CN108721615B

CN108721615B - 一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗

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Publication number: CN108721615B
Application number: CN201810465182.8A
Authority: CN
Inventors: 刘月焕; 罗顺; 林健; 张业炘; 杨志远; 王嘉琪; 王小蕾; 杨云; 段会娟; 杨贵君; 刘立新; 耿风廷; 程慧敏; 陈佩兰; 赵际成; 赵志欣; 潘洁; 钱建宁; 王盟
Original assignee: Gansu Jianshun Biotechnology Co ltd; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Gansu Jianshun Biotechnology Co ltd; Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2018-05-16
Filing date: 2018-05-16
Publication date: 2019-05-17
Anticipated expiration: 2038-05-16
Also published as: CN108721615A

Abstract

本发明公开了一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗，病毒接种所用细胞系为EB66细胞系（一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株），病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养；并经过1）毒种选育；2）建立毒种种子批；3）制备细胞毒液；4）灭活病毒；5）乳化等步骤完成疫苗的制备。本发明方法具有制备的细胞毒液病毒含量高、生产工艺稳定、智能化控制、可大规模无血清悬浮培养、易操作和成本低等特点，制备的鸭坦布苏病毒灭活疫苗具有安全、副反应低、免疫效力高、批间差异小、检验次数少和成本低等优点，为水禽产业预防鸭坦布苏病毒病发生和流行的理想疫苗。

Description

一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，更具体地说涉及用一种细胞系生产鸭坦布苏病毒病灭活苗的方法，属于生物技术领域。

技术背景

我国鸭存栏量每年约40亿只。从2010年春季开始，我国浙江、江苏、山东、河北和北京等地区相继暴发了一种以鸭产蛋下降为主要特征的疫病，雏鸭发病后期出现精神沉郁、体重减轻、仰翻、侧翻和死亡等临床症状，若细菌继发感染，出现肝周炎、心包炎和气囊炎等，死淘率增加。2010年，根据产蛋下降和卵泡出血，将该病命名鸭出血性卵巢炎（duckhemorrhagic ovaritis, DHO），后经病原学研究证实该病是由黄病毒科坦布苏病毒（DuckTembusu Virus, DTMUV）引起，将该病命名为鸭坦布苏病毒病。北京鸭、樱桃谷鸭、金定鸭、麻鸭和康贝尔鸭等均可发病，该病给养鸭业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是预防传染病有效和经济的方法之一，疫苗制备方法与疫苗的质量和成本密切相关，能够生成出抗原含量高、批间差异小、低成本和易放大等工艺是研究的重点，是行业发展方向。

在疫苗研究方面，研究人员就全病毒灭活疫苗和致弱活疫苗进行了大量的研究工作，鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）和活疫苗（WF100）先后获得新兽药注册证书。目前资料表明，研究人员或疫苗生产企业主要利用鸭胚、鸡胚、鸡胚成纤维细胞、鸭胚成纤维细胞、BHK－21、Vero细胞、DF-1细胞等细胞增殖病毒。我们的研究结果表明，利用无血清全悬浮BHK-21细胞反应器培养的鸭坦布苏病毒含量低，利用微载体灌流法悬浮培养Vero细胞培养的病毒液，其病毒含量可达到制备疫苗的标准，但是由于微载体和血清昂贵，存在成本高和不易放大的缺点，不适合养鸭企业适用。采用无血清全悬浮何种细胞培养病毒含量高、培养成本低的鸭坦布苏病毒培养工艺，是我们多年来一直研究和摸索的工作。

EB66细胞来源于鸭胚干细胞，经驯化后形成的一种遗传稳定、纯净、可在无血清培养基中大规模悬浮培养、广泛用于人或动物疫苗生产用细胞系。国内外尚未见建有利用鸭胚干细胞EB66和无血清全悬浮反应器培养鸭坦布苏病毒的报道或专利申请。

发明内容

为克服利用鸭胚生产存在的劳动强度大、成本高、工艺复杂、自动化程度低、抗原批间差异大和现有细胞培养的病毒含量低等缺点，提供一种用鸭胚干细胞系EB66生产鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗。

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

一种制备鸭坦布苏病毒病出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，所述细胞系为EB66（一株鸭胚胎干细胞衍生细胞株），病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养。

上述方法，包括如下步骤：

1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在EB66细胞系中连续传代至病毒适应细胞，经鸡胚有限稀释克隆法，取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养，培养出病毒含量高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株（基础种毒株）；

2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种EB66细胞，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代，处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥10^6.5 ELD₅₀/1ml。以1～10ml/冻存管的剂量分装，-70℃保存。确定无菌检验、特异性检验、病毒含量检验和外源病毒检验合格的F2～F7代作为毒种种子批，其中F2～F5代病毒为基础毒种，F6～F7代为生成种毒（工作种子）；确定病毒感染复数（MOI）：测定F6和F7代生成种毒的病毒含量（ELD₅₀，鸡胚半数感染量），通过1个ELD₅₀接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥10^7.1 ELD₅₀/1ml的标准，确定了F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001；

3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞，培养条件为温度30～37℃，pH7.2～7.5；当反应器中利用无血清培养基全悬浮培养的EB66细胞数量达到400～1000万时，接种F6或F7代毒种，作用2h后，加入2倍细胞体积维持液，30～37℃继续培养，30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量应≥10^7.1 ELD₅₀/1ml；

4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液总量（V/V）0.1～0.2%的灭活剂，2～37℃振荡灭活16～144h；成品检验：取所得灭活病毒，以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡，判定毒液灭活完全；同时，取样，接种细菌检验用TG、GA和GP培养基，观察10日，无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染；

5）乳化：向步骤4）所得细胞毒液加入（V/V）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3：1进行乳化，乳化后即得成品。

上述方法，所述细胞为鸭胚干细胞系（EB66）；

上述方法：所述培养方法为细胞培养三角摇瓶或生物反应器，全悬浮细胞培养工艺；

上述方法：所述培养基为无血清培养基；

上述方法：毒株选育技术为鸡胚有限稀释法纯化技术；

上述方法，所述病毒感染复数（MOI）为0.1～0.001；

上述方法，所述培养工艺为接种病毒后，作用2h，再加入2倍体积的细胞维持液，30～37℃继续培养30～120h；

上述方法，细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理；

上述方法，所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液，2～37℃振荡灭活16～144h；

上述方法，所述灭活检验方法为以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡；

上述方法，所述乳化成疫苗的方法为按照油相与水相的体积比1.5～3:1进行乳化，乳化后即得疫苗成品。

与现有技术相比，本发明具有如下显著的有益效果：

（1）鸭坦布苏病毒用本发明确定的鸭胚干细胞系EB66培养，病毒适应性好和病毒含量高；

（2）经鸡胚有限稀释法筛选出的毒种免疫原性好；

（3）用反应器培养鸭坦布苏病毒，显著降低了病毒的扩散风险，具有更好的安全性；

（4）不采用鸭胚培养病毒工艺，不需要专门饲养种鸭和避免了挑选易感鸭胚的繁琐；

（5）培养的病毒液中仅含有病毒和细胞碎片，与鸭胚增殖病毒方法相比，不需要无害化处理鸭胚组织物，对环境影响小；

（6）利用鸭胚干细胞系EB66无血清全悬浮培养的病毒液，其病毒含量不低于鸭胚，显著高于（10～100倍）BHK-21细胞培养的病毒。由于不使用微载体，成本显著低于微载体灌流法Vero细胞培养工艺。

