CN102260649B

CN102260649B - 传染性法氏囊病毒及用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法

Info

Publication number: CN102260649B
Application number: CN2011101805061A
Authority: CN
Inventors: 王泽霖; 王川庆; 赵军; 陈陆; 王新卫; 杨霞; 常洪涛; 王雷; 周欣; 余彬辉; 宋羚羚; 高焕河
Original assignee: POULTRY DISEASE RESEARCH INSTITUTE OF HENAN AGRICULTURAL UNIVERSITY
Current assignee: POULTRY DISEASE RESEARCH INSTITUTE OF HENAN AGRICULTURAL UNIVERSITY
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2031-06-30
Also published as: CN102260649A

Abstract

本发明涉及一种IBDV HQ株CGMCC NO.4935及传染性法氏囊病灭活疫苗和联苗的制备方法。其主要包括：①细胞种子链扩增；②在消毒后的生物反应器中加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行悬浮培养；③细胞长至最大密度时更换含传染性法氏囊病毒毒种的维持液，继续培养；④适时收获病毒，并测定毒价；⑤灭活病毒液，按不同的配比制备传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗。本发明方法可使细胞密度增加，病毒滴度提高；疫苗效价提高、副反应减少；降低劳动强度，减少了生产成本；提高了生产过程的可控性，保证了产品质量的均一稳定；生产出的传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗安全性好、免疫效力高，对法氏囊强毒攻击具有完全的保护作用。

Description

传染性法氏囊病毒及用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种传染性法氏囊病病毒及用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病病毒制备灭活疫苗和联苗的方法。

背景技术

传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)属双股RNA病毒科，双股RNA病毒属，是一种主要侵害3～12周龄的雏鸡与青年鸡的高度接触性传染病，该病原主要破坏鸡的中枢免疫器官-法氏囊，造成机体的免疫抑制，导致感染雏鸡死亡和对(其他)致病因子的感染性增加、对(其他)疫苗的免疫应答能力下降，给养禽业造成严重的危害。目前，该病主要通过疫苗接种来防控。除给雏鸡使用活疫苗免疫外，通常还给种鸡注射灭活疫苗使雏鸡获得高的母源抗体，以保护其在生命早期不感染传染性法氏囊病病毒。

我国目前传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗的生产主要采用传统的转瓶原代细胞(成纤维细胞)培养病毒液。转瓶原代细胞(鸡胚成纤维细胞)培养法是培养细胞贴壁生长于玻璃培养瓶内壁上，虽然其操作技术要求较低和技术成熟稳定，但与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现为：(1)传染性法氏囊病病毒在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度不高，需要加大浓缩倍数，增加生产成本，所以在实践中应用效果差；(2)转瓶鸡胚成纤维细胞培养，不能做到培养条件适时调整，无法保证细胞培养处于最佳条件，因而培养细胞密度小、病毒繁殖的滴度低、鸡只免疫后的效果差、副反应大；(3)转瓶培养细胞生产过程不完全可控，细胞批间差异大，产品质量的不均一、不稳定；(4)转瓶培养细胞劳动强度大、生产效力低；(病毒液需加大浓缩倍数后才能制成合格疫苗，生产成本高；)(5)存在鸡胚源外源病毒污染的生物安全隐患。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种由超强毒经培育、训化的传染性法氏囊病细胞毒HQ株，并提供了用激流式生物反应器代替传统的转瓶繁殖法氏囊病毒液制备IBDV灭活疫苗的方法，其制备出的灭活疫苗安全性好、免疫效力高，对传染性法氏囊病强毒攻击具有完全的保护作用，且生产成本大为降低。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种传染性法氏囊病毒HQ株，其保藏编号为CGMCC NO.4935。

上述传染性法氏囊病毒HQ株在制备传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。

一种用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒液制备灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)细胞种子链的扩增，即用细胞生长液在方瓶或转瓶中培养制苗用细胞；

(2)在消毒后的激流式生物反应器中加入细胞生长液，接种上步所得制苗用细胞进行悬浮培养；

(3)悬浮培养一定时间后向上述激流式生物反应器中接种含传染性法氏囊病毒HQ株CGMCC NO.4935，继续培养；

(4)接毒后22～28h后，即当耗糖量降至0或近似0时，即视细胞绝大多数已病变后收获病毒，反复冻融灌注袋内细胞1～3次，收获全悬液毒液，测定毒价；

(5)灭活上步所得病毒液(加入10％甲醛溶液，随加随摇，直至溶液中的甲醛终浓度为0.1％，置37℃灭活16小时，得传染性法氏囊病水相)，并按规定的配比制得传染性法氏囊病病毒疫苗。

在所述步骤(2)中，在10L的反应器(AP20)中接种约6×10⁹个的细胞数，培养温度为37～39℃。

在所述步骤(3)中，在接种细胞后4～5天，悬浮培养至细胞耗糖量最大时(约2g/L/24h)，以替换细胞生长液的形式向所述生物反应器的维持液中接入一定量的MOI为0.5～0.9传染性法氏囊病毒HQ株CGMCC NO.4935毒种，37℃下继续培养。

所述维持液含98％DMEM/F12、2％胎牛血清、100U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、DO 30％～50％(溶氧)。

所述步骤(1)、(2)中的细胞生长液含90％DMEM/F12、10％胎牛血清、90～100U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、DO(溶氧)体积百分含量30％～60％。

所述激流式生物反应器为Amprotein AP-20C或/和Amprotein AP-10C。

所述制苗用细胞为鸡胚源细胞系DF-1(购自美国ATCC公司)。

步骤(5)所述传染性法氏囊病病毒疫苗为传染性法氏囊病灭活疫苗、鸡新城疫-传染性法氏囊病二联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-传染性法氏囊病三联灭活疫苗、鸡新城疫-传染性支气管炎-产蛋下降综合征-传染性法氏囊病四联灭活疫苗中的任意一种或多种。

本发明具有积极有益的效果：

1.传染性法氏囊病毒HQ株是上世纪90年代初从发病鸡群中分离的，是一株典型的具代表性的超强毒株，后经鸡胚囊源细胞、鸡胚肾细胞、鸡胚成纤维细胞多次传代后致病性减弱，对细胞的适应性大大增强。经培育、训化而成的细胞毒HQ株具有良好的免疫原性，是一株经过鉴定的优秀的制苗毒株。

2.本发明利用激流式生物反应器纸片载体、激流溶氧和补糖，及先进的控制系统，可最大限度地提高反应器中单位体积细胞的生长密度，在疫苗生产中具有很大的潜力和优势，具体表现为：(1)细胞密度大大增加，病毒滴度极大提高，TCID₅₀≤10^-8.0/0.1ml；(2)疫苗效价大大提高，副反应减少；(3)降低了劳动强度，减少了人力、物力和占地面积，大大降低了生产成本；(4)连续、封闭式的病毒培养方式，提高了生产过程的可控性，保证了产品质量的均一、稳定；(5)进一步降低了疫苗生产的安全隐患，更符合疫苗生产的GMP要求，因而具有广阔的发展前景。利用本发明生产的传染性法氏囊病灭活疫苗及其联苗的安全性好、免疫效力高，对传染性法氏囊强毒攻击具有完全的保护作用。

本发明所述传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)HQ株，已于2011年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该传染性法氏囊病毒的保藏编号为CGMCC NO.4935。

本发明所述产蛋下降综合征病毒Z16株，已于2011年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该产蛋下降综合征病毒的保藏编号为CGMCC NO.4934。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1HQ毒株的分离、培育、鉴定过程

上世纪90年代初期，国际上流行的传染性法氏囊超强毒传入中国，引起未免疫的雏鸡大批发病和死亡，死亡率高达40～60％。发明人于1992年6月在河南郑州郊区的一个从暴发传染性法氏囊病的鸡场中收取鸡亡鸡只的法氏囊进行病毒分离，得超强毒株，经鸡胚囊源细胞、鸡胚肾细胞、鸡胚成纤维细胞多次传代、训化后，细胞毒致病性减弱，对细胞的适应性大大增强，在成纤维细胞上的毒价，TCID₅₀≤10^-6.0/0.1ml；在DF-1细胞上的毒价，TCID₅₀≤10^-7.0/0.1ml，明明为HQ株；HQ株细胞毒经克隆纯化和外源病检测后，于2000年初委托中国兽医药品监察所作毒价检验，结论认为符合《鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗试行规程》的规定(报告编号：2000S004)。HQ株具有良好的免疫原性，是一株优秀的制苗毒株。

实施例2用激流式反应器Amprotein AP-20C繁殖传染性法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法，包括如下步骤：

(1)选择生物反应器：激流式反应器Amprotein AP-20C，体积7～10L；

(2)选用鸡胚源传代细胞系DF-1，为自发永生细胞，非常适合HQ毒株生长的传代细胞系，无致癌性，购于美国ACCT公司；

(3)培育和选择制苗毒种：河南农业大学禽病研究所培育的法氏囊细胞适应毒HQ毒株，保藏编号为CGMCC NO.4935；

(4)细胞种子链的扩增：用细胞生长液在方瓶或转瓶中培养制苗用细胞。将细胞从液氮罐取出快速解冻接种至1个T25方瓶，从T25以1传2或1传3的比例连续放大至10L转瓶；

(5)反应器细胞培养：将生物反应器和微载体经消毒后，将所述步骤(4)得到的细胞接种到激流式生物反应器中，并加入细胞生长液进行悬浮培养，接种的细胞数为6×10⁹个，培养温度为39℃。控制培养液中含糖量，当残糖低于1g/L时，全部换液一次；

(6)所述步骤(4)和(5)中的细胞生长液含90％DMEM/F12、10％胎牛血清、抗菌素，细胞生长液的pH 7.2～7.3，DO 30％～60％(溶氧)；

(7)接毒：培养4天后当耗糖最大时(约2g/L/24h)，测算细胞总数达6×10¹⁰个/10L时换液，接种含MOI为0.5～0.9的法氏囊病毒毒种的维持液，继续培养；

(8)所述步骤(7)中的细胞维持液含98％DMEM/F12、2％胎牛血清、抗菌素，所述细胞生长液的pH 7.2～7.3，DO 30％～50％(溶氧)；

(9)收获：所述步骤(7)接毒后1天左右当糖耗降至接近0时，视细胞绝大多数已病变，收获病毒，冻融灌注袋内细胞2次，收获全悬毒液置-15℃以下保存，并测定毒价，传染性法氏囊病毒液的TCID₅₀应达10^8.0以上/0.1ml。

试验表明，鸡胚源DF-1细胞对HQ毒株非常敏感，从转瓶成纤维细胞到转瓶DF-1细胞毒价提高1个滴度，即10倍，从转瓶DF-1细胞到激流式生物反应器培养毒价又提高1个滴度，即10倍，总计提高100倍。

(10)传染性法氏囊病灭活疫苗和联苗制备：灭活传染性法氏囊病毒液后，再按不同的配比方式与不同浓缩倍数的其它病毒液(鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征)混合，再与油相1∶3乳化，进而分装而成。

将所得毒液浓缩至病毒含量≥4×10^7.0TCID₅₀/0.1ml后，加入10％甲醛溶液，随加随摇，直至溶液中的甲醛终浓度为0.1％，置37℃灭活16小时，得传染性法氏囊病水相，取疫苗用油相3份，传染性法氏囊病水相1份混合乳化后制成传染性法氏囊病灭活单疫苗。

将所得制苗用毒液浓缩至原体积量的1/8(病毒含量≥8×10^7.0TCID₅₀/0.1ml)，同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒La Sota株(购自中国兽医药品监察所)接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至原体积量的1/2～1/3(病毒含量≥2×10^8.0EID₅₀/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶1280)，灭活后即成；再分别取鸡新城疫水相1份、传染性法氏囊病水相1份，再各自与油相3份混合乳化制成鸡新城疫、传染性法氏囊病两种单疫苗，再将该两种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗。

将所得制苗用毒液浓缩至原体积量的1/12(病毒含量≥12×10^7.0TCID₅₀/0.1ml)，同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒La Sota株(购自中国兽医药品监察所)接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，浓缩至原体积量的1/3～1/4.5(病毒含量≥3×10^8.0EID₅₀/0.1ml、红细胞凝集价≥1∶3×640)，灭活后即成；并以下述步骤制备传染性支气管炎水相：将传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至原体积量的1/3～1/4.5(病毒含量≥3×10^6.0EID₅₀/0.1ml)，灭活后即成；再分别取鸡新城疫水相、传染性法氏囊病水相和传染性支气管炎水相1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎三种单疫苗，再将该三种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗。

将所得制苗用毒液浓缩至原体积量的1/16(病毒含量≥16×10^7.0TCID₅₀/0.1ml)，同时按下述步骤制备鸡新城疫水相：将鸡新城疫病毒La Sota株(购自中国兽医药品监察所)接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，收获60～96h死胚与96h活胚的鸡胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶640的鸡胚液混合，再浓缩至原体积量的1/4～1/6(病毒含量≥4×10^8.0EID₅₀/0.1ml)，灭活后即成；并以下述步骤制备传染性支气管炎水相：将传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)接种10日龄SPF鸡胚，培养收获毒液后将含毒鸡胚液浓缩至原体积量的1/4～1/6(病毒含量≥4×10^6.0EID₅₀/0.1ml)，灭活后即成；且以下述步骤制备产蛋下降综合征水相：产蛋下降综合征病毒Z16株(CGMCC NO.4934)接种10～11日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，收获72～120h死胚和120h活胚的鸭胚液，将检验无菌、对1％鸡红细胞悬液凝集价≥1∶10240的鸭胚液混合后进行浓缩，浓缩至原体积量的1/4～1/6(红细胞凝集价≥1∶4×10240)，灭活后即成；再分别取鸡新城疫水相、传染性支气管炎水相、产蛋下降综合征水相和传染性法氏囊病水相各1份，再各自与油相3份混合制成鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征水相和传染性法氏囊病四种单疫苗，再将该四种单疫苗等体积充分混合即制成鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗。

制苗用毒液的检验：按《中华人民共和国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体生长，其它各项指标均应符合“鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗制造及检验试行规程”、“鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗制造及检验试行规程”、“鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗制造及检验试行规程”中有关规定。

成品检验：按照《中华人民共和国兽药典》、“鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗制造及检验试行规程”(2003新兽药证字第56号，河南农业大学禽病研究所)、“鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联灭活疫苗制造及检验试行规程”(2003新兽药证字第01号，河南农业大学)、“鸡新城疫、传染性支气管炎、产蛋下降综合征、传染性法氏囊病四联灭活疫苗制造及检验试行规程”(2002新兽药证第06号，河南农业大学)中成品检验规定。其中鸡传染性法氏囊病部分的效力检验：用21～28日龄SPF鸡20只，各肌肉或皮下注射疫苗0.5ml，30日后，连同条件相同的对照鸡20只，分别采血、分离血清，测定中和抗体，免疫鸡几何平均效价应≥1∶5000；对照鸡几何平均效价应≤1∶8；或经口接种鸡传染性法氏囊病病毒BC6-85株强毒，每只0.2ml(含2×10⁴BID)，72小时后全部剖杀，检查法氏囊病病变。对照组应至少有16只鸡发病，免疫组应全部保护。

实施例3激流式生物反应器细胞系传染性法氏囊病灭活疫苗的最小免疫量测定

按上述实施例2所记载的方法和要求，用激流式生物反应器在DF-1细胞上繁殖传染性法氏囊病毒液(TCID₅₀为10^-8.5/0.1ml)制备传染性法氏囊病灭活疫苗三批，每批用不含抗原的生理盐水制备的油乳剂稀释成1/2、1/4、1/8、1/16羽份，分别免疫28日龄SPF鸡各10只，肌注0.5ml/只，另设对照组鸡10只，不做任何免疫。免疫后30天采血，测定各组法氏囊的中和抗体和琼扩抗体水平，并用鸡传染性法氏囊病病毒强毒BC6-85株，经口接种，每只0.2ml(含2×10⁴BID)，72小时后剖杀所有鸡，检查法氏囊病病变。按照IBD效力检验的判定标准，中和抗体几何平均效价应≥1∶5000，对照鸡几何平均效价应≤1∶8；攻毒后对照组应至少有16只鸡有病变，免疫组应全部保护。确定能使IBD效力检验合格的最小免疫剂量，结果见表1。

从表1可见三批传染性法氏囊病灭活疫苗1、1/2、1/4、1/8、1/16头份的IBD血清学检查都达到了“质量标准”中的效力检验标准，攻毒的结果也达到100％的保护，而在1/32～1/64中无论是血清学抗体或攻毒保护均不能完全达到要求，因此法氏囊反应器细胞疫苗的最小免疫剂量为1/16头份，即31.25μl/头份。用转瓶DF-1细胞生产的同类苗其最小免疫剂量通常为1/4头份，根据以上结果可知用反应器生产的传染性法氏囊病灭活疫苗的免疫效力远远高于用转瓶生产的同类疫苗效力，且更节省人力、物力，更符合生物安全。

表1反应器细胞系传染性法氏囊病灭活联苗的最小免疫量测定

Claims

1.一种传染性法氏囊病毒HQ株，其保藏编号为 CGMCC NO.4935。

2.权利要求1所述的传染性法氏囊病毒HQ株在制备传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。

3.一种用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

(3)悬浮培养一定时间后向上述激流式生物反应器中接种传染性法氏囊病毒HQ株 CGMCC NO.4935，继续培养；

(4)接毒后22～28h后，即当耗糖量降至0或近似0时，收获病毒，反复冻融灌注袋内细胞1～3次，收获全悬液毒液，测定毒价；

(5)灭活上步所得病毒液，并按规定的配比制得传染性法氏囊病病毒灭活疫苗。

4.根据权利要求3所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，每10L的反应器中接种6×10⁹个的细胞数，培养温度为37～39℃。

5.根据权利要求3所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，在接种细胞后4～5天，悬浮培养至细胞耗糖量最大时，以替换细胞生长液的形式向所述生物反应器的维持液中接入一定量的MOI为0.5～0.9的传染性法氏囊病毒HQ株 CGMCC NO.4935毒种，37℃下继续培养。

6.根据权利要求5所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，所述维持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、90～110U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、 DO 30%～50%。

7.根据权利要求3所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）中的细胞生长液含90%DMEM/F12、10%胎牛血清、90～100U/ml抗菌素，其pH 7.2～7.3、DO体积百分含量30%～60%。

8.根据权利要求3所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，所述激流式生物反应器为Amprotein AP-20C或/和Amprotein AP-10C。

9.根据权利要求3所述的用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备疫苗的方法，其特征在于，所述制苗用细胞为鸡胚源细胞系DF-1。