主要特征是：身体表面有毛，一般分头、颈、躯干、四肢和尾五个部分，用肺呼吸，体温恒定，是恒温动物，脑较大而发达。哺乳动物包括但不限为小鼠、大鼠、猴、兔、猫、狗。
在一些实施方式中，根据本领域常规方法提供神经组织。在一些具体实施方式中，通过商业购买、细胞中心提供、医疗机构收集等途径来提供神经组织。在一些具体实施方式中，可以自行制备神经组织，通过常规组织学方法得到。
一、材料
1.1动物材料，由南通大学实验动物中心提供：出生1d(P1)的SD大鼠，动物实验已通过伦理委员会审查同意，备5只P1大鼠逐个取材，用75％乙醇全身消毒大鼠后，无菌超净台内处死，剪开背部皮肤，打开脊髓腔，用显微镊小心从椎管中取出双侧的大鼠DRG神经组织，置于冰上的DMEM培养基中备用。
1.2试剂DMEM培养基、Neurobasal培养基、胎牛血清(febtalbovineserum,FBS)、羊血清、0.25％胰酶和0.01mol/LPBS购自Gibco公司；
B27和多聚赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)购自Invitrogen公司；
牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、L-谷氨酰胺、Ara-C和I型胶原蛋白酶购自Sigma公司；
CCK8购自Dojindo公司；其他试剂为分析纯。
二、实施例
实验组实施例1
(1)DRG的酶解消化：将5只P1大鼠的DRG加2mLⅠ型胶原酶(3mg/mL)37℃消化30min，小心吸去胶原酶，然后再加入2mL0.25％胰酶37℃消化20min，用含DMEM完全培养基(DMEM培养基添加10％FBS)终止消化，1000r/min离心5min后弃上清。
(2)接种细胞前应用密度梯度离心法分离细胞：将5只P1大鼠的DRG消化后获得的细胞沉淀重悬于5mL15％BSA溶液(含15％BSA的0.01mol/LPBS溶液)中，1000r/min离心5min后弃上清。
(3)接种细胞：用DMEM完全培养基重悬神经细胞，过400目筛网。细胞计数后以(1～1.5)×105/孔密度接种到6孔培养板。
(4)接种细胞后应用差速黏附特性分离细胞：神经细胞接种6～8h后，观察到所有神经细胞已完全贴壁，用移液器轻轻均匀吹打神经细胞，当显微镜下观察到大部分神经细胞已被吹起而重新悬浮后，立即将含悬浮细胞的培养液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清后重悬。
(5)Ara-C纯化神经元1次：细胞重新计数后以(2～3)×104/孔密度用含10％FBS的神经元培养液接种到24孔培养板，培养12～16h，用神经元纯化培养液纯化2d后更换为神经元培养液，培养24h后观察并用于实验。
本改良方案1个周期仅需要5d。所有培养板均预先用PLL包被待用。
对照组(对照例)
(1)酶解消化：将5只P1大鼠的DRG加2mLⅠ型胶原酶(3mg/mL)37℃消化30min，小心吸去胶原酶，然后再加入2mL0.25％胰酶37℃消化20min，用含DMEM完全培养基(DMEM培养基添加10％FBS)终止消化，1000r/min离心5min后弃上清。
(2)接种细胞：细胞沉淀重悬于DMEM完全培养基，过400目筛网。细胞计数，以(2～4)×104/孔密度接种到24孔培养板，置于5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱内培养，24h后更换为神经元培养液(Neurobasal培养基添加2％B27、2mmol/LL-谷氨酰胺)培养2d。
(3)纯化细胞：为去除神经胶质细胞，更换为神经元纯化培养液(神经元培养液添加10μmol/LAra-C)培养2d，再用神经元培养液恢复2d，按此方式至少纯化2轮后用于实验。
按此方案1个周期至少需要10d。
三、对比分析
3.1.细胞形态学观察采用相差显微镜观察神经元细胞及其他非神经元细胞的形态，观察可见，对照例方法获得的神经元(图1A，1C)胞体有一定透亮度和折光性，突起分支十分茂密，可见不少神经胶质细胞及细胞碎片；本发明实施例方法获得的(图1B，1D)胞体更加透亮、呈圆形或椭圆形、折光性好，突起分支相互交织成网，神经胶质细胞明显减少。
3.2.细胞纯度鉴定通过β-TubulinⅢ的免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)染色，采用荧光显微镜观察DRG神经元形态：DRG神经元的β-TubulinⅢICC染色：4％多聚甲醛常规室温固定细胞15min，洗涤后室温封闭1h，加一抗(mouseanti-βTubulinⅢantibody，1︰1000，Sigma公司)4℃孵育过夜，洗涤后加二抗(TRITCgoatanti-mouse，1︰200，SantaCruz公司)室温避光孵育2h，洗涤后加Hoechst33342(5μg/mL)37℃复染细胞核8min。洗涤后滴加荧光封片液封片。荧光显微镜下随机拍摄细胞图片，随机计数10个视野中的细胞总数和β-TubulinⅢ的ICC染色阳性细胞数，计数百分比。
荧光显微镜观察可见神经元胞体和突起均表达β-TubulinⅢ，对照例方法获得的神经元(见图2A，2C)突起分支茂密，可见不少非神经元细胞核；本发明实施例方法获得的神经元(见图2B，2D)突起分支清晰，非神经元细胞核明显减少。
DRG神经元纯度的比较与对照组比较，实施例1的β-TubulinⅢ阳性细胞比例达到93％，对照例组纯度仅达到68％，差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。
3.3细胞活力检测在PLL包被的96孔板中接种DRG神经元，密度为1×105/mL，每孔100μL，对照例和实施例1每组10个复孔。培养24h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，将培养板在37℃培养箱内孵育2h后，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。
CCK-8检测结果显示实施例1的细胞活力高于对照例，差异有统计学意义(P<0.05)(见图4)。
本实验中定量数据以x±s表示，应用GraphPadPrism5软件分析数据，单因素两组间采用T-Test配对资料分析，P<0.05认为差异有统计学意义。
本发明的方法主要是在接种细胞这一步骤的前后分别增加不同的纯化步骤，并减少Ara-C纯化神经元的次数。根据神经元和神经胶质细胞的体积与密度的差异，使用15％BSA溶液密度梯度离心法，明显去除了许多细胞碎片和体积较小的神经胶质细胞；接种培养6～8h后，由于神经元细胞贴壁能力弱，轻轻地吹打即可重新悬浮起来，利用差速黏附特性进一步去除了更多贴壁能力较强的神经胶质细胞；最后，应用Ara-C抑制神经胶质细胞在神经元培养液中的生长，使神经元得到进一步纯化。通常每5只P1大鼠取材，可获得(1～1.5)×105个高纯度DRG神经元用于工厂或实验。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤
(1)提供神经组织；
(2)酶解消化：将Ⅰ型胶原蛋白酶加入神经组织，36-38℃进行消化，消化完毕吸去Ⅰ型胶原蛋白酶，再加入胰酶36-38℃消化，最后用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基终止消化，800-1500r/min离心后弃上清；
(3)密度梯度离心法分离细胞：将步骤(2)消化后获得的细胞沉淀重悬于15％牛血清白蛋白溶液中，800-1500r/min离心后弃上清；
(4)接种细胞：用DMEM完全培养基重悬前述步骤获得的细胞沉淀，过400目筛网，细胞计数后接种到培养板；
(5)应用差速黏附特性分离细胞：细胞接种6～8h后，观察到所有细胞已完全贴壁，用移液器轻轻均匀吹打细胞，当显微镜下观察到大部分神经元已被吹起而重新悬浮后，立即将含悬浮细胞的培养液转移至离心管中，800-1500r/min离心，弃上清后重悬；
(6)Ara-C纯化：细胞重新计数后用含10％FBS的神经元培养液接种到培养板，培养12～16h，用神经元纯化培养液纯化1d-2d后更换为神经元培养液，培养温度37℃，培养24h后收获神经元。
2.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，前述步骤中的离心转速为1000r/min，离心时间5min。
3.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，Ⅰ型胶原蛋白酶的浓度为3mg/mL，消化时间为30min。
4.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，胰酶的浓度为0.25％，消化时间为20min。
5.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)中，细胞接种密度为1×105～1.5×105/孔。
6.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，所述步骤(6)中的细胞接种密度为2×104～3×104/孔。
7.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，所述步骤(6)中神经元培养液为Neurobasal培养基添加2％B27、2mmol/LL-谷氨酰胺；神经元纯化培养液为神经元培养液添加10μmol/LAra-C。
8.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，本方法的1个周期为4d-5d时间。
9.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，所述的神经元为DRG神经元。
10.根据权利要求1所述的神经元原代培养的纯化方法，其特征在于，所有培养板均预先用PLL包被待用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160127 |