（7）无血清全悬浮工艺培养的病毒液成本不到鸭胚工艺的一半。

（8）由于不需要鸭胚孵化车间、逐枚接种、逐枚收获、组织到随机捣碎等优点，该方法占用空间小，制备流程简单。

用鸭胚干细胞系EB66细胞生产的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，安全，副反应小，免疫效力更高，疫苗批间质量差异小。该生产工艺简单稳定、易操作、产量大、培养的半成品病毒含量高、成本低和外源病原污染几率小等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。

具体实施方案

实施例1

一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，所述细胞系为鸭胚干细胞系EB66。

上述方法，包括如下步骤：

1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒（鸭坦布苏病毒-HB株，北京市农林科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存，基因登录号为JF523187）鸭胚适应株在EB66细胞系（该细胞株于2015年由甘肃健顺生物购自法国Valneva公司，并拥有中国独家代理权）中连续传代至病毒适应细胞，经鸡胚有限稀释克隆法（即将病毒液进行10倍系列稀释，取最高稀释度毒液接种鸡胚后收获的病毒），取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养，培养出病毒含量高、免疫原性好的毒株作为候选病毒株（基础种毒株）；

2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种EB66细胞，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代（疫苗研究过程中，对生产毒种的传代进行限定，由于传代次数增加，毒种的免疫原性会降低。本发明选择F6和F7作为生产毒种，F8代是疫苗代次。根据疫苗研究要求，一般往后在传3代，即F11代，如果F11代的免疫原性良好，表明F8代疫苗的保护效果会理想。处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥10^6.5 ELD₅₀/1ml。以1～10ml/冻存管的剂量分装，-70℃保存。确定无菌检验、特异性检验、病毒含量检验和外源病毒检验合格的F2～F7代作为毒种种子批，其中F2～F5代病毒为基础毒种，F6～F7代为生成种毒（工作种子）；确定病毒感染复数（MOI）：测定F6和F7代生成种毒的病毒含量（ELD₅₀，鸡胚半数感染量），通过1个ELD₅₀接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥10^7.1 ELD₅₀/1ml的标准，确定了F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001；

3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞，培养条件为温度30～37℃，pH7.2～7.5；当反应器中利用无血清培养基全悬浮培养的EB66细胞数量达到400～1000万时，接种步骤2）F6或F7代毒种，作用2h后，加入2倍细胞体积维持液，30～37℃继续培养，30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量应≥10^7.1 ELD₅₀/1ml；

4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液总量（V/V）0.1～0.2%的灭活剂（质量浓度37%的甲醛溶液），2～37℃振荡灭活16～144h；成品检验：取所得灭活病毒，以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡，判定毒液灭活完全；同时，取样，接种细菌检验用TG、GA和GP培养基，观察10日，无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染；

5）乳化：向步骤4）所得细胞毒液加入（V/V）4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相（油佐剂Marcol52 +司盘制备而成）与水相的体积比1.5～3:1进行乳化，乳化后即得成品。

实施例2

使用实施例1所用的方法制备得到的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）（外观乳白色均匀乳剂；剂型油包水型。取一清洁吸管，吸收少量疫苗，滴于清洁冷水表面，除第一滴外，均应不扩散；黏度按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定；稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，应不分层，管底析出的水相应不超过0.5mL；无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长；安全检验取28日龄DHOV抗体阴性健康北京鸭（或樱桃谷鸭）5只，每只颈部皮下注射 1mL。隔离饲养，观察14日，应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应；效力检验取20只42～120日龄DHOV抗体阴性健康北京鸭（或樱桃谷鸭），10只为免疫组，每只胸部肌肉接种0.5mL疫苗，另10只作为非免疫对照。首次免疫14日后，按照同样的剂量和接种途径对免疫鸭进行二次免疫。二次免疫后28日，免疫组和对照组，采血，测定HI抗体效价，且每只鸭各肌肉注射DHOV-HB株病毒液0.5mL（100个DID₅₀）。攻毒后2日，采集血液，分离血清，进行病毒分离。对照组HI抗体效价应均小于1:10，免疫组应至少7只HI抗体效价不低于1:20。对照组应至少9只鸭病毒分离阳性，免疫组应至少7只鸭病毒分离阴性。

甲醛残留量测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合规定。。

我们在利用鸭胚研制成鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的基础上，将疫苗生产用毒种HB株接种EB66细胞培养，连续培养11代病毒的含量表明，利用EB66细胞可以培养出高滴度的病毒（均不低于10^6.1ELD₅₀/0.1ml）。8个代次病毒制备疫苗免疫鸭的结果表明，经EB66培养的病毒，其抗原性和免疫原性无明显的改变。利用EB66细胞悬浮培养工艺克服了利用鸭胚生产存在的工艺复杂问题，达到了工艺简单稳定、易放大、节省人力和疫苗批次差异小的目的。利用反应器无血清全悬浮EB66细胞工艺培养的鸭坦布苏病毒，制备成的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗质量高、价格低，是一种“物美价廉”的防疫用品。

Claims

1.一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，病毒接种所用细胞系为EB66细胞系，病毒培养采用生物反应器以无血清全悬浮方式培养；

具体包括如下步骤：

1）选育毒株：将鸭坦布苏病毒鸭胚适应株在EB66细胞系中连续传代至病毒适应细胞，经有限稀释克隆法，取病毒含量最高的适应毒株继续经EB66细胞培养并从中筛选出候选病毒株；

2）建立毒种种子批：将步骤1）所得候选株病毒接种EB66细胞系，用细胞培养三角摇瓶传代培养至第11代，处理细胞培养液，各代次毒种的病毒含量应≥10^6.5 ELD₅₀/1ml；以 F2～F7代作为毒种种子批，其中F2～F5代病毒为基础毒种保存，F6～F7代为生成毒种进行下一步工作；

3）制备细胞毒液：在激流式生物反应器中利用无血清培养基全悬浮培养EB66细胞，培养条件为温度30～37℃，pH7.2～7.5；当反应器中EB66细胞数量达到400～1000万时，接种步骤2）所得的F6或F7代毒种；作用2h后，加入细胞维持液，30～37℃继续培养；30～120h后，当细胞活力下降到80%以下时收获细胞毒液，该细胞毒液病毒含量≥10^7.1 ELD₅₀/1ml；

4）灭活病毒：取步骤3）所得细胞毒液采用反复冻融、高速组织捣碎机处理、超声波处理或高压细胞破碎机处理，加入细胞毒液体积总量0.1～0.2%的灭活剂，2～37℃振荡灭活16～144h得到灭活病毒；

5）乳化：向步骤4）所得细胞毒液加入体积总量4%～8%吐温80，搅拌均匀为水相，按照油相与水相的体积比1.5～3:1进行乳化，乳化后即得疫苗成品。

2.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，所述F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001。

3.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤4）中所述灭活剂为质量浓度37%的甲醛溶液。

4.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤2）获得F6～F7代为生成毒种后，确定其病毒感染复数：测定F6和F7代生成毒种的病毒含量，通过1个ELD₅₀接种10000、1000、100、10、1个细胞后增殖的病毒含量，按照≥10^7.1 ELD₅₀/1ml的标准，确定F6和F7毒种接种EB66细胞的MOI为0.1~0.001。

5.根据权利要求1所述的制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法，其特征在于，步骤4）获得灭活病毒后，进行半成品检验：取灭活病毒，以0.2ml/胚的剂量经CAM途径接种10枚易感鸭胚或鸡胚，观察144小时，无特异性鸭胚或鸡胚死亡，判定毒液灭活完全；同时，取样，接种细菌检验用TG、GA和GP培养基，观察10日，无细菌生长，判定灭活毒液无细菌污染。

6.一种鸭坦布苏病毒病灭活疫苗及其制品，其特征在于，采用如权利要求1～5任一权利要求所述的方法制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗。