CN111041002B

CN111041002B - 猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN111041002B
Application number: CN201911337362.9A
Authority: CN
Inventors: 张华伟; 周明光; 余蕾; 徐高原; 倪冬冬; 金建云; 罗修鑫
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111041002A

Abstract

本发明提供一种猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法。该二价灭活疫苗包括目前流行的两种猪流行性腹泻变异毒株2a和2b亚型，可以预防由这两种不同变异株引起的腹泻，一针两用、安全有效，减少了动物的免疫和应激次数，可以通过免疫母猪保护小猪。制备方法包括：猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b全悬浮无血清培养，将灭活后的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b病毒液按比例混合，再加入佐剂充分乳化即得。本发明采用全悬浮无血清ST细胞培养工艺制备所得病毒液抗原含量高、易于放大培养、批量大、批间差异小，该工艺降低了污染风险、成本低，为PEDV的防控提供有效手段。

Description

猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术和预防兽医领域，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪腹泻疾病包括细菌引起的腹泻和病毒引起的腹泻，而在病毒性腹泻中起到主要防疫作用的是猪流行性腹泻病毒。目前市面可见的猪腹泻疫苗大多为猪流行性腹泻病毒灭活苗或者活苗、猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎或其它病毒的二联苗及猪流行性腹泻病毒-猪传染性胃肠炎病毒-猪轮状病毒等其它病毒的三联苗。然而，这些单苗或联苗对于现在流行的2a亚型或2b亚型变异株无效。另外，目前疫苗生产中血清问题日益突出，价格高、对猪有副反应等问题推动着无血清病毒培养技术的快速发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒2a KQ01株，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编 430072，保藏编号CCTCC NO:V202005，保藏日期2019年12月19日。

第二方面，本发明提供猪流行性腹泻病毒2b KQ02株，该毒株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202006，保藏日期2019年12月19日。

第三方面，本发明提供所述猪流行性腹泻病毒2a KQ01株和/或所述猪流行性腹泻病毒2b KQ02株在疫苗制备中的应用。

第四方面，本发明提供一种组合物，其包含所述猪流行性腹泻病毒2a KQ01株和 /或所述猪流行性腹泻病毒2b KQ02株以及药学上可接受的载体。

第五方面，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、2b二价灭活疫苗，所述二联灭活疫苗是将猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、猪流行性腹泻病毒2b KQ02株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。

其中，收获的猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、2b KQ02株的病毒液滴度不低于10⁷TCID₅₀/0.1mL。

优选地，两种病毒液灭活后按等体积混合。

可选地，所述佐剂为IMS1313。

第六方面，本发明提供所述二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、2b KQ02 株分别接种培养好的ST细胞，继续培养，22～26小时(优选22小时左右)分别收获病毒，加入甲醛灭活病毒；

2)灭活后的两种病毒按比例混合后，加入佐剂混匀。

细胞培养条件为：37℃，pH7.2～7.4，DO值40％～60％，转速65～150rpm。在摇床上的转速可以是150rpm，反应器上可以是65～75rpm。

本发明中，用于悬浮培养ST细胞的培养基(ST无血清培养基)购自甘肃健顺生物科技有限公司，货号Catalog No.:10604-17023。

对于猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、2b KQ02株，最佳接毒细胞密度为2×10⁶cells/ml，最佳接毒量为1％。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的二价灭活疫苗包括目前流行的两种猪流行性腹泻变异毒株2a和2b亚型，可以预防由这两种不同变异株引起的腹泻，一针两用、安全有效，减少了动物的免疫和应激次数，可以通过免疫母猪保护小猪。制备方法包括：猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b全悬浮无血清培养，将灭活后的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b 病毒液按比例混合，再加入佐剂充分乳化即为猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗。本发明采用全悬浮无血清ST细胞培养工艺制备所得病毒液抗原含量高、易于放大培养、批量大、批间差异小，该工艺降低了污染风险、成本低。本发明为 PEDV的防控提供有效手段。具体优点如下：

(一)本发明提供的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗可起到一针两用的效果，减少猪的副反应，可以通过免疫母猪保护小猪。

