CN110106149A - 高效分离和培养皮层神经元的方法 - Google Patents

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朱惠敏
王常勇
刘伟
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Abstract

本发明公开了属于细胞培养技术领域的一种高效分离和培养皮层神经元的方法。本发明使用的种植液为85％DMEM+10％马血清+5％胎牛血清，维持液为90％DMEM+10％马血清的培养体系，培养体系成分简单，成本低，但培养得到的神经元存活率高、形态典型、长期培养可形成复杂的功能化神经网络。虽然没有使用阿糖胞苷等试剂对神经元进行纯化，但本培养体系下神经元仍有较高纯度。

Description

高效分离和培养皮层神经元的方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种高效分离和培养皮层神经元的方法。
背景技术
神经元是神经系统最基本的结构和功能单元，能够接受刺激、产生并传导兴奋。培养原代神经元是研究神经元形态结构及各种病理因素影响的重要方法之一。由于神经元是高度分化的一种细胞，其分离和培养比其他细胞更困难。皮层即大脑皮质，是调节驱动运动的最高级中枢。因此高效分离和培养皮层神经元的研究非常重要。
目前常见的培养体系有两种：一种是Neurobasal+B27的无血清培养体系，另一种是DMEM/F12+胎牛血清的培养体系。也有研究人员在神经元接种后通过添加阿糖胞苷的方式对神经元进行纯化。但是这些培养体系所得到的皮层神经元活性不高，甚至培养一段时间后功能活性丧失。
公开号为“CN103789266A”的专利公开了一种大脑皮层神经元分离和原代培养方法，但是存在不足：该专利的细胞种植液为DMEM/F12+胎牛血清+活性发酵滤液+双抗，细胞维持液为Neurobasal+2％B27+1％谷氨酰胺，涉及到的试剂成本高、成分复杂。该专利还比较了不同方法下的细胞存活率，仅提供了数据结果，置于其对应的形态学结果以及长期培养下的状态未进行阐述，缺乏信服力。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种高效分离和培养皮层神经元的方法。
为达到上述目的，采用如下技术方案：
1)提取大脑皮层组织：取出SD大鼠孕鼠羊膜囊中的胚胎置于PBS缓冲溶液中，剪下胚胎的大脑，取出脑组织，提取大脑皮层，之后将提取的大脑皮层组织置于60mm皿中，吸出多余的PBS液体，机械分离组织及剪碎；
2)组织消化：将剪碎的组织中添加0.05％胰酶，置于37℃孵箱中消化30分钟；
3)分离细胞：转移至离心管中，添加DMEM液体，吹打未消散的聚团，之后添加含有血清的培养基终止消化，过滤，仅保留单细胞，对细胞悬液1000rpm离心5分钟；
4)培养细胞：对离心后的沉淀使用细胞种植液接种在预铺多聚赖氨酸的孔板/皿中，接种密度为1x105cells/cm2，细胞贴壁2小时后，吸取上清转移至新的培养孔板/皿，8小时后换成细胞维持液，之后隔天半量换液；所述细胞种植液包括85％DMEM、10％马血清及5％胎牛血清，细胞维持液包括90％DMEM、10％马血清。
所述步骤1)中60mm皿中放有3-5℃的PBS缓冲液，且置于冰板上，步骤1)的操作在冰板上进行；
所述步骤4)中预铺多聚赖氨酸的孔板/皿的方法为:用多聚赖氨酸溶液覆盖培养孔板/皿，无菌条件下室温孵育，24小时后吸出多聚赖氨酸溶液，并用无菌ddH2O洗涤一次，吸出全部液体。所述多聚赖氨酸溶液为浓度1mg/ml多聚赖氨酸浓缩液用无菌ddH2O稀释至终浓度为10μg/ml的溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请方案不同于Neurobasal+B27或是DMEM/F12+胎牛血清的培养体系，代为使用种植液为85％DMEM+10％马血清+5％胎牛血清，维持液为90％DMEM+10％马血清的培养体系。由于阿糖胞苷等抑制胶质细胞生长的试剂毒性强、浓度不好控制等因素，未在神经元接种后通过添加阿糖胞苷的方式对神经元进行纯化。
本申请方案培养体系成分简单，成本低，但培养得到的神经元存活率高、形态典型、长期培养可形成复杂的功能化神经网络。虽然没有使用阿糖胞苷等试剂对神经元进行纯化，但本发明培养体系下神经元仍有较高纯度。
附图说明
图1为培养3天的皮层神经元细胞的明场图。
图2为培养7天的皮层神经元细胞的明场图。
图3为培养1天的皮层神经元细胞的Live/Dead染色图。
图4为培养3天的皮层神经元细胞的Live/Dead染色图。
图5培养7天的皮层神经元细胞的Live/Dead染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
实施例1
1.配制多聚赖氨酸：5mg多聚赖氨酸中添加5ml无菌ddH2O，多次吹吸以混合多聚赖氨酸，获得储存液，浓度为1mg/ml，4℃储存。
2.包被培养孔板/皿：使用无菌ddH2O稀释多聚赖氨酸浓缩液(1mg/ml)至终浓度为10μg/ml。吸取足够的液体来覆盖培养孔板或者皿，60mm的皿使用3ml即可铺满，轻轻地摇动以确保液体均匀铺满培养板/皿表面。无菌条件下室温孵育过夜。第二天，也就是分离组织当天，吸出多聚赖氨酸溶液，并用无菌ddH2O洗涤一次，完全吸出液体。
3.皮层神经元的分离和培养：
(1)37℃水浴预热以下试剂：0.05％胰酶、DMEM+10％马血清+5％胎牛血清、DMEM。
(2)准备一个冰板，冰板上放置多个60mm皿，向60mm皿中加入4℃的PBS缓冲液。
(3)选用E16-E18的SD大鼠孕鼠，断颈处死，使用75％酒精喷洒孕鼠下腹部，使用剪刀剪开皮肤和肌肉，暴露子宫，从羊膜囊中取出胚胎，置于PBS中，清洗胚胎，置于新的PBS中；使用剪刀将大脑剪下来，清洗干净后置于新的装有PBS的皿中。
(4)在解剖显微镜下，使用镊子，对皮肤和头骨进行剥离，从中取出脑组织，使用眼科镊将大脑左右半球分开，去除中脑等仅保留大脑皮层，剥离脑膜。
(5)将提取的大脑皮层组织置于一个新的60mm皿中，吸出多余的PBS液体，使用剪刀对组织进行机械分离及剪碎，组织碎块剪的越碎越好，以上这些步骤置于冰板上，并且控制时间在1小时以内。
(6)添加0.05％胰酶，对组织碎块进行消化。10个胚胎的皮层碎块添加大约5ml左右的胰酶，置于37度孵箱中消化30分钟，其中15分钟拿出来拍打一下，以免组织碎块聚集成团。
(7)30分钟后，取出转移至50ml离心管中，添加30ml左右的DMEM液体，使用10ml的吸管对离心管内聚团或者未消散的团块进行吹打，可以帮助因粘稠而聚集在一起的组织分离成单细胞，而后添加含有血清的培养基进行终止消化。
(8)依次使用100目、200目的筛网对细胞悬液进行过滤，去除未消散的组织团块，仅保留单细胞。对细胞悬液进行计数，大约1个胚胎分离得到1x107个细胞。对细胞悬液进行离心，1000rpm5分钟。
(9)种植液成分为：85％DMEM+10％马血清+5％胎牛血清，对离心后的沉淀使用种植液接种在预铺多聚赖氨酸的孔板/皿中，接种密度为：1x105cells/cm2。细胞贴壁2小时后，吸取上清转移至新的培养孔板/皿，这一步骤是为了去除血细胞、内皮细胞、胶质细胞等除神经元以外的杂细胞。第8个小时后换成细胞维持液：即90％DMEM+10％马血清。而后，隔天半量换液。
实施例2
1.显微镜观察
细胞分离接种后12小时，如图1-2所示，通过倒置显微镜观察可见，细胞基本贴壁，胞体为圆形或椭圆形，胞体饱满，部分可见短小的突起。随着培养时间的延长，胞体明显增大，突起明显增长，形态多样，较多突起互相作用产生连接。培养至7天即可见到突起呈现网络样连接。
2.细胞活性检测
通过Live/Dead染色，检测并定量分离1天、3天、7天的大脑皮层神经元的细胞活力，如图3-5所示，神经元存活率高、形态典型、长期培养可形成复杂的功能化神经网络。培养1天、3天、7天的神经元的细胞活力如表1所示
表1培养的大脑皮层神经元的细胞活力
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种高效分离和培养皮层神经元的方法，其特征在于，培养皮层神经元的细胞种植液包括85％DMEM、10％马血清及5％胎牛血清，细胞维持液包括90％DMEM、10％马血清。
2.一种高效分离和培养皮层神经元的方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
1)提取大脑皮层组织：取出SD大鼠孕鼠羊膜囊中的胚胎置于PBS缓冲溶液中，剪下胚胎的大脑，取出脑组织，提取大脑皮层，之后将提取的大脑皮层组织置于60mm皿中，吸出多余的PBS液体，机械分离组织及剪碎；
2)组织消化：将剪碎的组织中添加0.05％胰酶，置于37℃孵箱中消化30分钟；
3)分离细胞：转移至离心管中，添加DMEM液体，吹打未消散的聚团，之后添加含有血清的培养基终止消化，过滤，仅保留单细胞，对细胞悬液1000rpm离心5分钟；
4)培养细胞：对离心后的沉淀使用权利要求1所述的细胞种植液接种在预铺多聚赖氨酸的孔板/皿中，接种密度为1x105cells/cm2，细胞贴壁2小时后，吸取上清转移至新的培养孔板/皿，8小时后换成权利要求1所述的细胞维持液，之后隔天半量换液。
3.根据权利要求2所述的一种高效分离和培养皮层神经元的方法，其特征在于，所述步骤1)中60mm皿中放有3-5℃的PBS缓冲液，且置于冰板上，步骤1)的操作在冰板上进行。
4.根据权利要求2所述的一种高效分离和培养皮层神经元的方法，其特征在于，所述步骤4)中预铺多聚赖氨酸的孔板/皿的方法为:用多聚赖氨酸溶液覆盖培养孔板/皿，无菌条件下室温孵育，24小时后吸出多聚赖氨酸溶液，并用无菌ddH2O洗涤一次，吸出全部液体。
5.根据权利要求4所述的一种高效分离和培养皮层神经元的方法，其特征在于，所述多聚赖氨酸溶液为浓度1mg/ml多聚赖氨酸浓缩液用无菌ddH2O稀释至终浓度为10μg/ml的溶液。
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