CN109679925B - 鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品 - Google Patents

鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品 Download PDF

Info

Publication number
CN109679925B
CN109679925B CN201811469419.6A CN201811469419A CN109679925B CN 109679925 B CN109679925 B CN 109679925B CN 201811469419 A CN201811469419 A CN 201811469419A CN 109679925 B CN109679925 B CN 109679925B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
virus
cells
cell
suspension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811469419.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109679925A (zh
Inventor
梁宛楠
杨末
吴增辉
刘鑫莹
杨大伟
王宁
李琳
孙晓峰
李应鹤
李倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Original Assignee
Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd filed Critical Harbin Pharmaceutical Group Bio Vaccine Co ltd
Priority to CN201811469419.6A priority Critical patent/CN109679925B/zh
Publication of CN109679925A publication Critical patent/CN109679925A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109679925B publication Critical patent/CN109679925B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24051—Methods of production or purification of viral material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品。本发明将鸡胚成纤维细胞细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞；本发明进一步提供了一种制备鸭坦布苏病毒的方法，其特征在于，包括：(1)将所述的适应无血清培养基呈悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的细胞接种鸭坦布苏病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，即得。本发明制备方法降低了污染风险和生产成本，有效缩短了鸭坦布苏病毒液的生产时间，所制备的鸭坦布苏病毒液安全性好，毒价高，便于进行大规模生产。

Description

鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品
技术领域
本发明涉及鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品，尤其涉及采用无血清悬浮培养技术制备鸭坦布苏病毒液的方法以及得到的鸭坦布苏病毒液产品，属于鸭坦布苏病毒液的制备领域。
背景技术
鸭坦布苏病毒隶属黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(Flavivirus)的恩塔亚病毒群。鸭坦布苏病毒病理变化主要表现为肉鸭脾脏肿大较为明显，有针尖状白色坏死灶出现在肝脏部位；蛋鸭卵巢出血、萎缩、破裂。感染鸭群的发病率比较高(近100％)，但是病死率却较低。多个品种鸭都面临坦布苏病毒的威胁，但是主要危害的品种为蛋鸭、野鸭、种鸭和肉种鸭。感染该病毒的主要特征表现为鸭群采食量、产蛋量迅速下降，严重时导致食欲废绝及停产，有不同程度死亡。病鸭体温升高，排绿色稀粪，部分出现神经症状，包括头颈抽搐、翻个、共济失调、瘫痪等。实际生产中，鸭群产蛋量随病程发展降到最低值后，由于机体健康水平逐渐恢复，产蛋量会再缓慢上升但无法达到之前的最高水平。
2010年，中国东南部地区首先爆发了以种鸭产蛋量急剧下降为主要特征的坦布苏病毒感染，短时间内迅速蔓延至全国各养鸭地区，并在鹅与商品肉鸭中相继山现大规模感染，给我网家禽养殖业造成了巨大的经济损失。自前该病在我国大部分养鸭地区均有流行,已成为危害水禽养殖的重要传染病之一。
DF-1细胞起源于鸡胚成纤维细胞，现已经成为一种成熟的传代细胞系。DF-1细胞体外培养具有很强的增殖能力，其细胞的密度能够超过CEF4倍以上。DF-1细胞是逆转录酶阴性、非致瘤性的细胞。DF-1细胞系是经美国食品与药物管理局(FDA)授权的全球商业化细胞系，目前已被广泛应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达、肿瘤病毒的研究及动物和人类疫苗的生产。
传统的DF-1培养大多采用血清贴壁的方式，该培养方式工艺复杂，占地面积大，需大量人工操作并且在培养过程中需要添加血清，增加了被外源病毒、支原体等污染的可能性，而且不同批次间的血清差异也会导致产品质量难以控制，同时也加大了下游分离纯化的难度。与血清贴壁培养技术相比，无血清悬浮培养技术无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，降低了污染风险和生产成本，缩短了生产时间。由于无血清悬浮培养技术不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。因此，无血清悬浮培养技术是细胞工业化生产疫苗的必然趋势。
因此，将DF-1细胞进行全悬浮驯化培养获得适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的细胞以及将其应用于鸭坦布苏病毒液的制备，对于降低鸭坦布苏病毒液的生产成本和污染风险、便于进行规模化生产等均具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞；
本发明的目的之二是应用所驯化获得的适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞(DF-1细胞)制备鸭坦布苏病毒，该制备方法采用悬浮培养技术降低鸭坦布苏病毒的生产成本和污染风险，能够进行规模化工业生产。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明将传代鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得一株适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，该细胞被命名为DF-1-XF。
本发明首先采用逐步降低血清的方法驯化DF-1细胞以适应低浓度血清培养：本发明将含10％新生牛血清的MEM培养液中稳定生长的DF-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×105cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中；经过数代后，DF-1细胞在含5％新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养；以同样的方法使DF-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。随着血清使用浓度的降低，DF-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。DF-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，仅有个别细胞呈现出稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，DF-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮DF-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明DF-1细胞已经适应了无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态；本发明经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1细胞命名为DF-1-XF细胞。
本发明将驯化培养获得适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：CGMCC No.16295，分类命名是：适应全悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞；保藏日期是：2018年9月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理中心普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明进一步的应用所述的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞制备鸭坦布苏病毒，包括：
(1)将DF-1-XF细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸭坦布苏病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，即得鸭坦布苏病毒液。
本发明将DF-1-XF细胞分别以初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml和0.75×106cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，每隔24小时取样计数，结果表明细胞初始接种密度为0.75×106cells/ml，培养48小时细胞密度可达3.0×106cells/ml以上，适合大生产需求；因此，步骤(1)将DF-1-XF细胞按照0.75×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；另外，步骤(1)中所述的细胞悬浮增殖培养条件还包括：pH值、溶氧、温度和搅拌转速等条件，这些参数均可以采用常规的细胞悬浮培养的参数进行培养，作为参考，所述pH可以控制为7.2、溶氧值可以控制(DO)为50％、温度可以控制为37℃、搅拌转速可以控制为50--500r/min。
