CN112961837B - 一种新城疫vii型弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞和生物制品领域，具体涉及一种新城疫VII型弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法。在本发明所述方法中，所用新城疫病毒的毒株为新城疫基因VII型强毒经F基因位点突变而致弱的毒株。本发明所述方法，采用无血清全悬浮细胞培养，不受种蛋供应不足或不可控因素影响；操作简单、制备病毒量大，病毒含量高，克服了病毒鸡胚培养因种蛋供应不足而影响病毒的繁殖导致疫苗生产停滞，从而影响市场疫苗的供应。

Description

一种新城疫VII型弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法

技术领域

本发明涉及细胞和生物制品领域，具体涉及一种新城疫弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法。

背景技术

新城疫是由病毒引起的一种高度接触性传染病，主要侵害鸡和其他禽类及野生鸟类，人也可以感染，主要表现为结膜炎。本病是鸡病中危害最严重的一种疫病，发病急、死亡率高，造成很大经济损失。现在我国各地普遍开展强制免疫接种以提高鸡群的免疫力减少疫病的发生。

新城疫病毒的培养目前大多仍采用鸡胚繁殖，操作过程复杂，包括种蛋的引进、码蛋、消毒、进入前孵化机孵化，接种前照蛋剔除光蛋和死蛋，接种病毒，接种后进入后孵化继续孵化繁殖病毒。接种后24小时内照蛋剔除死胚，以后每天照蛋取出死胚直至培养结束，将培养结束的活鸡胚放入冷库冷冻4小时以上，收获全部鸡胚病毒液，将收获的病毒液过滤去除大的杂质，离心、纯化，最后纯化好的病毒液即为制苗用病毒液，收获病毒液后的鸡胚需高压并进行无害化处理。这一过程消耗大量人力物力，制备时间长，成本高、易污染，费时费力，且病毒液收获量少，从而增加了制苗成本。

有文献或专利报道用鸡胚成纤维细胞培养新城疫病毒，但成本相比悬浮细胞毒要高，且制作原代细胞过程复杂，不太适合大规模培养。有报道用EB66细胞培养新城疫病毒，但EB66细胞购买成本较高，培养基为专属用培养基，在国内一时难以推广开来，且免疫效果不确定。有用鸭胚视网膜(AGE1细胞)悬浮细胞培养新城疫基因VII型病毒，但AGEI细胞对营养要求高，相比于BHK细胞成本要增加。近些年BHK-21悬浮细胞培养新城疫病毒的研究报道开始增多，大多为培养新城疫经典毒株(如Lasota株)，但未见用BHK无血清全悬浮细胞培养新城疫基因VII型弱毒株的文献或专利。

全悬浮细胞培养制备抗原已成疫苗行业的流行趋势，全悬浮细胞培养相比于转瓶培养和微载体悬浮培养等更加容易操作，减少了贴壁细胞的胰酶消化过程，细胞密度也远超过贴壁细胞的量，更加容易放大培养增加病毒的繁殖量，减少细胞污染的机会，从而也节省了大量的人力、物力和财力。

禽类病毒异源细胞的全悬浮培养国内外早有研究，但真正用于生产的还很少，大多正处在研究阶段，这与病毒对异源细胞的适应性有关，不同病毒对异源细胞的适应性不同，很多禽类病毒不能在异源细胞上生长繁殖或者还没有被发现或者方法不对有待开发。鸡新城疫病毒的全悬浮细胞培养近几年有不少文献和专利报道，主要是针对新城疫病毒Lasota株的研究报道，Lasota株是较经典和常用的病毒株，但对悬浮细胞的适应性较弱。

发明内容

本发明的目的是针对引起免疫鸡群新城疫流行的基因VII型新城疫病毒制备生产基因VII型新城疫疫苗。

近年来，屡有发现免疫鸡群仍发生新城疫的流行，经实验室诊断确诊免疫鸡群流行的新城疫绝大多数属于基因VII型。基因VII型新城疫病毒与我国广泛使用的Lasota疫苗株之间存在明显遗传差异和抗原性差异，这是造成现行使用的疫苗免疫失败的原因，加速生产基因VII型新城疫疫苗势在必行。

第一方面，本发明提供一种新城疫弱毒株，所述新城疫弱毒株为新城疫VII型强毒经F基因位点突变而致弱的病毒株；所述F基因位点突变为毒株基因组的3161-3168位置的GCTTCAAC突变为GTTTAAAC。

本发明提供的弱毒株无需经过贴壁细胞或鸡胚上繁殖适应，可直接接种于悬浮细胞培养，经过悬浮细胞培养至第4代，病毒液HA血凝价可达到9孔，目前已传代至13代，病毒液HA血凝价仍能稳定在9孔及以上。而新城疫基因VII型强毒株或Lasota株在悬浮细胞上培养需要连续多次传代才能完全适应细胞培养，基因VII型强毒株在传至第4代时HA血凝价最高为6孔，继续传至第9代HA检测血凝价达到9孔，Lasota株病毒在传至第4代时HA血凝价最高为3孔，继续传至第11代时HA检测血凝价达到9孔。可见本发明致弱的NF02株病毒更适合在无血清全悬浮细胞上快速繁殖培养。

第二方面，本发明提供一种新城疫弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法，其中新城疫弱毒株的接种量为0.01-0.1％。

本发明所述方法操作简单、制备病毒量大，病毒含量高，且病毒繁殖稳定，可连续繁殖病毒，不会受种蛋供应不足或不可控因素导致无种蛋可用，而影响病毒的繁殖导致疫苗生产停滞，从而影响市场疫苗的供应。

在本发明提供的新城疫弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法中，最佳的病毒液收获时间是接种后的48-54h；在进行细胞培养过程中TPCK胰酶最佳使用浓度为1-6μg/mL。

进一步的，在本发明所提供的方法中，所述新城疫弱毒株接种时培养基中的细胞密度为1×10⁶-1.5×10⁶。

在细胞接种密度上，现有技术细胞接种密度在2.5x10⁶个细胞及以上，本发明优化的细胞接种密度只需1.0x10⁶个细胞，培养的病毒液HA效价不低于9(即1:512)孔。细胞接种密度的降低更有利于病毒液的大规模培养，从而降低生产成本和节省人力物力。

在上述方法中，优选所述新城疫弱毒株为新城疫VII型强毒经F基因位点突变而致弱的病毒株。

以上对本发明的技术方案及具体实施方式进行了详细介绍，但本发明所提供的BHK无血清全悬浮细胞培养不局限于新城疫基因VII型弱毒株的培养，对于新城疫基因VII型强毒株及新城疫其他病毒株的无血清全悬浮细胞培养都属于本发明的范围。

本发明所提供的新城疫弱病毒株的细胞培养方法，包括如下步骤：

使用占细胞培养液0.01-0.1％的新城疫弱毒株接种到细胞密度为1×10⁶的细胞培养基中；使用浓度为1-6μg/mL的TPCK胰酶处理；在所述新城疫弱毒株接种后的48-54h后，收获病毒液。

现有技术中TPCK胰酶使用浓度为10ug/ml，本发明的TPCK胰酶使用浓度为2ug/ml，极大的节省了胰酶使用量。

第三方面，本发明要求保护使用上述方法制备得到的新城疫病毒液，即新城疫疫苗抗原。

根据本领域技术人员的理解，本发明还要求保护上述新城疫病毒弱毒株或上述方法或上述新城疫疫苗抗原在以下的应用：

(1)在新城疫病毒疫苗生产中的应用；

(2)在新城疫病毒疫苗质量控制中的应用

(3)在新城疫病毒防治中的应用；

(4)在新城疫病毒检测中的应用。

本发明的有益效果至少包括：

(1)本发明所提供的新城疫弱毒株适应细胞培养的能力强、所产病毒液的毒价高，病毒繁殖稳定，且可连续繁殖病毒，可大批量制备疫苗；

(2)本发明所提供的悬浮细胞培养病毒相比鸡胚培养简单、快速、制备量大，适合于生产大批量制备抗原；

(3)本发明所提供的悬浮细胞培养病毒克服了用鸡胚培养病毒中易污染、操作繁琐、抗原制备量不确定等不足；

(4)本发明所提供的悬浮细胞培养病毒克服了因种蛋供应不足或不可控因素导致无种蛋可用，从而影响病毒的繁殖而导致疫苗生产停滞。

附图说明

图1为本发明实施例1中新城疫基因VII型弱毒(NF02株)悬浮培养至48小时的病变细胞图和正常对照细胞图。

图2为本发明实施例6中新城疫基因VII型弱毒(NF02株)鸡胚毒和新城疫基因VII型弱毒(NF02株)F6代悬浮细胞毒的序列对比图。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1病毒最佳收获时间

本实施例探究所述方法中，病毒液最佳收获时间，步骤如下：显微镜下观察并计数细胞密度为7.9×10⁶个，调整细胞接种密度为1.5×10⁶个，TPCK胰酶加入量为1-6ug/ml，病毒接种量为0.001-1％，37℃震摇培养，转速为100-150r/min，分别于接种后36h、41h、48h、54h、60h、72h收获病毒液，检测每个时间点的HA效价，结果见表1。

本实施例中新城疫基因VII型弱毒(NF02株)悬浮培养至48小时的病变图片和正常对照细胞图见图1。

表1不同收获时间病毒液HA检测结果

病毒液收获时间	36h	41h	48h	54h	60h	72h
							HA	7	8	9	9	9	9

表1结果显示，接种后48h，新城疫细胞毒的效价稳定在9，考虑到细胞生长繁殖的特点，选择接种后48-54h作为新城疫细胞毒的最佳收获时间。

实施例2细胞最佳接种密度

本实施例探究所述方法中，最适的细胞接种密度，步骤如下：观察并计数细胞密度为8.0×10⁶个，将细胞密度调整为1.0×10⁶，2.0×10⁶，3.0×10⁶个。TPCK胰酶浓度为1-6ug/ml，病毒接种浓度为0.001-1％，37℃震摇培养，转速为100-150r/min，培养48-54小时收获，检测病毒HA效价，结果见表2。

表2不同细胞密度接种培养得到病毒液的HA检测

细胞密度	1.0x10<sup>6</sup>	2.0x10<sup>6</sup>	3.0x10<sup>6</sup>
				HA	9	7	1

表2结果显示，细胞密度在1.0×10⁶时，进行接种病毒繁殖能力最佳。

实施例3TPCK胰酶最佳使用浓度

本实施例探究所述方法中，TPCK胰酶最佳使用浓度，步骤如下：按试验需要调整细胞密度为1.0×10⁶个细胞，分装至5个125ml摇瓶内，加入TPCK胰酶浓度分别为1ug/ml，2ug/ml，3ug/ml，5ug/ml，6ug/ml，病毒接种浓度为0.001-1％，100-150r/min培养48-54小时收获，检测病毒HA效价，结果见表3。

表3最佳TPCK胰酶使用浓度HA检测

胰酶浓度	1ug/ml	2ug/ml	3ug/ml	5ug/ml	6ug/ml
						HA	6	9	9	8	8

表3结果显示，TPCK胰酶浓度为2-3ug/ml时病毒繁殖最佳。

实施例4病毒细胞培养的最佳接种剂量

本实施例探究所述方法中，病毒细胞培养的最佳接种剂量，步骤如下：

调整细胞密度为1.0×10⁶个细胞，分装至4个125ml摇瓶内，加入TPCK胰酶浓度约为2ug/ml，病毒接种量分别为1％、0.1％、0.01％、0.001％，37℃震摇培养，转速为100-150r/min，培养48-54小时收获，检测病毒HA效价，结果如表4。

表4不同接种剂量得到的病毒液HA检测

病毒接种剂量	1％	0.1％	0.01％	0.001％
					HA	8	9	9	8.5

表4结果显示，本发明所述无血清全悬浮细胞培养方法中，病毒接种量在0.01-0.1％时最佳。

实施例5NF02株细胞毒制备

本实施例提供新城疫弱毒株的细胞培养方法，具体地，本实施例提供无血清全悬浮培养得到新城疫细胞毒的方法，具体步骤如下：

(1)无血清悬浮细胞的培养

从液氮罐中快速取出一支BHK悬浮培养细胞，置于42℃水浴中顺时针方向快速溶解，将溶解的细胞移入到含有20ml培养基的50ml离心管内，800rpm/min离心5min弃上清，加入无血清悬浮培养基重悬细胞，将细胞移入250ml摇瓶内定容至25ml，置于摇床上调整转速为130r/min。培养36～60小时计数细胞数量，当细胞处于对数生长期且细胞密度不低于8.0x10⁶个细胞时将细胞传代扩大培养用于下游病毒的繁殖接种。

(2)新城疫弱毒的接种

将培养好的细胞按上述优化好的新城疫VII弱毒培养条件，调整细胞密度为1.0x10⁶个细胞，加入TPCK胰酶，浓度为2ug/ml，按体积比加入0.01％的NF02株病毒混匀后置于摇床上37℃130r/min匀速摇动培养，培养至36小时开始观察细胞病变，当出现细胞碎片增多或死亡细胞增多时开始收获病毒液。

(3)病毒液的收获

当细胞病变明显时开始收获病毒液，-20℃反复冻融或用细胞破碎仪裂解细胞释放病毒，离心去除细胞碎片，收获的上清液即为制苗用病毒液，病毒液HA检测应不低于9孔，标记名称、日期及病毒液效价，4℃保存备用。

实施例6病毒F基因突变位点测定

为验证病毒在异源细胞上培养对病毒基因序列的影响，取新城疫基因VII型弱毒(NF02株)鸡胚毒和新城疫基因VII型弱毒(NF02株)F6代悬浮细胞毒，提取病毒RNA，经RT-PCR反转录为cDNA，扩增目的片段，送测序公司进行F基因突变位点的序列测定，经鸡胚毒和悬浮细胞毒部分基因序列对比，见图2。

图2中鸡胚增殖得到的NF02株鸡胚毒及细胞培养得到的NF02株细胞毒的序列是一致的；也可以看出与参考序列(新城疫VII型强毒)相比，新城疫VII型弱毒的F基因位点突变为：毒株基因组的3161-3168位置的GCTTCAAC突变为GTTTAAAC。

图2结果证明新城疫基因VII型弱毒(NF02株)在异源细胞上培养不会改变病毒的基因序列，新城疫基因VII弱毒完全可以在异源细胞上培养。

实施例7疫苗的制备及免疫效力试验

将实施例5制备得到的病毒液按体积比加入0.1％的甲醛溶液，混匀后37℃灭活16小时，期间摇动数次，用鸡胚进行灭活检验，合格后加入4％的吐温-80作为水相，充分混匀后4℃保存备用。取Marcl-52白矿物油佐剂，加入6％的司苯-80作为油相，混匀后灭菌备用。取制备好的油相和水相按2:1比例乳化制备疫苗，先将油相加入容器内低速搅拌，再将水相缓慢加入油相内，调整转速至10000r，持续搅拌5～15分钟即为油佐剂灭活疫苗。对疫苗进行外观、剂型、粘度、稳定性检验和无菌检验，合格后进行疫苗的免疫效力试验。

取3～4周龄SPF鸡进行颈部皮下免疫接种，分胚毒苗免疫组和悬浮细胞毒苗免疫组，每组10只，每只鸡免疫20ul，至免疫接种后3～4周采血分离血清，进行HI抗体效价检测，检测结果见表5。

表5 HI抗体效价检测

表5抗体检测结果显示，悬浮细胞毒苗抗体效价为2^5.9孔(1:59.7)，与胚毒苗的抗体效价2^6.1孔(1:68.6)接近，均能达到完全保护。且对Lasota株也有较好的交叉保护效果。

实验例1病毒传代稳定性试验

根据上述优化的试验数据，进行病毒的传代稳定性试验，连续传代至第13代，病毒HA效价仍维持在9孔以上，如表6。

表6病毒传代稳定性结果

代次	F1	F2	F3	F4	F5	F6	F7	F8	F9	F10	F11	F12	F13
														HA	7	7	8	9	9	9	9	9	9.5	9.5	9	9	9

实验例2

1、病毒液对鸡胚的致死性试验

分别取悬浮细胞毒NF02株弱毒、悬浮细胞毒基因VII型强毒株、悬浮细胞毒Lasota株弱毒进行鸡胚致死性试验，将病毒1000倍稀释接种10日龄SPF鸡胚，以后每日照胚观察，NF02株悬浮细胞毒接种后120小时可致2/5鸡胚死亡，其余活鸡胚进行HA检测仍有10孔的血凝价；基因VII型强毒悬浮细胞毒40小时内可致鸡胚全部死亡，HA检测为4～8孔的血凝价；Lasota株悬浮细胞毒120小时鸡胚无死亡，HA检测为1～7孔。可见本致弱毒毒力明显减弱且能很快从悬浮细胞毒适应鸡胚的繁殖，这也是本病毒较其他病毒不同的地方。

2、脑内致病指数(ICPI)试验

将悬浮细胞毒NF02株F6代反复冻融三次离心去细胞碎片并进行10倍稀释，另取基因VII型强毒按上述方法稀释作为阳性对照，脑内接种1日龄SPF鸡各10只，每只0.05ml。另取2只按同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05ml。接种后每天在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(行动灵活，无共济失调现象)、发病(麻痹、卧地不起)和死亡。观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常0、发病为1，死亡为2)累计总分数。ICPI为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数的平均值。NF02株ICPI检测结果为0.22，基因VII型强毒ICPI检测值为1.6，两只空白对照鸡正常无死亡。(ICPI值<0.5为弱毒，ICPI值在0.5～1.5为中等毒，ICPI值在1.5～2.0为强毒)。可见本研究培养的新城疫VII型病毒为完全致弱的病毒株。

3、病毒液EID₅₀检测

取悬浮细胞毒液，反复冻融后离心去细胞碎片，用生理盐水10倍系列稀释，取10^-6～10^-9稀释度接9日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，密封针孔后标记，置入37℃恒温培养箱内培养120小时，每天早晚两次照胚，弃去24小时内死胚，直至120小时，无论死胚、活胚全部进行HA血凝价检测，凝集孔不低于7孔的判为感染，按照Reed-Mench法计算病毒的EID₅₀，EID₅₀检测结果为10^-8.38/0.1ml，结果见表7。

表7病毒液EID₅₀检测结果

D＝(80-50)/(80-0)＝0.38

LogEID₅₀＝-8+0.38(-1)＝-8.38

EID₅₀＝10^-8.38/0.1ml。

试验证明，不同的新城疫病毒对细胞的易感性不同，感染细胞的强度也不同，如Lasota株病毒经过无血清全悬浮细胞培养再接种10日龄SPF鸡胚，37℃培养120小时不致死鸡胚，进行HA血凝价检测，凝集孔为1～7孔。本研究致弱的新城疫VII型病毒，经过无血清全悬浮细胞培养再接种10日龄SPF鸡胚，37℃培养120小时能使2/5的鸡胚死亡，进行HA血凝价检测，凝集孔为8～10孔。新城疫基因VII型强毒经过无血清全悬浮细胞培养再接种10日龄SPF鸡胚，37℃培养，96小时内鸡胚全部死亡，进行HA血凝价检测，凝集孔为4～8孔。说明本致弱毒既能适应无血清全悬浮细胞培养有不失对鸡胚的易感性，本弱毒相比于新城疫经典毒株(如Lasota株)更适合在无血清全悬浮细胞上培养。

本发明的弱毒在悬浮细胞上繁殖细胞密度在1x10⁶就可产生很高的病毒量，从而节省了细胞用量，更有利于病毒的扩大培养。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种新城疫弱毒株，其特征在于，所述新城疫弱毒株为新城疫VII型强毒株基因组的3161-3168位置的GCTTCAAC突变为GTTTAAAC而致弱的病毒株。

2.权利要求1所述新城疫弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法，其特征在于，新城疫弱毒株的接种量为0.01-0.1%。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，病毒液收获时间是所述新城疫弱毒株接种到细胞后48-54h；TPCK胰酶最佳使用浓度为1-6μg/mL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述新城疫弱毒株接种时细胞密度为1×10⁶-1.5×10⁶。

5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述新城疫弱毒株为新城疫VII型强毒株基因组3161-3168位置GCTTCAAC突变为GTTTAAAC而致弱的病毒株。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括：

使用占细胞培养液0.01-0.1%的新城疫弱毒株接种到细胞密度为1×10⁶的细胞培养基中；

使用浓度为1-6μg/mL的TPCK胰酶处理；

在新城疫弱毒株接种后的48-54h后，收获病毒液。

7.一种新城疫病毒的病毒液，其特征在于，使用权利要求2-6任一项所述方法制备得到。

8.权利要求1所述新城疫弱毒株或权利要求2-6任一项所述方法或权利要求7所述病毒液在制备新城疫病毒疫苗中的应用。

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