CN103157102B

CN103157102B - 一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法

Info

Publication number: CN103157102B
Application number: CN201210578007.2A
Authority: CN
Inventors: 刘月焕; 何平有; 毛雅元; 刘涛; 郑朝朝; 韩春华; 林健; 徐倩倩; 杨保收; 梁武; 郁宏伟; 李建丽
Original assignee: Institute Of Animal Husbandry And Veterinary Medicine Beijing Academy Of Agricultural And Forestry Sciences; Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Institute Of Animal Husbandry And Veterinary Medicine Beijing Academy Of Agricultural And Forestry Sciences; Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: CN103157102A

Abstract

一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：a.制苗用细胞的培养；b.病毒接种与培养；c.病毒液收获；d.病毒液灭活；e.疫苗制备。本发明对制苗用细胞进行了筛选，加强了细胞与病毒的匹配性；使用激流灌注式生物反应器培养体系提高了病毒的增殖滴度及收获量；而且整个生产工艺不涉及其他生物安全和公共卫生问题，适合于大规模生产。

Description

一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，属于生物技术领域

背景技术

鸭出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DHO)是一种急性、高度接触性鸭传染病，是因感染鸭出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus，DHOV)所致，DHOV属于黄病毒科成员，可引起不同日龄鸭采食量、产蛋率急剧下降，甚至瘫痪。剖解主要可见卵巢出血、萎缩，卵泡变形、变性，卵黄、睾丸、输卵管和输精管萎缩。

2010年，鸭出血性卵巢炎疾病首次发现于中国浙江，随后在江苏、山东、河北和北京等地区发生。主要见于开产蛋鸭，感染鸭群发病率几乎100%，死亡率为5%～30%，产蛋率可下降至10~30%甚至10%以下，给养鸭业带来巨大的经济损失，由于该病是病毒性疾病，目前无特效治疗方法，及时注射疫苗及预防性接种是防治该病唯一有效手段。

目前，国内已有利用分离的流行毒株制备鸭出血性卵巢炎疫苗的研究报道，其生产工艺均为传统的转瓶生产方式，利用生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法未见报道。生物反应器作为一种新型工具，能够有效提高细胞及病毒产量，稳定疫苗批间差异，因此研究利用生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗符合行业发展趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用激流灌注式生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反应器为培养系统，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、第二蠕动泵，第一硅胶管、第二硅胶管、激流罐、灌注袋、有孔硅胶管和聚酯纤维纸片载体；所述灌注袋为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋，两个灌注袋结构与功能完全相同，以相同的方式与激流罐连接，通过外源泵实现物质交换；

灭活疫苗的制备按以下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养

将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上，接种密度为：每克载体接种0.8～1.2×10⁷个细胞，设定设备参数：温度T1：37～37.5℃、T2：40～45℃、T3：35～36℃，pH：7.0～7.4，DO：40%～70%，振荡速度30～50r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

b.病毒接种与培养

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将鸭出血性卵巢炎病毒种毒接种制苗用细胞，设定设备参数：温度T1：36.5～37.5℃、T2：39～41℃、T3：34～35℃，pH：7.2～7.4，DO：40%～70%，振荡速度30～50 r/min，空气流量400ml/min～4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养鸭出血性卵巢炎病毒；

c.病毒液收获

病毒培养42～46h后，收获激流罐（5）与灌注袋（6）内的病毒液，将灌注袋（6）反复冻融2～3次后收获上清液，混合后-20℃保存备用；检测病毒液效价；

d.病毒液灭活

收获的病毒液中加入甲醛灭活剂，灭活病毒；

e.疫苗制备

灭活的病毒液加入佐剂，乳化制备成鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤a中，种子细胞为幼仓鼠肾传代细胞BHK21，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞；应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过TCID₅₀筛选鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤a中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于2g/L时，流加补充细胞生长液，流加量以培养液残糖量不低于1g/L为准，当培养液体积达到有效培养体积时，进行换液。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤a中，逐日增大空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤b中，病毒接种前将种毒混于细胞维持液中，种毒与细胞维持液按V/V 0.5%～2%混合，病毒接种时将混有病毒液的细胞维持液泵入反应器系统中，无需吸附，直接启动病毒培养程序扩增培养病毒。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤b中，病毒培养12h时开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培养液残糖量不低于1g/L为准；所述n等于2～5。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，所述n倍浓缩DMEM液配制方法为：1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述n等于2～5。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤d中，收获病毒液中按V/V 1%~10%加入质量浓度为37%的甲醛溶液，70～140r/min，2-8℃灭活12～24h。

上述制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤e中，在灭活的病毒液中按水相与油相佐剂V/V 3:1缓慢加入ISA 28 VG或MF59佐剂，乳化制备成水包油型鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明应用生物反应器培养并增殖鸭出血性卵巢炎病毒，与传统的转瓶生产工艺相比，提供了更大的表面积，增加了细胞密度，提高了病毒产量及滴度，自动化控制了细胞培养环境，稳定疫苗批间差异。

2.在本发明中，制苗用细胞经过纯化筛选，提高了细胞对病毒的敏感性，保证了种子细胞的状态均一，减少细胞批次间差异，确保生产工艺参数和产品质量的稳定。

3.在本发明中，与常规激流灌注式生物反应器培养系统相比，增加了一个灌注袋，有效增大了细胞贴壁面积，细胞数量增加近一倍，大幅提高病毒液产量。

4.本发明细胞接种至反应器后，逐日增加空气流量，可以加快系统内气体循环，有利于培养液内CO₂的溢出，减少NaHCO₃的使用量。

5.本发明中，鸭出血性卵巢炎病毒接种时采用同步接种法，无需吸附，简化操作，节省人力。

6.本发明在接毒后补充订制的浓缩营养液和葡萄糖，可以倍增多种氨基酸含量，为病毒繁殖提供了充足的营养，有利于提高病毒产量。

7.本发明在半成品灭活中中采用高浓度甲醛低温灭活鸭出血性卵巢病毒，一方面，更好的保持病毒良好的抗原性，另一方面又快速灭活病毒，减少病毒的失活损失。

8.本发明中采用进口水包油型佐剂，具有单位疫苗抗原含量高，产生免疫反应快，免疫后1~2周就能较好对抗强毒攻击，适合于紧急免疫预防接种。

附图说明

图1 是激流灌注式生物反应器的液体循环系统组成示意图；

图2 是本发明的工艺路线图；

图3 病毒液时间滴度曲线图。

附图或文中中各标号清单为：1.第一蠕动泵（灌注出液泵），2.第二蠕动泵（灌注进液泵），3.第一硅胶管、4.第二硅胶管，5.激流罐，6.灌注袋，7.有孔硅胶管，8.聚酯纤维纸片载体；

T1为激流罐内液体温度，T2为激流罐加热膜的温度，T3为灌注袋外环境温度，pH为激流罐内液体pH值，DO为激流罐内液体溶氧率，振荡速度为激流罐的振荡速度，空气流量为激流罐内空气流通量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，其中各实施例仅用于说明本发明而并非限定本发明的专利保护范围。

实施例1 有限稀释法克隆纯化筛选制苗用细胞（仓鼠肾细胞BHK21）

幼仓鼠肾细胞BHK21购自中国兽医药品监察所。

鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株为鸭出血性卵巢炎病毒HB株，于2011年7月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC V201122；保藏地址为：中国，武汉大学。所述病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒颗粒大体呈球状，直径40～60nm；该病毒对外界环境的抵抗力较强，在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月，其感染力均不受影响；该病毒对乙醚、氯仿敏感；大多数去污剂能将它迅速灭活；在37℃条件下，用0.1％福尔马林熏蒸6h便可把它灭活；该病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡的红细胞，可以凝集1%鸽红血球；所述病毒可在9～13日龄鸭胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，9～10日龄鸡胚尿囊腔、胚绒毛尿囊膜，6日龄鸡胚卵黄囊，7～8日龄鸭胚卵黄囊中培养。

细胞生长液的配方为体积百分含量90%高糖DMEM液，10%新生牛血清，调整PH值为7.4；

细胞维持液为体积百分含量96%高糖DMEM液，4%新生牛血清，调整PH值为7.5；

A. 单克隆细胞株制备

a. 细胞悬液的制备

细胞瓶中培养仓鼠肾细胞BHK21，待细胞长满为致密的单层、轮廓清晰时，用0.05%胰酶进行消化，制成悬液。

b. 细胞的有限稀释

对所制备的仓鼠肾细胞BHK21悬液进行细胞计数，加入无血清的DMEM培养液稀释细胞悬液，使得细胞密度约为1.0×10⁵个/ml；用无血清DMEM培养液将稀释后的仓鼠肾细胞BHK21悬液10倍梯度稀释至10³个/ml，再用细胞生长液10倍梯度稀释到10¹个/ml，即每0.1ml 1个细胞。

c. 细胞的克隆培养

将上述稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板中，0.1ml/孔，显微镜下观察，弃去非单一细胞并且细胞状态不佳的细胞孔，置于37℃ 5% CO₂培养，每天观察细胞生长状态并及时换液，待细胞增殖为克隆群落，选取生长状态良好的细胞孔，用0.05%胰酶进行消化，制成悬液，重复上述克隆方法1~2次，直至筛选出单克隆生长孔。

d. 单克隆化细胞株的扩大培养

选取单克隆生长孔，用0.05%胰酶消化，以小牛血清中和，以细胞生长液重悬，转移至24孔细胞培养板进行扩大培养，当细胞增殖到汇合度约为80%时，用0.05%胰酶消化，加入细胞生长液，接种于细胞培养瓶中扩大培养，培养6~10瓶，进行单克隆细胞的冻存及细胞库的建立。

B. 鸭出血性卵巢炎病毒高适应性细胞株的筛选

a.BHK21单克隆细胞株的消化铺板

将长满单层的BHK21单克隆细胞株用0.05%胰酶消化并计数，每株单克隆细胞铺24 孔细胞培养板，设复孔，30000个细胞/孔。置于37℃，5% CO₂培养24h。

b.BHK21单克隆细胞株接种鸭出血性卵巢炎病毒

弃去24孔细胞培养板中的细胞生长液，加入0.1M PBS，0.8ml/孔，吹洗2~3遍后，按V:V 0.3%接种量接种鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株，1.0ml/孔，置于37℃，5% CO₂培养，72h后-20℃反复3次冻融，并收获病毒液。

c.鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株感染BHK21单克隆细胞株的TCID₅₀检测

按常规方法将收获病毒液用细胞维持液作10^-6~10^-9倍系列稀释，接种于长满BHK21单克隆细胞单层的96孔细胞培养板中，0.1ml/孔，每个稀释度接种8孔，置37℃培养箱中观察5d，以出现典型CPE为判定依据，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

C. 结果

a. BHK21单克隆细胞株的培养

通过有限稀释法进行仓鼠肾细胞BHK21的克隆纯化，经过3次纯化，筛选出45株BHK21单克隆细胞株。

2 鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株高适应性BHK21单克隆细胞株的筛选

通过鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株感染BHK21单克隆细胞株72h后的TCID₅₀测定，筛选出1株效价最高的BHK21单克隆细胞株：第40株，其在45株中病毒滴度最高，为10^7.8TCID₅₀/ml，与鸭出血性卵巢炎病毒感染普通仓鼠肾细胞BHK21的TCID₅₀（10^6.5～10^7.4）相比，病毒效价可提高约2～10倍。由此，筛选获得第40株为鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株高适应性BHK21单克隆细胞株，并标号为B40。

B40号仓鼠肾细胞BHK21于2012年11月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO C2012181；保藏地址为：中国武汉大学。

实施例2 AP20C型激流灌注式生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗

本实施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反应器，灌注袋6体积为8L（两个灌注袋的体积均为4L），激流罐5体积为13L，灌注袋6内含有300g聚酯纤维纸片载体8（两灌注袋各含150g载体）；理论有效培养体积为21L。

细胞同实施例1中菌种保藏的仓鼠肾细胞BHK21；

种毒同实施例1，某一批次鸭出血性卵巢炎病毒HB株种毒，病毒效价为10^7.7TCID₅₀/ml。

细胞生长液的配方为体积百分含量92%高糖DMEM液，8%新生牛血清，调整PH值为7.3；

细胞维持液为体积百分含量98%高糖DMEM液，2%新生牛血清，调整PH值为7.4；

无Na-DMEM干粉培养基为不含有NaCl和酚红的高糖DMEM培养基，由Invitrogen Corporation生产销售。

A、准备工作：

检验系统气密性，校准电极，PBS处理纸片载体8，连接灌注袋6与激流罐5，用细胞生长液浸泡纸片载体8，平衡系统。

B、制备工作，具体步骤如下：

a.制苗用细胞的复苏与前期培养

从液氮罐中取出冻存的仓鼠肾细胞BHK21复苏后，用细胞生长液于37℃培养，长成良好单层后消化转至10L转瓶中培养、备用。

b.制苗用细胞在生物反应器中的接种、培养

取8个长满单层细胞的转瓶，用0.05%胰酶消化细胞，制备细胞悬液10L（含细胞和细胞生长液），细胞总数约3.1×10⁹个。

细胞接种采用两步接种法，第一步：两灌注袋中各从下部打入细胞悬液4.0L，静置吸附1h；第二步：将两灌注袋中的液体各打出1L，再从两灌注袋上部深层管各打入1L剩余细胞悬液，静置吸附0.5h；同时在激流罐5内补充5L细胞生长液预热；细胞接种密度为：每克载体接种1.0×10⁷个细胞。

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1:37.5℃，T2:44℃，T3:36℃，PH:7.2，DO:40～70%，振荡速度45r/min，循环速度400ml/min，空气流量100ml/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。

每日取样2次测残糖量，计算单日耗糖量。逐日增大空气流量，每24h增加100ml/min。细胞生长液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管3、硅胶管4内液体颜色保持基本一致。

细胞培养48h培养液残糖量低于2g/L，开始流加补充细胞生长液，流加速度为10ml/min。

细胞培养60h时，泵出培养液13L，补入细胞生长液2L后流加补充细胞生长液，流加速度改为为13ml/min。

细胞培养60h时培养液体积接近有效体积21L，将培养液全部打出，换入20L新鲜细胞生长液继续培养。

c.鸭出血性卵巢炎病毒接种制苗用细胞，继续培养

细胞接种后第4日（96h）单日耗糖量达到3.68g/L/24h，且趋于平稳，确定细胞密度达到了接毒要求。排空反应器内液体，将含细胞维持液15L和病毒液300ml的种毒悬液打入系统中，设置设备参数如下：T1：37.3℃，T2：41℃，T3：35.5℃，pH：7.2，DO：40～70%，振荡速度45r/min，循环速度400ml/min，空气流量400ml/min，启动病毒培养程序开始培养。

病毒接种12h后开始流加补充200g/L葡萄糖、3倍浓缩DMEM液（1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入2份无Na-DMEM干粉培养基，溶解而成），3倍浓缩DMEM液流加速度为2.4ml/min，葡萄糖流加速度为0.16ml/min。

d.收获病毒液，灭活病毒

分别在30h、32h、32h、34h、36h、38h、40h、42h培养的病毒液取样，测定各时间点病毒效价（病毒滴度），并绘制时间滴度曲线图（见图3）。

病毒培养42h后，收获激流罐5和灌注袋6内的病毒液，灌注袋6冻融3次后收获上清液，将收获的全部病毒液混匀，共得20.4L病毒液，备用。

收获的病毒液测定效价，每1ml含病毒10^8.1TCID₅₀。

收获的20.4L病毒液内加入2.04L质量浓度为37%甲醛溶液至终浓度为10%，100r/m 4℃灭活12h。上述灭活病毒液用无菌0.1M pH7.2 的PBS稀释10倍，再用50KD膜包浓缩至20L。

e.疫苗制备

将检验合格的灭活病毒液置于乳化罐中，按水相与油佐剂V/V3:1的比例缓慢加入油佐剂6.67L ISA 28 VG，边加边搅拌，然后以800r/min搅拌30min，制成水包油型鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。

f.安全检验

取5~8周龄SPF鸭10只，随机分为2组，每组5只，一组按2倍剂量（1.0ml）经胸部肌肉接种疫苗，另一组不接种疫苗，作为对照，在同等条件下隔离饲养。观察14天，免疫组和对照组均未出现精神沉郁、采食量下降和拉绿色或白色稀便的临床症状。

g.疫苗效力检验

取取200日北京鸭20只，随机分为2组，每组10只，一组各胸部肌肉注射疫苗0.5ml/只，另1组用相同剂量的无病毒细胞液乳化剂接种作为阴性对照，在同等条件下隔离饲养。14日后，对所有免疫鸭及对照鸭攻击鸭出血性卵巢炎病毒HB株，攻毒后5d剖杀，免疫组攻毒保护率为90%，对照组全部未保护。

与转瓶工艺比较：转瓶培养工艺每瓶收获体积1L，病毒效价一般为10^7.0 TCID₅₀/ml左右；本次实验病毒总产量与200个10L转瓶产量持平。

实施例3 AP200型激流灌注式生物反应器制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗

本实施例中所用的激流灌注式生物反应器包括AP20C型和AP200型两种。

AP20C型激流灌注式生物反应器同实施例2。

制苗用细胞、种毒均同实施例2。

AP200型灌注袋6体积为80L（两个灌注袋的体积均为40L），激流罐5体积为130L，灌注袋6内含有3000g聚酯纤维纸片载体8（两灌注袋各含1500g载体）；理论有效培养体积为210L。

A、准备工作：

选用AP20C型和AP200型两种激流灌注式生物反应器，做培养细胞前准备工作。

B、制备工作，具体步骤如下：

a.制苗用细胞的培养

按照实施例2方法，在AP20C型生物反应器内培养制苗用细胞96h，至细胞耗糖量增至3.7g/L/24h且趋于平稳时，用0.05%胰酶消化一个灌注袋6内细胞，制得细胞悬液100L，内含仓鼠肾细胞BHK21约2.7×10¹⁰个。将制得的细胞悬液分两步接种于AP200型生物反应器灌注袋6内：第一步：两灌注袋中各从下部打入细胞悬液40L，静置吸附1h；第二步：将两灌注袋中的液体各打出10L，再从两灌注袋上部深层管各打入10L剩余细胞悬液，静置吸附0.5h；同时在激流罐5内补充50L细胞生长液预热；细胞接种密度为：每克载体接种0.9×10⁷个细胞。

吸附过程完成后，设置设备参数如下：T1:37.5℃，T2:43℃，T3:36℃，PH:7.2，DO:40～70%，振荡速度43r/min，循环速度4000ml/min，空气流量1000ml/min。启动细胞培养程序，进行细胞培养。

每日取样2次测残糖量，计算单日耗糖量，逐日增大空气流量，每24h增加1000ml/min。细胞生长液循环灌注速度随培养时间的增加逐渐增大，使硅胶管3、硅胶管4内液体颜色保持基本一致。

细胞培养48h培养液残糖量低于2g/L，开始流加补充细胞生长液，流加速度为100ml/min。

细胞培养60h时，泵出培养液130L，补入细胞生长液20L后流加补充细胞生长液，流加速度改为为130ml/min。

细胞培养72h时培养液体积接近有效体积210L，将培养液全部打出，换入200L新鲜细胞生长液继续培养。

b.鸭出血性卵巢炎病毒接种制苗用细胞，继续培养

细胞接种后第4日（96h）单日耗糖量达到3.58g/L/24h，且趋于平稳，确定细胞密度达到了接毒要求。排空反应器内液体，将含细胞维持液150L和病毒液3L的种毒悬液（效价为10^7.7TCID₅₀/ml）打入系统中，设置设备参数如下：T1：37℃，T2：40℃，T3：35.5℃，pH：7.2，DO：40～70%，振荡速度45r/min，循环速度4000ml/min，空气流量4000ml/min，启动病毒培养程序开始培养。

病毒接种12h后开始流加补充200g/L葡萄糖、3倍浓缩DMEM液（1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入2份无Na-DMEM干粉培养基，溶解而成），3倍浓缩DMEM液流加速度为24ml/min，葡萄糖流加速度为1.6ml/min。

c.收获病毒液，灭活病毒

病毒培养40h后，收获激流罐5和灌注袋6内的病毒液，灌注袋6冻融3次后收获上清液，将收获的全部病毒液混匀，共得约207L病毒液，备用。

收获的病毒液测定效价，每1ml含病毒10^8.3TCID₅₀。

收获的207L病毒液内加入2.07L质量浓度为37%甲醛溶液至终浓度为1%，140r/min，4℃灭活24h。上述灭活病毒液用无菌0.1M pH7.2的PBS稀释4倍，再用50KD膜包浓缩至207L。

d.疫苗制备

将检验合格的灭活病毒液置于乳化罐中，按水相与油佐剂V/V3:1的比例缓慢加入MF59油佐剂69L，边加边搅拌，然后以1000r/min搅拌30min，制成水包油型鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。

e.安全检验

f.疫苗效力检验

取200日北京鸭20只，随机分为2组，每组10只，一组各胸部肌肉注射疫苗0.5ml/只，另1组用相同剂量的无病毒细胞液乳化剂接种作为阴性对照，在同等条件下隔离饲养。14日后，对所有免疫鸭及对照鸭攻击鸭出血性卵巢炎病毒HB株，攻毒后5d剖杀，免疫组攻毒保护率为90%，对照组全部未保护。

与转瓶工艺比较：转瓶培养工艺每瓶收获体积1L，病毒效价一般为10^7.0 TCID₅₀/ml左右；本次实验病毒总产量与2000个10L转瓶产量持平。

Claims

1.一种制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，它利用激流灌注式生物反应器为培养系统，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵（1）、第二蠕动泵（2），第一硅胶管（3）、第二硅胶管（4）、激流罐（5）、灌注袋（6）、有孔硅胶管（7）和聚酯纤维纸片载体（8）；所述灌注袋（6）为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋，两个灌注袋结构与功能完全相同，以相同的方式与激流罐（5）连接，通过外源泵实现物质交换；

灭活疫苗的制备按以下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养

b.病毒接种与培养

c.病毒液收获

d.病毒液灭活

收获的病毒液中加入甲醛灭活剂，灭活病毒；

e.疫苗制备

灭活的病毒液加入佐剂，乳化制备成鸭出血性卵巢炎灭活疫苗；

所述步骤a中，种子细胞为幼仓鼠肾传代细胞BHK21，为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞；应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过TCID₅₀筛选鸭出血性卵巢炎病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株；

所述步骤a中，细胞培养过程中采用阶段流加方式补充细胞生长液，当残糖量低于2g/L时，流加补充细胞生长液，流加量以培养液残糖量不低于1g/L为准，当培养液体积达到有效培养体积时，进行换液；

步骤a中，逐日增大空气流量，每24h增加100ml/min～1000ml/min；

步骤b中，病毒培养12h时开始持续流加补充n倍浓缩DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培养液残糖量不低于1g/L为准；所述n等于2～5；

所述n倍浓缩DMEM液配制方法为：1份DMEM干粉培养基按照使用说明书用量加入去离子水配置成1×DMEM液后，再加入（n-1）份无Na-DMEM干粉培养基，溶解即成；所述n等于2～5。

2.根据权利要求1所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤b中，病毒接种前将种毒混于细胞维持液中，种毒与细胞维持液按V/V 0.5%～2%混合，病毒接种时将混有病毒液的细胞维持液泵入反应器系统中，无需吸附，直接启动病毒培养程序扩增培养病毒。

3.根据权利要求2所述的方法，步骤d中，收获病毒液中按V/V 1%~10%加入质量浓度为37%的甲醛溶液，70～140r/min，2-8℃灭活12～24h。

4.根据权利要求3所述的制备鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，步骤e中，在灭活的病毒液中按水相与油相佐剂V/V 3:1缓慢加入ISA 28 VG或MF59佐剂，乳化制备成水包油型鸭出血性卵巢炎灭活疫苗。