(二)本发明增殖病毒采用的是无血清全悬浮培养，可以减少生产成本、减少血清带来的副反应、易于扩大生产。

(三)本发明采用的ST细胞增殖病毒的工艺得到的病毒效价比传统工艺增殖的病毒效价至少高1个滴度，可达10^7.0TCID₅₀/0.1ml。

附图说明

图1显示为正常悬浮的ST细胞。

具体实施方式

本发明提供一种更有效预防目前流行的由猪流行性腹泻变异株2a和2b引起的猪腹泻的猪流行性腹泻变异株2a、2b二价灭活苗及其全悬浮无血清制备方法。所述方法包括：复苏ST纯悬浮细胞后，转移至生物反应器中扩大培养，按一定比例分别接种猪流行性腹泻病毒变异株2a和猪流行性腹泻病毒变异株2b，收获后的病毒液灭活，将灭活后的病毒液按比例混合得到抗原，加入水佐剂充分乳化后即为猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b病毒液的制备

1.毒种繁殖

将全悬浮ST细胞以0.5×10⁶-1×10⁶个/ml的密度接种于摇瓶中，于37℃、5％CO₂、150rpm培养箱中培养，72h后用ST无血清培养基将细胞密度稀释至2×10⁶-3×10⁶个 /ml，加入胰酶终浓度为10ug/ml，按1％的培养体积接种猪流行性腹泻病毒变异株2a 或2b，37℃继续培养，18h-24h收获病毒液，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装、冻干，于-80℃以下保存。

2.生产用毒种的繁殖

包括细胞的扩大培养，病毒接种，病毒液收获，病毒效价测定，无菌及外源检测。

①种子罐中的细胞扩大培养：待摇瓶中全悬浮ST细胞密度达到7×10⁶-10×10⁶个/ml且细胞活率为95％以上时，将细胞转接于种子罐中。转接细胞前，对种子罐的溶氧(DO)电极、PH电极、温度电极要进行校准，罐体进行高压灭菌。根据种子罐体积泵入总体积20％的ST无血清培养基，以0.5×10⁶-1×10⁶个/ml的密度接入全悬浮 ST细胞，设置最佳培养条件为37℃，pH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70rpm±5rpm。

②病毒接种：当生物反应器中ST细胞密度达到7×10⁶-10×10⁶个/ml，用ST无血清培养基将细胞密度稀释至2×10⁶-3×10⁶个/ml，加入的胰酶终浓度为10-15ug/ml，将步骤1的病毒液作为种毒，按0.5％-1％的培养体积接种猪流行性腹泻病毒变异株2a 或2b，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，pH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70rpm ±5rpm。

③病毒液收获：接毒后18-24h收获并取样检测其TCID₅₀，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装。

④病毒含量测定及无菌、外源检验：按现行《中国兽药典》附录进行病毒效价测定及检验，病毒含量均不低于10⁷TCID₅₀/ml，且应无菌生长、无规定外源。

图1显示为正常悬浮的ST细胞。

3.猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b病毒液的制备

①生物反应器的扩大培养：待种子罐中细胞培养72h或96h且细胞活率为95％以上时转接细胞于生物反应器。在接种细胞前对溶氧(DO)电极、PH电极、温度电极要进行校准，罐体进行高压灭菌。泵入生物反应器总体积20％的ST无血清培养基，以0.5×10⁶-1×10⁶个/ml的细胞密度将细胞转接于生物反应器中，设置最佳培养条件为37℃，pH 7.2-7.4，DO40％-60％，70rpm±5rpm。

②病毒接种：当生物反应器中ST细胞密度达到7×10⁶-10×10⁶个/ml，用ST无血清培养基将细胞密度稀释至2×10⁶-3×10⁶个/ml，加入的胰酶终浓度为10-15ug/ml，按0.5％-1％的培养体积的接种猪流行性腹泻病毒变异株2a或2b，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，pH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70rpm±5rpm。

③病毒液收获：接毒后18h开始每隔6h取样检测其TCID₅₀，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装。

⑤病毒液纯化：将自然沉淀的病毒液吸取上清通过0.65μm滤器，再通过300KDa 的膜包浓缩。

4.灭活及半成品检测

①灭活：将纯化后的病毒液原液或稀释后加入灭活罐中，加入甲醛灭活，使甲醛终浓度为0.2％，边加边搅拌，混合均匀后于37℃下灭活48h，在此期间每隔2-4h搅拌一次。

②无菌检验：按现行〖中国兽药典〗附录进行检验，应无菌生长。

③灭活检验：取灭活后的抗原做无菌检测及将灭活液按1％体积比接种于贴壁的Vero，36h后收获并反复冻融2-3次，将收获的冻融物按以上方法接种Vero细胞，如此反复盲传2代，细胞应无病变。

实施例2猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b抗原制备的最佳条件优化

本实施例提供猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b培养最佳条件优化，具体如下：

1、最佳细胞密度的确定：待摇瓶中细胞密度达到7×10⁶-10×10⁶个/ml时，用ST 无血清培养基将ST细胞稀释，加入胰酶且浓度为15μg/ml，按体积比的1％接毒，分别设置细胞密度为2×10⁶个/ml和3×10⁶个/ml，24h后取样并测定病毒效价。结果显示最佳接毒细胞密度为2×10⁶个/ml。

2、最佳胰酶浓度的确定：待细胞密度达到7×10⁶-10×10⁶个/ml后用ST无血清培养基将ST细胞稀释为2×10⁶个/ml的细胞密度，按体积比的1％接毒，分别使胰酶浓度为10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，24h后取样并检测病毒含量。结果表明最佳胰酶浓度为10μg/ml。

3、最佳接毒量的确定：待细胞密度达到7×10⁶-10×10⁶个/ml后用ST无血清培养基将ST细胞稀释为2×10⁶个/ml的细胞密度，加入的胰酶浓度为10μg/ml，接毒量分别按体积比的1％、3％接毒，24h后取样并检测病毒含量。结果表明最佳接毒量为1％。

实施例3猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗的制备

按照实施例2中猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b培养最佳条件下制备的灭活病毒液，进行二联灭活疫苗的制备。

1、PEDV-2a/2b二价灭活疫苗制备

①水相制备：将灭活好的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b按体积比1：1混合均匀，混合后猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b的效价均≥10⁶TCID₅₀/0.1mL。

②乳化、分装：将水相与水佐剂IMS1313按体积比3：1混合后乳化，检测合格后定量分装、轧盖、贴签。

2、疫苗检验方法

按照上述方法制备3批疫苗，批号分别为：20190101、10190102、20190103。

①性状检验：3批灭活疫苗外观呈淡黄色

②无菌检验：3批灭活疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

③支原体检验：3批灭活疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。

④外源病毒检验：3批灭活疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应为纯净毒种。

⑤安全检验：选取猪流行性腹泻病毒中和抗体、抗原均为阴性的3日龄仔猪20 头，分成4组，每组5头，肌肉注射10头份疫苗，临床观察2周，均为100％健活，未见不良反应。结果见表1：

表1 3批猪流行性腹泻病毒变异株2A/2B二价灭活疫苗检验结果

检验项目	20190101	20190102	20190103
				性状检验	淡黄色	淡黄色	淡黄色
无菌检验	无菌生长	无菌生长	无菌生长
				支原体检验	无支原体生长	无支原体生长	无支原体生长
外源病毒检验	无外援病毒污染	无外援病毒污染	无外援病毒污染
				安全性检验	100％健活，未见不良反应	100％健活，未见不良反应	100％健活，未见不良反应

实施例4猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗安全性试验

1.选取某猪场21-28日龄仔猪，并对其进行主要病原和相关抗体检测，选用对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病病毒检测为阴性和猪流行性腹泻中和抗体阴性(PEDV中和抗体效价不高于1：2)仔猪，共计20头。

2.将试验猪随机分成4组，每组5头。组1、组2分别肌肉注射实施例3制备的批号为20190101的灭活苗各1头份/头，组2免疫2周后再肌肉注射1头份/头，组3肌肉注射2 头份/头，组4不进行注射免疫为对照组。观察4周。

3.结果：免疫组1、2、3均与对照组比较，采食、饮水均未见异常，注射部位未见不良反应，100％健活。

以上实验结果表明，本发明提供的二联灭活疫苗的安全性良好。

实施例5猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗的免疫保护效力试验

1.选取产前5-6周猪流行性腹泻中和抗体阴性(PEDV中和抗体效价不高于1：2) 的妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5头猪，组1免疫实施例3制备的批号为20190101 的灭活苗1头份/头，组2肌肉注射相同量的生理盐水作为对照组，分别于免疫后第1 周、第2周、第3周、第4周、第5周采血，测定其中和抗体水平；待母猪产仔后，分别随机取组1中3日龄、7日龄仔猪各10头，组2中3日龄、7日龄仔猪各10头；均口服猪流行性腹泻病毒强毒2a(保藏号CCTCC NO:V202005)和2b(保藏号CCTCC NO:V202006)各5ml，观察仔猪攻毒后的临床表现。

2.试验结果：结果表明在免疫后2周中和抗体水平最高，且中和抗体水平可以维持到母猪产仔。免疫猪流行性腹泻变异猪2a/2b灭活疫苗的母猪所产下仔猪，3日龄和 7日龄攻毒后，10头免疫仔猪哺乳、精神、粪便均未见异常，100％健活；注射生理盐水的对照组所产下仔猪，3日龄和7日龄攻毒后，10头免疫仔猪全部表现为典型的猪流行性腹泻症状，全部死亡。实验数据见表2～表4。

表2母猪免疫二联灭活疫苗后针对猪流行性腹泻病毒变异株2a的中和抗体水平

	第1周	第2周	第3周	第4周	第5周
						中和抗体水平	1：32	1：64	1：42	1：42	1：28

表3母猪免疫二联灭活疫苗后针对猪流行性腹泻病毒变异株2b的中和抗体水平

	第1周	第2周	第3周	第4周	第5周
						中和抗体水平	1：32	1：70	1：50	1：50	1：36

表4免疫母猪所产的仔猪攻毒保护率

以上实验结果表明，免疫了猪流行性腹泻变异猪2a/2b灭活疫苗的母猪能够产生针对猪流行性腹泻病毒变异株2a及2b的中和抗体，能有效防止母猪及其所产仔猪对猪流行性腹泻病毒变异株2a和2b感染所致的猪腹泻病。

本发明提供的猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗，可以有效防止猪行性腹泻变异株2a、2b的感染，可以通过免疫母猪保护小猪。本发明采用ST细胞全悬浮无血清增殖的猪流行性腹泻病毒效价更高、副反应小。为PEDV的防控提供有效手段。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.猪流行性腹泻病毒2a KQ01株，其特征在于，保藏号为CCTCC NO:V202005。

2.猪流行性腹泻病毒2b KQ02株，其特征在于，保藏号为CCTCC NO:V202006。

3.权利要求1所述猪流行性腹泻病毒2a KQ01株和权利要求2所述猪流行性腹泻病毒变异株2b在疫苗制备中的应用。

4.一种组合物，其特征在于，其包含权利要求1所述猪流行性腹泻病毒2a KQ01株和权利要求2所述猪流行性腹泻病毒变异株2b以及药学上可接受的载体。

5.猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、2b KQ02株二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗是将权利要求1所述猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、权利要求2所述猪流行性腹泻病毒2b KQ02株分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。

6.根据权利要求5所述的二联灭活疫苗，其特征在于，收获的猪流行性腹泻病毒2aKQ01株、2b KQ02株的病毒液滴度不低于10⁷ TCID₅₀/0.1 mL；

两种病毒液灭活后按等体积混合。

7.根据权利要求5或6所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为IMS1313。

8.权利要求5-7任一项所述二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪流行性腹泻病毒2a KQ01株、2b KQ02株分别接种培养好的ST细胞，继续培养，22~26小时分别收获病毒，加入甲醛灭活病毒；

2）灭活后的两种病毒按比例混合后，加入佐剂混匀。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，细胞培养条件为：37℃，pH7.2~7.4，DO值40%~60%，转速65~150rpm。