本发明在血清浓度为1％、细胞初始接种密度0.75×106个/ml、pH为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃的条件下，将DF-1-XF细胞分别以60r/min、80r/min、100r/min和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行DF-1细胞悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。结果发现，当搅拌转速为100r/min时，细胞增殖最快，48小时细胞密度为3.2×106cells/ml；因此在步骤(1)中进行细胞悬浮增殖培养时，所采用的搅拌转速优选为100r/min。
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养36小时、48小时和60小时按2v/v％接种鸭坦布苏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。
本发明进一步发现，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸭坦布苏病毒的接毒时间对于病毒的增殖培养效果影响较大：
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养24小时、48小时和72小时按5v/v％接种鸭坦布苏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量。结果表明，细胞培养48h后接种病毒，病毒含量最高可达106.75EID50/ml，即最佳接毒时间为细胞培养48h；因此，步骤(2)中优选将DF-1-XF细胞悬浮增殖培养48小时接种鸭坦布苏病毒。
本发明进一步发现，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸭坦布苏病毒的接毒剂量以及收获毒液的收集时间对于鸡痘病毒的增殖培养效果非常显著：
本发明将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养60小时后，分别以体积比2.5％、5％、7.5％和10％的接毒量接种鸭坦布苏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量。结果表明，接毒剂量为5％，接种后72h收获病毒液，病毒含量可达106.52EID50/0.1ml，即最佳接毒剂量为培养体积的5％，收毒时间为接种后72h；因此，步骤(2)中，优选的，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞按照2.5％-10％的接种剂量接种鸭坦布苏病毒，当病毒增殖培养24-120小时后收获病毒液；更优选的，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞按照5％的接种剂量接种鸭坦布苏病毒，当病毒增殖培养72小时后收获病毒液。
本发明进一步将原代细胞CEF培养增殖鸭坦布苏病毒、鸡胚培养增殖鸭坦布苏病毒以及采用悬浮细胞DF-1-XF培养增殖鸭坦布苏病毒等不同的培养方法增殖鸭坦布苏病毒进行了比较，结果表明，通过悬浮细胞DF-1-XF培养收获的细胞毒的鸡胚半数致死量和细胞培养半数感染量显著高于鸡胚培养收获的鸡胚毒和通过原代细胞CEF培养收获的细胞毒的鸡胚半数致死量和细胞培养半数感染量。
本发明鸭坦布苏病毒的制备方法采用无血清悬浮培养技术，与血清贴壁培养技术相比，本发明制备方法无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，显著降低了污染风险和生产成本，有效缩短了生产时间；不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。本发明制备方法所制备的鸭坦布苏病毒液安全性好、毒价高。
附图说明
图1 DF-1细胞驯化过程中的细胞形态变化；A:悬浮培养初期；B:悬浮培养后期。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的DF-1细胞的驯化培养采用逐步降低血清的方法驯化DF-1细胞以适应低浓度血清培养。将含10％新生牛血清的MEM培养液中稳定生长的DF-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×105cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中。经过数代后，DF-1细胞在含5％新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养。以同样的方法使DF-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。将适应了1％新生牛血清培养条件的DF-1细胞在细胞三角瓶中进行悬浮培养驯化适应。细胞培养液为上海源培DF-1无血清培养基，细胞初始接种密度为1.0×106cells/ml，转速设置为160r/min，置于5％CO2培养箱中进行悬浮培养。
随着血清使用浓度的降低，DF-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。DF-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，各别细胞呈现出稍稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，DF-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮DF-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明DF-1细胞已经适应了无血清悬浮状态生长，将其命名为DF-1-XF细胞。
实施例2鸭坦布苏病毒液的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮培养，培养时间为36小时；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；
(2)向悬浮增殖培养48小时的DF-1-XF细胞按照5％(V/V)的接种剂量接种鸭坦布苏病毒(SD株)进行病毒增殖培养；增殖培养72小时后收获病毒液；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；经检测，病毒毒价为106.78EID50/0.2ml。
实施例3鸭坦布苏病毒液的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.3×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；
(2)向悬浮增殖培养48小时的DF-1-XF细胞按照7.5％(V/V)的接种剂量接种鸭坦布苏病毒(SD株)进行病毒增殖培养；增殖培养48小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为105.05EID50/0.2ml。
实施例4鸭坦布苏病毒的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；
(2)向悬浮增殖培养24小时的DF-1-XF细胞按照10％(V/V)的接种剂量接种鸭坦布苏病毒(SD株)进行病毒增殖培养；增殖培养96小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为104.89EID50/0.2ml。
实施例5鸭坦布苏病毒的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；
(2)向悬浮增殖培养48小时的DF-1-XF细胞按照2.5％(V/V)的接种剂量接种鸭坦布苏病毒(SD株)进行病毒增殖培养；增殖培养24小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为104.76EID50/0.2ml。
试验例1鸭坦布苏病毒的制备工艺参数优化试验
1.试验方法
1.1细胞悬浮培养条件的优化
1.1.1细胞初始接种密度的优化
将DF-1-XF细胞分别以0.3×106个/ml、0.5×106个/ml和0.75×106个/ml三个初始密度接种于生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。其它悬浮培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速为100r/min。
1.1.2搅拌转速的优化
将DF-1-XF细胞分别以60、80、100和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行DF-1细胞悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。其它悬浮培养条件：血清浓度为1％、细胞初始接种密度0.75×106个/ml、pH为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃。
1.2病毒悬浮培养参数优化
1.2.1接毒时间的优化
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养24、48和72小时按5v/v％接种鸭坦布苏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。1.2.2接毒剂量以及收毒时间的优化
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养48小时后，分别以体积比2.5％、5％、7.5％和10％的接毒量接种病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量及收毒时间。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。
2.试验结果
2.1细胞初始接种密度优化结果
将DF-1-XF细胞分别以初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml和0.75×106cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，每隔24小时取样计数，结果表明细胞初始接种密度为0.75×106cells/ml，培养48小时细胞密度可3.0×106cells/ml以上，适合大生产需求，结果见表1，因此本发明优选0.75×106cells/ml为细胞初始接种密度。
表1 不同细胞接种密度与悬浮细胞生长速度的关系
2.2搅拌转速的优化结果
将DF-1-XF细胞分别以60r/min、80r/min、100r/min和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。结果表明当搅拌转速为100r/min时，细胞增殖最快，48小时细胞密度为3.2×106cells/ml，结果见表2。
表2 不同搅拌转速与悬浮细胞生长速度的关系
2.3接毒时间的优化结果
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养24小时、48小时和72小时按5v/v％接种鸭坦布苏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量。优化试验结果表明，细胞培养48h后接种病毒，病毒含量最高可达106.75EID50/ml，即最佳接毒时间为细胞培养48h，结果见表3。
表3 不同接毒时间对病毒含量的影响(EID50/0.1ml)
2.4接毒剂量以及收毒时间的的优化结果
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养60小时后，分别以体积比2.5％、5％、7.5％和10％的接毒量接种鸭坦布苏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量。结果表明，接毒剂量为5％，接种后72h收获，病毒含量最高可达106.52EID50/0.1ml，即最佳接毒剂量为培养体积的5％，收毒时间为接种后72h，结果见表4。
表4 不同接毒剂量对病毒含量的影响(EID50/0.1ml)
试验例2不同培养方式增殖鸭坦布苏病毒的对比试验
1.不同的培养方法增殖鸭坦布苏病毒
1.1原代细胞CEF培养增殖鸭坦布苏病毒
取对数生长的CEF细胞，按5v/v％接种病毒，加入含有2％FBS的细胞维持液，置37℃含有5％CO2培养箱中培养，于96h收获病毒液。
1.2鸡胚培养增殖鸭坦布苏病毒
将病毒用灭菌生理盐水作1000倍稀释后，经绒毛尿囊腔接种9-10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育，选择接种48-96h死亡的鸡胚，收集尿囊液。
1.3悬浮细胞DF-1-XF培养增殖鸭坦布苏病毒
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养48小时后，以体积比5％的接毒量接种病毒液，培养72h收获病毒液。
1.4不同培养方式收获的病毒液EID50的测定方法
将不同培养方式收获的病毒液分别进行EID50的测定，方法如下，将病毒液作10倍系列稀释至10-7，取10-4、10-5、10-6和10-74个不同稀释度，分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，0.1ml/枚，记录接种后96h内鸡胚死亡情况，并按Reed-Muench法计算鸡胚半数致死量(EID50)。
1.5不同培养方式收获的病毒液TCID50的测定方法
将不同培养方式收获的病毒液分别在CEF细胞上进行TCID50的测定，方法如下，制备原代鸡胚成纤维细胞，分装于96孔板中长满单层。将病毒液作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6和10-73个稀释度，各加入96孔细胞培养板，每个稀释度6孔，每孔100μl，同设6孔加100μl MEM作为无病毒空白对照。120h时记录各稀释度病变孔数，并按Reed-Muench法计算鸡细胞培养半数感染量(TCID50)。
2.试验结果
2.1不同培养方式收获的病毒液EID50的比较
通过对悬浮细胞DF-1-XF培养收获的细胞毒、鸡胚培养收获的鸡胚毒和原代细胞CEF培养收获的细胞毒的EID50进行比较，表5的结果表明，通过悬浮细胞DF-1-XF培养收获的细胞毒相比于鸡胚培养收获的鸡胚毒和通过原代细胞CEF培养收获的细胞毒，鸡胚半数致死量高。
表5 不同培养方式病毒液病毒含量(EID50/0.1ml)
2.2不同培养方式收获的病毒液TCID50的比较
通过对悬浮细胞DF-1-XF培养收获的细胞毒、鸡胚培养收获的鸡胚毒和原代细胞CEF培养收获的细胞毒的TCID50进行比较，表6的结果表明，通过悬浮细胞DF-1-XF培养收获的细胞毒相比于鸡胚培养收获的鸡胚毒和通过原代细胞CEF培养收获的细胞毒，细胞培养半数感染量高。
表6 不同培养方式病毒液病毒含量(TCID50/0.1ml)

Claims (1)

1.一种制备鸭坦布苏病毒液的方法，其特征在于，包括：
（1）将鸡胚成纤维细胞进行传代驯化培养得到适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞DF-1-XF，其微生物保藏编号是：CGMCC No.16295；
（2）将驯化培养得到的传代鸡胚成纤维细胞DF-1-XF按照初始密度为0.75×106cells/ml的接种密度接种到生物反应器或细胞培养瓶中在搅拌转速为100r/min的条件进行细胞悬浮增殖培养；所述的细胞悬浮增殖培养的条件还包括：pH值为7.2、溶氧值为50%、培养温度为37℃；
（3）向悬浮增殖培养48小时的传代鸡胚成纤维细胞DF-1-XF按照培养体积的5%的接种量接种鸭坦布苏病毒进行病毒增殖培养72小时后收获病毒液，即得；其中，所述的病毒增殖培养的条件包括：pH值为7.2、溶氧为50%、温度37℃、搅拌转速为100r/min。
CN201811469419.6A 2018-12-04 2018-12-04 鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品 Active CN109679925B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811469419.6A CN109679925B (zh) 2018-12-04 2018-12-04 鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811469419.6A CN109679925B (zh) 2018-12-04 2018-12-04 鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109679925A CN109679925A (zh) 2019-04-26
CN109679925B true CN109679925B (zh) 2023-08-04

Family

ID=66186068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811469419.6A Active CN109679925B (zh) 2018-12-04 2018-12-04 鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109679925B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540292A (zh) * 2022-02-23 2022-05-27 苏州双洳生物科技有限公司 一种麻鸭鸭胚肝间充质干细胞的悬浮驯化方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101194012A (zh) * 2005-04-11 2008-06-04 维涡里斯公司 在悬浮的禽类胚胎衍生的干细胞中制备病毒疫苗的方法
CN108721615A (zh) * 2018-05-16 2018-11-02 北京市农林科学院 一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101194012A (zh) * 2005-04-11 2008-06-04 维涡里斯公司 在悬浮的禽类胚胎衍生的干细胞中制备病毒疫苗的方法
CN108721615A (zh) * 2018-05-16 2018-11-02 北京市农林科学院 一种制备鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的方法及其疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
CN109679925A (zh) 2019-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106011083B (zh) 一种在无血清全悬浮培养的mdck细胞生长的禽流感病毒的制备方法及获得的禽流感病毒
CN109913404B (zh) 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法
CN114317405B (zh) 无血清全悬浮培养型f81细胞系及其构建方法与应用
CN108300704B (zh) 一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法
CN108220221A (zh) 一种全悬浮细胞培养重组禽流感亚型病毒的方法
CN105191790B (zh) 一种小丛红景天的离体培养方法
CN114107170B (zh) 猫肾悬浮细胞系及其构建方法与应用
CN108220227A (zh) 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
CN108570454A (zh) Mdbk驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺
CN110313405A (zh) 一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法
CN109295009A (zh) 一种鸡传染性法氏囊病病毒的全悬浮培养方法
CN109679925B (zh) 鸭坦布苏病毒液的制备方法及其产品
CN109207439A (zh) 一种鸭瘟病毒的全悬浮培养方法
CN105176915A (zh) 一种适于Marc-145细胞生长的低血清无蛋白培养基及其制备方法
CN107012162A (zh) 农杆菌介导的棉花胚尖快速转化方法
CN106237324B (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法
CN109679900B (zh) 禽流感疫苗的制备方法及其产品
KR20080073388A (ko) 체세포배 세포 급속증식을 이용한 나리류의 자구 대량생산방법
CN109908337A (zh) 鸡痘活疫苗的制备方法及其产品
CN103272229A (zh) 一种阻断白斑综合症病毒感染对虾的口服剂及其制备方法和应用
CN103157107A (zh) 用连续传代细胞系生产鸡马立克氏病疫苗及方法
CN109280648B (zh) 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用
CN109602900A (zh) 鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品
CN105145364A (zh) 一种金毛狗绿色球状体途径的组培繁殖方法
CN110862972B (zh) 一种犬腺病毒ⅰ型无血清培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant