CN110042085A - 一种i群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法 - Google Patents
一种i群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110042085A CN110042085A CN201910400918.8A CN201910400918A CN110042085A CN 110042085 A CN110042085 A CN 110042085A CN 201910400918 A CN201910400918 A CN 201910400918A CN 110042085 A CN110042085 A CN 110042085A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- bioreactor
- cell
- aviadenovirus
- lmh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000701802 Aviadenovirus Species 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims abstract description 33
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 41
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 22
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 15
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 14
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 14
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 11
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 15
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 15
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 3
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 3
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 241000521257 Hydrops Species 0.000 description 1
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
- C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，属于病毒疫苗技术领域。上述方法包括：步骤1：制苗用细胞的传代与接种；步骤2：制苗用种毒的制备；步骤3：禽腺病毒在生物反应器中的全悬浮培养；步骤4：病毒的收获与效价检测。本申请用生物反应器全悬浮细胞培养技术代替贴壁细胞培养技术制造禽腺病毒灭活疫苗，能实现对禽腺病毒的高效培养，病毒含量比贴壁培养细胞培养高100倍以上，提高半成品质量，进而提升疫苗质量，提高疫苗的安全性和效力。
Description
技术领域
本发明涉及病毒疫苗技术领域，具体是提供一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法。
背景技术
禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。
禽腺病毒是一种双股DNA无囊膜病毒，直径69～76nm之间，二十面立体对称，有252个壳粒。鸡胚是鸡腺病毒的最佳分离培养物。但目前，禽腺病毒主要都采用贴壁鸡肝细胞培养方法实现，该传统工艺生产半成品抗原效价低，不仅影响免疫效果而且直接影响疫苗成本及价格。也有报道利用纸片载体作为细胞生长的介质进行病毒的培养，但纸片载体的价格较高，难以控制成本，工业化生产需要操作简单、成本低、生产效率高、病毒含量高的一种培养方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，该方法可以大量降低生产成本，而且生产周期短、病毒含量高，可显著提高疫苗产量和质量。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
本发明提供一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，包括：
步骤1：制苗用细胞的传代与接种
将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；
步骤2：制苗用种毒的制备
将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；接毒后细胞培养一段时间后补加TPCK-胰酶；在细胞培养48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，作为生产用种毒；
步骤3：禽腺病毒在生物反应器中的全悬浮培养
取生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养后72h后，按体积比1-2％接种步骤2的毒种打入总体积50％的维持液，按步骤2继续培养；
步骤4：病毒的收获与效价检测
维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。
进一步的，所述步骤1中，生物反应器容积为2L-200L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；
(1)生物反应器的准备：
根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上T，pH，DO电极，对电极进行校正；
(2)气密性检查：
反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；
(3)灭菌：
灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，5L及5L以下一般采用离线灭菌，在高压锅中121℃高压30min，灭菌结束后取出自然冷却；50L及50L以上的生物反应器通常采用在位灭菌的方式灭菌。
进一步的，所述生物反应器的培养条件为：温度为37.0℃，pH值为7.20，DO为40％，转速为80rpm。
进一步的，所述步骤2中，LMH-s细胞生长液与接种禽腺病毒的体积比为1-1.5％；LMH-s细胞生长液与维持液的体积比为50-60％。
进一步的，所述维持液为含血清1％的DMEM溶液，pH为7.20。
进一步的，所述步骤2中，接毒后在细胞培养33h时补加5mg/L的TPCK-胰酶；在细胞培养约48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次。
进一步的，所述TPCK-胰酶为浓度为1.25mg/L的胰酶细胞生长液，细胞生长液为体积比例为90％的DMEM和体积比例为10％的FBS的混合液。
进一步的，所述步骤3中，起始细胞密度调整为0.5×106个cells/ml，生物反应器设定如下参数温度37℃、pH7.2、搅拌速度80rpm、溶氧含量40％进行反应器自动控制培养。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)用生物反应器全悬浮细胞培养技术代替贴壁细胞培养技术制造禽腺病毒灭活疫苗，能实现对禽腺病毒的高效培养，病毒含量比贴壁培养细胞培养高100倍以上。提高半成品质量，进而提升疫苗质量，提高疫苗的安全性和效力；
(2)本发明可以大量降低生产成本，生产周期短，每个生产周期仅需9-15天，相比现有贴壁细胞培养法的21-30天以上明显缩短；
(3)应用生物反应器进行疫苗生产，具有自动化程度高，生产工艺简单稳定，质量稳定，减少人工成本。
附图说明
图1为本发明I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法流程图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1
一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，包括：
步骤1：制苗用细胞的传代与接种
首先选用生物反应器容积为50L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；
(1)生物反应器的准备：
根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上温度，pH，DO电极，对电极进行校正；
(2)气密性检查：
反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；
(3)灭菌：
灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；
然后，将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；温度为37.0℃，pH值为7.20，DO为40％，转速为80rpm；
步骤2：制苗用种毒的制备
将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；LMH-s细胞溶液与接种禽腺病毒的体积比为1％；LMH-s细胞溶液与维持液的体积比为50％；所述维持液为含血清1％的DMEM溶液，pH为7.20；接毒后在细胞培养33h时补加5mg/L的TPCK-胰酶；在细胞培养约48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，合格后作为生产用种毒；所述TPCK-胰酶为浓度为1.25mg/L的胰酶溶液，胰酶溶液的溶剂为体积比例为90％的DMEM和体积比例为10％的FBS的混合液；
步骤3：LMH-s细胞在生物反应器中的全悬浮培养
取转瓶上生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养72h后，按体积比1％接种步骤2的毒种，打入总体积50％的维持液，按照步骤2继续培养；起始细胞密度调整为0.5×106个cells/ml，生物反应器设定如下参数温度37℃、pH7.2、搅拌速度80rpm、溶氧含量40％进行反应器自动控制培养；
步骤4：病毒的收获与效价检测
维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。
将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定毒价，病毒含量为7.2×108.0TCID50/ml。
实施例2
一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，包括：
步骤1：制苗用细胞的传代与接种
首先选用生物反应器容积为100L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；
(1)生物反应器的准备：
根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上温度，pH，DO电极，对电极进行校正；
(2)气密性检查：
反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；
(3)灭菌：
灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后，采用在位灭菌的方式灭菌。
然后，将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；温度为37.0℃，pH值为7.20，DO为40％，转速为80rpm；
步骤2：制苗用种毒的制备
将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；LMH-s细胞溶液与接种禽腺病毒的体积比为1.2％；LMH-s细胞溶液与维持液的体积比为60％；所述维持液为含血清1％的DMEM溶液，pH为7.20；接毒后在细胞培养33h时补加5mg/L的TPCK-胰酶；在细胞培养约48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，合格后作为生产用种毒；所述TPCK-胰酶为浓度为1.25mg/L的胰酶细胞生长液，细胞生长液为体积比例为90％的DMEM和体积比例为10％的FBS的混合液；
步骤3：LMH-s细胞在生物反应器中的全悬浮培养
取转瓶上生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养后72h后，按体积比1.5％接种步骤2的毒种，打入总体积50％的维持液继续培养；起始细胞密度调整为0.5×106个cells/ml，生物反应器设定如下参数温度37℃、pH7.2、搅拌速度80rpm、溶氧含量40％进行反应器自动控制培养；
步骤4：病毒的收获与效价检测
维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。
将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定毒价，病毒含量为5×108.0TCID50/ml。
实施例3
一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，包括：
步骤1：制苗用细胞的传代与接种
首先选用生物反应器容积为100L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；
(1)生物反应器的准备：
根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上温度，pH，DO电极，对电极进行校正；
(2)气密性检查：
反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；
(3)灭菌：
灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后，采用在位灭菌的方式灭菌。
然后，将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；温度为37.0℃，pH值为7.20，DO为40％，转速为80rpm。
步骤2：制苗用种毒的制备
将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；LMH-s细胞溶液与接种禽腺病毒的体积比为1.5％；LMH-s细胞溶液与维持液的体积比为55％；所述维持液为含血清1％的DMEM溶液，pH为7.20；接毒后在细胞培养33h时补加5mg/L的TPCK-胰酶；在细胞培养约48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，合格后作为生产用种毒；所述TPCK-胰酶为浓度为1.25mg/L的胰酶细胞生长液，细胞生长液为体积比例为90％的DMEM和体积比例为10％的FBS的混合液；
步骤3：LMH-s细胞在生物反应器中的全悬浮培养
取转瓶上生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养后72h后，按体积比2％接种步骤2的毒种，打入总体积50％的维持液继续培养；起始细胞密度调整为0.5×106个cells/ml，生物反应器设定如下参数温度37℃、pH7.2、搅拌速度80rpm、溶氧含量40％进行反应器自动控制培养；
步骤4：病毒的收获与效价检测
维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。
将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定毒价，病毒含量为6×108.0TCID50/ml。
同时对上述实施例制备的病毒液按照《中国兽药典》对各代病毒液进行无菌检验，检测结果为无菌生长。
取上述实施例1-3制备的病毒液进行效力试验，具体的：取5日龄清远麻黄鸡100只，试验组每组10只，分别用0.3mL/只、0.5mL/只和1.0mL/只进行肌肉注射疫苗，剩余10只鸡进行肌肉注射生理盐水，作为对照组。免疫后20日，用禽腺病毒4型病毒细胞液(约含108/0.1mL)进行攻毒，每只肌肉注射1.0mL。观察7天，每天详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况。
结果显示：对照组鸡攻毒7天内全部发病，死亡9只，不同剂量免疫组攻毒7天内没有出现任何症状；且死亡鸡及发病鸡(攻毒后7天进行剖检)剖检病理变化：均出现典型的心包积液、肝脏肿大、典型的胰腺炎。攻毒7日后对免疫鸡只进行剖检，未出现由禽腺病毒4型引起的一些病理变化。
综上可知，本申请用生物反应器全悬浮细胞培养技术代替贴壁细胞培养技术制造禽腺病毒灭活疫苗，能实现对禽腺病毒的高效培养，病毒含量比贴壁培养细胞培养高100倍以上，提高半成品质量，进而提升疫苗质量，提高疫苗的安全性和效力。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，包括：
步骤1：制苗用细胞的传代与接种
将驯化的全悬浮LMH-s细胞复苏、传代培养后取样计数，用含10％FBS的DMEM生长液将LMH-s细胞调整为0.5×106个cells/ml，再接种到生物反应器上进行培养；
步骤2：制苗用种毒的制备
将在生物反应器中培养的LMH-s细胞接种禽腺病毒，然后加入维持液，接毒后继续培养；接毒后细胞培养一段时间后补加TPCK-胰酶；在细胞培养48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次，至接毒后96h，将收获的病毒液进行无菌检验和效力检验，作为生产用种毒；
步骤3：禽腺病毒在生物反应器中的全悬浮培养
取生长良好的LMH-s细胞计数后接种到生物反应器中，进行生物反应器全悬浮培养；细胞培养后72h后，按体积比1-2％接种步骤2的毒种，打入总体积50％的维持液，按步骤2继续培养；
步骤4：病毒的收获与效价检测
维持液培养后约72h后停止搅拌，此时将培养液全部收获，冻融一次后保存。
2.根据权利要求1所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述步骤1中，生物反应器容积为2L-200L，生物反应器在使用前需要进行电极校正、灭菌、平衡，具体方法如下；
(1)生物反应器的准备：
根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道和补料，换液的接口，接上温度、pH、DO电极，对电极进行校正；
(2)气密性检查：
反应器中装入适量的PBS，通关闭出气口，向罐内补气，停止补气后看压力维持情况，检查罐体和连接瓶的气密性；
(3)灭菌：
灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，5L及5L以下一般采用离线灭菌，在高压锅中121℃高压30min，灭菌结束后取出自然冷却；50L及50L以上的生物反应器通常采用在位灭菌的方式灭菌。
3.根据权利要求2所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述生物反应器的培养条件为：温度为37.0℃，pH值为7.20，DO为40％，转速为80rpm。
4.根据权利要求1所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述步骤2中，LMH-s细胞生长液与接种禽腺病毒的体积比为1-1.5％；LMH-s细胞生长液与维持液的体积比为50-60％。
5.根据权利要求4所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述维持液为含血清1％的DMEM溶液，pH为7.20。
6.根据权利要求1所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述步骤2中，接毒后在细胞培养33h时补加5mg/L的TPCK-胰酶；在细胞培养约48h时取病毒液测定TCID50，之后每隔12h取样检测一次。
7.根据权利要求6所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述TPCK-胰酶为浓度为1.25mg/L的胰酶细胞生长液，细胞生长液为体积比例为90％的DMEM和体积比例为10％的FBS的混合液。
8.根据权利要求1所述的I群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法，其特征在于，所述步骤3中，起始细胞密度调整为0.5×106个cells/ml，生物反应器设定如下参数温度37℃、pH7.2、搅拌速度80rpm、溶氧含量40％进行反应器自动控制培养。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910400918.8A CN110042085A (zh) | 2019-05-15 | 2019-05-15 | 一种i群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910400918.8A CN110042085A (zh) | 2019-05-15 | 2019-05-15 | 一种i群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110042085A true CN110042085A (zh) | 2019-07-23 |
Family
ID=67282064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910400918.8A Pending CN110042085A (zh) | 2019-05-15 | 2019-05-15 | 一种i群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110042085A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111905100A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-11-10 | 山东信得科技股份有限公司 | 一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法 |
| CN116987676A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种微载体痘病毒高效培养方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106692964A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-24 | 扬州大学 | 一种血清4型禽腺病毒灭活苗及其制备方法 |
| CN106798918A (zh) * | 2017-03-08 | 2017-06-06 | 广州博恒生物科技有限公司 | 一种用lmh细胞系生产禽腺病毒灭活疫苗的方法 |
| CN108220221A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-29 | 吉林冠界生物技术有限公司 | 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法 |
-
2019
- 2019-05-15 CN CN201910400918.8A patent/CN110042085A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106692964A (zh) * | 2016-12-05 | 2017-05-24 | 扬州大学 | 一种血清4型禽腺病毒灭活苗及其制备方法 |
| CN106798918A (zh) * | 2017-03-08 | 2017-06-06 | 广州博恒生物科技有限公司 | 一种用lmh细胞系生产禽腺病毒灭活疫苗的方法 |
| CN108220221A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-06-29 | 吉林冠界生物技术有限公司 | 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111905100A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-11-10 | 山东信得科技股份有限公司 | 一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法 |
| CN116987676A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种微载体痘病毒高效培养方法 |
| CN116987676B (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-19 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种微载体痘病毒高效培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102258777B (zh) | 用鸡胚源细胞系繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 | |
| CN108220221A (zh) | 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法 | |
| CN102260649B (zh) | 传染性法氏囊病毒及用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法 | |
| CN110093307A (zh) | 适应无血清悬浮培养的bhk-21-sc细胞株和用该细胞株制备疫苗抗原的方法 | |
| CN107460156A (zh) | 无血清全悬浮mdck细胞株及其在生产流感病毒中的应用 | |
| CN108220227A (zh) | 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法 | |
| CN102220287A (zh) | 鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用 | |
| CN107904215A (zh) | 一种禽流感病毒的全悬浮培养方法 | |
| CN111548996A (zh) | 一种家禽癌细胞无血清悬浮细胞系及其建立方法和应用 | |
| CN108300704A (zh) | 一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法 | |
| CN106119212A (zh) | 禽腺病毒毒株、灭活疫苗及制备方法 | |
| CN110237246A (zh) | 一种全悬浮细胞培养禽流感(h9)灭活疫苗的方法 | |
| CN108992674A (zh) | 一种耐热保护剂及其应用 | |
| CN101869702A (zh) | 以悬浮微载体细胞培养系统产制的疫苗及其方法 | |
| CN113564127A (zh) | 一种大规模悬浮培养禽腺病毒的方法 | |
| CN109913404A (zh) | 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法 | |
| CN110042085A (zh) | 一种i群4型禽腺病毒全悬浮的培养方法 | |
| CN105664150B (zh) | 一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗 | |
| CN105274064B (zh) | 一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用 | |
| CN102727877A (zh) | 一种生物反应器制备高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（jxa1-r株）的方法及其应用 | |
| CN103285385B (zh) | 一种制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法 | |
| CN103157102B (zh) | 一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法 | |
| CN102886043B (zh) | 猪乙型脑炎病毒与猪细小病毒二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN109207436A (zh) | 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用 | |
| CN108159412A (zh) | 一种生产细胞源鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗的方法及其产品 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20200401 Address after: No. 16, Tianhai Road, Hongdao street, Hongdao Economic Zone, Qingdao City, Shandong Province Applicant after: QINGDAO VLAND BIOTECH GROUP Co.,Ltd. Applicant after: QINGDAO VLAND BIOTECH Inc. Address before: 266113 No. 16 Tianhai Road, Hongdao Street, Hongdao Economic Zone, Qingdao City, Shandong Province Applicant before: QINGDAO VLAND BIOTECH GROUP Co.,Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190723 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |