CN110093307A

CN110093307A - 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法

Info

Publication number: CN110093307A
Application number: CN201910290340.5A
Authority: CN
Inventors: 李燕; 刘少奇; 张乾顺; 张凌云; 陈小娟; 孔俊飞; 李磊
Original assignee: Zhuhai Dingan Biological Products Co ltd; Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Dingan Biological Products Co ltd; Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-08-06

Abstract

本发明公开了一株适应无血清悬浮培养的BHK‑21‑SC细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法，所述BHK‑21‑SC细胞株为幼金仓鼠肾细胞株，该细胞株的保藏编号为CGMCC No.16817。所述细胞株按0.5‑0.6ⅹ10⁶cell/ml的起始细胞密度进行培养，72h后细胞密度生长到8‑10ⅹ10⁶cell/ml。本发明筛选和驯化一株适应无血清全悬浮培养的BHK‑21细胞株用于高滴度鸡新城疫病毒液的生产，并建立适应无血清悬浮培养BHK‑21细胞株制备新城疫种毒的驯化流程。

Description

适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法

技术领域

本发明涉及无血清全悬浮培养BHK-21细胞在新城疫疫苗生产中的应用，属于兽用生物制药领域。

背景技术

目前，国内鸡新城疫疫苗主要使用低毒力活疫苗和油佐剂灭活疫苗，为养禽业防制鸡新城疫的常规防制措施。目前国内鸡新城疫疫苗的生产，还是主要依靠传统的“鸡胚法”工艺实现。此法大规模生产时，因为SPF鸡胚(无特异性病原，生产活疫苗)和普通鸡胚(生产灭活疫苗)存在鸡胚数量不足，成本较高、鸡胚生产周期长等缺点，国内疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。某些禽用疫苗的制备，企业实际生产中采用普通的鸡胚用于生产，这样就会引入潜在外源病毒污染的问题，且鸡胚液收获完成后会产生大量带毒的鸡胚垃圾。据估计每年生产该类疫苗全国需要消耗上亿枚鸡胚，并处理由此产生的带有病毒的鸡胚约上千吨。因为用于疫苗生产的鸡胚带有病毒，处理不慎会导致病毒扩散的严重后果。该类生物垃圾处理起来成本很高且上千吨的的鸡胚垃圾焚烧处理对于环境也会造成严重地污染。因此用鸡胚生产鸡新城疫疫苗属于低产能的第一代疫苗生产工艺，该工艺的生产过程需要大量的人员，产品的批次差异大，但对于产品品质影响最大的因素在于鸡胚可能带有外源的未知病毒和母源抗体。

无血清悬浮培养细胞生产疫苗属于第三代的疫苗生产方式，第三代工艺是目前最理想的动物疫苗生产技术，本项目利用无血清悬浮培养BHK-21细胞在生物反应器中生产鸡新城疫病毒液。该工艺的优点在于工艺简单、反应器规模大、全自动生产、安全、高效、稳定。1,000L的生物反应器一次生产的病毒液相当于接种10万枚蛋的产量，但用生物反应器生产病毒液下游的工艺处理简单，不会产生类似带毒鸡胚这样的生物垃圾,生物安全性高。利用无血清悬浮BHK-21细胞生产鸡新城疫灭活疫苗同鸡胚不同，该工艺不会引入未知的外源病毒，产品批间差很小，产品的质量更有保证。

动物细胞悬浮培养的优势为单位体积培养液的细胞产率高；无血清培养基可以避免由血清带来的批次不稳定，免疫副反应大等不利因素；悬浮培养动物实验技术收获过程简便，放大容易，培养系统占地面积和空间小，节约劳动成本。目前国内依然没有企业实现悬浮BHK-21细胞在鸡新城疫疫苗中的应用，其原因可能在于现有的工艺利用悬浮培养BHK-21细胞无法得到满足企业工业化要求的高滴度病毒液。本发明的应用有助于改进和提高目前禽类疫苗生产行业的生产方式和工作效率。

发明内容

本发明的目的在于，提供一株适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株及其筛选方法和采用该细胞株制备的抗原。本发明筛选和驯化一株适应无血清全悬浮培养的BHK-21细胞株用于高滴度鸡新城疫病毒液的生产，并建立适应无血清悬浮培养 BHK-21细胞株的新城疫种毒驯化流程。

为达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一株适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株，为幼金仓鼠肾细胞株，该细胞株的保藏编号为CGMCC No.16817。

上述适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：

将BHK-21细胞经低血清悬浮培养驯化阶段、无血清悬浮培养驯化阶段，并通过新城疫病毒适应性筛选得到适应无血清悬浮培养且能生产高病毒滴度新城疫病毒液的BHK-21-SC细胞株。

一种新城疫病毒疫苗株细胞适应毒，所述新城疫病毒疫苗株细胞适应毒的保藏编号为CGMCC No.14989。

优选地，所述新城疫病毒疫苗株为鸡新城疫病毒La Sota疫苗株。

一种上述新城疫病毒疫苗株细胞适应毒的驯化方法，所述驯化方法包括以下步骤：

将用新城疫病毒疫苗株的鸡胚种毒在悬浮培养的适应无血清悬浮培养的 BHK-21-SC细胞株中驯化为能通过悬浮培养传代繁育的种毒，该种毒即为新城疫病毒疫苗株细胞适应毒。

一种新城疫抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株培育后，接入新城疫病毒疫苗株细胞适应毒，接毒后收获的病毒液即新城疫病毒抗原半成品。

一种新城疫疫苗，所述疫苗包括上述制备方法制备的新城疫疫苗抗原。

具体地，本发明的技术方案包括以下内容：

(1)悬浮细胞株的驯化和选育：

将适合新城疫病毒培养用的BHK-21细胞先进行悬浮驯化，驯化过程分别经历低血清悬浮阶段和无血清悬浮阶段。无血清悬浮培养BHK-21细胞的单克隆化和筛选，筛选分为生长速度筛选阶段和病毒适应性筛选阶段。

1)悬浮驯化起始：贴壁培养的BHK-21细胞经胰酶消化离心，以含2％NBS 的BHK105培养基重悬后，制备细胞悬液，将细胞转移到摇瓶中，置于细胞培养箱内的摇床上，开始悬浮驯化。

2)低血清悬浮驯化阶段A：步骤1)中培养的BHK-21细胞当细胞密度大于 2×10⁶cells/ml时，利用离心传代的方式，用含2％NBS的BHK105培养基重悬培养，连续传代5代，使细胞初步适应低血清悬浮培养条件。

3)低血清悬浮驯化阶段B：步骤2)中培养的BHK-21细胞当细胞密度大于 3.5×10⁶cells/ml时，利用稀释传代的方式，用含2％NBS的BHK105培养基重悬培养，连续传代4-5代，使细胞完全适应低血清悬浮培养条件。

4)无血清悬浮驯化阶段A：步骤3)中培养的BHK-21细胞当细胞密度大于 2×10⁶cells/ml时，利用离心传代的方式，用BHK105培养基重悬培养，连续传代4-5 代，使细胞初步适应无血清悬浮培养条件。

5)无血清悬浮驯化阶段B：步骤4)中培养的BHK-21细胞当细胞密度大于 4×10⁶cells/ml时，利用稀释传代的方式，用BHK105培养基重悬培养，连续传代4-5 代，使细胞完全适应无血清悬浮培养条件，得到能够初步适应于无血清培养的 BHK-21-S细胞株。

(2)BHK-21-SC细胞株的筛选

通过有限稀释法扩大培养获得BHK-21-S单克隆细胞株25株。液氮冷冻保存，每株单克隆细胞冻存5支，每支1.0ml，密度约为1×10⁷cell/ml。

通过鸡新城疫病毒La Sota株鸡胚种毒感染BHK-21-S单克隆细胞株72小时后的血凝滴度检测，筛选出1株血凝滴度最高的BHK-21-S单克隆细胞株：第24株。其血凝滴度均为1:512。由此，筛选获得第24株为鸡新城疫病毒La Sota株高适应性 BHK-21-S单克隆细胞株，并命名为BHK-21-SC。

(3)BHK-21-SC细胞株的细胞形态和生长特性：

在光学显微镜下观察各代次BHK-21-SC细胞株的细胞大小均匀一致，细胞形态颜色一致好。研究BHK-21-SC细胞株的生长曲线和细胞传代情况。

(4)BHK-21-SC细胞株在生物反应器中的级联放大培养：

复苏BHK-21-SC细胞株悬浮细胞，通过细胞传代级联放大为3个500ml规格的细胞摇瓶中，将细胞密度达到8×10⁶cells/ml的细胞转移到5L生物反应器中，补加培养基至4L，反应器参数设定3路气体空气，氧气和CO₂，转速120-180rpm，温度 33-39℃，PH 7.0-7.4，溶氧40％。研究BHK-21-SC细胞株在5L反应器中的生长曲线和传代活率，并做3批重复验证。

(5)细胞适应毒的驯化工艺：

通过设计合理的种毒驯化路径，将用鸡新城疫病毒La Sota疫苗株的鸡胚种毒驯化为能在悬浮培养的BHK-21细胞中传代繁育的种毒即鸡新城疫病毒La Sota疫苗株细胞适应毒，并确定出种毒使用的代次范围。

(6)接毒和收毒：

BHK-21-SC细胞株在5L反应器中，细胞培养体积为细胞密度以0.5×106cells/ml起始培养72h后，细胞密度达8×106cells/ml时，按MOI为0.1接入新城疫病毒La Sota 疫苗株细胞适应毒，并加入病毒繁育液和TPCK胰酶。在生物反应器中设定反应器参数设定3路气体空气，氧气和CO₂，转速120-180rpm，温度33-38℃，PH 7.0-7.4，溶氧20-40％，接毒后24h，36h，48h和60h分别取样计数，在接毒后的60h时收获病毒液。

(7)用BHK-21-SC细胞株生产鸡新城疫抗原的遗传稳定性分析：

收集不同代次鸡新城疫病毒La Sota疫苗株细胞适应种毒所生产的病毒液，提取各代次病毒液的病毒核酸并利用RT-PCR进行反转录得到病毒的cDNA文库，从病毒的cDNA文库分别扩增HN基因和F基因的片段并测序，比较分析各代次病毒液的HN基因和F基因的遗传稳定性。

(8)灭活疫苗的配制：

油相制备：取优质注射用白油94份，加入硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，高压灭菌备用。

水相制备：取两种检验合格的半成品抗原按体积比1:1比例混合。取混合后的抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。

乳化：水相与油相按1:2比例，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化，终止前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3500rpm离心 15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

分装：将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。

本发明用于制备抗原所述的病毒，可以是新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。

本发明用以上所述的新城疫病毒疫苗生产中的抗原液制备，包括新城疫病毒的任何疫苗生产毒株。

本发明涉及的微生物资源信息：

本发明涉及的细胞为：适合新城疫病毒抗原液培养用的无血清全悬浮BHK-21 细胞株，系申请人将已适应新城疫病毒疫苗株细胞适应毒繁育的BHK-21(Baby hamsterkidney cell)细胞，经悬浮驯化和单克隆化以及单克隆细胞株的筛选，获得的一株能够无血清全悬浮培养的BHK-21细胞株，该细胞株为幼金仓鼠肾细胞 BHK-21-SC株，分类命名为BHK-21细胞系，该细胞株已于2018年11月22日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16817。所述新城疫病毒疫苗株细胞适应毒(新城疫病毒疫苗株lasota株细胞适应毒， NDV/lasota/SC/DC/2018)已于2018年12月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.14989。

本发明涉及BHK-21细胞无血清全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用。

本发明提供了一株BHK-21悬浮细胞株，该细胞株不仅能适应无血清全悬浮培养且细胞生长速度快且细胞活率高。该细胞株能实现稳定传代30代以上。该细胞株的生长特性完全满足工业化生产用细胞株的要求。

本发明所提供的BHK-21悬浮细胞株接种鸡新城疫病毒疫苗株细胞适应毒能产生高病毒血凝(haemagglutination,HA)滴度的新城疫抗原液，这为该疫苗下游工艺的纯化和精制提供了空间，促进该类疫苗的品质提升。

因为BHK-21-SC细胞株采用无血清培养基培养，所以在其生产的新城疫病原液中不含有血清成分，杂蛋白少。无血清的优势在于利用该病毒液制备的疫苗其免疫副反应大大减轻，且可以避免由于血清批间差异带来的不同批次样品间的品质差异。

本发明提供了一种可以驯化新城疫疫苗株鸡胚毒适应在BHK-21-SC株悬浮培养驯化为新城疫疫苗株细胞适应毒的驯化路线和方式。该种病毒驯化方式较利用贴壁 BHK-21细胞株做种毒驯化的优势在于，操作简单，生产效率高且不含血清，能满足工业大大规模生产的需求。

本发明BHK-21细胞系代替鸡胚制造新城疫疫苗，不仅可以解决鸡胚供应受限制约禽用疫苗生产的问题，还可解决禽源外源病原的污染问题，确保疫苗质量和安全性。

本发明无血清悬浮BHK-21细胞系代替鸡胚制造新城疫疫苗，使得新城疫疫苗生产的周期缩短，产量增加，质量稳定，成本显著降低。

本发明提供的无血清全悬浮BHK-21细胞株生产新城疫疫苗的工艺，减少了疫苗生产过程中GMP车间、设备、净化面积、人力资源等的投入，降低了生产成本。

本发明制备的新城疫灭活疫苗，经过初步的效力检验，发现采用该工艺生产的未经纯化的病毒液原液制备的新城疫灭活疫苗，其临床效果符合现行《中国兽药典》 (2015版)的要求。

本发明相比于现有技术，其优点在于：

(1)细胞株：本发明所申报的细胞株生长速度远快于现有工艺的细胞株，本发明所申报的细胞株按0.5-0.6ⅹ10⁶cell/ml的起始细胞密度进行培养，72h后细胞密度能够生长到8-10ⅹ10⁶cell/ml。该细胞生长速度远高于现有技术的细胞生长2倍以上。该细胞除了生长速度快外，其耐剪切力的能力高于现有的细胞株，该细胞株能够耐受100-180rpm的搅拌速度，高于现有细胞株的80rpm，综合分析，本发明申报细胞株从细胞生长速度和耐剪切力均明显优于现有技术的细胞株。

(2)病毒原液半成品：本发明所生产得到的新城疫病毒抗原液半成品因为细胞培养和种毒均不含有血清，所以病毒液半成品绝对不含有血清，造成生产批次稳定性好，免疫副反应小和无外源病毒污染等。

(3)种毒驯化工艺：本发明采用完全不同于现有工艺的种毒驯化工艺过程。本发明所采用的种毒驯化为在无血清悬浮培养的细胞上直接驯化，该工艺的优点在于该种毒驯化工艺较现有鸡胚生产和转瓶工艺而言更加适应于工业化大规模生产，且通过该工艺生产得到的种毒不含有血清。

(4)病毒液生产工艺：本发明的病毒液生产工艺开发出非常适合新城疫病毒繁育的病毒繁育液，不同于现有技术的生产工艺，通过本发明的生产工艺可以生产得到高病毒滴度的新城疫病毒抗原液，该工艺生产的病毒滴度最低为1：1024，高于现有鸡胚生产工艺。

本发明涉及BHK-21细胞全悬浮培养技术在新城疫疫苗生产中的应用。本发明公开的BHK-21细胞无血清全悬浮培养生产新城疫疫苗的工艺包括以下内容：(1) 新城疫病毒株细胞适应毒的驯化：鸡胚培养的新城疫种毒接种无血清悬浮培养 BHK-21细胞，加入病毒繁育液，经过种毒的传代驯化出适应于无血清悬浮培养的 BHK-21细胞株(BHK-21-SC)生产新城疫疫苗的细胞适应种毒，并对其遗传稳定性进行鉴定；(2)无血清全悬浮细胞株的驯化与选育：适合新城疫病毒培养用无血清全悬浮BHK-21细胞株的驯化和筛选，从而得到能即能生产高病毒滴度的新城疫病毒的BHK-21细胞株，同时该细胞株还能无血清全悬浮培养；(3)适应于BHK-21-SC 细胞株的病毒繁育工艺：本工艺采用新城疫疫苗株细胞适用毒做为种毒，并采用特殊的接毒工艺对新城疫病毒进行繁育，从而得到高病毒滴度的新城疫病毒液；本发明推动新城疫疫苗生产从低能的第一代疫苗生产工艺向第三代疫苗工艺生产跨越式转变，使得新城疫疫苗生产采用大规模生物反应器集成工业化生产有了实现的可能，该发明不仅能简化新城疫疫苗的生产工艺，降低生产成本，且能大大提高产品的品质并为该疫苗的纯化精制提供了空间。(4)本发明采用无血清全悬浮培养 BHK-21细胞，接种细胞适应的新城疫Lasota种毒，制备了三批新城疫病毒La Sota 株的病毒液半成品，并利用这三批病毒液按照实施例五，制备三批新城疫灭活疫苗并同2家上市销售的新城疫灭活疫苗进行效力检验对比。从效力检验的结果来看，该三批疫苗免疫鸡后血清中新城疫HI抗体的检测结果能达到《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2015年版三部.中国农业出版社，2016年) 鸡新城疫灭活疫苗效力检验标准要求，即30-60日龄SPF鸡，免疫新城疫灭活疫苗后21天，其血清中可以检测到的HI抗体的几何平均滴度不低于1：16，对照组不高于1：4。

附图说明

图1为BHK-21细胞不同驯化阶段的细胞形态图；

图2为BHK-21-S细胞传代图和细胞活率曲线；

图3为BHK-21-S细胞生长曲线图；

图4为BHK-21-SC细胞株接种新城疫病毒疫苗株后不同时间点的细胞形态图；

图5为不同种毒代次的新城疫细胞毒和胚毒F基因PCR结果图；

图6为不同种毒代次的新城疫细胞毒和胚毒HN基因PCR结果图。

具体实施方式

本说明书中公开得任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或者类似特征中的一个例子而已。所述仅仅是为了帮助理解本发明，不应该视为对本发明的具体限制。

下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例一无血清全悬浮培养BHK-21细胞的驯化

1材料

1.1细胞株：BHK-21细胞，购自北京协和细胞资源中心，为驯化用贴壁细胞。

1.2试剂：DMEM培养基，胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶-EDTA均购自Gibco 公司；新生牛血清(NBS)购自武汉三利公司；TS-BHK105无血清细胞培养基(简称 BHK105培养基)来源于壹生科(深圳)有限公司。

1.3耗材：T75方瓶、96孔细胞培养板、6孔细胞培养板、125ml摇瓶、500ml 摇瓶均购自Corning公司。

1.4仪器：摇床(型号OS-200，杭州奥盛)、5L生物反应器(赛多利斯)、普通离心机、倒置显微镜、恒温细胞培养箱、生物安全柜、自动细胞计数仪(型号IC100)。

2方法

2.1细胞复苏、传代和冻存

2.1.1细胞复苏从液氮罐中取出冻存的BHK-21细胞，在37～39℃水浴中快速摇动使其在1min内完全融化，以1000rpm离心5min，弃上清，用适量含10％FBS 的DMEM细胞培养液重悬，移入细胞瓶中，在37℃、含5％CO₂培养箱中培养至长满单层。

2.1.2细胞传代取处于对数生长期BHK-21细胞，用适量的0.25％的胰蛋白酶 -EDTA进行消化，37℃孵育3-5min，待细胞圆缩开始脱落时，加入含10％FBS的 DMEM细胞培养液终止，并吹起细胞，将消化好的细胞转移到无菌离心管中，800rmp 离心4min，弃上清。用含2％NBS的BHK105培养基，重悬细胞，混匀，计数。用含2％NBS的BHK105培养基调整细胞数在0.5×10⁶个/ml以上，制备细胞悬液，将细胞转移到摇瓶中，置于细胞培养箱内的摇床上，摇床的转速为140rpm，观察并计数，待密度大于2×10⁶cells/ml时，800rmp离心4min，用含2％NBS的BHK105培养基培养，连续传代5代，活率>95％，细胞生长稳定，及时冻存各代细胞。

2.1.3细胞冻存取生长良好的单层BHK-21细胞按2.1.2项消化、分散，并将所有相同代次的细胞悬液混匀，以1000rpm离心5分钟，弃上清。加入细胞冻存液(含 70-80％BHK105细胞培养液、10％DMSO、10％血清)重悬细胞，并调整至适宜密度，每管1ml分装到冻存管中，注明名称、代次、冻存日期。将细胞冻存管放入细胞程序降温盒中，于-80℃下放置12小时后，置于液氮中。

2.2BHK-21细胞低血清悬浮驯化

2.2.1细胞复苏从液氮罐中取出冻存的BHK-21细胞，在37～39℃水浴中快速摇动使其在1min内完全融化，以1000rpm离心5min，弃上清，用适量含10％NBS 的DMEM细胞培养液重悬，移入细胞瓶中，在37℃、含5％CO₂培养箱中培养至长满单层。

2.2.2BHK-21细胞低血清稀释传代驯化

为了使BHK-21细胞能够逐步适应低血清的悬浮培养，BHK-21细胞的传代方式要进一步优化。将已适应低血清培养基培养的BHK-21细胞，按0.5×10⁶cells/ml的起始细胞密度进行细胞的传代，当悬浮培养的BHK-21细胞培养到第72h时，对悬浮培养的细胞进行细胞计数，若细胞密度已经能生长到3-4×10⁶cells/ml，通过稀释传代的方式，调整细胞密度为0.5×10⁶cell/ml，活率＞95％，将细胞连续传代5-7代以上，及时冻存部分已适应低血清悬浮培养的BHK-21细胞。

2.3BHK-21细胞无血清悬浮驯化

取处于对数生长期的低血清悬浮培养的BHK-21细胞，活率大于95％。用无血清细胞悬浮培养的培养基BHK105，接种密度为0.5×10⁶cell/ml，在37℃、含5％的 CO₂培养箱中培养72h，对培养的细胞悬液进行细胞计数和活率检测。

按0.5×10⁶cell/ml的起始细胞密度进行细胞的传代，当悬浮培养的BHK-21细胞培养到第72h时，对悬浮培养的细胞进行细胞计数，取出传代所需的细胞悬液，以 800rpm的转速离心5分钟，去上清后用BHK105培养基培养重悬，调整起始细胞密度为0.5×10⁶cell/ml，采用相同的细胞传代方式继续传代至5-6代，通过这个过程让 BHK-21细胞逐渐适应无血清细胞培养基。

将已适应无血清培养基培养的BHK-21细胞，按0.5×10⁶cells/ml的起始细胞密度进行稀释方式的细胞传代，当无血清悬浮培养的BHK-21细胞培养到第72h时，进行细胞计数，已初步适应无血清细胞培养基的细胞生长72h后，细胞密度可达4-6×10⁶cell/ml，通过直接吸取一定体积的细胞悬液并加入相应量的无血清细胞培养基BHK105的稀释传代方式，调整细胞密度为0.5×10⁶cell/ml，活率＞95％，将细胞连续传代5-7代以上，使低血清培养BHK-21细胞适应无血清培养基培养，连续传代 3代，及时冻存部分已适应无血清悬浮培养的BHK-21细胞，命名为BHK-21-S。

2.5BHK-21-S细胞株生物学特性检测

在光学显微镜下观察各代次BHK-21-S细胞株的细胞形态是否均一。研究 BHK-21-S细胞株的生长曲线和细胞传代情况。

2.6细胞计数及活力检测

取各代处于对数生长期的细胞悬液，用自动细胞计数仪进行细胞计数及活力检测，活率应＞90％。

2.7无菌检验

按现行《中国兽药典》附录对BHK-21-S细胞株各代细胞进行无菌检验。

2.8支原体检验

按现行《中国兽药典》附录对BHK-21-S细胞株各代细胞进行支原体检验。

2.9外源病毒检验

按现行《中国兽药典》附录禽源细胞及制品的外源病毒检验方法对BHK-21-S 细胞株各代细胞进行鸡胚检查和细胞检查。

3.结果

3.1细胞驯化及传代结果

贴壁培养的BHK-21细胞(如图1所示)用低血清细胞培养基培养，在125ml 摇瓶中进行连续传代，刚开始几代，BHK-21细胞出现生长缓慢、死亡、细胞结团严重等现象(如图1所示)，在细胞传代时，尽可能去掉细胞团块，后来随着BHK-21 细胞传代(6-8代)，贴壁的BHK-21细胞在低血清悬浮培养基中逐步适应，细胞生长速度逐步变快，细胞倍增时间逐步变为有规律，125ml摇瓶中的细胞密度可达到 2×10⁶cells/ml以上，获得了适应低血清悬浮培养的BHK-21悬浮细胞株(如图1所示)。将已适应低血清培养基培养的BHK-21悬浮细胞，用无血清细胞悬浮培养基，按 0.5×10⁶cells/ml的起始细胞密度进行细胞的传代，随着BHK-21细胞传代(8-12代)，低血清培养基培养的BHK-21悬浮细胞在无血清细胞悬浮培养基中逐步适应，细胞生长速度逐步变快，细胞倍增时间逐步变为有规律，获得了适应无血清悬浮培养的 BHK-21悬浮细胞株(命名为BHK-21-S细胞)，细胞呈圆形、饱满、光滑，轮廓清晰、大小均一，分布均匀，培养液清亮，均为单一细胞，未见结团现象(如图1所示)。

从图1可以看出，BHK-21细胞在贴壁状态为上皮成纤维样细胞形态。BHK-21 细胞刚在低血清培养基中培养时，BHK-21细胞成团较严重。BHK-21细胞适应低血清培养基后，其成团细胞较少，分散的细胞逐渐增多，细胞密度增加。BHK-21细胞刚在无血清培养基中驯化时，其细胞依然有明显可见的成团，细胞密度较低血清时细胞密度有所增加。当BHK-21细胞适应无血清培养基后，基本上细胞的成团现象消失，细胞的分散度很好，且细胞密度很高。

3.2BHK-21-S细胞计数及活率结果

BHK-21-S细胞株培养72h达对数生长期，其细胞密度均可达到5-6×10⁶cell/ml，细胞活率均＞95％，见图2和图3。

从图2可以看出，BHK-S细胞每培养72h细胞进行传代，细胞密度按0.5ⅹ10⁶ cell/ml起始，培养72h后细胞密度平均达5-6ⅹ10⁶cell/ml，细胞活率平均为98％左右。

从图3可以看出，BHK-S细胞的对数生长期为24h-72h之间，细胞活率保持在 98％以上。当细胞生长到96h时细胞的密度达到顶峰，96h后细胞活率开始下降。

3.3经检验，BHK-21-S细胞株连续传代3代，各代均无菌生长。详见表1。

表1 BHK-21-S细胞株无菌检验结果

注：“－”表示无菌生长。

3.4支原体检验BHK-21-S细胞株连续传代3代，各代支原体检验均为阴性，结果详见表2。

表2支原体检验结果

3.5外源病毒检验

3.5.1鸡胚检查法BHK-21-S细胞株连续传代3代，各代细胞经3次冻融后分别经尿囊腔和绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚各10枚，37℃培养7日，接种鸡胚除非特异性死亡外均健活，详见表3。

表3 BHK-21-S细胞株鸡胚检查法外源病毒检验结果

注：“1*”为24小时出现一枚非特异性死亡。

实施例二：新城疫病毒的高适应性BHK-21细胞株的筛选

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 BHK-21-S细胞株由北京鼎持生物技术有限公司驯化并保存；

1.1.2病毒鸡新城疫病毒La Sota株由青岛蔚蓝生物制品有限公司鉴定并保存；

1.1.3培养基TS-BHK105(简称BHK105培养基)和TS-BHK106病毒繁育增强液(简称BHK106病毒繁育增强液)来源于壹生科(深圳)有限公司，DMEM培养基购自GIBCO公司；

1.1.4血清胎牛血清购自GIBCO公司；

1.1.5TPCK胰酶购自SIGMA公司；

1.1.6 1％鸡红细胞悬液，北京鼎持生物技术有限公司自制。

1.2方法

1.2.1悬浮培养的BHK-21-S单克隆化细胞株的制备

取悬浮培养的BHK-21-S细胞计数后，用含10％FBS的DMEM基本培养基稀释至5cell/ml，一共配制200ml。取细胞混合液至96孔细胞培养板中，200μl/孔，然后置37℃，5％CO₂培养箱中培养，每日观察细胞生长情况并及时换液。待细胞生长增殖到足够数量后，用胰酶将其消化，转移至12孔细胞培养板，待细胞密度达到 80-90％时，用胰蛋白酶进行消化，转移至10cm²细胞培养平皿内。待生长增殖到足够数量后，按0.5×10⁶cells/ml的起始细胞密度用30ml无血清细胞悬浮培养液接种到 125ml摇瓶中，将细胞摇瓶放置于CO₂细胞培养箱中的摇床上，以140rmp的转速， 37℃，含5％的CO₂摇床中培养，并在细胞培养72h后完成悬浮培养的BHK-21-S细胞的传代。取部分细胞加细胞冻存液于液氮中冻存。

1.2.2鸡新城疫病毒高适应性细胞株的筛选

1.2.2.1良好生长特性的BHK-21-S单克隆细胞株筛选

在125ml细胞摇瓶中，悬浮培养的BHK-21-S单克隆细胞株以0.5-0.6×10⁶ cells/mL起始密度接种于悬浮细胞培养液中于37℃，含5％的CO₂摇床上，摇床的转速为140rpm。培养72h后，以稀释传代的方式进行细胞计数和传代，并且记录下各个单克隆细胞株各代次的细胞生长数据。通过比较各单克隆细胞株的细胞生长数据和至少15个细胞代次的细胞传代数据，筛选出细胞生长特性良好的细胞株做为后续的接种鸡新城疫病毒La Sota株后高产的细胞株的筛选库。

因为用于工业化生产的细胞株，对该细胞株的生长特性要求较高，即要求细胞生长速度也对细胞稳定传代都有要求。从悬浮培养的40株单克隆细胞株中选出25 株细胞，这25株细胞株按0.5-0.6×10⁶cells/mL的密度起始培养，培养72h后细胞密度能稳定到达6.0-10×10⁶cells/mL细胞密度的细胞株，且平均能稳定传代30个细胞代次。

1.2.2.2高适应鸡新城疫病毒La Sota株细胞株的筛选

选择1.2.2.1中通过生长特性筛选得到的25株细胞株分别以0.5-0.6×10⁶cells/mL 的起始密度接种于悬浮细胞培养液BHK105中于37℃，含5％CO₂摇床上培养，摇床的转速为140rpm，连续培养72h后，加入同等体积的病毒繁育增强液BHK106，按5％的体积比接入鸡新城疫病毒La Sota株鸡胚种毒，并加入5～10μg/ml TPCK胰酶；接毒后细胞于33℃，5％CO₂摇床上培养，摇床的转速为140rpm，继续培养72h，观察细胞状态，应出现大量细胞碎片，分别取各细胞株病毒液进行检验，并将样品置于-70℃以下保存备用。

1.2.2.3感染BHK-21-S单克隆细胞株的鸡新城疫病毒La Sota株的HA检测按现行《中国兽药典》附录对各细胞株进行测定。

2.结果

2.1细胞单克隆结果

通过有限稀释法得到40个细胞单克隆，并对40株细胞进行传代。

40株细胞株的传代数据见下表，筛选得到的各单克隆细胞株的各代次的平均细胞密度和能稳定传代的25株细胞，各细胞株代次数据见表4。

表4不同单克隆细胞株的生长数据和传代代次数据

2.2鸡新城疫病毒La Sota株高适应性单克隆细胞株的筛选

鸡新城疫病毒La Sota株高适应性BHK-21-S单克隆细胞株的筛选

通过有限稀释法扩大培养获得BHK-21-S单克隆细胞株25株。液氮冷冻保存，每株单克隆细胞冻存5支，每支1.0ml，密度约为1×10⁷/ml。

通过鸡新城疫病毒La Sota株感染BHK-21-S单克隆细胞株72小时后的血凝滴度检测，筛选出1株血凝滴度最高的BHK-21单克隆细胞株：第24株。其血凝滴度均为1:512，见表5。由此，筛选获得第24株为鸡新城疫病毒La Sota株高适应性 BHK-21-S单克隆细胞株，并命名为BHK-21-SC，该单克隆细胞株再经过生产工艺的优化后，生产La Sota株HA的滴度可以达到1：1024-1：2048。

表5单克隆细胞株接种鸡新城疫病毒La Sota株HA结果

实施例三：新城疫病毒疫苗株La Sota株细胞适应毒的驯化方法

1材料与方法

1.1材料

1.1.1新城疫La Sota株鸡胚种毒(基础种子库代次)，HA效价为1:512，由青岛蔚蓝生物制品有限公司培养、纯化、鉴定。

1.1.2实验动物SPF鸡胚和SPF鸡：购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.3诊断用抗原及抗体

禽流感病毒HI抗原为哈尔滨兽医研究所产品；AIV阳性血清购自哈尔滨兽医研究所产品；鸡NDV阳性血清、ILTV阳性血清、IBV阳性血清、IBDV阳性血清、 EDSV阳性血清以及无上述特定病原的鸡阴性血清从中国兽医药品监察所购进；辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗鸡IgG单克隆抗体，从深圳晶美生物公司购进。

1.1.4细胞及细胞培养基病毒培养用BHK-21-SC株悬浮细胞，由北京鼎持生物技术有限公司保管、供应。

细胞营养液：无血清BHK悬浮培养基TS-BHK105(简称BHK105培养基)由壹生科(深圳)有限公司提供。

病毒繁育增强液：无血清TS-BHK106培养基(简称BHK106培养基)由壹生科 (深圳)有限公司提供。

1.1.5PCR试剂及主要酶类RNA抽提试剂盒，DNA抽提试剂盒，病毒核酸提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；Trizol Reagent，Reverse Transcriptase、RNA酶抑制剂、dNTPs、DNA Marker等均为Thermo产品；DH5α 感受态细胞和EasyPfu Taq酶为北京全式金生物技术有限公司产品；

1.2方法

1.2.1悬浮培养BHK-21-SC悬浮细胞的培养方法

从液氮罐中取出冻存管至37℃水浴中迅速融化，将细胞移入装有10ml BHK105 培养基的离心管中进行离心，1000rpm，5分钟。弃去上清，用细胞营养液BHK105 悬浮细胞，置于转速140rpm的摇床上，于5％CO₂，37℃培养箱中悬浮培养，细胞培养72h后，按0.5ⅹ10⁶cell/ml的起始细胞密度进行细胞的传代，每个细胞代次生长时间为72h。

1.2.2鸡新城疫细胞适应毒La Sota株的传代

取La Sota株的鸡胚尿囊液，在125ml摇瓶中，进行La Sota株在BHK-21-SC细胞中的适应性传代。

方法如下：按0.5ⅹ10⁶cell/ml的起始细胞密度进行细胞培养，培养72h后按照培养的细胞悬液体积的1/2加入BHK106培养基，并按总体积的5％加入鸡新城疫La Sota株(鸡胚毒)和TPCK胰酶，在33℃，转速为140rpm的摇床中继续培养60h，收获病毒液，并将病毒液保存在-80度的冰箱中，该病毒样品融化后，检测其HA效价。将收获的病毒液进行连续传代，并保存各代病毒液备用，检测每一代的HA效价，至HA效价稳定在1：256以上时作为鸡新城疫细胞适应毒La Sota株的F0代。

1.2.3鸡新城疫细胞适应毒La Sota株生物学特性检测

1.2.3.1HA效价测定按现行《中国兽药典》附录进行测定。

1.2.3.2细胞半数感染量(TCID₅₀)测定

将用含10％FBS的DMEM培养液中，生长成的单层的BHK-21细胞，用无菌 PBS清洗后，用胰酶消化并计数。按5ⅹ10⁴个细胞/孔放置到96孔板中，于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中，继续培养18h，长成单层的BHK-21细胞。将待检病毒液用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10^-5～10^-9共5个稀释度，每个稀释度病毒液，分别接种于已长成良好单层的96孔板BHK-21细胞。在加入稀释的病毒液前先用PBS清洗BHK-21细胞两次，每个稀释度的病毒液接种5孔细胞，每孔 0.1ml，于37℃，5％CO2的条件下孵育1h后，去掉病毒液上清后用PBS洗两遍细胞后，于每孔加入含10μg/ml TPCK胰酶的DMEM培养基，于31℃，5％CO2的条件下，继续培养120-144h后，检测细胞上清的HA滴度。当HA滴度大于1：4时，判断为阳性孔。统计各稀释度HA阳性情况，计算各稀释度细胞感染的百分率。按 Reed-Muench法计算病毒细胞半数感染量(TCID50)。lg(TCID50)＝高于或等于 50％的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。

1.2.3.3病毒基因测序

对病毒进行核酸抽提(使用天根病毒核酸提取试剂盒)，利用设计的特异引物，

HN基因检测引物为：

HN-F1(SEQ ID NO.1)：TTGTAGATGACCAAAGGACGATATACGG；

HN-F2(SEQ ID NO.2)：AACTGGCAACATGGAATTCGAGCA；

F基因检测引物为：

F-F1(SEQ ID NO.3):CACTCACCCAGATCATCATGACACAA；

F-R1(SEQ ID NO.4):CTGAACTGACAGACTACCAGAACTTTCACA。

2.结果

2.1病毒在BHK-21-SC细胞株中适应性传代结果

鸡新城疫La Sota株在BHK-21-SC细胞株上传代，按照方法1.2.2，得到鸡新城疫细胞适应毒La Sota株，进行病毒HA效价检测，结果见表6。结果表明，在连续传代的过程中，鸡胚尿囊液种毒首次接种BHK-21-SC时，HA效价没有明显变化，从第2代时，HA效价明显降低，至第三代时其TCID50/ml大于10⁸，并可稳定至第 12代。阴性对照样品传代后HA均为0。故将第3代定义为细胞适应种毒F1代。

表6鸡新城疫La Sota毒株在BHK-21-SC细胞株连续传代HA效价

2.2病毒测定序列结果

对病毒进行核酸抽提，利用设计的特异引物，进行RT-PCR、克隆、测序，得到该病毒的HN基因，将获得的序列与已发表的新城疫病毒相应的HN基因序列进行比较，结果表明该新城疫细胞适应毒La Sota株为鸡新城疫病毒。

实施例四：悬浮培养BHK-21-SC细胞株生产新城疫病毒疫苗株La Sota株病毒液的方法

1.材料

1.1.1BHK-21-SC细胞北京鼎持生物技术有限公司筛选、鉴定、保管和供应。

1.1.2毒株鸡新城疫细胞适应毒La Sota株F3代，北京鼎持生物技术有限公司保管和供应。

1.1.3仪器：摇床(型号OS-200，杭州奥盛)、5L生物反应器(赛多利斯)、普通离心机、倒置显微镜、恒温细胞培养箱、生物安全柜、自动细胞计数仪(型号 IC100)。

1.1.4主要试剂无血清细胞培养基TS-BHK105(简称BHK105培养基)和病毒繁育液TS-BHK106(检测BHK106病毒繁育液)均来源于壹生科(深圳)有限公司，胰酶购自GIBCO公司，新生牛血清购自武汉三利生物技术有限公司。

2.方法

2.1BHK-21-SC细胞悬浮培养细胞制备

在500ml细胞摇瓶中，悬浮培养的BHK-21-SC细胞株以0.5×10⁶cells/mL起始密度接种于培养基BHK105中，置于摇床上，于37℃，CO₂浓度为5％，摇床转速为 140rpm，连续培养72h后，以稀释传代的方式接种到5L生物反应器中，调整细胞密度为0.5×10⁶cells/mL，细胞悬浮培养的培养基为BHK105，设定反应器参数：DO值为40％、搅拌速度为140rpm、PH为7.0、温度为37℃。细胞培养约72h后，待细胞密度达到6×10⁶cells/mL时进行接毒。

2.2准备反应器

2.2.1罐体部件检查

(1)检查主控制台、玻璃罐体、加热底盘或加热毯均能正常工作。

(2)检查罐体各组件是否齐全，各个螺帽中垫圈有无损坏，以免密封不好造成染菌。

(3)检查水、电、气情况，确保正常工作。

2.2.2pH电极的标定

(1)根据培养过程中所需要控制pH的范围选择pH标准缓冲液。

(2)打开pH电极帽，将电极与缆线相连后与主控制台pH缆线接口连接。

(3)打开主控制台电源后进入触摸屏界面进行PH标定和校准。

2.2.3DO电极的标定

(1)打开DO电极帽，将电极与缆线相连后连接于主控制台DO缆线接口进行电极极化，极化时间6小时以上。

(2)极化完成后，标定零点，将DO电极与电极导线断开连接，完成标定后将电极与缆线重新连接。待反应器高压灭菌后，将反应器同主控制台连接后，通工作状态时的空气流量2小时后，标定DO电极的100％。

2.2.4罐体安装

(1)将挡板放入玻璃罐体内，加入配制的培养基或缓冲液。

(2)安装罐盖，手动对角拧紧螺丝帽，保证受力均匀。

(3)安装pH电极，将转接头按顺序接于pH电极上，将电极放入罐盖适合孔径中，并调整至合适高度后，手动拧紧适配螺母，并盖上电极帽。

(4)安装DO电极，将转接头按顺序接于DO电极上，将电极放入罐盖适合。

2.2.5罐体灭菌

2.2.5.1灭菌前检查

(1)灭菌前请检查罐盖各个接口情况，确保没有直接暴露的端口。

(2)检查位于液面下方管道是否夹紧，尾气出口是否排气顺畅，并包扎完好；检查取样瓶是否拧到1/2处。

(3)将搅拌轴承帽内边缘涂上硅润滑脂，盖于罐盖中间搅拌轴上，保护轴承。

(4)检查罐体的气密性。

2.2.5.2灭菌

(1)将罐体放入灭菌罐中进行灭菌，根据不同培养基选择合适的灭菌时间和温度。

(2)灭菌温度降到80℃以下后，进行灭菌锅排气，防止温度过高排气后冷空气进入灭菌锅，与热的玻璃罐体接触造成玻璃罐体爆裂。

(3)待罐体温度冷却至70℃以下再将反应器出高压锅中取出。

2.2.6反应器同主控制台的连接和检查

(1)已灭菌的生物反应器同主控制台连接，并对DO电极进行100％标定，检查 PH电极和DO电极是否处于正常工作状态，气路连接是否正确。

(2)将2L BHK105细胞培养基打入到生物反应器中，并在37℃，DO为40％，PH 为7.0，搅拌速度为140rpm的条件下，培养24h后，取样可以检测整个生物反应器是否无菌以及整个培养控制系统是否正确稳定。

2.3BHK-21-SC细胞接种鸡新城疫细胞适应毒La Sota株

按2.1中的方法准备细胞，待细胞密度达到8×10⁶cells/ml后，加入2L的BHK106病毒繁育液，加入5μg/ml胰蛋白酶，按MOI为0.1接种量接种鸡新城疫细胞适应毒 La Sota株，分别于48h、60h、72h、84h收集病毒液。反应器的控制参数分别设为 PH为7.0，DO为40％，温度为33℃，搅拌速度为140rpm。测定不同接毒量及不同收毒时间病毒液的HA和TCID₅₀。

2.4HA效价测定将病毒液用PBS做2倍系列稀释(25μl病毒液+25μl PBS)，加入等量1％鸡红细胞，同时设红细胞阴性对照。振荡混匀后，22～27℃ 孵育30分钟后检查结果，使50％红细胞凝集的最高稀释度，作为判定终点。

2.6新城疫La Sota株主要抗原HN和F基因遗传稳定性检测

根据新城疫病毒La Sota株NCBI标准毒株中HN基因设计合成一对引物，引物序列如下：

P1(SEQ ID NO.5)：5′-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3′；

P2(SEQ ID NO.6)：5′-GGAGGATGTTGGCAGCATT-3′；

根据新城疫病毒La Sota株NCBI标准毒株中F基因设计合成一对引物，引物序列如下：

F-F1(SEQ ID NO.7):CACTCACCCAGATCATCATGACACAA；

F-R1(SEQ ID NO.8):CTGAACTGACAGACTACCAGAACTTTCACA。

HN和F基因的预期扩增片段大小分别为1600bp和2000bp。采用天根生物的 RNA提取试剂盒提取RNA，然后采用全式金一步法RT-PCR试剂盒进行 RT-PCR。反应体系(25μl)：逆转录酶1μl，2×buffer 12.5μl，P1和P2引物(均为 25μm)各1μl，RNA模板10μl。反应条件为：42℃60min，94℃5min；然后94℃ 40s，56℃1min，72℃1min，共35个循环，然后72℃10min；最后4℃保温。病毒液及NDV对照应出现359bp特异性条带，阴性对照应无条带。

3.结果

3.1按2.1方法制备3批细胞用于接毒实验，该3批细胞在生物反应器中的生长数目和活率详见表7。

表7 5L生物反应器培养BHK-21-SC细胞的细胞计数和活率

3.2按方法2.3完成5L生物反应器中BHK-21-SC细胞接种新城疫病毒疫苗株 LaSota株细胞适应毒的接毒和病毒液HA和TCID₅₀的检测，3批细胞的接毒结果见表8，接毒后不同时间点，BHK-21-SC细胞的病变图，如图4所示。从图4可以看出，BHK-21-SC细胞株接种新城疫病毒疫苗株后，细胞逐渐死亡。当接毒时间为72h 时，BHK-21-SC细胞已经基本上只剩下细胞碎片。

表8 5L生物反应器培养BHK-21-SC细胞接种新城疫病毒疫苗株La Sota株细胞适应毒的结果

3.3按方法2.6检测5L生物反应器和不同代次细胞适应毒所产新城疫病毒液其F基因和HN基因遗传稳定性研究，取3批病毒液样本提取病毒液RNA，并进行RT-PCR 将新城疫的病毒RNA反转录为cDNA后，分别利用F基因和HN基因的扩增引物进行PCR，PCR产物送测序后得到3批生物反应器病毒液新城疫主要病毒抗原的测序结果，该测序结果同La Sota标准毒株的比对，其3批抗原液与胚毒的F基因和HN基因的序列的比对结果一致。

为了检测不同代次细胞适应毒的F基因和HN基因的序列是否一致，分别检测 F0、F2、F3、F5和F10的新城疫病毒毒液样品的F基因和HN基因序列。分别提取新城疫病毒胚毒(F0)和F2、F3、F5和F10为新城疫细胞毒病毒液中的RNA，利用RT-PCR 对病毒基因组进行反转录后，利用F基因的检测引物分别扩增RT-PCR后的样品，并用核酸电泳进行检测，结果如图5所示。分别提取(F0)和F2、F3、F5和F10为新城疫细胞毒病毒液中的RNA，利用RT-PCR对病毒基因组进行反转录后，利用HN基因的检测引物分别扩增RT-PCR后的样品，并用核酸电泳进行检测，结果如图6所示。

该实验结果表明5L生物反应器所生产的3个批次的病毒液和不同代次的细胞毒液其HN基因和F基因的序列同La Sota株的胚毒对应的病毒序列完全相同，这说明利用该工艺生产得到的病毒液其主要抗原基因序列和蛋白序列均保持不变。

结果显示在5L生物反应器中，对鸡新城疫La Sota株细胞适应毒在BHK-21-SC 细胞株中的病毒繁育条件进行了优化。根据同鸡新城疫La Sota株细胞适应毒病毒繁育密切相关的因素包括病毒接种量，胰酶加入量，温度和病毒收获时间逐一进行了条件优化。通过比较在不同因素下鸡新城疫La Sota株细胞适应毒接毒后的病毒HA 滴度来评价最优的病毒繁育条件。本研究最终确定鸡新城疫La Sota株细胞适应毒接种BHK-21-SC细胞株的实验体系：MOI为0.1的病毒接种量，5ug/ml的胰酶加入量， 33℃病毒培养温度，病毒收获时间为接毒后60h。在优化的实验体系下所产生的鸡新城疫病毒滴度为1：1024。

实施例五：本实例说明无血清全悬浮培养BHK-21细胞技术制备的新城疫病毒液制备新城疫灭活疫苗的方法

1毒种

1.1制备本品用的毒株为鸡新城疫细胞适应毒La Sota株由北京鼎持驯化而来。

1.2毒种标准

1.2.1疫苗毒株应符合以下标准

1.2.1.1毒力

1.2.1.1.1鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)

用灭菌生理盐水溶液将新收获的BHK细胞悬浮技术制备的新城疫病毒液，以 10作为稀释倍数，将病毒液做梯度稀释，取10^-7、10^-8、10^-9 3个稀释度，稀释所得到的病毒液每个稀释度，分别于上午8点和下午5点，分别接种10日龄鸡胚5 枚，每枚鸡胚接种0.1ml的病毒液于鸡胚尿囊腔中，上午的鸡胚标记为“M”，下午的鸡胚标记为“A”。

接种后，每日上午8点和下午5点，M和A组各照蛋一次，若有鸡胚死亡，则记录其死亡时间，并收获尿囊液检测HA效价。观察7日后，将所有活胚收获尿囊液，并检测HA效价。M组和A组鸡胚全部死亡的最高稀释度，即为最小致死量，然后计算该组鸡胚的平均死亡时间，则为最小致死量的平均死亡时间，应为 103～119小时。

1.2.1.1.2脑内接种致死指数(ICPI)

用灭菌生理盐水溶液将新收获的BHK细胞悬浮技术制备的新城疫病毒液，稀释 10倍后，于上午10点，取1日龄SPF雏鸡10只，每只雏鸡脑内注射稀释好的新鲜病毒液0.05ml(接种针头直径0.45mm，长5mm)。另取2只雏鸡以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05ml。

接种后，每日上午10点，记录雏鸡情况，若行动灵活，无共济失调现象则为正常；若麻痹或卧地不起则为发病；最后一种情况为死亡。观察8日，每天记录正常，发病和死亡的鸡总数；按正常0分，发病1分和死亡2分的权值，计算累计总分数。ICPI＝累计总分/(累计正常，发病和死亡鸡的累计总数)。ICPI应为0.1～0.4范围内。

1.2.1.2病毒含量测定

将用含10％FBS的DMEM培养液中，生长成的单层的BHK-21细胞，用无菌 PBS清洗后，用胰酶消化并计数。按5ⅹ104个细胞/孔放置到96孔板中，于37℃， 5％CO2的细胞培养箱中，继续培养18h，长成单层的BHK-21细胞。将待检病毒液用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10^-5～10^-9共5个稀释度，每个稀释度病毒液，分别接种于已长成良好单层的96孔板BHK-21细胞。在加入稀释的病毒液前先用PBS清洗BHK-21细胞两次，每个稀释度的病毒液接种5孔细胞，每孔0.1ml，于37℃，5％CO2的条件下孵育1h后，去掉病毒液上清后用PBS洗两遍细胞后，于每孔加入含10μg/ml TPCK胰酶的DMEM培养基，于31℃，5％CO2的条件下，继续培养120-144h后，检测细胞上清的HA滴度。当HA滴度大于1：4 时，判断为阳性孔，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒含量TCID50应不低于10^8.0/ml。

1.2.1.3新城疫细胞适应毒La Sota株的HA效价检测：按现行2015年《中国兽药典》附录进行测定。病毒液对鸡红细胞凝集价应不低于1:512。

1.2.1.4安全性用无新城疫抗体的5日龄雏鸡20只，分为两组，第一组10只，每只滴鼻接种5倍稀释的BHK细胞悬浮技术制备的新城疫病毒液0.05ml，第二组 10只，不接种作为对照，两组在同条件下分别饲养，观察10日，应无不正常反应。如有非特异死亡，免疫组与对照组均不应超过1只。

1.2.1.5纯净性按现行《中国兽药典》方法进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，均应为阴性。

1.2.1.6鸡新城疫病毒细胞适应毒La Sota株特异性将鸡新城疫病毒细胞适应毒La Sota株用灭菌生理盐水做1000倍稀释(约含10^5.0TCID50/ml)，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，接种9-11日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，至37℃观察120小时。在24-120小时内应不引起特异性死亡，且至少存活8枚；取鸡胚液做红细胞凝集试验，应为阴性。

1.2.1.7免疫原性

接种病毒液到悬浮培养的BHK-21细胞中制备病毒液，经甲醛溶液灭活后，加矿物油佐剂制成油包水型灭活疫苗，按以下方法进行检验：用3～4周龄SPF鸡15只，其中10只经颈部皮下或肌肉注射途径接种疫苗20μ1，5只为对照组。接种后21日，每组分别采血并分离血清，利用新城疫病毒La Sota株灭活抗原测定HI效价。免疫组鸡HI抗体效价应不低于1:64，对照组鸡HI抗体效价均应不高于1:4。

1.2.1.8纯净性按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。

1.2.1.9种毒基础种子代数:F3～F9代。

2疫苗制造及半成品检验

2.1生产用毒种制备

2.1.1毒种繁殖按0.5ⅹ10⁶cell/ml的起始细胞密度进行细胞培养，培养72h后按照培养的细胞悬液体积的1/2加入BHK106培养基，并按总体积的5％加入鸡新城疫LaSota株和TPCK胰酶，在33℃，转速为140rpm的摇床中继续培养60h，收获病毒液，并将病毒液保存在-80度中，留样进行鉴定，经鉴定TCID50≥10^-8/ml，方可作为种毒。

2.1.2毒种鉴定按1.2.1.2、1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.5、1.2.1.6、1.2.1.7、1.2.1.8 项进行，应符合规定。符合以上标准的毒种作为生产用毒种。

2.1.3毒种保存 -70℃以下，保存期为18个月。

2.1.4毒种继代应不超过9代。

2.2制苗材料的选择制苗所用病毒繁育细胞系为由北京鼎持公司培养，驯化和筛选而来的适应于新城疫病毒繁育的可悬浮培养的BHK-21-SC细胞株。该细胞株处于良好的生长状态时方可用于新城疫病毒液的繁育。

2.3病毒液半成品制备利用可悬浮的BHK-21-SC细胞株和鸡新城疫La Sota 细胞驯化毒株用于生产制备新城疫病毒液半成品。新城疫病毒液半成品制备的具体步骤和方法详见实施例四。

2.4病毒液半成品的保存和效价检测从生物反应器中将病毒液泵出分罐保存，并分别取样进行检验，-20℃以下保存备用。收获的病毒液，应逐瓶作无菌检验及红细胞凝集试验，并抽取混合样一份测定病毒含量(EID₅₀)。病毒液应无菌生长，对 1％鸡红细胞悬液凝集价应不低于1:1024，每0.2ml病毒含量应≥10^8.0EID₅₀。

2.5病毒液的灭活将检验合格的NDV病毒液，分别进行灭活，其中新城疫病毒液加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，37℃灭活18小时；灭活后的病毒液置2～8℃保存，应不超过3个月。

2.6半成品检验

2.6.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录，分别对灭活后的NDV进行无菌检验，应无菌生长。

2.6.2灭活检验取灭活后的病毒原液，经尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚 10枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异死亡不应超过2枚。收获所有鸡胚的尿囊液，测定红细胞凝集价，应全部为阴性。将收获的鸡胚液混合，利用上述相同方法盲传一代，取传代鸡胚的胚液进行红细胞凝集试验，应均为阴性。

2.7灭活疫苗的配制

2.7.1油相制备取优质注射用白油94份，加入硬脂酸铝2份，边加边搅拌，直到完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，高压灭菌备用。

2.7.2水相制备取两种检验合格的半成品抗原按体积比1:1比例混合。取混合后的抗原液96份，加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。

2.7.3乳化水相与油相按1:2比例，先将油相输入乳化罐中搅拌再缓慢加入水相，继续搅拌使油相与水相充分混匀，然后通过剪切机在线乳化，终止前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3500rpm 离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

2.8分装将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封，并粘贴标签。置2～8℃保存。

3成品检验

3.1性状

外观为淡粉红色略带粘滞性乳状液

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10m1加入离心管中，以3500rpm离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

3.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

采用本发明技术方案制备三批疫苗物理性状、无菌检验结果见表9。

表9疫苗物理性状、无菌检验结果

3.3安全检验用30-60日龄SPF鸡6只，每只肌肉或或劲背部皮下注射疫苗 1.0ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应，结果见表10。

表10安全检测结果

3.4效力检验用30-60日龄SPF鸡15只，其中10只经颈部皮下或肌肉注射疫苗20μl，5只为对照组。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI 抗体效价测定(微量法)。如表11所示为，疫苗效力检验的结果。

表11效力检验结果

3.5结果分析

采用无血清全悬浮培养BHK-21细胞，制备了三批新城疫病毒La Sota株的病毒液半成品，并利用这三批病毒液按照实施例五，制备三批新城疫灭活疫苗，经过初步的效力检验，发现采用该工艺生产的未经纯化的病毒液原液制备的新城疫灭活疫苗，其临床效果符合现行《中国兽药典》的要求。

实施例六——采用无血清全悬浮培养BHK-21细胞生产的新城疫灭活疫苗与商品化疫苗免疫效果的比较

1材料

1.1疫苗

1.1.1悬浮培养新城疫疫苗采用新城疫病毒疫苗株La Sota株细胞适应毒F5代(由北京鼎持生物技术有限公司驯化和保存)，采用实例三制备的病毒液半成品(采用S20180511、S20180601、S20180615批),并采用实施例五的疫苗制备方法制备三批灭活疫苗(分别为V20180515、V20180605和V20180621三批)。

1.1.2商品化疫苗A企业鸡新城疫灭活疫苗(La Sota株)、B企业鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗(La Sota株+F株)。

1.2试验动物30～60日龄SPF鸡65只(HI抗体滴度<1：4)；

2方法

2.1效力检验用30-60日龄SPF鸡15只，其中10只经颈部皮下或肌肉注射疫苗 20μl，5只为对照组。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI抗体效价测定(微量测定法)，结果见表12。

表12无血清全悬浮培养BHK-21细胞制备的新城疫灭活疫苗与商品化疫苗免疫效果的比较结果

3结果分析

采用无血清全悬浮培养BHK-21细胞，接种细胞适应的新城疫Lasota株种毒，制备了三批新城疫病毒La Sota株的病毒液半成品，并利用这三批病毒液按照实施例五，制备三批新城疫灭活疫苗并同2家市面销售的新城疫灭活疫苗进行效力检验。从效力检验的结果来看，该三批疫苗免疫鸡后血清中新城疫HI抗体的检测结果能达到《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典2015年版三部.中国农业出版社，2016年)中鸡新城疫灭活疫苗效力检验标准要求，即30-60日龄SPF 鸡，免疫新城疫灭活疫苗后21天，其血清中可以检测到的HI抗体的几何平均滴度不低于1：16，对照组不高于1：4。该结果表明采用该工艺制备的新城疫灭活疫苗，进行效力检验时三批疫苗的临床保护效果虽然尚未完全达到使用鸡胚生产的商品化灭活疫苗的水平，但是因为本研究配制疫苗采用为未进行浓缩纯化处理的病毒液半成品直接制苗，且该工艺可以获得大量的病毒液半成品，所以经过下游的纯化和浓缩工艺，可以得到效价更好的新城疫灭活疫苗，非常有望达到甚至超越现有市场商品化的产品效果。采用该工艺不但具有可以进行大规模生产和工业化应用的前景，且可以解决鸡胚的使用量和由鸡胚带入的外源病毒污染，所以该工艺的应用可以提升新城疫疫苗的生产的行业水平。

本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。

本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 北京鼎持生物技术有限公司

珠海鼎安生物制品有限公司

<120> 适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgtagatga ccaaaggacg atatacgg 28

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactggcaac atggaattcg agca 24

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cactcaccca gatcatcatg acacaa 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgaactgac agactaccag aactttcaca 30

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttgatggcag gcctcttgc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaggatgtt ggcagcatt 19

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cactcaccca gatcatcatg acacaa 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctgaactgac agactaccag aactttcaca 30

Claims

1.一株适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株，为幼金仓鼠肾细胞株，该细胞株的保藏编号为CGMCC No.16817。

2.根据权利要求1所述适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株，其特征在于，所述细胞株按0.5ⅹ10⁶-0.6ⅹ10⁶cell/ml的起始细胞密度进行培养，72h后细胞密度生长到8ⅹ10⁶-10ⅹ10⁶cell/ml。

3.权利要求1或2所述适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：

将BHK-21细胞经低血清悬浮培养驯化阶段、无血清悬浮培养驯化阶段和新城疫病毒适应性筛选得到适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株。

4.一种新城疫病毒疫苗株细胞适应毒，其特征在于，所述新城疫病毒疫苗株细胞适应毒的保藏编号为CGMCC No.14989。

5.权利要求4所述新城疫病毒疫苗株细胞适应毒的驯化方法，所述驯化方法包括以下步骤：

将新城疫病毒疫苗株的鸡胚种毒在悬浮培养的权利要求1所述的适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株中驯化为能传代繁育的种毒，该种毒即为新城疫病毒疫苗株细胞适应毒。

6.根据权利要求5所述的驯化方法，其特征在于，所述新城疫病毒疫苗株为鸡新城疫病毒La Sota疫苗株。

7.一种新城疫疫苗抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将权利要求1所述的适应无血清悬浮培养的BHK-21-SC细胞株培育后接入新城疫病毒疫苗株细胞适应毒，接毒后收获的病毒液即新城疫疫苗抗原。

8.一种新城疫疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求7所制备的新城疫疫苗抗原。