CN112080478B - 一种h5亚型禽流感病毒的高效增殖方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种H5亚型禽流感病毒的高效增殖方法及应用，主要涉及种毒稀释液的改进，本发明以磷酸缓冲液为基础，通过添加天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子，实现了H5亚型禽流感病毒在SPF鸡胚和非免鸡胚中的高效增殖，其在疫苗制备过程中，仅需要进行离心和过滤处理即可得到符合生产标准的抗原，且也能达到传统生产工艺经浓缩后的抗原液同样的病毒含量和HA效价，免疫后的HI抗体水平也与传统工艺无显著差异。其相比传统工序，无需进行浓缩处理，其节约了生产成本，特别是浓缩设备和浓缩工艺费用，提高了生产效率，且可以降低产品生产中的污染风险。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种H5亚型禽流感病毒的高效增殖方法及应用。
背景技术：
禽流感（Avian Influenza）是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被OIE定为I类传染病，其是以侵害呼吸系统为主的疾病，常常导致家禽发病甚至死亡，亦可感染哺乳动物和人。根据禽流感病毒致病能力的差异，可将禽流感分为低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI），其中H5亚型是HPAI之一，禽类是H5N1病毒的天然宿主，研究表明H5N1禽流感病毒可以打破物种屏障，更容易使哺乳动物致病，造成大流行。世界不同国家采取扑杀或疫苗免疫进行有效防控H5N1等HPAI，我国H5N1亚型禽流感灭活疫苗对鸡和水禽均具有良好的免疫效果。
在禽流感疫苗生产中，目前主要依靠鸡胚法，通常采用SPF鸡胚或者非免鸡胚进行培养，然而，在培养过程中，存在病毒培养含量低的问题，通常需要通过浓缩的方法实现，但是，一方面，浓缩会导致生产线的延长，增加生产成本，另一方面，在浓缩过程中可能会增加污染的几率。因此，基于节约生产成本和提高疫苗质量的考虑，各疫苗生产企业致力于研究如何提高病毒的含量，如发明专利申请CN201611170075X（公开号：CN106754750A）即提出了一种H5亚型禽流感病毒的增殖方法，在种毒接种过程中采用由氨基酸混合物和维生素混合物组成的磷酸盐缓冲液，可以有效提高尿囊液中的病毒含量，其丰富了禽流感疫苗的制备方法。基于禽流感病毒，特别是H5N1亚型的高致病性，其对于SPF鸡胚和非免鸡胚的致死性比较强，生产过程中通常接种后鸡胚的死亡率高达5%以上，对于生产效率具有较大的影响。
发明内容：
基于现有H5亚型禽流感病毒鸡胚培养滴度低，以及在接种后鸡胚的死亡率高的问题，本发明旨在提供一种H5亚型禽流感病毒的高效增殖方法，所述方法能够提升鸡胚培养时尿囊液中的病毒含量以及尿囊液的产量，同时降低鸡胚的死亡率，对于生产效率的提升具有积极意义。
一种H5亚型禽流感病毒的高效增殖方法，其是将所述方法是将 H5亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于SPF鸡胚或非免鸡胚，接种后置 36～37℃继续孵育 72-96 小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、过滤后得到 H5亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl2 和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。
本发明还请求保护一种生产H5亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括利用SPF鸡胚或非免鸡胚生产H5亚型禽流感病毒原液，经灭活后，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H5亚型禽流感病毒灭活疫苗，所述生产H5亚型禽流感病毒原液的方法是将H5亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于非免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、过滤后得到H5亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。
所述磷酸盐缓冲液按照如下方法配制：取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4﹒12H2O2.9g，KH2PO4 0.2g，将以上试剂依次溶解于800mL双蒸馏水中，边加边搅拌使其溶解，然后用NaOH或HCl调节至pH 7.4，最后加双蒸水至1000mL，灭菌备用。
所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1.5ng/mL。
所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1.5ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。
所述H5亚型禽流感病毒优选为重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株，由中国农业科学哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应，本公司被授权生产。
所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子（rhEGF），购自武汉艾美捷科技有限公司，产品货号为PRP100159。
本发明还请求保护一种生产H5亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一，取H5亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释，取10-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄非免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，不必翻蛋；
步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12～24小时。
步骤三，将冷却12～24小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；
步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；
步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个储存罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，取样测定毒价，其HA效价不低于1：512；
步骤六，采用甲醛灭活，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鸡胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，按抗原量计，使甲醛最终浓度为0.2%，甲醛加入完毕后，启动储存罐升温系统，抗原温度达到37℃时，将抗原倒到另一个已灭菌的灭活罐内开始计时，灭活24小时，期间不停搅拌。至灭活24小时，取样做无菌检验和灭活检验；
步骤七，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H5亚型禽流感病毒灭活疫苗。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明通过对种毒稀释液进行调整和优化，以磷酸缓冲液为基础，通过添加天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子，实现了H5亚型禽流感病毒在SPF鸡胚和非免鸡胚中的高效增殖，其在疫苗制备过程中，仅需要进行离心和过滤处理即可得到符合生产标准的抗原，且也能达到传统生产工艺经浓缩后的抗原液同样的病毒含量和HA效价，免疫后的HI抗体水平也与传统工艺无显著差异。其相比传统工序，无需进行浓缩处理，其节约了生产成本，特别是浓缩设备和浓缩工艺费用，提高了生产效率，且可以降低产品生产中的污染风险。
另外，在本发明的种毒稀释液中首次添加了ZnCl2和表皮生长因子，试验表明，两者的配合试验能够提高鸡胚接种后的活胚数量，减少鸡胚的死亡，另外，单胚尿囊液的收获量、病毒含量相比磷酸缓冲液作为种毒稀释液得到了很大的提高，两者相互配合，取得了不可预期的技术效果。
具体实施方式：
本发明所选用的种毒为重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株，由中国农业科学哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应，本公司被授权生产，所述种毒毒液的病毒含量为109.0EID50/0.1mL，HA效价为10log2。
实施例1: 种毒稀释液对鸡胚生产重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株的影响
本公司在研发中发现，天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子对于鸡胚的生长以及鸡胚中病毒的增殖存在一定的影响，为了得到最合适的种毒稀释液，以提高非免鸡胚中病毒的增殖效果，本公司优化了天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子的添加量，通过前期研发，发现天冬氨酸最合适的浓度为1.5 mg/mL，因此，本发明中进一步对ZnCl2和表皮生长因子及其用量进行了进一步的优化试验，具体试验设计如下：
H5亚型禽流感病毒的培养方法，将H5亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后，10-4稀释度的病毒液接种于鸡胚，接种后置37℃继续孵育72小时，收获活胚的鸡胚液，经离心后取上清液，即为H5亚型禽流感病毒培养液。
在收获过程中记录活胚数、尿囊液总收获量，并测定病毒培养液的EID50 值。
试验设计中，选取非免活鸡胚800枚。
试验分为8组，其中组1-5为对照试验组，采用与本发明不同的种毒稀释液进行稀释；组6-7为实验组，采用本发明优化后的种毒稀释液；组8为空白对照组，采用磷酸盐缓冲液作为种毒稀释液。试验过程中，种毒及稀释度、接种方式、孵育条件等均相同，区别仅在于种毒稀释液的组成。具体种毒稀释液的试验设计参见以下表1。
表1 种毒稀释液组成对H5亚型禽流感病毒增殖的影响试验设计
通过对收获的鸡胚进行检验，分别记录活胚数、尿囊液总收获量，并测定病毒培养液的EID50值。具体试验结果见下表2。
表2 鸡胚收获和病毒增殖生产情况
基于以上表2的试验结果可知，试验组6和7（种毒稀释液组成为天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的浓度为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1.5ng/mL）的活胚数分别达到98和99枚，其平均收获量分别为15.82和15.93mL/枚，病毒含量分别为108.97和109.02EID50/0.1mL，均高于空白对照组8和对照试验组1-5。以上结果表明，H5亚型种毒采用本发明的种毒稀释液稀释后，其病毒增殖的效率高于传统的磷酸盐缓冲液，同时，通过对比实验可知，在种毒稀释液中，ZnCl2和表皮生长因子的加入对于H5亚型禽流感病毒的增殖都具有非常重要的意义，且在本发明所限定的配比组成下，其能获得最佳的增殖效果。以上试验表明，在该种毒稀释液中，ZnCl2和表皮生长因子在特定浓度比例下发挥了相互协同的作用，不仅能够提高活胚比例，减少死胚的发生，而且其也能促进尿囊液的增加以及尿囊液中病毒的增殖，这在先前报道和现有文献中均不曾报道。
实施例2：重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株的高效增殖方法
步骤一，取H5亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释，取10-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄非免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育，不必翻蛋；
步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12～24小时。
步骤三，将冷却12～24小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；
步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；
步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个储存罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，取样测定毒价。
所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1.5ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。
采用磷酸盐缓冲液替换以上种毒稀释液，用以上同样的方法进行H5N1亚型Re-11株的培养，并在离心后采用公司现有工艺对其进一步3倍浓缩，分别测定了浓缩前后的病毒效价HA和病毒培养液的EID50值。
其中每个试验进行两个批次，分别命名为试验组1、试验组2，对照组1，对照组2，每次接种100枚活鸡胚。具体结果见下表。
表3 重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株的高效增殖试验
| 活胚数 | 离心后HA（log2） | 离心后EID<sub>50</sub>值（10<sup>X</sup>EID<sub>50</sub>/0.1mL） | 浓缩后HA（log2） | 浓缩后EID<sub>50</sub>值（10<sup>X</sup>EID<sub>50</sub>/0.1mL） | |
| 试验组1 | 99 | 12 | 8.86 | / | / |
| 试验组2 | 98 | 12 | 8.83 | / | / |
| 对照组1 | 92 | 9 | 7.65 | 11 | 8.13 |
| 对照组2 | 93 | 9 | 7.74 | 11 | 8.19 |
基于以上试验可知，采用本发明的种毒稀释液制备抗原液的试验组1和组2，其无需进行浓缩处理，即可达到较高的HA，满足生产的需求，而传统的采用生理盐水或磷酸盐缓冲液对种毒进行稀释后，其病毒的增殖量较低，必须依赖进一步的浓缩处理才能达到HA效价的基本要求。以上试验表明，本发明所述的方法可以高效增殖重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株，其在生产过程中无需浓缩即可达到抗原生产的基本要求，可以减少浓缩工序，节约生产成本以及降低浓缩工序对抗原液的污染，提高产品的安全性。
实施例3：H5N1亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法
步骤一，取重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释，取10-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄非免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育，不必翻蛋；
步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12小时。
步骤三，将冷却12小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；
步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；
步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个储存罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，同时取样测定毒价；
步骤六，采用甲醛灭活，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鸡胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，按抗原量计，使甲醛最终浓度为0.2%，甲醛加入完毕后，启动储存罐升温系统，抗原温度达到37℃时，将抗原倒到另一个已灭菌的灭活罐内开始计时，灭活24小时，期间不停搅拌。至灭活24小时，取样做无菌检验和灭活检验；
步骤七，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H5N1亚型禽流感病毒灭活疫苗。
所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1.5ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。
对于制备的疫苗，通过接种试验对本发明的制备的疫苗以及本公司按照传统工艺生产的H5N1灭活疫苗（实施例2中的对照组1和2）进行了免疫效力比对。
取21日龄的SPF鸡60只，随机分为3组，其中组1接种本发明的H5N1灭活疫苗，组2接种传统工艺生产的H5N1灭活疫苗，组3为对照组，注射等量的生理盐水，接种量为0.3mL/羽。免疫21天后采血检测HI抗体，经测定，组1中的HI抗体效价HI均值为10.5，组2中的HI抗体效价HI均值为10.1，空白对照组3中经检测，其呈现HI抗体阴性。以上试验结果表明，采用本发明所述方法制备得到的疫苗，其能达到传统疫苗生产工艺同样的免疫效力，可以用于流感病毒联苗的生产。且本发明的制备方法相比省略了浓缩工艺，节约了生产成本，提高了生产效率。
Claims (7)
1.一种H5亚型禽流感病毒的高效增殖用种毒稀释液，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl2 和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液；所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1.5ng/mL。
2.根据权利要求1所述的种毒稀释液，其特征在于，所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1.5ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。
3.一种H5亚型禽流感病毒的高效增殖方法，其是将所述方法是将 H5亚型禽流感病毒毒种用权利要求1-2中任一项所述的种毒稀释液稀释后接种于SPF鸡胚或非免鸡胚，接种后置 36～37℃继续孵育 72-96 小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、过滤后得到 H5亚型禽流感病毒原液。
4.根据权利要求3所述的H5亚型禽流感病毒的高效增殖方法，所述H5亚型禽流感病毒为重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株。
5.一种生产H5亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括利用SPF鸡胚或非免鸡胚生产H5亚型禽流感病毒原液，经灭活后，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H5亚型禽流感病毒灭活疫苗，所述生产H5亚型禽流感病毒原液的方法是将H5亚型禽流感病毒毒种用权利要求1-2中任一项所述的种毒稀释液稀释后接种于非免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、过滤后得到H5亚型禽流感病毒原液。
6.根据权利要求5所述的生产H5亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，所述H5亚型禽流感病毒为重组禽流感病毒H5N1亚型Re-11株。
7.根据权利要求6所述的生产H5亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一，取H5亚型禽流感病毒毒种用权利要求1-2中任一项所述的种毒稀释液作10倍系列稀释，取10-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄非免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，不必翻蛋；
步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12～24小时；
步骤三，将冷却12～24小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；
步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；
步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个储存罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，取样测定毒价，其HA效价不低于1：512；
步骤六，采用甲醛灭活，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鸡胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，按抗原量计，使甲醛最终浓度为0.2%，甲醛加入完毕后，启动储存罐升温系统，抗原温度达到37℃时，将抗原倒到另一个已灭菌的灭活罐内开始计时，灭活24小时，期间不停搅拌，至灭活24小时，取样做无菌检验和灭活检验；
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A highly efficient method for proliferation of H5 subtype avian influenza virus and its application Effective date of registration: 20221020 Granted publication date: 20210921 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: GUANGDONG WINSUN BIOPHARMACEUTICALS CO.,LTD. Registration number: Y2022980014976 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20231123 Granted publication date: 20210921 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: GUANGDONG WINSUN BIOPHARMACEUTICALS CO.,LTD. Registration number: Y2022980014976 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: An efficient proliferation method and application of H5 subtype avian influenza virus Effective date of registration: 20231206 Granted publication date: 20210921 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: GUANGDONG WINSUN BIOPHARMACEUTICALS CO.,LTD. Registration number: Y2023980069708 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |